TW201940079A - 使用馬利乳酸桿菌製造轉葡萄糖基化甜菊醣苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關於使用馬利乳酸桿菌菌株的粗酵素液以製備轉葡萄糖基化甜菊醣苷的方法。
Description
本發明係有關於使用馬利乳酸桿菌菌株的粗酵素液以製備轉葡萄糖基化甜菊醣苷的方法。
當世界衛生組織(World Health Organization；WHO)由於擔憂因糖的食用量所造成的相關疾病(肥胖)而建議降低每日糖攝取量，已開發國家的政府機關積極地討論針對降低糖攝取之含量的各種政策。因此，隨著對於發展各式各樣的替代性甜味劑(alternative sweeteners)之需求在市場上增加，替代性甜味劑也持續地被開發並被商品化。作為替代性甜味劑者，其等為在下列的形式中連續變異的主體：即，合成高強度甜味劑(synthetic high-intensity sweeteners)(如糖精、阿斯巴甜、蔗糖素等)、合成糖醇(如麥芽糖醇及木糖醇)，以及高強度甜味劑(如甜葉菊苷A(Rebaudioside A)及甘草)。然而，由於擔憂合成甜味劑的安全性，消費者對天然甜味劑的需求正穩定地增加。但是，因受限於天然甜味劑所具有的特殊風味(即，異味及敗味(off-odor and off-flavor))之特性，天然甜味劑無法完全地取代由合成甜味劑所製成的現有之低卡路里及零卡路里之產品。
近年來備受關注的一天然高強度甜味劑為萃取自甜葉菊 (Stevia rebaudiana Bertoni)之葉片的甜菊。甜菊為天然的材料，且其甜度為糖的200倍至300倍。此外，甜菊係由甜菊糖(Stevioside)、甜葉菊苷A、B、C、D、E等所組成。再者，由於報導指出甜菊不會產生卡路里、對血糖及胰島素水平(insulin levels)具有正面作用，且對人體不具副作用，因此甜菊具有作為替代性甜味劑的潛力。然而，甜菊具有苦味，故在使用上受到限制。
迄今，已經有三種改善甜菊的甜味之方法：(1)混合醣類甜味劑、胺基酸或胺基酸鹽之方法；(2)包括材料如環糊精之物理方法；以及(3)使用酵素以轉移葡萄糖之方法。作為使用酵素以轉移葡萄糖的方法而言，在該領域中廣泛地運用使用CGTase(Cyclodextrin Glycosyltransferase；環狀糊精葡萄糖苷基轉移脢)以將1個至12個葡萄糖分子轉移至甜菊醣苷(Steviol Glycoside)之方法(韓國發明專利申請案第10-1991-0020769號)。然而，該方法具有所有由葡萄糖所轉移的甜菊醣苷會被腸道微生物分解而增加卡路里的缺點。
已知當一般的乳桿菌(Lactobacilli)與β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)反應時會產生甜茶素(Rubusoside)(韓國發明專利申請案第10-17676060000號)。另外，特定的基因體洛德乳酸桿菌180(Lactobacillus reuteri 180)係唯一已知會辨認甜菊醣苷以產生轉葡萄糖基化甜菊醣苷(transglucosylated steviol glycoside)之乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。
在此情況下，本發明人等發現馬利乳酸桿菌(Lactobacillus mali)係經由α-(1,6)-鍵(α-(1,6)-bond)將葡萄糖進行轉葡萄糖基化(transglucosylate)成甜菊醣苷，以產生難消化性(indigestible)的轉葡萄糖基化甜菊醣苷，藉此完成本發明。
(專利文件1)韓國發明專利申請案第10-1991-0020769號。
(專利文件2)韓國發明專利申請案第10-17676060000號。
本發明的一個目的是提供一種使用馬利乳酸桿菌微生物或其培養物以製備轉葡萄糖基化甜菊醣苷的方法。
本發明的另一個目的是提供一種透過上述製備方法所製備的轉葡萄糖基化甜菊醣苷。
本發明的再另一個目的是提供一種用以生產轉葡萄糖基化甜菊醣苷的組成物，其包括一馬利乳酸桿菌微生物或其培養物。
本發明的再另一個目的是提供一種甜味劑，其包括透過上述使用馬利乳酸桿菌微生物或其培養物之製備方法所製備的轉葡萄糖基化甜菊醣苷。
以下將詳細說明本發明。同時，在此揭示的每一個說明以及例示性實施例皆可應用至其它的說明以及例示性實施例。亦即，在此揭示的各種要素之所有組合皆屬於本發明的範圍。另外，本發明的範圍不應受限於以下提供的特定揭露內容。
為達成本發明的目的，本發明的一方案係提供一種使用馬利乳酸桿菌微生物或其培養物以製備轉葡萄糖基化甜菊醣苷的方法。
在此所使用的用語「steviol glycoside(甜菊醣苷)」係指一具有鏈結於化學式1之13-OH或19-OH的一葡萄糖、鼠李糖、木糖等天然甜味劑：
一般在化學式1中，R1係可與氫(H)鍵結，或可透過β-鍵與1個至3個葡萄糖分子鍵結；R2係可與葡萄糖、木糖以及鼠李糖之任一者鍵結，且可透過β-鍵使0個至2個葡萄糖分子與其鍵結，但不限於此。
甜菊醣苷的優點在於，相較於糖，甜菊醣苷具有較少的卡路里，且其甜度約為糖的200倍至300倍；而甜菊醣苷的缺點在於，其伴有獨特的澀味或苦味。因此，至今仍致力於改善甜菊醣苷的甜味。
α-/β-醣苷鏈(glycosidic bonds)係藉由變旋異構位置(anomeric position)以及距離單醣的1-碳最遠的立構中心(stereocenter)之相對立體化學(relative stereochemistry)(R-型或S-型)而被辨識。一般而言，α-醣苷鏈係當兩 個碳具有相同的立體化學時形成，而β-醣苷鏈係當兩個碳具有不同立體化學時存在。
本發明人等首次發現，馬利乳酸桿菌微生物及其培養物係利用糖以及甜菊醣苷作為基質以將糖分解成葡萄糖，並藉由α-鍵選擇性地將1個至4個葡萄糖分子鏈結至甜菊醣苷。此外，本發明人等首次發現，衍自本發明的馬利乳酸桿菌之酵素的優點在於，其具有絕佳的轉葡萄糖基化甜菊醣苷之轉換率(conversion rate)，以及相較於現有的甜菊醣苷，其氣味減少且其甜味顯著地增加。
在此所使用的用語「transglucosylated steviol glycoside(轉葡萄糖基化甜菊醣苷)」可指具有以下的構成之甜菊醣苷：藉由利用糖以及甜菊醣苷作為基質，並藉由馬利乳酸桿菌透過α-鍵使1個至4個葡萄糖分子被直接添加至甜菊醣苷的19-OH位置。更具體而言，轉葡萄糖基化甜菊醣苷可為以下的構成：1個至4個葡萄糖分子係被添加至一藉由α-(1,6)-鍵鏈結至甜菊醣苷之19-OH位置的葡萄糖，但不限於此。
用以製備轉葡萄糖基化甜菊醣苷之方法的各步驟將詳細予以說明。首先，在該方法中可製備馬利乳酸桿菌微生物或其培養物。
在用以製備轉葡萄糖基化甜菊醣苷之方法的下一個步驟中，在馬利乳酸桿菌微生物或其培養物的存在下，可使糖與甜菊醣苷產生反應。
用於本發明之目的，該培養物可指含有細胞的培養基或是剔除細胞的粗酵素液(crude enzyme liquid)。具有糖之水解活性的酵素可發揮選擇性地使1個至4個葡萄糖分子α-鍵結至鏈結於甜菊醣苷的19-OH位置之葡 萄糖的作用，但不限於此。
在此，甜菊醣苷可選自於由甜菊糖(Stevioside)、甜茶素、衛矛醇苷A(Dulcoside A)、甜葉菊苷A、甜葉菊苷C、甜葉菊苷D、甜葉菊苷E、甜葉菊苷F以及甜葉菊苷M所組成之群組的一種或多種，但不限於此。
進一步地，使糖與甜菊醣苷接觸的步驟可在pH 1至pH 10執行，更具體而言在pH 2至pH 9，或是pH 3至pH 8執行，但pH值不限於此。
另外，使糖與甜菊醣苷接觸的步驟可在1℃至80℃的溫度執行，更具體而言在5℃至70℃、10℃至60℃或是25℃至50℃的溫度執行，但溫度不限於此。
此外，相較於其他含有已知酵素的微生物，馬利乳酸桿菌具有轉葡萄糖基化甜菊醣苷之具備更高的由甜菊醣苷轉換為轉葡萄糖基化甜菊醣苷之轉換率的功能之特性。
本發明之轉換成轉葡萄糖基化甜菊醣苷的轉換率可為40%至90%，但不限於此。更具體而言，轉換率可為40%至90%、50%至80%、50%至85%、60%至85%、60%至80%、70%至85%或70%至80%，但不限於此。
更具體而言，該轉換率係在以下條件下被量測：以4000rpm至8000rpm的轉速，對含有在30℃培養24小時至48小時的具備轉葡萄糖基化甜菊醣苷特性之馬利乳酸桿菌的培養基離心1分鐘至20分鐘，以分離細胞，並使該粗酵素液與含有甜菊醣苷及糖的基質溶液產生反應。
為達成本發明的目的，本發明的另一方案係提供一種透過上述製備方法所製備的轉葡萄糖基化甜菊醣苷。該轉葡萄糖基化甜菊醣苷可 具有以下的構成：透過α-鍵使1個至4個葡萄糖分子直接添加至甜菊醣苷的19-OH位置，且更具體而言可為以下的構成：透過α-(1,6)-鍵使1個至4個葡萄糖分子直接添加至甜菊醣苷之19-OH位置，但不限於此。
更具體而言，根據上述方法所製備的轉葡萄糖基化甜菊醣苷可選自於由轉葡萄糖基化甜菊糖(transglucosylated Stevioside)、轉葡萄糖基化甜茶素(transglucosylated Rubusoside)、轉葡萄糖基化衛矛醇苷A(transglucosylated Dulcoside A)、轉葡萄糖基化甜葉菊苷A(transglucosylated Rebaudioside A)、轉葡萄糖基化甜葉菊苷C、轉葡萄糖基化甜葉菊苷D、轉葡萄糖基化甜葉菊苷E、轉葡萄糖基化甜葉菊苷F以及轉葡萄糖基化甜葉菊苷M所組成之群組的一種或多種，但不限於此。
本發明的再另一個方案是提供一種用以生產轉葡萄糖基化甜菊醣苷的組成物，其包括一馬利乳酸桿菌微生物或其培養物。
本發明的再另一個方案是提供一種甜味劑，其包括透過上述方法所製備的轉葡萄糖基化甜菊醣苷。用於本發明的目的，該甜味劑的特徴在於具有經減少的異味以及經增強的甜味。
本發明的再另一個方案是提供一種用以增強該包括使用馬利乳酸桿菌微生物或其培養物以生產轉葡萄糖基化甜菊醣苷之甜味劑的甜味之方法。
本發明的用以製備轉葡萄糖基化甜菊醣苷之方法能夠使用馬利乳酸桿菌微生物或其培養物以具體生產轉葡萄糖基化甜菊醣苷。此 外，轉葡萄糖基化甜菊醣苷具有由甜菊醣苷轉換成轉葡萄糖基化甜菊醣苷之高轉換率，因此能夠有效地生產轉葡萄糖基化甜菊醣苷。根據本發明的轉葡萄糖基化甜菊醣苷，係用作為具有改良的苦味且其焓(caloric content)相較於已知的轉葡萄糖基化甜菊醣苷並不高之高強度甜味劑的材料，且因此得以使用在不同領域中。
圖1至圖9係顯示使用馬利乳酸桿菌菌株之粗酵素液所製備的轉葡萄糖基化甜菊醣苷之HPLC結果。
圖10至圖16係顯示使用馬利乳酸桿菌菌株之粗酵素液所製備的轉葡萄糖基化甜菊醣苷之HPLC/MS結果。
圖17係根據溫度所呈現的轉葡萄糖基化甜菊醣苷之轉換率(甜菊糖及甜葉菊苷A)的曲線圖。
圖18係根據pH所呈現的轉葡萄糖基化甜菊醣苷之轉換率(甜菊糖及甜葉菊苷A)的曲線圖。
圖19係根據甜菊醣苷之濃度所呈現的轉葡萄糖基化甜菊醣苷之轉換率(甜菊糖及甜葉菊苷A)的曲線圖。
以下將以附隨的例示性實施例詳細說明本發明。然而，此處所揭示的例示性實施例僅用於說明之目的，不應被解釋為限制本發明之範圍。
[實例1]具有糖之水解活性的新穎馬利乳酸桿菌衍生之酵素的製備方法
在一含有以酵母萃取及玉米浸液(corn steep liquor)作為氮源並以糖(具有99%或更高之純度的Beksul白糖)作為碳源的營養培養基中，胺基酸等、馬利乳酸桿菌微生物(DSM20444,ATCC 27054,ATCC 27304)係在30℃個別培養24小時。該培養基(culture media)(培養物(cultures))係以8000rpm的轉速離心10分鐘以分離細胞及上清液，且其後僅收集上清液。該粗酵素液係與糖反應，其導致糖之水解活性，並確定了在粗酵素液中具有糖之水解活性的新穎酵素之存在。
[實例2]由甜菊醣苷轉換成轉葡萄糖基化甜菊醣苷之轉換的評估
在0.05M的醋酸鹽緩衝溶液中溶解甜菊醣苷以及糖，並將實例1所製備的馬利乳酸桿菌菌株之粗酵素液添加於其中，隨後在40℃進行24小時的接觸。反應之後，反應溶液在100℃被鈍化(inactivated)，接著藉由HPLC(High Performance Liquid Chromatography；高效液相層析)確認轉葡萄糖基化甜菊醣苷的生產。所使用的甜菊醣苷係甜菊糖、甜茶素、衛矛醇苷A以及甜葉菊苷A/C/D/E/F/M，並藉由HPLC確定其等是否生產轉葡萄糖基化甜菊糖、轉葡萄糖基化甜茶素、轉葡萄糖基化衛矛醇苷A以及轉葡萄糖基化甜葉菊苷A/C/D/E/F/M。具體而言，基於圖1至圖9，藉由執行HPLC/MS(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry；高效液相層析-質譜法)分析以確定其等轉葡萄糖基化甜菊醣苷之分子量，以鑑別透過馬利乳酸 桿菌菌株之粗酵素液與甜菊醣苷之間的反應所新生產的物質，且該物質已確認為其等轉葡萄糖基化甜菊醣苷。經HPLC/MS進行分析的甜菊醣苷為甜菊糖、甜葉菊苷A/C/D/E/F/M、甜茶素以及衛矛醇苷A。
圖10至圖16係顯示針對使用馬利乳酸桿菌菌株之粗酵素液所製備的轉葡萄糖基化甜菊醣苷之HPLC/MS分析之結果。經由圖10至圖16已確認，於使用馬利乳酸桿菌菌株之粗酵素液所製備的轉葡萄糖基化甜菊醣苷中，1個至4個葡萄糖分子已轉移至其等甜菊醣苷(甜菊糖、甜葉菊苷A/C/E/F、甜茶素以及衛矛醇苷A)。
[實例3]溫度對於合成轉葡萄糖基化甜菊醣苷的效應
在透過由馬利乳酸桿菌菌株衍生之粗酵素液所生產的轉葡萄糖基化甜菊醣苷中，溫度的效應係被評估。在0.05M的醋酸緩衝溶液(pH 5.0)中溶解甜菊醣苷(甜菊糖及甜葉菊苷A)以及糖，並將該粗酵素液添加於其中，隨後在10℃至80℃進行24小時的接觸。反應之後，藉由HPLC分析該反應溶液中的轉葡萄糖基化甜菊醣苷的量。
圖17係根據溫度所呈現的轉葡萄糖基化甜菊醣苷之轉換率(甜菊糖及甜葉菊苷A)的曲線圖。根據圖17，藉由馬利乳酸桿菌菌株之粗酵素液而轉換至轉葡萄糖基化甜菊醣苷之轉換率係在10℃至50℃高達10%至70%。
[實例4]pH對於合成轉葡萄糖基化甜菊醣苷的效應
在透過馬利乳酸桿菌菌株之粗酵素液所生產的轉葡萄糖基 化甜菊醣苷中，pH的效應係被評估。甜菊醣苷以及糖係溶解於0.05M的醋酸緩衝溶液(pH 2.0至pH 5.0)、磷酸鹽緩衝溶液(pH 6.0)、參緩衝液(tris buffer solution)(pH 7.0至pH 8.0)以及碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)緩衝溶液(pH 9.0)中。此後，將粗酵素液添加於其中，並在pH 2至pH 9進行反應24小時。反應之後，藉由HPLC分析轉葡萄糖基化甜菊醣苷的量。
圖18係根據pH所呈現的轉葡萄糖基化甜菊醣苷之合成轉換率的曲線圖。根據圖18，藉由馬利乳酸桿菌菌株之粗酵素液而轉換至轉葡萄糖基化甜菊醣苷之轉換率係在pH 4.0至pH 7.0呈現高轉換率，且尤其在pH 5.0呈現最高轉換率90%。
[實例5]依據甜菊醣苷之濃度對轉葡萄糖基化甜菊醣苷的分析
依據甜菊醣苷的濃度對透過馬利乳酸桿菌之粗酵素液所生產之轉葡萄糖基化甜菊醣苷進行評估。在醋酸緩衝溶液(pH 5.0)中溶解糖以及甜菊醣苷(甜菊糖及甜葉菊苷A)，並於40℃進行24小時的反應。反應之後，藉由HPLC分析轉葡萄糖基化甜菊醣苷的生產。
圖19係根據甜菊醣苷(甜菊糖及甜葉菊苷A)之濃度所呈現的轉葡萄糖基化甜菊醣苷之轉換率的曲線圖。結果證實，藉由馬利乳酸桿菌之粗酵素液而轉換至轉葡萄糖基化甜菊醣苷之轉換率係在0%(w/w)至4%(w/w)呈現高轉換率，且尤其在6%(w/w)呈現最高轉換率。
圖19係根據甜葉菊苷A之濃度所呈現的轉葡萄糖基化甜葉菊苷A之合成轉換率。結果證實，藉由馬利乳酸桿菌之粗酵素液而轉換至轉葡萄糖基化甜葉菊苷A之轉換率係在0%(w/w)至32%(w/w)呈現高轉換率，且 尤其在6%(w/w)呈現最高轉換率。
[實例6]轉葡萄糖基化甜菊醣苷的核磁共振(NMR)分析
在醋酸緩衝溶液(pH 5.0)中溶解糖以及甜菊醣苷，並將該粗酵素液添加於其中，隨後在40℃進行24小時的接觸。該反應溶液在100℃被鈍化，並使用0.45μm的過濾器去除不純物。在每一個甜菊醣苷(甜菊糖及甜葉菊苷A)中，一個葡萄糖係被轉移，並透過HP20樹脂被純粹分離(purely separated)。藉由1H/13C NMR、同核(homonuclear)相關譜(Correlation Spectroscopy；COSY)、全相關譜(Total Correlation Spectroscopy；TOCSY)、異核單量子同調性(Heteronuclear Single-Quantum Coherence；HSQC)以及異核多重鍵相關性(Heteronuclear Multiple-Bond Correlation；HMBC)分析經分離的轉葡萄糖基化甜菊糖以及轉葡萄糖基化甜葉菊苷A之鍵結結構(bonding structure)。此外，其等結果(1H/13C NMR、COSY以及HMBC)係顯示於表1及表2中。
另外，鑑別轉葡萄糖基化甜菊糖及轉葡萄糖基化甜葉菊苷A的結構之結果證實，其等為新穎化合物，如轉葡萄糖基化甜菊糖係13-[(2-正-β-D-葡萄呱喃糖苷-β-D-葡萄呱喃糖苷)氧基]映-貝殼杉-16-烯-19-酸6-正-α-D-葡萄呱喃糖苷-β-D-葡萄呱喃糖苷酯(13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]ent-kaur-16-en-19-oic acid 6-O-α-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl ester)以及轉葡萄糖基化甜葉菊苷A係13-[(2-正-β-D-葡萄呱喃糖苷-3-正-β-D-葡萄呱喃糖苷-β-D-葡萄呱喃糖苷)氧基]映-貝殼杉-16-烯-19-酸6-正-α-D-葡萄呱喃糖-β-D-葡萄呱喃 糖苷酯(13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]ent-kaur-16-en-19-oic acid 6-O-α-D-glucopyranose-β-D-glucopyranosyl ester)。
<轉葡萄糖基化甜菊糖之圖示>
<轉葡萄糖基化甜葉菊苷A之圖示>
雖然已參照特定的說明性實施例描述了本發明，本發明所屬 技術領域中具有通常知識者將理解只要不脫離本發明的技術精神或必要特徵，則可將本發明以其它特定形式體現。因此，以上所描述的實施例係在各方面都被認為是用以說明而非用以限制。再者，本發明的範圍係藉由附加的請求項所界定而非由詳細說明的內容所界定，且應當理解的是所有衍生自本發明的意涵與範圍以及其均等物之所有改良及變更皆包括於附加的請求項之範圍內。
Claims (10)
- 一種使用馬利乳酸桿菌微生物或其培養物以製備轉葡萄糖基化甜菊醣苷的方法。
- 如請求項1所述之使用馬利乳酸桿菌微生物或其培養物以製備轉葡萄糖基化甜菊醣苷的方法，其中，該方法包括在該馬利乳酸桿菌微生物或其培養物存在下，使甜菊醣苷與糖接觸。
- 如請求項2所述之使用馬利乳酸桿菌微生物或其培養物以製備轉葡萄糖基化甜菊醣苷的方法，其中，該甜菊醣苷係選自於由甜菊糖、甜茶素、衛矛醇苷A、甜葉菊苷A、甜葉菊苷C、甜葉菊苷D、甜葉菊苷E、甜葉菊苷F以及甜葉菊苷M所組成之群組的一種或多種。
- 如請求項2所述之使用馬利乳酸桿菌微生物或其培養物以製備轉葡萄糖基化甜菊醣苷的方法，其中，係在pH 3至pH 8且10℃至60℃的溫度執行該甜菊醣苷與該糖的接觸。
- 如請求項1所述之使用馬利乳酸桿菌微生物或其培養物以製備轉葡萄糖基化甜菊醣苷的方法，其中，該轉葡萄糖基化甜菊醣苷係一甜菊醣苷，於其中葡萄糖係藉由透過經由一 α-(1,6)-鍵而鏈結至該甜菊醣苷之一19-OH位置之一葡萄糖鏈結的方式而添加。
- 如請求項5所述之使用馬利乳酸桿菌微生物或其培養物以製備轉葡萄糖基化甜菊醣苷的方法，其中，該轉葡萄糖基化甜菊醣苷包括1個至4個葡萄糖分子。
- 一種透過如請求項1至6中任一項之方法所製備的轉葡萄糖基化甜菊醣苷。
- 如請求項7所述之轉葡萄糖基化甜菊醣苷，其中，該轉葡萄糖基化甜菊醣苷係選自於由轉葡萄糖基化甜菊糖、轉葡萄糖基化甜茶素、轉葡萄糖基化衛矛醇苷A、轉葡萄糖基化甜葉菊苷A、轉葡萄糖基化甜葉菊苷C、轉葡萄糖基化甜葉菊苷D、轉葡萄糖基化甜葉菊苷E、轉葡萄糖基化甜葉菊苷F以及轉葡萄糖基化甜葉菊苷M所組成之群組的一種或多種。
- 一種用以生產轉葡萄糖基化甜菊醣苷的組成物，其包括一馬利乳酸桿菌微生物或其培養物。
- 一種甜味劑，其包括透過如請求項1至6中任一項之方法所製備的轉葡萄糖基化甜菊醣苷。
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