WO2013019050A2 - 신규한 α-글루코실 스테비오사이드 및 이의 제조 방법 - Google Patents

신규한 α-글루코실 스테비오사이드 및 이의 제조 방법 Download PDF

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WO2013019050A2
WO2013019050A2 PCT/KR2012/006070 KR2012006070W WO2013019050A2 WO 2013019050 A2 WO2013019050 A2 WO 2013019050A2 KR 2012006070 W KR2012006070 W KR 2012006070W WO 2013019050 A2 WO2013019050 A2 WO 2013019050A2
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WO
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stevioside
microorganism
glucosyl
leuconostoc
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PCT/KR2012/006070
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이우송
김영민
노문철
류영배
박수진
김중수
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한국생명공학연구원
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/30—Artificial sweetening agents
    • A23L27/33—Artificial sweetening agents containing sugars or derivatives
    • A23L27/36—Terpene glycosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin

Definitions

  • the present invention relates to a novel ⁇ -glucosyl stevioside and a method for preparing the same, and more particularly, ⁇ -glucosyl stevioside in which glucose is added to the 19-OH position of stevioside by being linked by an alpha-glycosidic bond.
  • a sweetener composition, a food composition containing the ⁇ -glucosyl stevioside as a sweetener, and a stevioside-containing plant characterized in that it comprises a step of treating a glucan sucrase or a microorganism producing the stevioside-containing plant or food; It relates to a method for improving sweetness of food.
  • Sugar has been widely used as a sweetener for food.
  • a large amount of sugar is used in soft drinks such as canned coffee and soft drinks such as carbonated drinks.
  • soft drinks such as canned coffee
  • soft drinks such as carbonated drinks.
  • a tendency to reduce the amount of sugar that causes obesity, diabetes, tooth decay, or to use a high sweetness sweetener instead of sugar is affected by the goal of health or low calorie.
  • Such high sweetness sweeteners typically include cyclamate, saccharin, aspartame, sucralose, neotame and acesulfame potassium.
  • sweeteners are known, their use in general foods has been banned or their use has been tightened in view of their stability. Therefore, there is an urgent need for the development of natural sweeteners that can replace them.
  • Stevioside is low calorie compared to sugar, and its sweetness is about 200-300 times higher than that of sugar.
  • Stevioside is a sweetener derived from Stevia rebaudiana BERTONI, a perennial herb, native to South America Paraguay, and consists of Stevioside, Rebaudioside A, B, C, D, and E.
  • Glucose is a beta glucosyl glycoside in the isosteviol skeleton.
  • Stevioside is currently used as a sweetener in soju and pickled foods.
  • Stevioside has a higher sweetness than sugar, but has a poor finish, such as a slower sweetness and a long aftertaste. There is this.
  • stevioside has a drawback that is accompanied by a unique astringent or bitter taste in the aftertaste, apart from sweetness, and has a disadvantage in that it is used for coffee drinks, soft drinks, and alcoholic beverages. Therefore, there is a problem in that the amount and use of the limit occurs, there have been efforts to improve the quality of steviosides.
  • Conventional methods for improving sweetening of stevioside include (1) adding one or more natural sugar sweeteners such as sugar, glucose, fructose, and the like, (2) combining with amino acids or amino acid salts, and (3) cyclodextrins. There is known a method of physically binding to a cyclic saccharide having inclusion ability. However, the above method requires the use of a considerable amount of additives, which in turn loses the character of stevioside as a low calorie sweetener.
  • a "rebaudioside A” analog which is a material having excellent sweetness and sweetness by using a bioconversion transfer technology.
  • This can be divided into three types according to the specific sugar transfer position of the enzyme and the microorganism used.
  • the first is to use enzymes capable of transferring sugar to the stevioside 13-OH moiety, typically ⁇ -glucosidase, pullulanase, galactosidase, dextrin-dextranase, ⁇ -1,4-galactosyl transferase, or Gibberlla fuiikuroi as a microbial resource. Actinomycete .
  • fructofuranosidase is used as a method of using a sugar-transferase enzyme in the stevioside 19-OH portion, and thirdly, an enzyme capable of sugar transfer to both 13-OH and 19-OH is used.
  • a method of causing genetic modification to a plant containing a large amount of rebaudioside A by irradiating gamma ray to a stevia plant has been reported.
  • Enzymatically treated steviosides with 1-12 glucose added randomly to the 13-OH or 19-OH sites of steviosides using CGTase are currently commercially available.
  • sweetening is performed using glucan sucrase derived from two microorganisms ( Leuconostoc citreum KM20 or L. lactics ).
  • glucan sucrase derived from two microorganisms
  • ST-G rebaudioside E analog
  • Still another object of the present invention is to provide a method of preparing the ⁇ -glucosyl stevioside.
  • Another object of the present invention is to provide an ⁇ -glucosylated composition of steviosides containing sucrose and glucan sucrase or microorganisms producing the same.
  • Still another object of the present invention is to provide a sweetener composition containing the ⁇ -glucosyl stevioside as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a food composition containing the ⁇ -glucosyl stevioside as a sweetener.
  • a novel ⁇ -glucosyl stevioside in which only one glucose is added to the 19-OH position is produced in a high yield of 95% or more. It is possible to be usefully used for food additives and food and cosmetics, pharmaceutical industry, including the same, so that sweetness is improved to give a sweet taste.
  • 1 is a thin-film chromatogram showing the analysis of glucosyl steviosides produced by the sugar transfer reaction of glucan sucrase.
  • Figure 2 is a high performance liquid chromatogram of the reaction product produced by the sugar transfer reaction of glucosyl stevioside.
  • the present invention provides ⁇ -glucosyl stevioside to which glucose is linked by alpha-glycosidic linkage at the 19-OH position of stevioside.
  • ⁇ -glucosyl stevioside in the present invention means a sugar transition stevioside in which one glucose is optionally linked to stevioside via an alpha-glycosidic bond.
  • the present invention is characterized by using glucan sucrase or a microorganism producing the same to prepare the ⁇ -glucosyl stevioside.
  • the ⁇ -glucosyl stevioside of the present invention is a glucose through an alpha-glycosidic bond to OH at the 19 carbon position of stevioside by the glucans sucrase or a microorganism producing the stevioside as a substrate.
  • May be added form more preferably one glucose added to the OH of the 19 carbon position of stevioside by alpha-1,3 or alpha-1,6 glycosidic bond, most preferably Are alpha-1,6 glucosyl steviosides and alpha-1,3 glucosyl steviosides represented by the following formulas (1) and (2), respectively.
  • Alpha-1,3 or alpha-1,6 glucosyl steviosides according to the present invention have significantly improved sweetness compared to conventional beta glucosyl steviosides and alpha-1,4 glucosyl steviosides. Genie was able to remedy the poor finish of the so-called sweetness, such as aftertaste sweetness remained relatively long.
  • the present invention provides a method for preparing the ⁇ -glucosyl stevioside.
  • the method for producing ⁇ -glucosyl stevioside according to the present invention includes treating glucan sucrase or a microorganism producing the same in stevioside.
  • Sucrose used as stevioside and a sugar donor can be used without limitation what is being synthesized or sold commercially.
  • the glucan sucrase or a microorganism producing the same may be used to recover and purify only the glucan sucrase produced by culturing the microorganism producing the glucan sucrase described above, or the cultured microorganism may be used directly. .
  • the medium and culture conditions for culturing the microorganism producing the glucan sucrase according to the present invention can be appropriately selected and used depending on the host cell.
  • the nutrient medium preferably contains a carbon source inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of host cells.
  • the carbon source include glucose, dextran, soluble starch, sucrose and the like.
  • inorganic or organic nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn steep liquer, peptone, casein, bovine extract, soybean white, and potato extract.
  • nutrients such as sodium chloride, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, inorganic salts such as magnesium chloride, vitamins, and antibiotics (tetracycline, neomasin, ampicillin, and kanamycin) may be included.
  • conditions such as temperature, pH of the medium, and incubation time may be appropriately adjusted to be suitable for growing cells and mass production of proteins.
  • the weight ratio of stevioside to sucrose is preferably 20: 1 to 1: 1, more preferably, the weight ratio of stevioside to sucrose is 2: 1 to 1: 1.
  • the addition amount of glucan sucrase is 0.2-1.0 U per mg of maltotriose.
  • glucan sucrase can be used in the form of glass or immobilized as necessary. Immobilization of glucan sucrase can be carried out by a method known in the art such as base bonding, cross linking, encapsulation or encapsulation.
  • the crosslinking may be carried out using, for example, glutaraldehyde
  • the base bonding may be carried out by adsorption bonding or covalent bonding
  • the encapsulation may use a semipermeable membrane in the form of a gel, microcapsules or fibers.
  • the reaction temperature is 20 ° C to 50 ° C, preferably 30 ° C
  • the pH range is 4.5 to 6.0
  • the reaction time is 12 hours to 120 hours, preferably 12 hours to 20 hours.
  • glucans sucrase in the present invention is an enzyme that catalyzes the synthesis of D-glucose multimers called glucans from sucrose, and in the present invention alpha- at the 19-OH position of stevioside. It means an enzyme that can add one glucose through glycosidic bonds.
  • the glucans sucrase of the present invention includes, without limitation, natural or recombinant proteins capable of adding one glucose via alpha-glycosidic linkage at the 19-OH position of stevioside.
  • glucan sucrase has glucose units in the main chain from sucrose to ⁇ - (1-2), ⁇ - (1-3), ⁇ - (1-4), and ⁇ - ( 1-6) is known to form glucans which are homopolymers connected by different bonds.
  • glucan sucrase depending on the type of glucan sucrase, the type, ratio and length of chains bonds also vary. Therefore, although various glucan sucrases have high similarity with each other, various glucans can be synthesized according to the form of glucosidic linkages. Leuconostoc sp.
  • Strain, ie, glucans sucrase expressed by Leuconostoc citreum KM20 or Leuconostoc lactics has stevioside and sucrose as substrates.
  • One glocos can optionally be linked to the 19-OH site of the side by alpha-1,3 or alpha-1,6 glycosidic bonds.
  • the natural or recombinant glucan sucrase of the present invention may be expressed or derived from a strain of Leuconostoc sp., More preferably, Leuconostoc citreum KM20 Or expressed or derived from Leuconostoc lactics .
  • the glucan sucrase of the present invention may be selectively linked to glucose at the 19-OH position of stevioside by using stevioside and sucrose as substrates, and more preferably 19-OH of stevioside. It is possible to connect by adding one glucose through the alpha-glycosidic linkage at the position, and most preferably, one glucose by ⁇ -1,3 or ⁇ -1,6 glycosidic linkage at the 19-OH position of stevioside. have.
  • microorganism producing glucan sucrase refers to a wild type that produces a natural or recombinant glucan sucrase capable of adding one glucose via alpha-glycosidic linkage at the 19-OH position of stevioside.
  • transgenic microorganisms without limitation.
  • Glucan sucrose is known to be produced mainly by lactic acid bacteria such as leukonostock and Streptococcus, and then secreted extracellularly, thereby protecting cells from the external environment by synthesizing the surrounding sucrose substrate into multimers. Therefore, it is possible to directly add stevioside and sucrose to a culture medium for culturing microorganisms expressing glucan sucrase to cause stevioside sugar transfer.
  • the present invention is preferably a wild type microorganism producing glucan sucrase, Leuconostoc sp.
  • Strain can be used directly to the sugar transition, more preferably Leukonostite citreum KM20 ( Leuconostoc citreum KM20) or Leuconostoc lactics strains can be used for direct metastasis.
  • the production method according to the present invention can be used without limitation microorganisms producing glucan sucrase wild type and transformants, the present invention uses a transformant transformed to express the glucan sucrase Can be.
  • transformation in the present invention means that the DNA encoding the glucans sucrase according to the present invention is introduced into a host cell so that the DNA can be replicated as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.
  • transformation methods include CaCl 2 precipitation method, CaCl 2 method, Hanahan method which improves efficiency by using DMSO (dimethyl sulfoxide), electroporation, calcium phosphate precipitation, plasma fusion method, silicon carbide Agitation with fibers, agrobacterial mediated transformation, transformation with PEG, dextran sulfate, lipofectamine and dry / inhibition mediated transformation.
  • CaCl 2 precipitation method CaCl 2 method
  • Hanahan method which improves efficiency by using DMSO (dimethyl sulfoxide)
  • electroporation calcium phosphate precipitation
  • plasma fusion method silicon carbide Agitation with fibers
  • agrobacterial mediated transformation transformation with PEG, dextran sulfate, lipofectamine and dry / inhibition mediated transformation.
  • the host cell used for transformation according to the present invention may be any host cell well known in the art, but the introduction efficiency of the polynucleotide encoding the glucan sucrase of the present invention is excellent.
  • Hosts with high expression efficiency can be used, for example, Escherichia bacteria such as E. coli , Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis , Pseudomonas putida Pseudomonas genus bacteria such as Pseudomonas putida , yeast, animal cells, plant cells and insect cells such as Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe .
  • the production method of the present invention may further comprise the step of recovering only ⁇ -glucosyl stevioside from the reaction product.
  • the reaction product includes additional sugars such as fructose from sucrose and leucrose, another sugar product, it is necessary to recover only ⁇ -glucosyl stevioside from the reaction product. do.
  • Recovery of ⁇ -glucosyl stevioside can be carried out using a membrane filtration method, fractional precipitation method, crystallization method and column chromatography method known in the art without limitation.
  • the salt is removed with a resin such as AW90, and then adsorbed using a porous adsorption resin (Diaion HP-20) to effectively remove incidental sugars, and alcohol (methanol, ethanol, isopropyl alcohol, butanol). Can be separated simply by using a concentration gradient of).
  • the glucosyl stevioside obtained by separation and purification in the above manner can be used as it is in liquid form, or it can be used by concentrating the liquid or drying and powdering as necessary.
  • gluconsucrase derived from Leuconostoc citreum KM20 Leuconostoc citreum KM20
  • Leuconostoc lactics glucose sucrose
  • FIG. 1 gluconsucrase derived from Leuconostoc citreum KM20
  • Leuconostoc citreum KM20 Leuconostoc citreum KM20
  • Leuconostoc lactics glucose sucrose
  • the present invention is sucrose And ⁇ -glucosylated composition of steviosides containing glucan sucrase or a microorganism producing the same as an active ingredient, as another embodiment.
  • the glucans sucrase of the present invention or microorganisms producing the same can be used alone or in combination to produce ⁇ -glucosyl stevioside more effectively, and carriers, excipients or It may be prepared as a composition in admixture with a diluent.
  • Examples of carriers, excipients and diluents that can be used in the ⁇ -glucosylated compositions of steviosides include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin , Calcium phosphate, calcium silicate, calcium carbonate, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.
  • the present invention provides a sweetener composition containing ⁇ -glucosyl stevioside according to the present invention as an active ingredient.
  • novel ⁇ -glucosyl steviosides according to the present invention can be used alone or as needed for one or more other sweetening agents such as glucose, sucrose, conventional steviosides, enzymatically treated stevios. It can be used as a sweetener composition of various foods by mixing with sweeteners such as Said, Rebaudioside A, Rebaudioside D or E, erythritol, maltitol, sorbitol and glutitol, etc., wherein the form of the sweetener composition is powder, fine powder , Solids such as granules, crystals, tablets, aqueous solutions, solutions, and the like. It does not restrict
  • a pharmaceutically acceptable carrier or a carrier that can be formulated in a food or drink may be appropriately blended.
  • a carrier include sugars such as lactose, glucose, fructose, sugar, and fructose glucose liquid sugar; Sugar alcohols such as sorbitol, erythritol, lactitol, maltitol, mannitol, xylitol, and reduced paratinose; Oligosaccharides such as isomaltooligosaccharide, galactooligosaccharide and fructooligosaccharide; Polysaccharides such as dextrin, cellulose, gum arabic and corn starch; And water.
  • sugars such as lactose, glucose, fructose, sugar, and fructose glucose liquid sugar
  • Sugar alcohols such as sorbitol, erythritol, lactitol, maltitol, mannitol, xylitol, and reduced paratinose
  • fragrances, pigments, acidulants, preservatives, and the like which are commonly used in food and beverages and medicines, may be added, and further, extenders or carriers other than the separate sweetening and flavoring components within the scope of not impairing the object of the present invention. It may contain what is used, for example.
  • the present invention provides a food composition containing the ⁇ -glucosyl stevioside as a sweetener.
  • the present invention provides a method for improving the sweetness of a stevioside-containing plant or food, comprising treating the stevioside-containing plant or food with a glucan sucrase or a microorganism producing the same.
  • the sweetness of the food may be improved.
  • the sweetener compositions of the present invention can be treated as ingredients and reagents in sweeteners, flavor enhancers and flavor modifiers in a variety of confectionery, beverages (including alcoholic beverages), foods, feed products, etc., to play an important role in improving their sweetness. Can be.
  • food refers to foods that require sweetness, such as beverages, candy, frozen desserts, yogurt, and chocolate.
  • Other sweetened products refer to sweetened products such as feed, medicine, oral composition.
  • the sweetener composition comprising ⁇ -glucosyl stevioside having improved taste quality according to the present invention as an active ingredient improves problems such as delay in the increase of sweetness of stevioside and the heaviness of taste due to the large amount of use.
  • Change the quality of the taste such as sugar, sour, salty, astringent, sweet, bitter, etc., in harmony with other aesthetics of various substances, to improve the sweetness, aesthetics, or quality improvement of ordinary food It can be used widely.
  • soy sauce powdered soy sauce, miso, powdered miso, salted fish
  • mayonnaise dressing, vinegar, ultra soy sauce, Chinese food ingredients, fried soy sauce, noodles soy sauce, sauce, ketchup, bulgogi sauce, curry, stew ingredients, soup
  • seasonings such as ingredients, composite seasonings, mirin, new mirin, table sugar and coffee sugar, or as an aesthetic enhancer, a quality improver and the like.
  • the ratio at the time of containing a sweetener composition in various foodstuffs changes with various factors, such as the kind of foodstuff used, the other component contained in the said foodstuff, individual palatability, it is not specifically limited. Do not. Therefore, although the content rate with respect to various foods may be used so that it may become a physical property, a flavor, and sweetness which a user requires, In general, it is preferable to make it contain in food within the range of about 5 to 60 weight%.
  • the property of the sweetener composition at the time of containing in a foodstuff as a powder or granules, depending on the kind of foodstuff, it may be used after heat-melting and making it into a liquid phase, and previously melt
  • the present invention provides the use of ⁇ -glucosyl stevioside, wherein glucose is linked by an alpha-glycosidic link to the 19-OH position of stevioside in sweetener preparation.
  • the ⁇ -glucosyl stevioside is a form in which one glucose is added to the OH at the carbon position 19 of stevioside by the glucans sucrase or a microorganism producing the same by using stevioside as a substrate. More preferably, one glucose may be added to the OH at the 19 carbon position of stevioside by an alpha-1,3 or alpha-1,6 glycoside linkage, and most preferably, each of the chemical formulas described above.
  • Alpha-1,6 glucosyl stevioside and alpha-1,3 glucosyl stevioside represented by 1 and 2.
  • Glucan sucrase an enzyme that delivers glucose from sucrose
  • used glucan sucrase derived from Leuconostoc citreum KM20 and Leuconostoc lactics Each of the microbial strains was inoculated in a medium containing yeast extract, peptone, K 2 HPO 4 and sucrose, pre-incubated at 30 ° C., and then cultured in the same medium for 12 hours. After centrifugation of the culture, the cells were separated, and only the culture supernatant was taken to obtain 250 to 680 U of partially purified enzyme using resins such as DEAE-Sepharose and Phenyl Sepharose.
  • recombinant glucan sucrase will flow Pocono stock sheet reum KM20 (KM20 Leuconostoc citreum) and flow then inserted into the stock Kawano glucan can lock the vertices of Klein expression vector a gene cloned from a pET23d (Leuconostoc lactics), E. coli BL21 (DE3) CodonPlus RIL, E. coli BL21 (DE3), E. coli BL21 (DE3) CodonPlus RP, E. coli BL21 (DE3) PlyS, E. coli Rosetta (DE3), E. coli Star (DE3) Transformation was performed to express glucan sucrase and purified by column chromatography.
  • reaction product of glucan sucrases 20 mM sodium was added to 0.4 U / mg of glucan sucrase or recombinant glucan sucrase, 40% (w / v) sucrose, 25% (w / v) stevioside. After mixing in acetate buffer (pH 5.2), the final volume was 40 L at 30 ° C and reacted at 30 ° C for 110 hours. After the reaction was terminated for 5 minutes, the reaction solution was filtered through Whatman filter paper, filtered using a 0.45 ⁇ m syringe filter, and analyzed using thin layer chromatography.
  • each sample was loaded in 1 mL of Whatman K5F TLC plate (10 cm x 10 cm), and then developed using a developing solution in which acetonitrile: water was mixed at a ratio of 85:15 (v / v). I was. After development, the plate was dried, immersed in a coloring solution prepared by dissolving 0.3% (w / v) N- (1-naphthyl) -ethylenediamine and 5% (v / v) sulfuric acid in methanol, and then taken out. Color development was carried out by heating in an oven for 10 minutes, and the results of thin layer chromatography are shown in FIG. 1. In addition, the conversion rate of the product produced from the glucan sucrase of the present invention through the results of the thin film chromatography is shown in Table 1.
  • the conversion rates of the product produced from the glucan sucrase according to the present invention were 97% and 95%, respectively.
  • FIG. 1 is a thin-film chromatogram of glucosyl steviosides produced by the sugar transfer reaction of glucan sucrose.
  • each enzyme represents a product reacted for 0 to 110 hours, and a glucosyl stevioside in which a portion indicated by an arrow is generated.
  • the fructose sucrose detected the fructose (fructose), the leucrose, and the sugar fructose stevioside.
  • the sugar transition steviosides generated from the reaction product were purified. Specifically, the reaction product obtained in Example 2 was passed through the AW90 resin to remove residual proteins and salts, and separated and separated using an ethanol concentration gradient (0-80%) through Diaion HP-20 and C 18 column chromatography. By purification, 9.8 kg and 8.7 kg of sugar transfer products by glucan sucrase derived from Leuconostoc citreum KM20 and glucan sucrase derived from Leuconostoc lactics were obtained, respectively.
  • the separated and purified reaction product was diluted with ultra pure water, filtered with a thin film filter of 0.45 ⁇ m, and then injected into a column of 10 ml, and analyzed using High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • the water flow rate was 1 ml / min and the detection wavelength was 265 nm using Waters 600E gradient pump and UV detector C 18 column. The results are shown in FIG. 2.
  • the two kinds of reaction products showed different elution times from the standards stevioside and ribioside A, and were derived from glucan sucrase derived from Leuconostoc citreum KM20. It was confirmed that the sugar transition products and the sugar transition products of glucans sucrase derived from Leuconostoc lactics also showed different elution times.
  • Example 3 The sample and stevioside isolated and purified in Example 3 were dissolved in D 2 O by 40 mg each, and the molecular weight and molecular formula of the compound obtained in Example 3 were determined using LC / MS.
  • sucrose was decomposed into glucose and fructose by glucan sucrase, and the degraded glucose was transferred to stevioside to generate ⁇ -glucosyl stevioside.
  • Stevioside was used as a control to evaluate the sweetness of the ⁇ -glucosyl stevioside of the present invention.
  • Each sample was prepared with an aqueous solution of sweetness corresponding to 2%, 5%, and 8% sugar solution.
  • the quality of the experimental solution of stevioside and glucosyl stevioside was good and bad.
  • Other experimental conditions were the same as the sweetness experiment of the above 5-1. The results are shown in Table 3.

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Abstract

본 발명은 신규한 α-글루코실 스테비오사이드 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 스테비오사이드의 19-OH 위치에 글루코스가 알파-글리코시드 결합에 의해 연결되어 부가된 α-글루코실 스테비오사이드, 상기 α-글루코실 스테비오사이드를 제조하는 방법, 수크로즈 및 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물을 함유하는 스테비오사이드의 α-글루코실화 조성물, 상기 α-글루코실 스테비오사이드를 유효성분으로 함유하는 감미료 조성물, 상기 α-글루코실 스테비오사이드를 감미료로 함유하는 식품 조성물, 및 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품에 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물을 처리하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품의 감미질 개선 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 글루칸수크라제를 사용하는 α-글루코실 스테비오사이드를 제조하는 방법을 이용하면 19-OH 위치에 글루코스가 하나만 부가된 신규한 α-글루코실 스테비오사이드를 95% 이상의 높은 수율로 제조가 가능하여 감미질이 향상되어 단맛을 내는 식품첨가제 및 이를 포함하는 식품 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 α-글루코실 스테비오사이드 및 이의 제조 방법
본 발명은 신규한 α-글루코실 스테비오사이드 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 스테비오사이드의 19-OH 위치에 글루코스가 알파-글리코시드 결합에 의해 연결되어 부가된 α-글루코실 스테비오사이드, 상기 α-글루코실 스테비오사이드를 제조하는 방법, 수크로즈 및 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물을 함유하는 스테비오사이드의 α-글루코실화 조성물, 상기 α-글루코실 스테비오사이드를 유효성분으로 함유하는 감미료 조성물, 상기 α-글루코실 스테비오사이드를 감미료로 함유하는 식품 조성물, 및 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품에 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물을 처리하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품의 감미질 개선 방법에 관한 것이다.
종래부터 음식물의 감미료로서는 설탕이 널리 이용되어오고 있다. 특히 캔 커피를 비롯한 커피 음료나 탄산음료 등의 청량 음료수에는 다량의 설탕이 사용되고 있다. 그러나 최근, 건강을 지향하거나 또는 저칼로리를 지향하는 것에 영향을 받아 비만, 당뇨병, 충치의 원인이 되는 설탕의 양을 줄이거나 설탕 대신에 고감미도의 감미료가 이용되는 경향이 나타나고 있다.
이러한, 고감미도 감미료로는 대표적으로 싸이클라메이트(cyclamate), 사카린(saccharin), 아스파르테임(aspartame), 수크랄로스(sucralose), 네오테임(neotame) 및 아세설팜칼륨(acesulfame potassium) 등의 합성 감미료가 알려져 있으나, 이들의 안정성의 면에서 일반 식품에의 사용이 금지되거나 사용 제한이 강화되고 있는 실정이다. 따라서, 이들을 대체할 수 있는 천연 감미료의 개발이 시급히 요구되고 있다.
이런 시점에서 개발되어진 대표적인 천연 감미료의 하나는 스테비오사이드이다. 스테비오사이드는 설탕에 비하여 저칼로리이며, 감미도는 설탕의 약 200-300배 높아 그의 수요가 급격하게 높아지고 있다. 스테비오사이드는 남미 파라과이가 원산지인 국화과 다년생 초본인 스테비아 레바우디아나 베르토니(Stevia rebaudiana BERTONI)로부터 추출한 감미성분으로 스테비오사이드, 레바우디오사이드 A, B, C, D, E 등으로 되어있으며, 이들은 이소스테비올 골격에 포도당의 베타 글루코실 배당체로 되어 있다.
스테비오사이드는 현재 소주, 절임식품 등에 감미료로 사용되고 있는데 스테비오사이드는 설탕에 비하여 감미도는 뛰어나지만, 감미의 상승이 느리다는 점, 뒷맛의 감미가 비교적 오래 남는다는 점 등의 이른바 감미의 마무리가 나쁘다는 결점이 있다. 또한, 스테비오사이드에는 감미와는 별도로 뒷맛에 독특한 떫은맛이나 쓴맛을 수반하는 결점이 있어, 커피음료, 청량 음료수, 알콜 음료에 이용하면 위화감을 주는 단점이 있다. 따라서, 그 사용량 및 용도에 한계가 발생하는 문제점이 있어 스테비오사이드의 미질을 개선하려는 노력이 있어 왔다.
종래 스테비오사이드의 감미질 개선 방법은 (1) 설탕, 포도당, 과당 등과 같은 천연 당질 감미료를 1종 또는 그 이상 첨가하는 방법, (2) 아미노산 또는 아미노산 염과 배합하는 방법, (3) 싸이클로덱스트린과 같이 포접능을 갖는 환형 당질에 물리적으로 결합시키는 방법 등이 알려져 있다. 그러나, 이상의 방법은 첨가물을 상당히 많은 양으로 사용하여야 하며, 결국 스테비오사이드가 저칼로리 감미료라는 특징을 잃어버리는 단점을 갖는다.
따라서, 또 다른 미질 개선 방법으로 생물전환 당전이 기술을 활용하여 감미도와 감미질이 우수한 물질인 "레바우디오사이드 A" 유사체를 제조하는 방법이 있다. 이는 사용된 효소와 미생물의 특이적인 당전이 위치에 따라 3가지로 구분할 수 있다. 첫번째는 스테비오사이드 13-OH 부분에 당전이 가능한 효소를 이용하는 방법으로, 대표적으로 α-glucosidase나 pullulanase, galactosidase, dextrin-dextranase, β-1,4-갈락토실 전이효소, 또는 미생물 자원으로 Gibberlla fuiikuroi, Actinomycete를 이용하는 것이다. 두 번째로 스테비오사이드 19-OH부분에 당전이가 가능한 효소를 이용하는 방법으로 프럭토퓨라노시다제(fructofuranosidase)를 사용하는 방법이며, 세번째는 13-OH과 19-OH에 모두 당전이 가능한 효소를 이용하는 방법으로 CGTase와 Streptomyces sp.를 이용하는 것이다. 이러한 방법들 중에서 CGTase는 90% 이상의 당전이 수율을 보였으며, 효소처리 스테비아의 순도를 향상시키기 위해 CGTase와 글루코아밀라제를 동시에 처리하는 방법과 효모 균주를 이용한 방법 등이 보고되어져 있다. 또한, 스테비아 식물에 감마광선을 조사하여 레바우디오사이드 A를 다량 함유케 하는 식물로 유전적 변형을 유발시키는 방법 등이 보고되어 있다. 현재 CGTase를 이용하여 스테비오사이드의 13-OH 또는 19-OH 부위에 무작위로 포도당이 1-12개 부가된 효소처리 스테비오사이드가 유일하게 시판 중에 있다.
그러나, 이러한 CGTase를 이용한 방법으로는 선택적으로 한 개의 포도당만 부가할 수가 없고, 부가된 글루코스가 장내 미생물에 의해 모두 분해되어 에너지원으로 전환된다면 가수 분해된 포도당 수만큼의 칼로리가 상승한다는 단점을 지니고 있다.
본 발명에서는 저칼로리의 스테비오사이드의 특징을 보유하면서 감미질이 개선된 신규 감미소재를 개발하고자 예의 노력한 결과, 두 종의 미생물(Leuconostoc citreum KM20 또는 L. lactics) 유래의 글루칸수크라제를 이용하여 감미질이 우수한 레바우디오사이드 E 유사체(ST-G, 19-OH 탄소위치에 글루코스가 1개만 부가됨)인 α-글루코실 스테비오사이드를 95%이상의 수율로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 스테비오사이드의 19-OH 위치에 글루코스가 알파-글리코시드 결합에 의해 연결되어 부가된 α-글루코실 스테비오사이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 α-글루코실 스테비오사이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수크로즈 및 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물을 함유하는 스테비오사이드의 α-글루코실화 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 α-글루코실 스테비오사이드를 유효성분으로 함유하는 감미료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 α-글루코실 스테비오사이드를 감미료로 함유하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품에 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물을 처리하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품의 감미질 개선 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 글루칸수크라제를 사용하는 α-글루코실 스테비오사이드를 제조하는 방법을 이용하면 19-OH 위치에 글루코스가 하나만 부가된 신규한 α-글루코실 스테비오사이드를 95% 이상의 높은 수율로 제조가 가능하여 감미질이 향상되어 단맛을 내는 식품첨가제 및 이를 포함하는 식품 및 화장품, 의약품 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 글루칸수크라제의 당전이 반응에 의해 생성된 글루코실 스테비오사이드를 분석하여 나타낸 박막크로마토그램이다.
도 2는 글루코실 스테비오사이드의 당전이 반응에 의해 생성된 반응생성물의 고성능 액체크로마토그램이다.
도 3은 본 발명에서 제조 및 정제한 α-1,6-글루코실 스테비오사이드의 LC/MS 스펙트럼이다.
도 4은 본 발명에서 제조 및 정제한 α-1,3-글루코실 스테비오사이드의 LC/MS 스펙트럼이다.
도 5은 본 발명에서 제조 및 정제한 α-1,6-글루코실 스테비오사이드의 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, HMBC, DEPT, H-H COZY, 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명에서 제조 및 정제한 α-1,3-글루코실 스테비오사이드의 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, HMBC, DEPT,H-H COZY, 스펙트럼이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 스테비오사이드의 19-OH 위치에 글루코스가 알파-글리코시드 결합에 의해 연결되어 부가된 α-글루코실 스테비오사이드를 제공한다.
본 발명에서의 용어 "α-글루코실 스테비오사이드"는 스테비오사이드에 선택적으로 하나의 글루코스가 알파-글리코시드 결합을 통해 연결되어진 당전이 스테비오사이드를 의미한다.
본 발명에서는 상기 α-글루코실 스테비오사이드를 제조하기 위해 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물을 사용하는 것에 특징이 있다.
바람직하게, 본 발명의 α-글루코실 스테비오사이드는 스테비오사이드를 기질로하여 상기 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물에 의해 스테비오사이드의 19번 탄소 위치의 OH에 알파-글리코시드 결합을 통해 글루코스 하나가 부가된 형태일 수 있고, 보다 바람직하게는 스테비오사이드의 19번 탄소 위치의 OH에 알파-1,3 또는 알파-1,6 글리코시드 결합으로 글루코스 하나가 부가된 형태일 수 있으며, 가장 바람직하게는 각각 하기 화학식 1 및 2로 나타내는 알파-1,6 글루코실 스테비오사이드 및 알파-1,3 글루코실 스테비오사이드이다.
화학식 1
Figure PCTKR2012006070-appb-C000001
화학식 2
Figure PCTKR2012006070-appb-C000002
CGTase는 스테비오사이드의 13번 탄소 위치의 OH(13-OH) 또는 19번 탄소 위치의 OH(19-OH) 부위에 무작위로 글루코스를 1 내지 12개 부가하므로, 선택적으로 한 개의 포도당만 부가할 수가 없다. 이에 본 발명자는 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.)균주, 보다 구체적으로는 류코노스톡 시트레움 KM20 (Leuconostoc citreum KM20) 또는 류코노스톡 락틱스(Leuconostoc lactics)에서 생산되는 글루칸수크라제가 스테비오사이드와 수크로즈를 기질로 하여 스테비오사이드의 19-OH 부위에 선택적으로 하나의 글로코스를 각각 알파-1,3 또는 알파-1,6 글리코시드 결합으로 연결시킨다는 것을 최초로 규명하였으며, 상기 화학식 1 및 2로 나타내는 신규한 알파-1,6 글루코실 스테비오사이드 및 알파-1,3 글루코실 스테비오사이드가 산업적으로 이용할 수 있을 만큼 충분한 감미도를 나타내는 것을 최초로 규명하였다.
본 발명에 따른 알파-1,3 또는 알파-1,6 글루코실 스테비오사이드는 종래의 베타 글루코실 스테비오사이드 및 알파-1,4 글루코실 스테비오사이드에 비해 감미질이 크게 향상되어 베타 글루코실 스테비오사이드가 지니는 뒷맛의 감미가 비교적 오래 남는다는 점 등의 이른바 감미의 마무리가 나쁘다는 특징을 개선할 수 있었다.
다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 α-글루코실 스테비오사이드를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 α-글루코실 스테비오사이드 제조 방법은 스테비오사이드에 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물을 처리하는 단계를 포함한다.
스테비오사이드와 당 공여체로 사용되는 수크로즈는 합성 또는 시판되고 있는 것을 제한없이 사용할 수 있다. 또한, 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물은 상기 기술한 글루칸수크라제를 생산하는 미생물을 배양하여 생산된 글루칸수크라제만을 회수 및 정제하여 사용할 수도 있고, 상기 배양된 미생물을 직접 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 글루칸수크라제를 생산하는 미생물을 배양하기 위한 배지 및 배양조건은 숙주 세포에 따라 적절히 선택 이용할 수 있다. 영양배지는 숙주세포의 생육에 필요한 탄소원 무기질소원 또는 유기질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로는 글루코스, 덱스트란, 가용성 전분, 및 수크로즈 등이 예시된다. 무기질소원 또는 유기질소원으로는 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘스팁 리쿼(corn steep liquer), 펩톤, 카제인, 소 추출물, 대두백, 및 감자추출물 등이 예시된다. 필요에 따라 다른 영양소, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 같은 무기염, 비타민류, 및 항생물질(테트라사이클린, 네오마신, 암피실린, 및 카나마이신) 등을 포함할 수 있다. 배양시는 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양 시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.
수크로즈에 대한 스테비오사이드의 중량비는 20:1 내지 1:1인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 수크로오스에 대한 스테비오사이드의 중량비가 2:1 내지 1:1인 것이다. 또한, 글루칸수크라제의 첨가량은 말토트리오스 1 mg당 0.2 내지 1.0 U가 되도록 하는 것이 바람직하다.
상기 단계에서 글루칸수크라제는 필요에 따라 유리 형태로 사용하거나 또는 고정화하여 사용할 수 있다. 글루칸수크라제의 고정화는 당 업계에 공지된 방법인 기제결합, 교차 결합, 봉입 또는 캡슐화 등에 의한 방법으로 수행될 수 있다. 상기 교차 결합은 예를 들면 글루타르알데히드를 사용하여 수행할 수 있으며, 기제 결합은 흡착 결합 또는 공유 결합에 의해 수행될 수 있고, 상기 봉입은 겔, 마이크로캡슐 또는 섬유 형태의 반투과성 막을 이용할 수 있다. 상기와 같은 방법으로 효소를 고정화하여 사용하면 효소의 재이용, 효소의 회수 및 정제 공정이 단축되는 장점이 있다.
반응온도는 20℃ 내지 50℃, 바람직하게는 30℃이며, pH 범위는 4.5 내지 6.0이고, 반응시간은 12 시간 내지 120 시간, 바람직하게는 12 시간 내지 20 시간이다.
본 발명에서의 용어 "글루칸수크라제"는 수크로즈(sucrose)로부터 글루칸(glucans)으로 불리는 D-글루코스 다량체의 합성을 촉매하는 효소로서, 본 발명에서는 스테비오사이드의 19-OH 위치에 알파-글리코시드 결합을 통해 글루코스 하나를 부가할 수 있는 효소를 의미한다. 본 발명의 글루칸수크라제는 스테비오사이드의 19-OH 위치에 알파-글리코시드 결합을 통해 글루코스 하나를 부가할 수 있는 천연형 또는 재조합 단백질을 제한없이 포함한다.
일반적으로 알려진 글루칸수크라제는 그 종류에 따라 수크로즈(sucrose)로부터 주쇄에 글루코스 단위가 α-(1-2), α-(1-3), α-(1-4), α-(1-6) 등 각기 다른 결합으로 연결된 동형다량체(homopolymer)인 글루칸(glucan)을 형성하는 것으로 알려져 있다. 또한, 글루칸수크라제의 종류에 따라 분지(chains) 결합의 종류, 비율 및 길이 역시 각각 달라진다. 따라서 다양하게 존재하는 글루칸수크라제는 서로 높은 유사성을 갖더라도 글루코시드 결합(glucosidic linkages)의 형태에 따라서 다양한 글루칸을 합성할 수 있다. 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.)균주, 즉 류코노스톡 시트레움 KM20(Leuconostoc citreum KM20) 또는 류코노스톡 락틱스(Leuconostoc lactics)가 발현하는 글루칸수크라제가 스테비오사이드와 수크로즈를 기질로 하여 스테비오사이드의 19-OH 부위에 선택적으로 하나의 글로코스를 알파-1,3 또는 알파-1,6 글리코시드 결합으로 연결할 수 있다.
따라서 바람직하게, 본 발명의 천연형 또는 재조합 글루칸수크라제는 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 균주로부터 발현 또는 유래된 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 류코노스톡 시트레움 KM20(Leuconostoc citreum KM20) 또는 류코노스톡 락틱스(Leuconostoc lactics)로부터 발현 또는 유래된 것일 수 있다.
또한 바람직하게, 본 발명의 글루칸수크라제는 스테비오사이드와 수크로즈를 기질로하여 스테비오사이드의 19-OH 위치에 글루코스 하나를 선택적으로 부가하여 연결할 수 있으며, 보다 바람직하게는 스테비오사이드의 19-OH 위치에 알파-글리코시드 결합을 통해 글루코스 하나를 부가하여 연결할 수 있고, 가장 바람직하게는 스테비오사이드의 19-OH 위치에 α-1,3 또는 α-1,6 글리코시드 결합으로 글루코스 하나를 연결할 수 있다.
본 발명에서의 용어 "글루칸수크라제를 생산하는 미생물"은 스테비오사이드의 19-OH 위치에 알파-글리코시드 결합을 통해 글루코스 하나를 부가할 수 있는 천연형 또는 재조합 글루칸수크라제를 생산하는 야생형 및 형질전환 미생물을 제한없이 포함한다.
지금까지 알려진 글루칸수크라제는 류코노스톡과 스트렙토코커스 속 등 젖산균에서 주로 생산된 후, 세포외로 분비되며, 주변에 있는 슈크로즈 기질을 다량체로 합성함으로써 세포를 외부 환경으로부터 보호하는 역할을 한다. 따라서, 글루칸수크라제를 발현하는 미생물을 배양하는 배양액에 스테비오사이드와 수크로즈를 직접첨가하여 스테비오사이드의 당전이를 일으키는 것이 가능하다.
상기와 같은 이유로 본 발명은 바람직하게 글루칸수크라제를 생산하는 야생형 미생물로 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.)균주를 직접 당전이에 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 류코노스톡 시트레움 KM20(Leuconostoc citreum KM20) 또는 류코노스톡 락틱스(Leuconostoc lactics)균주를 직접 당전이에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 제조 방법에는 글루칸수크라제를 생산하는 미생물을 야생형 및 형질전환체에 제한없이 사용되어질 수 있으므로, 본 발명은 상기 글루칸수크라제를 발현하도록 형질전환된 형질전환체를 사용할 수 있다.
본 발명에서의 용어 "형질전환"은 본 발명에 따른 글루칸수크라제를 암호화하는 DNA를 숙주세포로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.
본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다.
본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 글루칸수크라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 도입효율이 우수하고, 도입된 폴리뉴클레오티드의 발현효율이 높은 숙주를 사용할 수 있는데, 예를 들면 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia)속 세균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)같은 바실러스(Bacillus)속 세균, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)같은 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)같은 효모, 동물세포, 식물세포 및 곤충 세포가 있다.
또한, 본 발명의 제조 방법은 반응산물로부터 α-글루코실 스테비오사이드만을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 반응산물 중에는 수크로즈로부터의 과당(Fructose)과 또 다른 당전이 산물인 레우크로스(Leucrose) 등의 부수적인 당들이 포함되어 있기 때문에 반응산물로부터 α-글루코실 스테비오사이드만을 회수하는 단계를 필요로 한다. α-글루코실 스테비오사이드의 회수는 당업계에 공지된 멤브레인 여과법, 분별 침전법, 결정화법 및 컬럼 크로마토그래피법 등을 제한없이 이용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, AW90과 같은 수지로 염을 제거하고 난 후, 다공성의 흡착수지(Diaion HP-20)를 이용하여 흡착시켜 효과적으로 부수적인 당을 제거하고, 알코올(메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, 부탄올)의 농도 구배를 이용하여 간단하게 분리할 수 있다. 상기와 같은 방법으로 분리 및 정제하여 수득한 글루코실 스테비오사이드는 액체 형태로 그대로 사용하거나 상기 액체를 농축하여 사용하거나 필요에 따라서는 건조시켜 분말화함으로써 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 류코노스톡 시트레움 KM20(Leuconostoc citreum KM20) 또는 류코노스톡 락틱스(Leuconostoc lactics) 유래의 글루칸수크라제를 사용하여 생성한 당전이 산물을 박막크로마토그래피로 분석하여 글루코실 스테비오사이드로 추정되는 스팟과 과당(fructose), 레우크로스로 추정되는 스팟을 확인하였고(도 1), 상기 반응산물을 Diaion HP-20 컬럼으로 정제한 분획을 고속액체크로마토그래피로 분석한 결과, 글루코실 스테비오사이드로 추정되는 피크만이 검출됨을 확인하였으며(도 2), 13C-NMR을 이용하여 반응산물의 구조를 분석한 결과 α-1,3-글루코실 스테비오사이드 및 α-1,6-글루코실 스테비오사이드임을 확인하였다(도 5 및 도 6).
본 발명에 따른 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물은 스테비오사이드의 19-OH 부위에 선택적으로 하나의 글로코스를 알파 글리코시드 결합으로 연결하여 부가할 수 있는 특징을 가지므로, 본 발명은 수크로즈 및 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물을 유효성분으로 함유하는 스테비오사이드의 α-글루코실화 조성물을 다른 하나의 양태로서 제공할 수 있다.
본 발명의 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물은 보다 효과적으로 α-글루코실 스테비오사이드를 생산하기 위해 단독 또는 복합적으로 사용되어질 수 있으며, 이들 효소 및 미생물을 사용시까지 안정하게 유지할 수 있도록 담체, 부형제 또는 희석제와 혼합된 형태의 조성물로 제조되어질 수 있다. 이러한 스테비오사이드의 α-글루코실화 조성물에 사용될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
다른 하나의 양태로서 본 발명은 본 발명에 따른 α-글루코실 스테비오사이드를 유효성분으로 함유하는 감미료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 α-글루코실 스테비오사이드는 우수한 물리화학적 특성 및 감미 특성을 통해, 그 단독 또는 필요에 따라 하나 이상의 기타 감미제, 예를 들면, 글루코오스, 수크로오스, 기존의 스테비오사이드, 효소처리 스테비오사이드, 레바우디오사이드 에이, 레바우디오사이드 D 또는 E, 에리스리톨, 말티톨, 솔비톨 및 글루시톨 등과 같은 감미제와 혼합하여 다양한 식품의 감미료 조성물로서 사용할 수 있는데, 이때 감미료 조성물의 형태는 분말, 미분, 과립, 결정, 정제 등의 고형물, 수용액, 용액 등의 어떤 형태라도 좋다. 이의 제조 방법에 대해서도 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 감미료 조성물 그 형태에 따라서 약학적으로 허용되는 담체, 또는 음식품에 배합 가능한 담체를 적절히 배합할 수도 있다. 이러한 담체로서는, 유당, 포도당, 과당, 설탕, 과당 포도당 액당 등의 당류; 소르비톨, 에리스리톨, 락티톨, 말티톨, 만니톨, 크실리톨, 환원 파라티노스 등의 당 알코올류; 이소말토올리고당, 갈락토올리고당, 프럭토올리고당 등의 올리고당류; 덱스트린, 셀룰로오스, 아라비아검 및 콘 스타치 등의 다당류; 및 물 등을 들 수 있다.
또한, 음식품이나 의약품에 통상 사용되는 향료, 색소, 산미료, 방부제 등을 첨가해도 좋고, 나아가 본 발명의 목적을 저해하지 않는 범위에서, 추가로 별개의 감미 성분이나 정미 성분이 아닌 증량제나, 담체 등으로 사용되는 것을 함유할 수 있다.
다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 α-글루코실 스테비오사이드를 감미료로 함유하는 식품 조성물을 제공한다.
또한, 다른 하나의 양태로서 본 발명은 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품에 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물을 처리하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품의 감미질 개선 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 α-글루코실 스테비오사이드를 감미료로 다양한 식품에 첨가하면 식품의 감미질을 개선할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 감미료 조성물은 다양한 제과, 음료(알콜 음료 포함), 식품, 사료 제품 등의 감미제, 풍미 강화제 및 풍미 변형제의 성분 및 시약으로서 처리되어 그들의 감미질을 개선하는데 중요한 역할을 할 수 있다.
본 발명에서 식품은, 음료, 캔디, 빙과, 요구르트, 초콜렛 등 감미를 필요로 하는 식품 전반을 말한다. 기타 감미를 부여한 제품에는 사료, 의약품, 구강용 조성물 등의 감미가 부여된 제품을 말한다.
다시 말해, 본 발명의 맛의 질이 개량된 α-글루코실 스테비오사이드를 유효성분으로 포함하는 감미료 조성물은, 스테비오사이드가 가지는 감미의 상승의 늦음이나 다량 사용에 의한 맛의 무거움 등의 문제점을 개선하고, 맛의 질을 변화시키며, 설탕과 같이, 신맛, 짠맛, 떫은맛, 단맛, 쓴맛 등, 각종의 물질의 다른 미감과 잘 조화되고, 보통의 일반 식품의 감미부, 미감 개량에, 또는 품질 개량 등에 광범위하게 사용할 수 있다.
예를 들면, 간장, 분말간장, 된장, 분말된장, 젓갈, 마요네즈, 드레싱, 식초, 초간장, 중화요리 재료, 튀김요리용 간장, 국수용 간장, 소스, 케첩, 불고기 소스, 카레, 스튜 재료, 수프 재료, 복합 조미료, 미림, 새 미림, 테이블 슈거, 커피 슈거 등 각종조미료의 감미료로서, 또는 미감 개량제, 품질 개량제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
또한, 예를 들면, 생과자, 밥풀과자, 떡류, 만두, 팥소류, 양갱, 물양생, 젤리, 카스테라, 알사탕, 빵, 비스킷, 크래커, 쿠키, 파이, 푸딩, 버터크림, 카스타드 크림, 슈크림, 와플, 스펀지 케이크, 도넛, 초콜렛, 츄잉검, 카라멜, 캔디 등의 각종 과자, 아이스크림, 샤베트 등의 빙과류, 과실의 시럽절임 등의 시럽류, 플라워 페이스트, 땅콩 페이스트, 과일 페이스트 등의 페이스트류, 잼, 마멀레이드, 시럽절임, 당과 등의 과실, 야채의 가공 식품류, 빵류, 국수류, 쌀밥류, 인조 고기 등 곡류 가공식품류, 무절임, 순무 절임, 염교 절임 등의 절임류, 단무지 절임의 재료, 배추 절임의 재료 등의 절임 재료류, 햄, 소시지 등의 축산제품류, 어육 햄, 어육 소시지, 어묵, 튀김 등의 어육제품, 성게, 오징어젓, 초 다시마, 찢은 오징어, 복어의 미림 말림 등의 각종 진미류, 김, 산채, 말린 오징어, 작은 물고기, 조개 등으로 제조되는 해산물 조림류, 콩자반, 포테이토 샐러드, 다시마 말이 등의 반찬식품, 유제품, 어육, 축육, 과실, 야채의 병조림, 통조림류, 합성 술, 과실술, 양주, 리큐어 등의 주류, 커피, 코코아, 쥬스, 탄산음료, 락트산음료, 유산균 음료 등의 청량음료수, 푸딩 믹스, 핫케이크 믹스 등의 프리믹스분류, 즉석 쥬스, 즉석 커피, 즉석 팥죽, 즉석 수프 등 즉석 식품 등의 각종 식품에의 감미료로서, 또는 미감개량제, 품질개량제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서 감미료 조성물을 각종 식품에 함유시킬 때의 비율은, 사용하는 대상으로 되는 식품의 종류, 상기 식품에 함유되는 다른 성분, 개개의 기호성 등, 각종 요인에 따라 변화되기 때문에, 특별히 한정되지 않는다. 따라서 각종 식품에 대한 함유율은, 사용자가 요구하는 물성, 풍미, 감미질로 되도록 변경하여 사용하면 좋으나, 일반적으로는, 5 ∼ 60 중량% 정도의 범위 내로 식품에 함유시키는 것이 바람직하다. 또한, 식품에 함유시킬 때의 감미료 조성물의 성상은, 분말 또는 과립 그대로 사용하는 것이 바람직하지만, 식품의 종류에 따라서는 가열 용융하여 액상으로 하고 나서 사용해도 좋고, 또 미리 물 등의 액체에 용해하여 사용해도 좋다.
다른 하나의 양태로서 본 발명은 감미료 제조에 있어서, 스테비오사이드의 19-OH 위치에 글루코스가 알파-글리코시드 결합에 의해 연결되어 부가된 α-글루코실 스테비오사이드의 용도를 제공한다.
상기 α-글루코실 스테비오사이드는 스테비오사이드를 기질로하여 상기 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물에 의해 스테비오사이드의 19번 탄소 위치의 OH에 알파-글리코시드 결합을 통해 글루코스 하나가 부가된 형태일 수 있고, 보다 바람직하게는 스테비오사이드의 19번 탄소 위치의 OH에 알파-1,3 또는 알파-1,6 글리코시드 결합으로 글루코스 하나가 부가된 형태일 수 있으며, 가장 바람직하게는 각각 상기 설명한 화학식 1 및 2로 나타내는 알파-1,6 글루코실 스테비오사이드 및 알파-1,3 글루코실 스테비오사이드이다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 글루칸수크라제의 준비
수크로즈로부터 포도당을 전달하는 효소인 글루칸수크라제는 류코노스톡 시트레움 KM20(Leuconostoc citreum KM20) 및 류코노스톡 락틱스 (Leuconostoc lactics) 유래 글루칸수크라제를 사용하였다. 상기 미생물 균주 각각을 효모추출물, 펩톤, K2HPO4 및 수크로즈를 함유하는 배지에 접종하여 30℃에서 전배양한 후, 같은 배지에서 12시간 배양하였다. 상기 배양된 배양액을 원심분리 후, 균체를 분리하고, 배양 상등액만을 취해 DEAE-세파로스 및 페닐 세파로스 등의 레진을 이용하여 각각 250 ~ 680 U의 부분 정제된 효소를 얻었다.
또한, 재조합 글루칸수크라제는 류코노스톡 시트레움 KM20(Leuconostoc citreum KM20)과 류코노스톡 락틱스(Leuconostoc lactics)로부터 클로닝한 글루칸수크라제 유전자를 발현 벡터인 pET23d에 삽입시킨 후, E. coli BL21(DE3)CodonPlus RIL, E. coli BL21(DE3), E. coli BL21(DE3)CodonPlus RP, E. coli BL21(DE3)PlyS, E. coli Rosetta(DE3), E. coli Star(DE3)에 형질 전환하여 이로부터 글루칸수크라제를 발현시킨 다음 컬럼크로마토그래피로 정제하여 준비하였다.
실시예 2: 글루칸수크라제의 반응 생성물 분석
글루칸수크라제들의 반응 생성물을 확인하기 위해, 0.4 U/mg의 글루칸수크라제 또는 재조합 글루칸수크라제, 40%(w/v) 수크로오스, 25%(w/v) 스테비오사이드를 20 mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.2)에 혼합한 후 30℃에서 최종 부피가 40 L가 되도록 하여 30℃에서 110시간동안 반응시켰다. 반응 후 5분간 반응액을 끊인 후 왓트만 여과지에 여과하고, 0.45 ㎛의 주사기 필터를 이용하여 여과한 후, 박막크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.
구체적으로, 각 시료를 와트만 K5F TLC 플레이트(10 cm × 10 cm)에 각각 1 mL로 로딩한 다음 아세토니트릴:물이 85:15(v/v)의 비율로 혼합된 전개액을 이용하여 전개시켰다. 전개 후 플레이트를 건조시키고, 메탄올에 0.3%(w/v) N-(1-나프틸)-에텔렌다이아민과 5%(v/v) 황산을 용해시켜 제조한 발색액에 담갔다 꺼낸 후 110℃ 오븐에서 10분간 가열하여 발색시켰고, 이러한 박막크로마토그래피 결과를 도 1에 나타내었다. 또한, 상기 박막크로마토그래피의 결과를 통해 본 발명의 글루칸수크라제로부터 생성되는 산물의 전환율을 확인하여 표 1에 나타내었다.
표 1 글루칸수크라제에 의한 스테비오사이드로부터 글루코실 스테비오사이드 전환율과 반응 수율.
반응 효소 탄수화물 양 (mg) 전환율 (%)
스테비오사이드 글루코실 스테비오사이드
L. citreum KM20 글루칸수크라제 3 97 97
L. lactics 글루칸수크라제 5 95 95
표 1에서와 같이 본 발명에 따른 글루칸수크라제로부터 생성되는 산물의 전환율은 각각 97%, 95%였다.
도 1은 글루칸수크라제의 당전이 반응에 의해 생성된 글루코실 스테비오사이드의 박막크로마토그램이다. 도 1에서 각각의 효소는 0 내지 110시간 반응한 산물을 나타내며 화살표로 표시된 부분이 생성된 글루코실 스테비오사이드이다. 도 1에 나타난 바와 같이 당전이 반응산물에서는 각각의 글루칸수크라제에 의해 과당(fructose)과 레우크로스, 및 당전이 스테비오사이드로 추정되는 스팟이 검출되었다.
실시예 3: α-글루코실 스테비오사이드의 정제
본 발명에 따라 생성된 당전이 스테비오사이드의 구조를 확인하기 위해 우선 반응 생성물로부터 생성된 당전이 스테비오사이드를 정제하였다. 구체적으로, 실시예 2에서 얻어진 반응 산물을 AW90수지에 통과하여 잔존 단백질 및 염을 제거하고, Diaion HP-20 및 C18컬럼 크로마토그래피를 통해 에탄올 농도구배(0-80%)를 이용하여 분리 및 정제하여, 류코노스톡 시트레움 KM20(Leuconostoc citreum KM20) 유래 글루칸수크라제 및 류코노스톡 락틱스(Leuconostoc lactics) 유래 글루칸수크라제에 의한 당전이 산물은 각각 9.8 kg 및 8.7 kg이 얻어졌다.
상기 분리 정제한 반응생성물을 초 순수로 희석하고, 0.45 ㎛의 박막여과지로 여과한 다음 컬럼에 10 ml를 주입하여 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 이용하여 분석하였다. 이때 분석조건은 워터스사의 600E 그래디언트 펌프와 자외선 검출기 C18 컬럼을 이용하여 유속 1 ml/min, 검출파장은 265 nm를 사용하였고, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이 두 종류의 반응생성물은 표준물질인 스테비오사이드 및 리바우디오사이드 A와는 다른 용출시간을 나타냄을 확인하였고, 류코노스톡 시트레움 KM20(Leuconostoc citreum KM20) 유래 글루칸수크라제의 당전이 산물과 류코노스톡 락틱스(Leuconostoc lactics) 유래 글루칸수크라제의 당전이 산물 또한 각기 다른 용출시간을 나타냄을 확인하였다.
실시예 4: α-글루코실 스테비오사이드의 구조 분석
상기 실시예 3에서 분리 및 정제한 시료와 스테비오사이드를 각각 40 mg씩 D2O에 용해시켜 사용하였으며, 상기 실시예 3에서 얻은 화합물의 분자량 및 분자식을 LC/MS를 사용하여 결정하였다. 또한, 핵자기공명(NMR) 분석(Bruker AM 500)을 통하여 1H NMR, 13C NMR, 호모-코지(HOMO-COSY), HMQC(1H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT(DistortionlessEnhancement by Polarization) 스펙트럼을 얻어, 분자구조를 결정하였다.
상기 측정 결과를 분석한 결과, 류코노스톡 시트레움 KM20(L. citreum KM20) 또는 류코노스톡 락틱스(L. lactics) 유래 글루칸수크라제에 의해 스테비오사이드에 글루코오스 하나가 각각 전이되어, 두 개의 반응 산물 모두 스테비오사이드에 글루코스 분자가 결합한 분자량을 나타내는 것을 확인하였으며(도 3 과 4), 구체적으로, α-1,6-글루코실(도 5) 또는 α-1,3-글루코실 스테비오사이드(도 6)가 생성되었음을 확인하였다.
이러한 결과로부터, 수크로즈가 글루칸수크라제에 의해 글루코스와 과당으로 분해됨과 동시에 상기 분해된 글루코스가 스테비오사이드에 전이되어 α-글루코실 스테비오사이드가 생성됨을 확인할 수 있었다.
실시예 5: α-글루코실 스테비오사이드의 감미능 조사
5-1. α-글루코실 스테비오사이드의 감미도 평가
실시예 3에서 분리 정제한 α-글루코실스테비오사이드를 0.01% 함유하는 수용액을 제조하고, 설탕의 1 내지 4% 수용액을 제조하여 표준용액으로 한 뒤 감미도 비교 실험을 수행하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2 α-글루코실 스테비오사이드의 감미도 평가 결과
설탕농도 (%) α-1,6 글루코실 스테비오사이드 α-1,3 글루코실 스테비오사이드
높다 같다 낮다 높다 같다 낮다
1 16 5 4 14 7 4
1.5 6 12 7 9 10 6
2 5 5 15 5 7 13
2.5 1 5 19 3 7 15
표 2의 결과로부터, 본 발명의 α-글루코실 스테비오사이드의 감미도는 0.01% 수용액의 경우 설탕 농도 1.5%에 상당하는 것으로 확인되었다.
5-2. α-글루코실 스테비오사이드의 감미질 평가
스테비오사이드를 대조군로 하여 본 발명의 α-글루코실 스테비오사이드의 감미질을 평가하였다. 각 시료를 2%, 5%, 8%의 설탕용액에 상응하는 감미도의 수용액을 제조하였다. 스테비오사이드와 글루코실 스테비오사이드의 실험용액의 미질이 좋고 나쁨을 비교하였다. 기타 실험 조건은 상기 5-1의 감미도 실험과 동일하게 하였다. 그 결과는 표 3에 나타내었다.
표 3 α-글루코실 스테비오사이드의 감미질 평가 결과
설탕농도 (%) 스테비오사이드 α-1,6글루코실스테비오사이드 α-1,3글루코실스테비오사이드
좋다 같다 나쁘다 좋다 같다 나쁘다 좋다 같다 나쁘다
2 0 10 15 18 7 0 15 10 0
4 0 5 20 20 5 0 15 10 0
6 0 2 23 18 7 0 17 8 0
8 0 0 25 17 8 0 15 10 0
표 3의 결과로부터, 본 발명의 α-글루코실 스테비오사이드는 미질에 있어서는 쓴맛, 떫은맛, 불쾌감 등이 남아 있지 않는 좋은 감미를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과들은, 본 발명의 신규한 α-글루코실 스테비오사이드를 사용하면, 스테비오사이드가 가지는 감미의 상승의 늦음이나 다량 사용에 의한 맛의 무거움 등의 문제점을 개선하고, 맛의 질을 변화시킬 수 있음을 나타낸다. 또한, 설탕과 같이, 신맛, 짠맛, 떫은맛, 단맛, 쓴맛 등 각종의 물질의 다른 미감과 잘 조화되고, 보통의 일반 식품의 감미부, 미감 개량, 또는 품질 개량 등에 광범위하게 사용할 수 있음을 나타낸다.

Claims (14)

  1. 스테비오사이드의 19-OH 위치에 글루코스가 알파-글리코시드 결합에 의해 연결되어 부가된 α-글루코실 스테비오사이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 글루코실 스테비오사이드는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 기재되는 것인 α-글루코실 스테비오사이드.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012006070-appb-I000001
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2012006070-appb-I000002
  3. 스테비오사이드에 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물을 처리하는 단계를 포함하는, 제1항 또는 제2항의 α-글루코실 스테비오사이드의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 글루칸수크라제는 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 미생물로부터 유래된 것이거나, 상기 미생물은 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 미생물인 것인 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 류코노스톡 속 미생물은 류코노스톡 시트레움 KM20 (Leuconostoc citreum KM20) 또는 류코노스톡 락틱스(Leuconostoc lactics)인 것인 제조 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물은 스테비오사이드의 19-OH 위치에 알파-1,3 또는 알파-1,6 글리코시드 결합을 통해 글루코스 하나를 선택적으로 부가하여 연결하는 것이 특징인 제조 방법.
  7. 수크로즈, 및 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물을 함유하는 스테비오사이드의 α-글루코실화 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 글루칸수크라제는 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 미생물로부터 유래된 것이거나, 상기 미생물은 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 미생물인 것인 α-글루코실화 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 레우코노스톡 속 미생물은 류코노스톡 시트레움 KM20 (Leuconostoc citreum KM20) 또는 류코노스톡 락틱스(Leuconostoc lactics)인 것인 α-글루코실화 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항의 α-글루코실 스테비오사이드를 유효성분으로 함유하는 감미료 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항의 α-글루코실 스테비오사이드를 감미료로 함유하는 식품 조성물.
  12. 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품에 글루칸수크라제 또는 이를 생산하는 미생물을 처리하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품의 감미질 개선 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 글루칸수크라제는 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 미생물로부터 유래된 것이거나, 상기 미생물은 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 미생물인 것인 감미질 개선 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 레우코노스톡 속 미생물은 류코노스톡 시트레움 KM20 (Leuconostoc citreum KM20) 또는 류코노스톡 락틱스(Leuconostoc lactics)인 것인 감미질 개선 방법.
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