KR20190072471A - 락토바실러스 말리를 이용하여 포도당전이 스테비올 배당체를 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 락토바실러스 말리 균주의 조효소액을 이용하여, 포도당전이 스테비올 배당체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 출원은 락토바실러스 말리 균주의 조효소액을 이용하여, 포도당전이 스테비올 배당체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
세계보건기구(WHO)의 당 섭취에 따른 질병(비만) 우려에 의해 일일 당 섭취량을 낮출 것을 권고함에 따라, 선진국을 중심으로 정부 주도하에 다양한 당류 섭취량을 줄이기 위한 정책이 활발히 논의 중이다. 이에 시장에서는 다양한 대체감미료소재에 대한 니즈가 증가하고 있어, 대체감미료 소재가 지속적으로 개발, 상용화 되고 있다. 대체감미료로는 합성고감미료(Saccharin, Aspartame, Sucralose 등), 합성당알콜류(Maltitol, Xylitol), 고감미료(Rebaudioside A, Liquorice)으로 지속적으로 변화되고 있다. 그러나 지속적인 합성감미료의 안전성에 대한 우려로 천연감미료에 대한 고객의 니즈가 지속적으로 커지고 있으나, 천연감미료 특유의 이미·이취의 맛 속성 한계로 기존의 합성감미료 중심의 저칼로리·제로칼로리제품을 본격적으로 대체하지 못하고 있는 실정이다.
최근 상당한 주목을 받고 있는 천연의 고감미료는 식물인 스테비아 리바우디아나 베르토니(Stevia rebaudiana Bertoni)의 잎에서 추출한 스테비아(Stevia)이다. 스테비아는 천연소재이면서 설탕의 200-300배의 감미도를 가지고 있으며, 스테비오사이드(Stevioside), 리바우디오사이드 (Rebaudioside) A, B, C, D, E, M 등으로 이뤄져 있다. 또한 스테비아는 열량을 내지 않고 혈중 포도당과 인슐린 수준에 긍정적이며, 인체에 부작용이 없는 것으로 보고되어 대체감미료로서의 잠재력을 띄고 있지만, 쓴맛이 특히 강하게 발현되는 단점이 있어 사용에 제한을 가지고 있다.
현재까지 스테비아의 감미질 개선 방법으로는 크게 3가지가 있는데, (1)당질 감미료나 아미노산 혹은 아미노산 염과 배합하는 방법과 (2)싸이클로덱스트린과 같이 물질로 포접시키는 물리적 방법과 (3)효소를 이용한 당전이 방법이 알려져 있다. 효소를 이용한 당전이 방법은 CGTase를 이용하여 스테비올 배당체에 포도당(1-12개)을 전이시키는 방법이 현재 널리 사용된다(한국특허출원 제10-1991-0020769호). 하지만, 스테비올 배당체에 전이된 포도당구조가 α-(1,4)로 장내 미생물에 의해 모두 분해되어, 칼로리를 상승시키는 결과를 초래한다는 단점이 있다.
일반 유산균은 β-글루코시다제를 스테비올 배당체와 반응시켰을 때 루부소사이드를 생산한다고 알려져 있다(한국등록특허 제10-17676060000호). 또한, 스테비올 배당체를 인식하여 당전이 스테비올배당체를 만드는 유산균은 특정 유전체인 Lactbacillus reuteri 180뿐으로 알려져 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali)가 포도당을 스테비올 배당체에 α-(1,6)결합으로 당전이시켜 난소화성 포도당전이 스테비올 배당체를 생성함을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은, 락토바실러스 말리(Lactobacillius mali) 미생물, 또는 이의 배양물을 이용한, 포도당전이 스테비올 배당체 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은, 상기 제조방법으로 제조된 포도당전이 스테비올 배당체를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은, 락토바실러스 말리(Lactobacillius mali) 미생물, 또는 이의 배양물을 포함하는, 포도당전이 스테비올 배당체 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은, 락토바실러스 말리(Lactobacillius mali) 미생물, 또는 이의 배양물을 이용하여, 포도당전이 스테비올 배당체 제조방법으로 제조된 포도당전이 스테비올 배당체를 포함하는, 감미료를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, 락토바실러스 말리(Lactobacillius mali) 미생물, 또는 이의 배양물을 갖는 효소를 이용한, 포도당전이 스테비올 배당체 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원에서의 용어 "스테비올 배당체"는 천연 감미료의 하나로서, 화학식 1(스테비올)의 13번, 19번-OH에 포도당, 람노스, 자일로스 등이 결합한 형태를 가진다.
[화학식 1]
일반적으로는 화학식 1에서 R1에는 수소(H)가 결합되어 있거나, 포도당(Glucose)이 β결합으로 1개 내지 3개 결합되어 있을 수 있으며, R2에는 포도당(Glucose) 내지 자일로스(Xylose) 내지 람노스(Rhamnose)가 β결합으로 1개 결합하고 여기에 포도당(Glucose)가 β결합으로 0개 내지 2개 결합되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 스테비올 배당체는 설탕에 비하여 저칼로리이며, 감미도는 설탕의 약 200-300배를 갖는 장점이 있으나, 독특한 떫은맛이나 쓴맛을 수반하는 단점이 있어, 감미질을 개선하는 노력이 있어 왔다.
α-/β- 글리코시드 결합은 아노머릭 위치(Anomeric position)와 단당의 1번탄소에서 가장 멀리 떨어여 있는 입체중심(Stereocenter)의 상대적 입체화학(Steriochemistry, R형 또는 S형)에 의해 구분된다. 일반적으로 두 개의 탄소가 동일한 입체 화학을 가지고있을 때 α-글리코시드 결합이 형성되는 반면, 두 개의 탄소가 다른 입체 화학을 가질 때 β-글리코시드 결합이 발생한다.
본 발명자들은 락토바실러스 말리(Lactobacillius mali) 미생물, 또는 이의 배양물이 설탕과 스테비올 배당체를 기질로 하여 설탕을 포도당으로 분해 및 스테비올 배당체에 선택적으로 1개 내지 4개의 포도당을 α-결합으로 연결시킨다는 것을 최초로 규명하였으며, 본 출원의 락토바실러스 말리 유래 효소가 포도당전이 스테비올 배당체의 우수한 전환율을 가지며 기존의 스테비올 배당체에 비하여 이미 이취가 감소하고, 감미질이 크게 향상되는 장점이 있음을 최초로 규명하였다.
본 출원에서의 용어 "포도당전이 스테비올 배당체"는 설탕과 스테비올 배당체를 기질로 하여, 락토바실러스 말리에 의해 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 α-결합을 통해 포도당이 1개 내지 4개가 부가된 형태일 수 있고, 보다 구체적으로는 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 결합된 포도당에 α-(1,6) 결합을 통해 포도당이 1개 내지 4개가 부가된 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 포도당전이 스테비올 배당체 제조방법의 각 단계에 대하여 구체적으로 설명하면, 우선, 락토바실러스 말리(Lactobacillius mali) 미생물, 또는 이의 배양물을 준비하는 것일 수 있다.
상기 포도당전이 스테비올 배당체 제조방법의 다음 단계는 락토바실러스 말리(Lactobacillius mali) 미생물, 또는 이의 배양물 존재하에, 설탕과 스테비올 배당체를 반응시키는 것이다.
본 출원의 목적상 상기 배양물은 균체를 포함하는 배양액 또는 균체를 제외한 조효소액을 의미하는 것으로 설탕 가수분해 활성을 갖는 효소는 설탕을 포도당으로 분해하거나 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 결합된 포도당에 선택적으로 1개 내지 4개의 포도당을 α-결합하는 역할을 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 스테비올 배당체는 스테비오사이드, 루부소사이드, 둘코사이드 A, 리바우디오사이드 A, 리바우디오사이드 C, 리바우디오사이드D, 리바우디오사이드 E, 리바우디오사이드 F, 및 리바우디오사이드 M으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 상기 설탕과 스테비올 배당체를 반응시키는 단계는, pH 1 내지 10 에서 수행될 수 있으며, 보다 구체적으로 pH 2 내지 9 또는 pH 3 내지 8 에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 상기 설탕과 스테비올 배당체를 반응시키는 단계는, 1 내지 80 ℃에서 수행될 수 있으며, 보다 구체적으로 5 내지 70 ℃, 10 내지 60 ℃ 또는 25 내지 50℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 포도당전이 스테비올 배당체 전환 특성을 갖는 락토바실러스 말리는, 스테비올 배당체로부터 포도당전이 스테비올 배당체로의 전환율이 공지된 효소를 포함하는 다른 미생물에 비하여 높은 것을 특징으로 한다. 본 출원의 포도당전이 스테비올 배당체로의 전환율은 40 내지 90 %일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 보다 구체적으로, 상기 전환율은 40 내지 90 %, 50 내지 80 %, 50 내지 85 %, 60 내지 85 %, 60 내지 80 %, 70 내지 85% 또는 70 내지 80% 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
더욱 구체적으로 상기 전환율은 포도당전이 스테비올 배당체 전환 특성을 갖는 락토바실러스 말리를 30℃, 24시간 내지 48시간 동안 배양한 배양액을 4000내지 8000 rpm에서 1 내지 20분 동안 원심분리하여 균체를 분리하여 조효소액을 스테비올 배당체 및 설탕를 포함하는 기질용액에 반응하는 경우를 조건으로하여 수행하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는, 상기 제조방법으로 제조된, 포도당전이 스테비올 배당체를 제공하는 것이다. 상기 포도당전이 스테비올 배당체는, 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 α-결합을 통해 포도당이 1개 내지 4개가 부가된 형태일 수 있고, 보다 구체적으로는 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 α-(1,6) 결합을 통해 포도당이 1개 내지 4개가 부가된 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
더욱 구체적으로, 상기 방법으로 제조된 포도당전이 스테비올 배당체는 포도당전이 스테비오사이드, 포도당전이 루부소사이드, 포도당전이 둘코사이드 A, 포도당전이 리바우디오사이드 A, 포도당전이 리바우디오사이드 C, 포도당전이 리바우디오사이드 D, 포도당전이 리바우디오사이드 E, 포도당전이 리바우디오사이드 F, 및 포도당전이 리바우디오사이드 M으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는, 락토바실러스 말리 미생물, 또는 이의 배양물을 포함하는, 포도당전이 스테비올 배당체 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는, 락토바실러스 말리(Lactobacillius mali) 미생물, 또는 이의 배양물을 포함하는, 포도당전이 스테비올 배당체 제조방법으로 제조된 포도당전이 스테비올 배당체를 포함하는 감미료를 제공하는 것이다. 본 출원의 목적상 상기 감미료는 이미 이취가 감소되고 감미질이 향상된 것을 특징으로 한다.
본 출원의 다른 하나의 양태는, 락토바실러스 말리(Lactobacillius mali) 미생물, 또는 이의 배양물을 이용하여, 포도당전이 스테비올 배당체를 제조하는 단계를 포함하는, 감미료의 감미질 개선방법을 제공하는 것이다.
본 출원에 따른 포도당전이 스테비올 배당체 제조방법은, 락토바실러스 말리 미생물, 또는 이의 배양물을 이용한 것으로서, 포도당전이 스테비올 배당체를 특이적으로 생산할 수 있다. 또한 상기 락토바실러스 말리 미생물 또는 이의 배양물은, 공지된 다른 미생물 및 이의 배양물에 비하여, 스테비올 배당체로부터 포도당전이 스테비올 배당체로의 전환율이 높으므로, 매우 효율적으로 포도당전이 스테비올 배당체를 생산할 수 있다. 본 출원에 따른 포도당전이 스테비올 배당체는, 스테비올 배당체의 쓴맛이 개선된 고감미료 소재이며, 공지된 포도당전이 스테비올 배당체에 비하여 칼로리가 높지 않으므로, 다양한 분야에 활용될 수 있다.
도 1 내지 9는, 락토바실러스 말리 균주의 조효소액을 이용하여 제조된 포도당전이 스테비올 배당체의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 10 내지 16은, 락토바실러스 말리 균주의 조효소액을 이용하여 제조된 포도당전이 스테비올 배당체의 HPLC/MS 결과를 나타낸 것이다.
도 17은, 온도에 따른 포도당전이 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A) 전환율을 나타낸 그래프이다.
도 18은, pH에 따른 포도당전이 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A) 합성 전환율을 나타낸 그래프이다.
도 19는 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A) 농도에 따른 포도당전이 스테비올 배당체 합성 전환율을 나타낸 그래프이다.
도 10 내지 16은, 락토바실러스 말리 균주의 조효소액을 이용하여 제조된 포도당전이 스테비올 배당체의 HPLC/MS 결과를 나타낸 것이다.
도 17은, 온도에 따른 포도당전이 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A) 전환율을 나타낸 그래프이다.
도 18은, pH에 따른 포도당전이 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A) 합성 전환율을 나타낸 그래프이다.
도 19는 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A) 농도에 따른 포도당전이 스테비올 배당체 합성 전환율을 나타낸 그래프이다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 락토바실러스 말리 유래의 설탕 가수분해 활성을 갖는 신규 효소의 제조 방법
설탕(백설 하얀설탕 순도 99% 이상)을 탄소원, 효모추출물 및 옥수수 침지액(Corn Steep Liquor)를 질소원, 아미노산 등을 함유한 영양 배지에 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali DSM20444, ATCC 27054, ATCC 27304)미생물을 30℃, 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 8000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 균체와 상등액을 분리한 후 상등액만 취하였다. 조효소액을 설탕과 반응하여 설탕 가수분해 활성을 확인하여, 상기 조효소액 내에 설탕 가수분해 활성을 갖는 신규 효소가 존재함을 확인하였다.
실시예 2: 스테비올 배당체로부터 포도당전이 스테비올 배당체로의 전환 평가
스테비올 배당체, 설탕을 0.05M 아세테트 완충용액에 용해한 후 실시예 1에서 준비한 락토바실러스 말리 균주의 조효소액을 첨가하여 40℃에서 24시간동안 반응시켰다. 반응 후 100℃에서 실활시킨 후 포도당전이 스테비올 배당체의 생산 여부를 HPLC로 확인하였다. 사용된 스테비올 배당체는 스테비오사이드, 루부소사이드, 둘코사이드 A, 리바우디오사이드 A/C/D/E/F/M로 포도당전이 스테비오사이드, 포도당전이 루부소사이드, 포도당전이 둘코사이드 A, 포도당전이 리바우디오사이드 A/C/D/E/F/M을 생성하는지 HPLC로 확인하였다. 구체적으로, 도 1 내지 도 9를 토대로 락토바실러스 말리 균주의 조효소액과 스테비올 배당체의 반응으로 새롭게 생성된 물질을 확인하기 위하여 HPLC/MS 분석을 시행하여 이들이 당전이 스테비올 배당체임을 확인하였다. HPLC/MS 분석을 시행한 스테비올 배당체는 스테비오사이드, 리바우디오사이드 A/C/D/E/F/M, 루부소사이드, 둘코사이드 A 이다.
도 10 내지 16는, 락토바실러스 말리 균주의 조효소액을 이용하여 제조된 포도당전이 스테비올 배당체의 HPLC/MS 결과를 나타낸 것이다. 도 10 내지 16를 통하여, 락토바실러스 말리 균주의 조효소액을 이용하여 제조된 포도당전이 스테비올 배당체는 포도당이 1-4개까지 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A/C/E/F, 루부소사이드, 둘코사이드 A)에 전이된 것임을 확인하였다.
실시예 3: 포도당전이 스테비올 배당체 합성에 대한 온도의 영향성
락토바실러스 말리 균주의 조효소액을 의한 포도당전이 스테비올 배당체 생산에 있어서, 온도의 영향성을 평가하였다. 설탕과 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A)을 0.05M 아세트산 완충용액(pH5.0)에 용해한 후, 상기 조효소액을 첨가하여 10 내지 80℃에서 24시간 반응하였다. 반응이 완료된 후, 용액 내 포도당전이 스테비올 배당체 양을 HPLC를 이용하여 분석하였다.
도 17은, 온도에 따른 포도당전이 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A) 전환율을 나타낸 그래프이다. 도 17을 참고하면, 락토바실러스 말리 균주의 조효소액에 의한 포도당전이 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A) 전환율은 10 내지 50 ℃에서 10 내지 80%의 높은 수준을 나타내었다.
실시예 4: 포도당전이 스테비올 배당체 합성에 대한 pH의 영향성
락토바실러스 말리 균주의 조효소액에 의한 포도당전이 스테비올 배당체 생산에 있어서, pH 의 영향성을 평가하였다. 설탕과 스테비올 배당체을 0.05M 아세트산 완충용액(pH 2.0-5.0), 인산염 완충 용액(pH 6.0), 트리스 완충용액(pH 7.0-8.0), 탄산수소나트륨 완충용액(pH 9.0)에 용해한 후, 상기 조효소액을 첨가하여 pH 2에서 pH 9의 범위에서 24시간 반응하였다. 반응이 완료된 후, 포도당전이 스테비올 배당체의 양을 HPLC를 이용하여 분석하였다.
도 18은, pH에 따른 포도당당전이 스테비올 배당체 합성 전환율을 나타낸 그래프이다. 도 18을 참고하면, 락토바실러스 말리 균주의 조효소액에 의한 포도당전이 스테비올 배당체 전환율은 pH 4 내지 7에서 높은 수준을 나타내었으며, 특히 pH 5.0에서 약 90%의 전환율을 나타내었다.
실시예 5: 스테비올 배당체 농도에 따른 포도당전이 스테비올 배당체 분석
락토바실러스 말리 조효소액에 의한 스테비올 배당체 농도에 따른 포도당전이 스테비올 배당체 생산을 평가하였다. 설탕과 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A)를 아세트산 완충용액(pH 5.0)에 용해시켜 40℃에서 24시간 반응하였다. 반응이 완료된 후, 포도당전이 스테비올 배당체의 생성을 HPLC를 이용하여 분석하였다.
도 18은, 스테비올 배당체 농도에 따른 포도당전이 스테비올 배당체 합성 전환율을 나타낸 그래프이다. 그 결과, 락토바실러스 말리 조효소액에 의한 포도당전이 스테비올 배당체 전환율은 0%(w/w) 내지 40%(w/w)에서 높은 수준을 나타내었으며, 특히 6%(w/w) 에서 가장 높게 나타냄을 확인하였다.
도 18은, 리바우디오 A 농도에 따른 락토바실러스 말리 조효소액에 의한 포도당전이 리바우디오사이드 A 전환율은 0%(w/w) 내지 32%(w/w)에서 높은 수준을 나타내었으며, 특히 6%(w/w) 에서 가장 높게 나타냄을 확인하였다.
실시예 6: 포도당전이 스테비올 배당체 Nuclear Magnetic Resonance (NMR) 분석
설탕과 스테비올 배당체을 아세트산 완충용액(pH5.0)에 용해한 후, 상기 조효소액를 첨가하여 40℃에서 24시간 반응시킨다. 반응용액을 100℃에서 실활시킨후, 0.45㎛ 필터를 이용하여 불순물을 제거하였다. HP20레진을 이용하여 포도당 한 개가 전이된 스테비올 배당체(스테비오사이드, 리바우디오사이드 A)를 각각 순수 분리하였다. 분리된 포도당전이 스테비오사이드와 포도당 전이 리바우디오사이드 A 의 결합 구조를 분석하고자 1H/13C NMR, Homonuclear correlation spectroscopy(COSY), Total correlation spectroscopy (TOCSY), Heteronuclear single-quantum coherence (HSQC), 및 heteronuclear multiple-bond correlation (HMBC)로 확인하고, 그 결과(1H/13C NMR, COSY 그리고 HMBC)를 하기 표 1와 표 2에 나타내었다
또한, 포도당전이 스테비오사이드와 포도당전이 리바우디오사이드 A 구조를 확인한 결과, 포도당전이 스테비오사이드는 13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-βD-glucopyranosyl)oxy]ent-kaur-16-en-19-oic acid 6-O-α-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl ester로, 포도당전이 리바우디오사이드 A는 13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]ent-kaur-16-en-19-oic acid 6-O-α-D- glucopyranose-β-D-glucopyranosyl ester로 신규 화합물임을 확인하였다.
< 포도당전이 스테비오사이드 모식도 >
< 포도당전이 리바우디오사이드 A 모식도 >
No. | δH mult. (J in Hz) | δC mult | HMBC Correlation | COSY corr. | Key ROESY corr. | |
1 | 0.76 br m 1.81 br m |
40.3 | CH2 | 1.37w, 1.78, 1.81 0.76, 1.36 |
|
|
2 | 1.36 br m 1.78 br m |
18.6 | CH2 | 1.78, 1.81 1.36 |
||
3 | 0.99 br t (10.5)2.08 br d (10.5) | 37.5 | CH2 | 40.3, 43.7, 56.9, 56.9 |
1.78, 2.08 0.99 |
|
4 | 43.7 | C | ||||
5 | 1.05 br m | 56.9 | CH | 14.9, 21.3, 27.9, 39.6, 40.8, 43.7, 178.4 | 1.81 | |
6 | 1.81 br m | 21.3 | CH2 | 1.34 | 3.41 | |
7 | 1.34 br m 1.53 br m |
40.8 | CH2 | 41.8, 53.5, 56.9 |
1.53 1.34 |
|
8 | 41.8 | C | ||||
9 | 0.89 br d (5.5) | 53.5 | CH | 14.9, 20.3, 36.0, 39.6, 41.8, 44.1, 46.9 | 1.54 | |
10 | 39.6 | C | ||||
11 | 1.54 br m 1.75 br d (10.5) |
20.3 | CH2 | 41.8, 86.8 |
1.75, 1.89 1.54, 1.89w |
|
12 | 1.46 br m1.89 br m | 36.0 | CH2 | 1.54, 1.89 1.46, 1.54, 1.75 |
||
13 | 86.8 | C | ||||
14 | 1.40 br d (10.5) 2.12 br m |
44.1 | CH2 | 36.0, 41.8, 53.5, 86.8 46.9, 86.8 |
2.12 1.40, 1.94 |
|
15 | 1.94 br d (16.0) 2.13 br d (16.0) |
46.9 | CH2 | 44.1, 53.5, 86.8 53.5, 152.9 |
2.13 1.94, 2.12 |
|
16 | 152.9 | C | ||||
17 | 4.84 br s 5.09 br s |
104.9 | CH2 | 46.9, 86.8, 152.9 46.9, 86.8, 152.9 |
2.13 2.13, 1.94 |
|
18 | 1.17 s | 27.9 | CH3 | 37.5, 43.7, 56.9, 178.4 | 3.23, 3.25, 3.41, 3.58, 3.63 | |
19 | 178.4 | C | ||||
20 | 0.83 s | 14.9 | CH3 | 39.6, 40.3, 53.5, 56.9 | 3.23, 3.25, 3.41, 3.63 | |
1’ | 5.35 d (8.0) | 94.1 | CH | 75.5, 178.4 | 3.41 | 3.41, 3.46, 3.66 |
2’ | 3.41 br m | 71.8 | CH | 76.3, 94.1 | 3.46, 5.35 | |
3’ | 3.46 br m | 76.3 | CH | 68.9, 71.8 | 3.41, 3.48 | |
4’ | 3.48 br m | 68.9 | CH | 65.1, 75.2, 76.3 | 3.46, 3.66 | |
5’ | 3.66 br m | 75.2 | CH | 3.48, 3.64 | ||
6’ | 3.64 br m 3.87 br d (10.0) |
65.1 | CH2 |
97.7
97.7 |
3.87 3.64 |
|
1’‘ | 4.64 br d (7.5) | 95.8 | CH | 76.0, 86.8 | 3.46 | 3.26, 3.46, 3.58 |
2’‘ | 3.46 br m | 80.5 | CH | 76.2, 95.8, 103.1 | 4.64, 3.58 | |
3’‘ | 3.58 br m | 76.2 | CH | 69.4, 80.5, 95.8 | 3.33, 3.46 | 3.26 |
4’‘ | 3.33 br m | 69.4 | CH | 3.26, 3.58 | ||
5’‘ | 3.26 br m | 75.6 | CH | 3.33, 3.62 | 3.58 | |
6’‘ | 3.62 br m 3.76 br d (11.5) |
60.6 | CH2 | 69.4 |
3.26, 3.76 3.62 |
|
1’’‘ | 4.62 d (8.0) | 103.1 | CH | 76,0, 80.5 | 3.23 | 3.23, 3.32, 3.41, 3.46 |
2’’‘ | 3.23 t (8.0) | 74.2 | CH | 75.7, 103.1 | 3.41, 4.62 | |
3’’‘ | 3.41 br m | 75.7 | CH | 3.23, 3.25 | ||
4’’‘ | 3.25 br m | 69.7 | CH | 61.1, 75.7, 76.3 | 3.32, 3.41 | |
5’’‘ | 3.32 br m | 76.3 | CH | 61.1, 69.7 | 3.25, 3.58 | |
6’’‘ | 3.58 br m* 3.78 br d (11.5) |
61.1 | CH2 | 76.3 69.7, 76.3 |
3.32, 3.78 3.58 |
|
1’’‘’ | 4.83 br d (3.5) | 97.7 | CH | 65.1 , 71.7, 73.1 | 3.45 | 3.45, 3.64 |
2’’‘’ | 3.45 br m | 71.4 | CH | 73.1 | 3.63, 4.83 | |
3’’’’ | 3.63 br t (9.0) | 73.1 | CH | 69.3, 71.4 | 3.34, 3.45 | |
4’’’’ | 3.34 t (9.0) | 69.3 | CH | 60.3, 71.7, 73.1 | 3.58, 3.63 | |
5’’’’ | 3.58 br m | 71.7 | CH | 3.34, 3.67 | ||
6’’’’ | 3.67 br m* 3.71 br d (11.5) |
60.3 | CH2 | 71.7, 69.3 |
3.58, 3.71 3.67 |
No. | δH mult. (J in Hz) | δC mult | HMBC Correlation | COSY corr. | Key ROESY corr. | |
1 | 0.76 br m 1.81 br m |
40.3 | CH2 | 15.0 | 1.37w, 1.78, 1.81 1.37 |
|
2 | 1.37 br m 1.78 br m |
18.7 | CH2 | 1.78 1.37 |
||
3 | 0.99 br m2.08 br m | 37.6 | CH2 | 40.3, 56.9 |
1.78, 2.08 0.99 |
|
4 | 43.8 | C | ||||
5 | 1.05 br m | 56.9 | CH | 15.0, 21.4, 28.0, 39.3, 40.9, 43.8, 178.4 | 1.81 | |
6 | 1.81 br m | 21.4 | CH2 | 1.35 | 3.40 | |
7 | 1.35 br m 1.53 br m |
40.9 | CH2 | 56.9 |
1.53 1.35, 1.81w |
|
8 | 42.0 | C | ||||
9 | 0.89 br s | 53.5 | CH | 15.0, 20.3, 36.3, 39.3, 42.0, 44.0, 47.1 | 1.54 | |
10 | 39.3 | C | ||||
11 | 1.54 br m1.75 br m | 20.3 | CH2 | 42.0, 53.5, 87.1 87.3 |
1.75, 1.89 1.54, 1.89w |
|
12 | 1.46 br m1.89 br m | 36.3 | CH2 | 1.89 1.46, 1.75 |
||
13 | 87.1 | C | ||||
14 | 1.43 br m 2.09 br m | 44.0 | 36.3, 42.0, 53.5, 87.1, 47.1, 87.1, 152.9 |
2.09 1.43 |
||
15 | 1.95 br d (16.0)2.14 br d (16.0) | 47.1 | CH2 | 44.0 53.5, 152.9 |
2.14 1.95, 2.09 |
|
16 | 152.9 | C | ||||
17 | 4.85 br s 5.08 br s | 104.8 | CH2 | 47.1, 87.1, 152.9 47.1, 87.1, 152.9 |
2.14 2.14, 1.95 |
|
18 | 1.17 s | 28.0 | CH3 | 37.6, 43.8, 56.9, 178.4 | 1.81, 3.40 | |
19 | 178.4 | C | ||||
20 | 0.83 s | 15.0 | CH3 | 39.3, 40.3, 53.5, 56.9 | 3.17, 3.41, 5.37 | |
1’ | 5.37 d (8.0) | 94.1 | CH | 75.2, 178.4 | 3.40 | 3.40, 3.47, 3.66 |
2’ | 3.40 br m | 71.9 | CH | 76.3, 94.1 | 3.47, 5.37 | 1.17, 1.81 |
3’ | 3.47 br m | 76.3 | CH | 68.9, 71.9, | 3.40 | |
4’ | 3.48 br m | 68.9 | CH | 65.2, 75.2, 76.3 | 3.66 | |
5’ | 3.66 br m | 75.2 | CH | 3.48, 3.64 | ||
6’ | 3.64 br m3.87 br m* | 65.2 | CH2 |
97.8
97.8 |
3.87 3.64 |
4.83 |
1’‘ | 4.66 ovlp solv. | 95.9 | CH | 75.2, 87.1 | 3.65 | |
2’‘ | 3.65 br m | 78.6 | CH | 85.1, 95.9, 102.11 | 4.66 | |
3’‘ | 3.80 br m | 85.1 | CH | 68.5, 78.6, 102.20 | 3.42 | 3.30, 3.70, |
4’‘ | 3.42 br m | 68.5 | CH | 60.8, 75.2, 85.1 | 3.29~3.33,3.80 | |
5’‘ | 3.30 br m | 75.2 | CH | 3.64 | 3.80 | |
6’‘ | 3.64 br m3.78 br m | 60.8 | CH2 | 3.30, 3.78 3.64 |
||
1’’‘ | 4.77 br d (8.0) | 102.1 | CH | 75,9, 76.5, 78.6 | 3.17 | 3.31, 3.37, 3.65 |
2’’‘ | 3.17 br m | 74.1 | CH | 75.9, 120.1 | 3.37, 4.77 | 1.46, 2.09 |
3’’‘ | 3.37 br m | 75.9 | CH | 70.2, 74.1 | 3.17 | |
4’’‘ | 3.18 br m | 70.3 | CH | 61.5, 75.9, 76.5 | 3.31 | |
5’’‘ | 3.31 br m | 76.5 | CH | 61.5 | 3.18, 3.55 | |
6’’‘ | 3.55 br m*3.80 br m* | 61.5 | CH2 | 76.5 | 3.80 3.55 |
|
1’’’’ | 4.70 ovlp solv. | 102.2 | CH | 75.8, 76.1, 85.1 , | 3.29 | |
2’’’’ | 3.29 br m | 73.3 | CH | 75.8, 102.2 | 3.42, 4.70 | |
3’’’’ | 3.42 br m | 75.8 | CH | 69.5, 73.3 | 3.29~3.33 | |
4’’’’ | 3.33 br m | 69.5 | CH | 61.6, 75.8, 76.1 | 3.42 | |
5’’’’ | 3.41 br m | 76.1 | CH | 3.63 | ||
6’’’’ | 3.63 br m3.83 br d (12.0) | 60.6 | CH2 | 76.3 69.5 |
3.41, 3.83 3.63 |
|
1’’‘’‘ | 4.83 br d (3.0) | 97.8 | CH | 65.2 , 71.7, 73.1 | 3.45 | 3.45, 3.64 |
2’’‘’‘ | 3.45 br m | 71.4 | CH | 97.8, | 3.63, 4.83 | |
3’’’’‘ | 3.63 br m | 73.1 | CH | 69.3, 71.4 | 3.34, 3.45 | |
4’’’’‘ | 3.34 br m | 69.3 | CH | 60.3, 71.7, 73.1 | 3.59, 3.63 | |
5’’’’‘ | 3.59 br m | 71.7 | CH | 3.34, 3.68 | ||
6’’’’‘ | 3.68 br m* 3.71 br d (12.0) |
60.3 | CH2 | 71.7, 69.3 |
3.59, 3.71 3.68 |
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (10)
- 락토바실러스 말리(Lactobacillius mali) 미생물 또는 이의 배양물을 이용한, 포도당전이 스테비올 배당체 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 방법은, 상기 락토바실러스 말리 미생물 또는 이의 배양물 존재하에, 설탕과 스테비올 배당체를 반응시키는 단계를 포함하는, 포도당전이 스테비올 배당체 제조방법.
- 제2항에 있어서,
상기 스테비올 배당체는 스테비오사이드, 루부소사이드, 둘코사이드 A, 리바우디오사이드 A, 리바우디오사이드 C, 리바우디오사이드D, 리바우디오사이드 E, 리바우디오사이드 F, 및 리바우디오사이드 M으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 포도당전이 스테비올 배당체 제조방법.
- 제2항에 있어서,
상기 설탕과 스테비올 배당체를 반응시키는 단계는, pH 3 내지 8 및 10 내지 60 ℃에서 수행되는, 포도당전이 스테비올 배당체 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 포도당전이 스테비올 배당체는, 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 결합된 포도당을 통해 포도당이 α-(1,6) 결합에 의해 연결되어 부가된 스테비올 배당체인, 포도당전이 스테비올 배당체 제조방법.
- 제5항에 있어서,
상기 포도당전이 스테비올 배당체는, 포도당을 1 내지 4개 포함하는, 포도당전이 스테비올 배당체 제조방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된, 포도당전이 스테비올 배당체.
- 제7항에 있어서,
상기 포도당전이 스테비올 배당체는, 포도당전이 스테비오사이드, 포도당전이 루부소사이드, 포도당전이 둘코사이드 A, 포도당전이 리바우디오사이드 A, 포도당전이 리바우디오사이드 C, 포도당전이 리바우디오사이드D, 포도당전이 리바우디오사이드 E, 포도당전이 리바우디오사이드 F, 및 포도당전이 리바우디오사이드 M으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 포도당전이 스테비올 배당체.
- 락토바실러스 말리(Lactobacillius mali) 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는, 포도당전이 스테비올 배당체 생산용 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 포도당전이 스테비올 배당체를 포함하는, 감미료.
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