JP6636003B2

JP6636003B2 - 糖組成物の製造方法及び糖組成物

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Publication number: JP6636003B2
Application number: JP2017226723A
Authority: JP
Inventors: 健太相沢; 宏基高木
Original assignee: Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Current assignee: Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2020-01-29
Anticipated expiration: 2037-11-27
Also published as: JP2019092469A

Description

本発明は、新規な糖組成物及び糖結晶の製造方法、該糖組成物を用いた飲食品、医薬品、呈味改善剤、腸内菌叢改善剤の製造方法、及び該製造方法によって得られた新規な糖組成物に関する。

基質糖質に糖質分解酵素の１種であるβ−グルコシダーゼを作用させることにより種々のオリゴ糖を製造する技術が報告されている。例えば、特許文献１には、乳糖にβ−グルコシダーゼを作用させるガラクトオリゴ糖の製造方法が記載されている。特許文献２には、グルコースにアスペルギルス属に属する微生物の生産するβ−グルコシダーゼを作用させるソホロースの製造方法が記載されている。特許文献３には、グルコースに微生物起源のβ−グルコシダーゼを作用させるβ−グルコオリゴ糖の製造方法が記載されている。

特開平０２−２０９８８４号公報特開平０５−２１１８８３号公報特開平０２−２１９５８４号公報

しかしながら、グルコースとフルクトースを含有する基質糖質にβ−グルコシダーゼを作用させることにより糖組成物を得たという報告例はない。

したがって、本発明の目的は、グルコースとフルクトースとを基質糖質としてβ−グルコシダーゼを作用させる、新たな糖組成物の製造方法を提供することにある。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、グルコースとフルクトースとを含有する基質糖質にβ−グルコシダーゼを作用させることにより、新たな糖組成物が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、グルコースとフルクトースとを含有する糖質原料にβ−グルコシダーゼを作用させることを特徴とする新規糖組成物の製造方法を提供するものである。

本発明の糖組成物の製造方法では、前記糖質原料に前記β−グルコシダーゼを作用させることによって、下記式（１）で示されるβ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースを含有する糖組成物を得ることが好ましい。

また、本発明の糖組成物の製造方法では、前記糖質原料に前記β−グルコシダーゼを作用させることによって得られる糖組成物を分画処理して、前記β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースの濃度が高められた画分を採取することが好ましい。

更に、本発明の糖組成物の製造方法では、前記β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースを０．５質量％以上含有することが好ましい。

更にまた、本発明の糖組成物の製造方法では、前記糖質原料におけるグルコースとフルクトースの含有質量比が０．１：１０〜１０：０．1であることが好ましい。

更にまた、本発明の糖組成物の製造方法では、グルコース及びフルクトースを含有し、固形分濃度が３０〜９０質量％である糖質原料水溶液に、前記β−グルコシダーゼを作用させることが好ましい。

更にまた、本発明の糖組成物の製造方法では、前記糖質原料として、果糖ブドウ糖液糖を用いることが好ましい。

更にまた、本発明は、上記の糖組成物の製造方法で得られた糖組成物から、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースの結晶を得ることを特徴とするβ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースの結晶の製造方法を提供するものである。

更にまた、本発明は、上記の糖組成物の製造方法で得られた糖組成物を、飲食品の原料として用いることを特徴とする飲食品の製造方法を提供するものである。

更にまた、本発明は、上記の糖組成物の製造方法で得られた糖組成物を、医薬品の原料として用いることを特徴とする医薬品の製造方法を提供するものである。

更にまた、本発明は、上記の糖組成物の製造方法で得られた糖組成物を、呈味改善剤の有効成分として用いることを特徴とする呈味改善剤の製造方法を提供するものである。

更にまた、本発明は、上記の糖組成物の製造方法で得られた糖組成物を、腸内菌叢改善剤の有効成分として用いることを特徴とする腸内菌叢改善剤の製造方法を提供するものである。

更にまた、本発明は、下記式（１）で示されるβ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースを含有することを特徴とする糖組成物を提供するものである。

本発明によれば、グルコースとフルクトースとを含有する糖質原料にβ−グルコシダーゼを作用させることにより、新規な糖であるβ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースを含有する糖組成物を製造することができる。本発明により得られる糖組成物に含まれるβ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースは苦味を有し、難消化性であるため、この糖組成物は、飲食品や医薬品の原料として有用であり、特に、呈味改善剤や腸内菌叢改善剤として有用である。

製造例１で得られた結晶の質量検出器分析チャートを示す図である。製造例１で得られた結晶の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのチャートを示す図である。製造例１で得られた結晶の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのチャートを示す図である。製造例１で得られた結晶のＨ−ＨＣＯＳＹスペクトルのチャートを示す図である。製造例１で得られた結晶のＥ−ＨＳＱＣスペクトルのチャートを示す図である。製造例１で得られた結晶のＨＭＢＣスペクトルのチャートを示す図である。製造例１で得られたサンプルの主成分であるβ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースの構造式（β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−β−Ｄ−フルクトピラノース型）を示す図である。 β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースとスクロースの人工胃液での残存率を示す図である。 β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースとスクロースの消化酵素での残存率を示す図である。 B. catenulatum JCM 1194を用いた、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースとスクロースとフルクトオリゴ糖の資化性試験を示す図である。 B. longum subsp. Longum JCM1217を用いた、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースとスクロースとフルクトオリゴ糖の資化性試験を示す図である。 B. adolecentis JCM1275を用いた、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースとスクロースとフルクトオリゴ糖の資化性試験を示す図である。

本発明の製造方法の１つは、グルコースとフルクトースとを含有する糖質原料にβ−グルコシダーゼを作用させる糖組成物の製造方法である。

原料となる糖質（糖質原料）は、グルコース及びフルクトースを含有するものであれば特に制限はなく、グルコース及びフルクトースを任意で混合したものでもよく、例えばスクロース等のグルコース及びフルクトースを構成糖として含む糖質を分解することにより生成させたものでもよく、例えば異性化酵素等の触媒によりグルコースまたはフルクトースをもう一方の糖質に異性化することにより生成させたものでもよい。このような糖として、入手のしやすさやコスト等を考慮すると、異性化糖（ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖、高果糖液糖）や転化糖を用いるのが好ましい。

糖質原料におけるグルコースとフルクトースの質量比は、特に制限はないが、固形分換算でグルコースとフルクトースの質量比が０．１：１０〜１０：０．１とするのが好ましく、１：１０〜１０：１とするのがより好ましく、１：４〜４：１とするのがさらに好ましい。

用いるβ−グルコシダーゼとしては、特に制限はなく、種々の起源の酵素を用いることができる。例えば、アーモンド由来、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）由来のβ−グルコシダーゼを用いることができ、培養した微生物等から分離精製した酵素を用いてもよく、市販の酵素製剤を用いてもよい。酵素製剤としてはβ-グルコシダーゼ製剤だけでなく、β-グルコシダーゼが混在したセルラーゼ製剤等を用いることができる。

また、β−グルコシダーゼに加えて他の酵素を併せて用いても良い。他の酵素としては、例えば、α−グルコシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコアミラーゼ等が挙げられる。

グルコースとフルクトースにβ−グルコシダーゼを作用させる条件としては、用いるβ−グルコシダーゼの至適条件等を考慮して適宜設定することができる。例えば、グルコース及びフルクトースを含有し、固形分濃度が好ましくは３０〜９０質量％、より好ましくは５０〜８０質量％である水溶液を調製し、ｐＨを好ましくは４．０〜８．０、より好ましくは５．０〜７．０とし、上記固形分１ｇ当たり、好ましくは０．１〜１０００ｍｇ、より好ましくは１〜２５０ｍｇとなるようにβ−グルコシダーゼを添加し、好ましくは３０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃にて、好ましくは１〜１００時間、より好ましくは２４〜７２時間保持することで作用させることができる。なお、上記水溶液の固形分当たりのグルコース及びフルクトースの合計含量は３０質量％以上であることが好ましく、５０質量％以上であることがより好ましく、７０質量％以上であることがさらに好ましい。

また、例えば、二糖含量の原料糖質からの増加量が３質量％以上となるように作用させることができ、好ましくは増加量が６質量％以上となるように、より好ましくは増加量が１０質量％以上となるように作用させることができる。また、例えば、グルコースおよびフルクトースの合計含有量が原料糖質の含有量（質量％）の９０％以下となるように作用させることができ、好ましくは８０％以下となるように、より好ましくは７５％以下となるように作用させることができる。さらに例えば、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトース含量が０．５質量％以上となるように作用させることができ、好ましくは１質量％以上となるように、より好ましくは２質量％以上となるように、特に好ましくは３質量％以上となるように作用させることができる。

グルコースとフルクトースにβ−グルコシダーゼを作用させて得られる糖組成物は、液状のままであってもよいが、噴霧乾燥等の公知の方法により粉末状とすることができる。

また、得られる糖組成物は、必要に応じて、ろ過、脱色、脱臭、脱塩などの精製処理を常法により施すことができ、必要に応じて、濃縮・希釈により固形分濃度を調整することができる。また、抽出、遠心分離、晶出、微生物資化、更に活性炭、多孔質担体、疎水性樹脂、親水性樹脂、イオン交換樹脂、吸着樹脂等を利用したクロマトグラフィーによる分画、透析、限界ろ過等の膜分画等の処理を施して特定の糖質を高純度で含むものとすることができる。工業的にはクロマトグラフィー分画あるいは膜分画により糖組成物中の単糖を除去する処理がよく実施される。また、クロマトグラフィー分画により目的組成物を多く含む画分を回収し、純度を向上させることもよく実施される。

さらに、得られる糖組成物は、結晶状であってもよい。結晶状とする方法としては、特に制限はなく、温度低下、濃縮、溶媒添加(エタノール、メタノール、アセトン等)等による方法が挙げられる。

本発明の糖組成物は、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースを含有する様々な二糖等を含む。ここで、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトース（以下、「Ｇβ１−１Ｆ」ともいう。）は、グルコースの１位とフルクトースの１位がβ結合した二糖である。

なお、上記β−グルコシダーゼの作用により生成するＧβ１−１Ｆは主にβ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−β−Ｄ−フルクトピラノースとして存在するが、後述の通り鎖状構造を介して構造が変化し、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−α−Ｄ−フルクトピラノース、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−α−Ｄ−フルクトフラノース、及びβ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−β−Ｄ−フルクトフラノースとしても微量に存在する。

本発明の糖組成物を分画処理して、Ｇβ１−１Ｆの純度が高められた画分を採取することができる。特に、Ｇβ１−１Ｆは水溶液中での溶解度が低いことから、例えば、Ｇβ１−１Ｆ含有糖組成物を冷却及び／又は濃縮することで容易に結晶状とすることが可能である。このように、Ｇβ１−１Ｆを結晶状とすることにもよって、比較的容易にＧβ１−１Ｆの高純度物を得ることができる。

本発明のＧβ１−１Ｆを含有する糖組成物は、Ｇβ１−１Ｆを含有するものであればよく、Ｇβ１−１Ｆの含有量は特に制限はないが、例えば、固形分あたり０．５質量％以上とすることが好ましく、１質量％以上とすることがより好ましく、２質量％以上とすることがさらに好ましく、３質量％以上とすることが最も好ましい。固形分あたりのＧβ１−１Ｆの含有量が０．５質量％未満では、Ｇβ１−１Ｆの特徴を十分に付与することができないというデメリットがある。

本発明の糖組成物は、飲食品の原料として利用することができる。対象となる飲食品としては、特に制限はなく、食することが可能なあらゆる飲食品を挙げることができる。例えば、下記飲食品が挙げられる。

・ノンアルコール飲料（果汁含有飲料、果汁ジュース、野菜ジュース、炭酸飲料、アイソトニック飲料、アミノ酸飲料、スポーツ飲料、コーヒー、カフェオレ、ココア飲料、茶系飲料、乳酸菌飲料、乳飲料、栄養ドリンク、ノンアルコールビール、ノンアルコールチューハイ、ノンアルコールカクテル、ニアウォーター、フレーバーウォーターなど）、アルコール飲料（ビール、発泡酒、リキュール、チューハイ、清酒、ワイン、果実酒、カクテル、蒸留酒など）などの飲料類
・アイスクリーム、アイスキャンディー、シャーベット、かき氷、フラッペ、フローズンヨーグルト、ゼリー、プリン、ババロア、水羊羹などの冷菓類
・水飴、果実のシロップ漬、氷みつ、チョコレートシロップ、カラメルシロップなどのシロップ類
・フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、バタークリーム、カスタードクリームなどのペースト類
・マーマレード、フルーツソース、ブルーベリージャム、苺ジャムなどのジャム類
・食パン、ロールパン、ブリオッシュ、蒸しパン、あんパン、クリームパンなどのパン類
・ビスケット、クラッカー、クッキー、ワッフル、マフィン、スポンジケーキ、パイなどの焼菓子類
・シュークリーム、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディなどの洋菓子類
・せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、大福、ういろう、餡類、錦玉、カステラ、飴玉などの和菓子類
・醤油、魚醤、味噌、ひしお、マヨネーズ、ドレッシング、三杯酢、天つゆ、麺つゆ、ウスターソース、オイスターソース、ケチャップ、焼き鳥のタレ、焼き肉のタレ、漬け込みタレ、甘味料、粉飴、食酢、すし酢、カレールウ、中華の素、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルソルト、テーブルシュガーなどの各種調味料類
・パスタソース、ミートソース、トマトソース、ホワイトソース、デミグラスソース、カレーソース、ハヤシソース、グレービーソース、ハンバーグソース、サルサソース、ステーキソースなどのソース類
・糠漬け、粕漬け、味噌漬け、福神漬け、べったら漬、奈良漬け、千枚漬、梅干しなどの漬物類
・たくわん漬の素、白菜漬の素、キムチの素などの漬物の素
・ハム、ベーコン、ソーセージ、ハンバーグ、ミートボールなどの畜肉製品類
・魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、干物などの魚肉製品類
・塩ウニ、カラスミ、塩辛、なれずし、酢コンブ、さきするめ、田麩などの各種珍味類
・海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類
・煮豆、煮魚、ポテトサラダ、コンブ巻などの惣菜食品
・乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜などの瓶詰類や缶詰類
・天ぷら、トンカツ、フリッター、唐揚げ、竜田揚げなどの揚げ物用衣類
・うどん、そば、中華麺、パスタ、春雨、ビーフン、餃子の皮、シューマイの皮などの麺類
・プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席汁粉、即席スープなどの即席食品類。

また、飲食品としては、特定保健用食品、栄養機能食品、老人用食品、特別用途食品、機能性食品、健康補助食品（サプリメント）等も挙げられる。この場合の飲食品の形態は、例えば、粉末状、頼粒状、錠剤状、カプセル状、又は液状とすることができる。

本発明の糖組成物の飲食品への添加量は、０．１質量％以上となるようにすることが好ましく、１質量％以上となるようにすることがより好ましく、５質量％以上となるようにすることがさらに好ましい。本発明の糖組成物の添加量が、０．１質量％未満だと、本発明の糖組成物の特徴を十分に付与することができなくなる場合がある。

また、本発明の糖組成物は、後述する生理活性効果をもたらすための医薬品の原料として利用することができる。この場合の医薬品は、経口投与用の医薬品であることが好ましいが、外用の医薬品にもて適用することもできる。経口投与用の医薬品の剤形としては、具体的には、固形製剤として、粉末剤、頼粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ等、また、液状製剤として内用液剤、外用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等が挙げられる。

本発明で得られる医薬品は、糖組成物の他、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合成分を適宜含有していてもよい。

本発明の糖組成物の医薬品への添加量は、１質量％以上となるようにすることが好ましく、５質量％以上となるようにすることがより好ましく、１０質量％以上となるようにすることがさらに好ましい。本発明の糖組成物の添加量が、１質量％未満だと、本発明の糖組成物の特徴を十分に付与することができなくなる場合がある。

特に、後述の実施例に示すとおり、本発明の糖組成物は、黒糖様の独特のコクを有するという特徴的な味質を有している。上記糖組成物は、種々の二糖等を含む複雑な糖組成であるため、種々の糖質の味質が影響し合い複雑なコクに繋がっているものと推察される。上記味質を利用して、本発明の糖組成物は、飲食品や医薬品の原料として用いることができ、さらに有効成分として呈味改善剤に用いることができる。

糖組成物を有効成分とする呈味改善剤を添加する飲食品も特に制限はないが、例えば、甘味、コク、キレ、苦味等を付与する目的や特定の風味をマスキングする目的で糖質を添加するものであればよい。このような飲食品として、呈味改善効果をより効果的に発揮できる観点から、飲料類、冷菓類、シロップ類、ペースト類、ジャム類、焼き菓子類、洋菓子類、和菓子類、調味料類、ソース類が例示される。

また、Ｇβ１−１Ｆ自体は、苦味を有することから、例えば、飲食品や医薬品に苦味を付与するために用いることができる。飲食品や医薬品に添加することで、コクの付与・増強、キレの付与・増強、果汁感の付与・増強、乳味感の付与・増強、エグ味低減、高甘味度甘味料の呈味改善等の呈味改善作用を発揮することが期待される。

また、特に、本発明の糖組成物が含有するＧβ１−１Ｆは、後述する実施例に示されるように、プレバイオティクス素材として知られるフルクトオリゴ糖と同等以上にBifidobacteriumに対する資化性を有していることから、本発明の糖組成物は、腸内菌叢改善剤、すなわち、腸内菌叢改善用の医薬品、飲食品として利用することができる。ここで、飲食品としては、特定保健用食品、栄養機能食品、老人用食品、特別用途食品、機能性食品、健康補助食品（サプリメント）等が含まれる。

この場合、本発明の腸内菌叢改善剤の有効投与量は、特に限定されないが、Ｇβ１−１Ｆの投与量として、成人１日当たり０．５〜３０ｇが好ましく、２〜１０ｇがより好ましい。

なお、Ｇβ１−１Ｆは、人や動物の栄養成分であるグルコース及びフルクトースを含有する原料にβ−グルコシダーゼを作用させて生成したものであることから、人や動物に対して安全性を有している。

また、Ｇβ１−１Ｆは、後述する実施例に示されるように、難消化性糖質であることから、ダイエット用の低カロリー素材として飲食品や医薬品に用いることができるだけでなく、脂肪蓄積抑制用、肥満改善及び/又は予防用、メタボリック症候群治療及び/又は予防用等の飲食品や医薬品に用いることができる。

さらに、本発明の糖組成物が含有するＧβ１−１Ｆは、難消化性糖質であって、腸内細菌の増殖を促進するという特徴から、糖組成物をプレバイオティクスとして飲食品や医薬品に用いることができる。

この他、本発明の糖組成物は、腸内細菌の増殖を促進するという特徴から、難消化性オリゴ糖と同様に、整腸剤、便通改善剤、ミネラル吸収促進剤、腸管バリア機能亢進剤、脂質代謝改善剤、免疫調節剤、血糖上昇抑制剤として機能を発揮することが期待される。

なお、本発明においては、下記実施例に示したＨＰＬＣ条件で保持時間３７．８分、３６．２分及び３４．５分に検出されるピーク成分を二糖成分と判断した。また、本発明における糖組成は、固形分あたりの糖組成（各糖質の含量（質量％））を意味する。

＜製造例1＞
Ｄ−グルコース（製品名：無水結晶ぶどう糖、日本食品化工株式会社製）（以下、「グルコース」ともいう。）、Ｄ−フルクトース（ナカライテスク株式会社製製）（以下、「フルクトース」ともいう。）、及びグルコースとフルクトースを等重量混合したものをそれぞれ７５ｗ／ｗ％となるように超純水に溶解した。１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を１０ｍＭとなるように添加した。６６℃下でβ−グルコシダーゼ（東洋紡株式会社製）を１４ｍｇ／ｇ−ｄｓ添加し、７２時間保持し、反応させた。それぞれの保持時間後の反応液中の糖組成をＨＰＬＣにて分析した。

ＨＰＬＣ分析は、カラム（３００ｍｍ×８．０ｍｍＩ．Ｄ．）（製品名：ＵＬＴＲＯＮＰＳ−８０Ｎ．Ｌ、信和化工株式会社製）を二本連結し、カラム温度を５０℃として超純水を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで通液し、示差屈折率検出器（株式会社島津製作所製）で検出を行った。

結果を表１に示した。

グルコースを糖質原料とした場合は、保持時間３４．５分に二糖、３１．５＋３０．７分に三糖、及び３０分よりも早い時間に四糖以上のピークが増加した。フルクトースを糖質原料とした場合は、糖組成は反応前後でほぼ変化しなかった。グルコースとフルクトース、それぞれ等量を糖質原料とした場合は、グルコースと同様に、保持時間３４．５分に二糖、３１．５＋３０．７分に三糖、及び３０分よりも早い時間に四糖以上のピークが増加し、それ以外に保持時間３６．２分、及び３７．８分に二糖のピークが増加した。

なお、表１から明らかな通り、グルコースとフルクトースを糖質原料とした反応液において、グルコースとフルクトースの合計含有量は７３．６％と原料糖質（９９．７質量％）の７３．８質量％であり、また二糖画分の増加量は１９．０質量％（原料の二糖含量０．３質量％に対し反応液の二糖含量１９．３質量％）であった。

それぞれ等量のグルコースとフルクトースを糖質原料として得られた反応液を、以降の試験の試料とした。

（１）味質の確認１
上記においてグルコースとフルクトースを糖質原料とした反応液を常法に沿って精製し、その味質を確認したところ、黒糖のような特有のコクを有する味質であった。すなわち、グルコースとフルクトースとを含有する糖質原料にβ−グルコシダーゼを作用させて得られた糖組成物は、黒糖様の特有のコク味を有することがわかった。

（２）分画処理
カーボン−セライトカラムクロマトグラフィーにより、反応液の分画を行った。活性炭「精製白驚」（製品名、大阪ガスケミカル株式会社製）と、「セライト５４５」（製品名、関東化学株式会社製）とを等重量混合し、水に懸濁したスラリーをガラスカラム（型番：ＸＫ―２６／４０、ファルマシア製）（φ２．６×４０ｃｍ）に充填し、これにＢｘ５０の試料１０ｍＬを負荷した。クロマトグラフィーは室温で行い、流速を５ｍＬ／ｍｉｎとした。まず超純水を通液して単糖類を溶出させた後、１.５ｖ/ｖ％エタノール及び３.０ｖ/ｖ％エタノールを通液して未知ピーク及び二糖を溶出させた。二糖の溶出が完了したことを確認後、５０ｖ/ｖ％エタノールを通液して三糖以上のサンプルを溶出させた。

１．５ｖ/ｖ％エタノールを通液したときの溶出液を一定量ずつ分画し、ロータリーエバポレーター（東京理化器械株式会社製）でＢｘ４０程度に濃縮した。

サンプルの糖組成を上記と同様にＨＰＬＣにて分析し、その結果を表２に示した。

サンプルの濃縮液を一晩４℃保存したところ、保持時間３６．２分の溶出物を多く含有する分画Ｎｏ.１〜３で白色結晶の生成が確認された。ＨＰＬＣで分析したところ、白色結晶は保持時間３６．２分の物質が主成分であった。

分画Ｎｏ.３の結晶を純水に再溶解し、Ｂｘ４０程度に濃縮して再び一晩４℃保存したところ再び結晶が生成し、主成分の純度が向上した。さらにもう一度同じ操作を繰り返すことで純度は９９．３％となった（表３）。

（３）生成物の同定
得られた結晶を質量検出器（製品名：５６１０質量検出器、日立ハイテクサイエンス製）で分析した結果、分子量３６５となり（ナトリウム分の２３を減じて３４２）、二糖であることが確認された（図１）。

次に、４００ＭＨｚ核磁気共鳴分光計（ＮＭＲ）（製品名：Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ４００ＰＬＵＳ、ＢＲＵＫＥＲ社製）を用いて結晶の分析を行った。測定は一次元として^１Ｈ（図２）、及び^１３Ｃ（図３）、二次元としてＨ−ＨＣＯＳＹ（図４）、Ｅ−ＨＳＱＣ（図５）、及びＨＭＢＣ（図６）により行った（表４）。なお、分析は結晶を重水に溶解して実施した。トリメチルシリルプロパン酸を内部基準物質として微量添加し、当該物質由来のピークを０ｐｐｍとした。

分析と解析の結果、サンプルの主成分はβ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−β−Ｄ−フルクトピラノースであった（図７）。ＮＭＲのデータには高純度のサンプルにも関わらず、複数の微小ピークが確認された。これはβ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−β−Ｄ−フルクトピラノースが開環構造を経て、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−α−Ｄ−フルクトピラノース、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−α−Ｄ−フルクトフラノース、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−β−Ｄ−フルクトフラノースの異性体となっているものと考えられた。従って、本サンプルはβ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−β−Ｄ−フルクトピラノースを主構造とするＧβ１−１Ｆであることが明らかとなった。

（４）味質の確認２
Ｇβ１−１Ｆを超純水に１０ｗ/ｗ％となるように溶解し味質を確認したところ、苦味が感じられた。すなわち、Ｇβ１−１Ｆは苦味を有する糖質であることがわかった。

（５）人工胃液試験
Ｇβ１−１Ｆの人工胃液による分解を確認した。

サンプルを０．７３ｗ／ｖ％となるように、１６．７ｍＭＨＣｌ−ＫＣｌ緩衝液（ｐＨ２．０）で溶解し、３７℃で保持した。０、３０、６０、１２０分でサンプリングし、イオン交換樹脂（製品名:アンバーライトＭＢ４、オルガノ株式会社）を加えて脱塩後、０．４５μｍフィルターろ過して、ＨＰＬＣで分析した。得られたピーク面積を反応０分のピーク面積で除し、１００を乗ずることで残存率を算出した。

ＨＰＬＣ分析は、カラム（３００ｍｍ×８．０ｍｍＩ．Ｄ．）（製品名：ＵＬＴＲＯＮＰＳ−８０Ｎ．Ｌ、信和化工株式会社製）を使用し、カラム温度を５０℃として超純水を流速０．９ｍＬ／ｍｉｎで通液し、示差屈折率検出器（株式会社島津製作所製）で検出を行った。

この結果から、Ｇβ１−１Ｆはスクロースと同様に人口胃液によっても分解されないことがわかった（図８）。

（６）消化性試験
Ｇβ１−１Ｆの消化酵素による消化性を確認した。

ラット小腸アセトンパウダー（製品名、シグマ社）２ｇを４５ｍＭマレイン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６．）２０ｍＬに懸濁後、遠心分離（１９０００ｇ、１０分間）して上清を回収した。得られた溶液の活性を測定し、消化酵素溶液として下記のインビトロ消化性試験に用いた。

消化酵素溶液の活性は、マルターゼ活性として測定した。純水で適宜希釈した消化酵素溶液１５μＬに０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を４０μＬ添加し、３７℃に保持した。これに２ｗ/ｖ％マルトース溶液４５μＬを添加して反応を開始した。１０分後、これに２ＭＴｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７．０）２００μＬを添加して反応を停止し、グルコースＣ−ＩＩテストワコー（製品名、和光純薬工業社）８０μＬを添加して３７℃に３０分間程度保持して発色させた。Ａ_４９２を測定し、グルコースの標準曲線に基づき、遊離グルコース量を算出した。

グルコースの標準曲線は、０〜０．０１ｗ／ｖ％グルコース水溶液１００μＬに上記と同様に２ＭＴｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７．０）及び発色試薬を添加することにより作成した。酵素活性１Ｕを上記条件下で１分間に２μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量と定義した。

４５ｍＭマレイン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）に終濃度０．４５ｗ/ｖ％となるようにサンプルを溶解し、上記手法で調製した消化酵素溶液を８６Ｕ／ｇ−ｄｓとなるように添加し、３７℃で保持した。反応液２０μＬを２ＭＴｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液２００μＬと混合して反応を停止し、適宜サンプリングを行った。サンプリングした溶液のグルコース量はグルコースＣ−ＩＩテストワコーを用いてグルコースオキシダーゼ法により測定した。分解率＝グルコース質量×２／基質質量×１００と定義した。

試験の結果、スクロースは速やかに分解されたのに対してＧβ１−１Ｆはまったく分解されなかったことから、Ｇβ１−１Ｆが難消化性糖質であることが明らかとなった（図９）。

（７）資化性試験
供試菌株B. catenulatum JCM 1194、B. longum subsp. Longum JCM 1217、及びB. adolecentis JCM1275（いずれもビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）の菌株、JCMの番号は、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室の寄託番号である）を用い、唯一の炭素源としてグルコースを終濃度１５％添加したＩＬ培地にて、嫌気ジャー及びアネロペック・ケンキ（ともに製品綿、三菱ガス化学社製）を使用した嫌気条件下にて３７℃、２４時間前培養を行った。次いで、Ｇβ１−１Ｆ又はフルクトオリゴ糖(和光純薬工業)を、それぞれ終濃度１％になるように添加したＩＬＳ培地３．０ｍＬに当該前培養液を１ｖ／ｖ％植菌し、３７℃、嫌気条件化にて培養を行った。またネガティブコントロールとして炭素源の代わりに滅菌超純水を添加した。資化性は菌体増殖にて判断することとし、経時的に簡易ＯＤモニター「ｍｉｎｉｐｈｏｔｏ５１８Ｒ」（製品名、ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて菌濁度（ＯＤ６６０）を測定し、増殖曲線を描いた。

B. catenulatum JCM 1194を用いた資化性試験では、Ｇβ１−１Ｆの資化性はフラクトオリゴ糖と同程度であった（図１０）。B. longum subsp. Longum JCM 1217を用いた資化性試験では、フラクトオリゴ糖が資化性を示したのに対して、Ｇβ１−１Ｆはほとんど資化性を示さなかった（図１１）。B. adolecentis JCM1275を用いた資化性試験では、Ｇβ１−１Ｆの資化性はフラクトオリゴ糖より高い資化性を示した（図１２）。

従って、Ｇβ１−１Ｆは、プレバイオティクス素材として知られるフルクトオリゴ糖と同等以上にBifidobacteriumに対する資化性を有していることから、プレバイオティクスとして利用できる可能性が示唆された。また、資化性を示さなかった菌株もあることから、特定の菌種を選択的に増殖させることができると示唆された。

＜製造例２＞
グルコースを４０質量％及びフルクトースを５５質量％含有する果糖ぶどう糖液糖（製品名：フジフラクトＨ−１００、日本食品化工株式会社製）をｐＨ５．０に調整し、６６℃下でセルラーゼ製剤「スミチームＡＣＬ」（製品名、新日本化学工業株式会社製)を１２８ｍｇ／ｇ−ｄｓ添加し、７２時間保持し、反応させた。

得られた反応液を上記製造例１と同様にＨＰＬＣ分析した結果を表５に示した。

表５に示されたとおり、得られた反応液において、グルコースとフルクトースの合計含有量は７４．８質量％と原料糖質（９５.０質量％）の７８．７％であり、また二糖画分の増加量は１５．８質量％（原料の二糖含量３．４質量％に対し反応液の二糖含量１９．２質量％）であった。また、その味を確認したところ、製造例１の反応液と同様の味質を有していた。

その後、上記と同様の分画処理を行ったところ、白色結晶が得られた。得られた結晶をＨＰＬＣで分析した結果、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースと同様の保持時間であった。

＜飲食品への添加試験例＞
表６に示す処方により果汁飲料を調製し、３名の専門パネラーにより官能評価を行った。

実施例では、「中、後半に味の厚みがある」、「複雑な味質を感じる」、「果汁感を強く感じる」等の比較例にはない良好な味質が確認された。

Claims

グルコースとフルクトースとを含有する糖質原料にβ−グルコシダーゼを作用させることを特徴とする、下記式（１）で示されるβ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースを含有する糖組成物の製造方法。
前記糖質原料に前記β−グルコシダーゼを作用させることによって得られる糖組成物を分画処理して、前記β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースの濃度が高められた画分を採取する、請求項１に記載の糖組成物の製造方法。
前記β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースを０．５質量％以上含有する請求項１又は２に記載の糖組成物の製造方法。
前記糖質原料におけるグルコースとフルクトースの含有質量比が０．１：１０〜１０：０．1である、請求項１〜３のいずれか1項に記載の糖組成物の製造方法。
グルコース及びフルクトースを含有し、固形分濃度が３０〜９０質量％である糖質原料水溶液に、前記β−グルコシダーゼを作用させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖組成物の製造方法。
前記糖質原料として、果糖ブドウ糖液糖を用いる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の糖組成物の製造方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖組成物の製造方法で得られた糖組成物から、β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースの結晶を得ることを特徴とするβ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースの結晶の製造方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖組成物の製造方法で得られた糖組成物を、飲食品の原料として用いることを特徴とする飲食品の製造方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖組成物の製造方法で得られた糖組成物を、医薬品の原料として用いることを特徴とする医薬品の製造方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖組成物の製造方法で得られた糖組成物を、呈味改善剤の有効成分として用いることを特徴とする呈味改善剤の製造方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖組成物の製造方法で得られた糖組成物を、腸内菌叢改善剤の有効成分として用いることを特徴とする腸内菌叢改善剤の製造方法。
下記式（１）で示されるβ−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−Ｄ−フルクトースを含有することを特徴とする糖組成物。