JP3650682B2 - トレハルロース含有糖質とその製造方法並びに用途 - Google Patents
トレハルロース含有糖質とその製造方法並びに用途 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、トレハルロース含有糖質とその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には蔗糖にマルトース・トレハロース変換酵素を作用させ得られるトレハルロース含有糖質、および蔗糖にマルトース・トレハロース変換酵素を作用させるトレハルロース含有糖質の製造方法、並びにこの糖質を含有せしめた組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トレハルロースは、グルコースとフルクトースとからなる二糖類であり、化学的には１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトースで示される還元性糖質で、天然界ではわずかながら蜂蜜中に存在している。トレハルロースは、非晶質であって水に対する溶解性が高く、しかも、う蝕を誘発しにくく、甘味度が蔗糖の約４０％の糖質であることから、種々の飲食物への利用が期待されており、特に甘味糖質を多く含む食品、例えば、ジャム、あん、羊羹等に利用するのに好適である。本糖質の調製方法としては、『精糖技術研究会誌』、第３４号、３７頁乃至第４４頁（１９８５年）に記載されているように、プロタミノバクター・ルブラム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）のα−グルコシダーゼの糖転移作用によって、蔗糖から生成することが知られている。この酵素反応では、得られる主成分がパラチノース（６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトース）であり、トレハルロースは、パラチノース結晶製品の副産物として得られる。また、トレハルロースを主成分とする糖質の製造方法としては、例えば、特開平４−１６９１９０号公報で報告されているシュードモナス・メソアシドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）ＭＸ−４５や、特開平５−１３０８８６号公報で報告されているアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＭＸ−２３２の固定化菌体を用いて蔗糖から製造する方法が提案されているものの、酵素活性、温度安定性などが不充分で、未だ工業的に実現を見ていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、蔗糖からのトレハルロース生成率が高く、工業的実施の容易なトレハルロースの製造方法を提供するとともに、この製造方法により得られるトレハルロース含有糖質とこの糖質の用途を提供することを課題とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、トレハルロースの製造方法について鋭意検討してきた。その結果、本発明者等が先に特開平７−１７０９７７号公報で開示したマルトース・トレハロース変換酵素が、マルトースをトレハロースへ変換するのみならず、蔗糖からトレハルロースを容易に高率で生成する意外な事実を見いだし、蔗糖含有溶液にマルトース・トレハロース変換酵素を作用させることを特徴とするトレハルロース含有糖質の製造方法を確立し、併せて、この製造方法で得られるトレハルロース含有糖質とこの糖質を含有せしめた飲食物、化粧品、医薬品などの組成物を確立して本発明を完成した。
【０００５】
マルトース・トレハロース変換酵素は、特開平７−１７０９７７号公報で開示したように、ピメロバクター・スピーシーズ（Ｐｉｍｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｒ４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１５）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）Ｈ２６２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７９）、あるいはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する微生物により生産され、マルトースをトレハロースに変換、又は、トレハロースをマルトースに変換する分子内糖転移酵素である。この反応の平衡点はトレハロース側に片寄っており、マルトースを基質とした場合のトレハロース生成率は約８０ｗ／ｗ％（以下、特にことわらない限り、本明細書ではｗ／ｗ％を％と略記する。）にも達する。
【０００６】
本発明では、上記菌株の酵素のみならず、ピメロバクター属及びシュードモナス属、サーマス属に属し、マルトース・トレハロース変換酵素産生能を有する他の菌株やこれらの変異株などの酵素も適宜使用することができる。また、サーマス属に属する微生物としては、例えば、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ２５１０４、サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ２７６３４、サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３、サーマス・フィリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ４３２８０、サーマス・ルーバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）ＡＴＣＣ３５９４８、サーマス・スピーシーズ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．）ＡＴＣＣ４３８１４、およびサーマス・スピーシーズ ＡＴＣＣ４３８１５などが有利に利用できる。
【０００７】
マルトース・トレハロース変換酵素を産生する微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、本酵素を産生するものであればよく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が資化できる物であればよく、例えば、グルコース、フルクトース、糖蜜、トレハロース、ラクトース、蔗糖、マンニトール、ソルビトール、澱粉部分分解物などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸又はそれらの塩なども使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択される。例えば、グルコースを用いる場合には、その濃度は、４０ｗ／ｖ％以下が望ましく、とりわけ、微生物の生育及び増殖からは１０ｗ／ｖ％以下が好ましい。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物や、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物などが用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。
【０００８】
培養条件は、微生物が生育し、本発明に用いるマルトース・トレハロース変換酵素を産生する条件であればよく、通常、温度約４乃至８０℃、好ましくは２０乃至７５℃、ｐＨ５乃至９、好ましくはｐＨ６乃至８．５から選ばれる条件で、好気的に行われる。培養時間は微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは約１０乃至１００時間である。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、約０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したり、酸素を使用したり、また、培養槽内の圧力を高めるなどの手段が採用される。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。
【０００９】
このようにして、微生物を培養した後、得られる培養物から酵素を回収する。マルトース・トレハロース変換酵素活性は、培養物の菌体外培養液及び菌体のいずれにも認められ、菌体外培養液及び菌体を粗酵素として回収すればよく、また、培養物全体を粗酵素として用いることもできる。菌体外培養液と菌体との分離には通常の固液分離手段が採用される。例えば、培養物そのものをそのまま遠心分離する手段、培養物に濾過助剤を加えたり、あるいは、プレコートすることにより濾過分離する手段、平膜、中空糸膜などを用いる膜濾過分離する手段などを適用し得る。菌体外培養液をそのまま粗酵素液として用いることができるが、好ましくは通常の手段で濃縮して用いる。例えば、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空糸膜などを用いる膜濃縮法などが採用される。
【００１０】
菌体内酵素は、通常の手段を用いて菌体から抽出し、粗酵素液として用いることができる。例えば、超音波による破砕法、ガラスビーズ及びアルミナによる機械的破砕法、フレンチプレスによる破砕法などで菌体から酵素を抽出し、遠心分離または膜濾過などで清澄な粗酵素液を得ることができる。
【００１１】
更に、菌体外培養液およびその濃縮物または菌体抽出液は、通常の手段で固定化することもできる。例えば、イオン交換体への結合法、樹脂および膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などが採用される。また、培養物から分離した菌体をそのまま粗酵素として用いることができるが、菌体を固定化し固定化酵素として用いてもよい。例えば、菌体をアルギン酸ナトリウムと混合して、塩化カルシウム溶液中に滴下して粒状にゲル化させ得られる粒状化菌体を、さらにポリエチレンイミン、グルタルアルデヒドで処理した固定化酵素として用いてもよい。
【００１２】
粗酵素はそのまま用いてもよいが、通常の手段によって精製することもできる。一例として、菌体破砕抽出液を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析後、ＤＥＡＥ−トヨパール樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、ブチルトヨパール樹脂を用いた疎水カラムクロマトグラフィー、モノＱ ＨＲ５／５樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、トヨパールＨＷ−５５樹脂を用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーなどを組合わせて電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。
【００１３】
本発明に用いるマルトース・トレハロース変換酵素の活性は次のようにして測定する。基質としてマルトース２０ｗ／ｖ％（１０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０）１ｍｌに酵素液１ｍｌを加え、反応温度を２５℃、３５℃あるいは６０℃とし、６０分間反応させた後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止させる。この反応液を５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．５で正確に１１倍に希釈し、その希釈液０．４ｍｌにトレハラーゼ含有溶液（１単位／ｍｌ）を０．１ｍｌ添加したものを４５℃、１２０分間インキュベートした後、この反応液中のグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量する。対照として、予め１００℃で１０分間加熱することにより失活させた酵素液およびトレハラーゼを用いて同様に測定する。上記の測定方法を用いて、増加するグルコース量からマルトース・トレハロース変換酵素により生成するトレハロース量を求め、その活性１単位は、１分間に１μｍｏｌｅのトレハロースを生成する酵素量と定義する。
なお、反応温度は、マルトース・トレハロース変換酵素が、ピメロバクター属に属する微生物由来の場合に２５℃とし、シュードモナス属に属する微生物由来の場合に３５℃とし、サーマス属に属する微生物由来の場合に６０℃とした。
【００１４】
本発明の基質濃度は特に限定されない。基質溶液として蔗糖濃度を、例えば、０．１％で用いた場合でも、５０％で用いた場合でも、本酵素の反応は進行し、トレハルロースを生成する。また、基質溶液中に完全に溶けきれない基質を含有する高濃度溶液であってもよい。反応温度は酵素が失活しない温度、すなわち８０℃付近までで行えばよいが、好ましくは約０乃至７０℃の範囲、とりわけサーマス属に属する微生物由来の酵素の場合には、約３０乃至５０℃の範囲において、蔗糖からのトレハルロース生成率が高く好都合である。反応ｐＨは、通常、５．５乃至９．０の範囲に調整すればよいが、好ましくはｐＨ約６．０乃至８．５の範囲に調整する。反応時間は、酵素反応の進行具合により適宜選択すればよく、通常、基質固形物グラム当たり約１０乃至１，０００単位の酵素使用量で約０．１乃至２００時間程度である。
【００１５】
このようにして得られる反応液のトレハルロース含量は、通常１０％以上、条件によっては３０％以上、最大で約８０％にも達することが判明した。
【００１６】
反応液は、常法により、瀘過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮し、シラップ状製品とすることも、更に、乾燥して粉末状製品にすることも随意である。
【００１７】
必要ならば、更に、高度な精製をすることも随意である。例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分画、活性炭カラムクロマトグラフィーによる分画、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画などの方法で精製することにより、高純度のトレハルロース製品を得ることも容易である。また、カラムクロマトグラフィーなどにより分離し得られる蔗糖を、再び、マルトース・トレハロース変換酵素の基質に用いてトレハルロース生成反応を行うことも有利に実施できる。
【００１８】
このようにして得られた本発明のトレハルロース含有糖質を、必要により、インベルターゼなどで加水分解したり、澱粉部分分解物などを加え、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼやグルコシルトランスフェラーゼなどで糖転移したりして、甘味性、粘性などを調整することも、また、酵母により発酵性糖質を除去することなど更なる加工処理を施すことも随意である。本発明のトレハルロース含有糖質から、前述の精製方法、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどにより、グルコース及びフルクトースを除去し、トレハルロース高含有画分を採取し、これを精製、濃縮して、シラップ状製品を得ることも、更に乾燥して粉末製品を得ることも有利に実施できる。
【００１９】
イオン交換カラムクロマトグラフィーとしては、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、夾雑糖類を除去してトレハルロース高含有画分を採取する方法が有利に実施できる。この際、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００２０】
このようにして製造される本発明のトレハルロース高含有糖質は、水に対する溶解性が高く、良質で上品な甘味を有している。更に、トレハルロースは、小腸の加水分解酵素によりグルコースとフルクトースとに分解されることから、経口摂取した場合、容易に消化吸収され、カロリー源として利用される。また、虫歯誘発菌などによって、醗酵されにくく、虫歯誘発菌による蔗糖からの不溶性グルカン合成を阻害することから、非う蝕性甘味料としても利用できる。
【００２１】
従って、本発明のトレハルロース含有糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤などとして飲食物、嗜好物、飼料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００２２】
本発明のトレハルロース含有糖質は、そのまま甘味付けのための調味料として使用することができる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メイプルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、レバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の一種または二種以上の適量と混合して使用してもよく、また必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００２３】
また、本発明のトレハルロース含有糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００２４】
例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、たくあん漬の素、白菜漬の素、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味料として有利に使用できる。
【００２５】
また、例えば、せんべい、あられ、おこし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、キャンデーなどの洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リキュール、洋酒などの酒類、紅茶、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、また、品質改良などに有利に利用できる。
【００２６】
また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤として、更には、品質改良剤として有利に利用できる。
【００２７】
以上述べたような各種組成物にトレハルロース含有糖質を含有せしめる方法は、その製品が完成するまでの工程で含有せしめればよく、例えば、混和、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常、トレハルロースとして０．１％以上、望ましくは、１％以上含有せしめるのが好適である。次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００２８】
【実験１】
〈酵素の産生〉
ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、硝酸ナトリウム０．０７ｗ／ｖ％、リン酸二ナトリウム０．０１ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム０．０１ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、ｐＨ７．５に調製した後、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃で、２０分間滅菌し、冷却して、サーマス アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３を接種し、６０℃、２００ｒｐｍで２４時間回転振とう培養したものを種培養とした。
【００２９】
容量３０ｌのファーメンター２基に種培養の場合と同組成の培地をそれぞれ約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度６０℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度６０℃、ｐＨ６．５乃至８．０に保ちつつ、約２０時間通気攪拌培養した。
【００３０】
【実験２】
〈酵素の精製〉
実験１で得られた培養液を遠心分離して湿重量約０．２８ｋｇの菌体を回収し、これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸濁液約１．９ｌを、超音波破砕機 モデルＵＳ３００（株式会社日本精機製作所製）で処理し、菌体を破砕した。この破砕処理液を遠心分離（１５，０００Ｇ、３０分間）することにより、約１．８ｌの上清を得た。その上清に飽和度０．７になるように硫安を加え溶解させ、４℃、一夜放置した後、遠心分離機にかけ、硫安塩析物を回収した。
【００３１】
得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透析液（１５６０ｍｌ）を、３回に分けて、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量５３０ｍｌ）にかけた。
【００３２】
マルトース・トレハロース変換酵素はＤＥＡＥ−トヨパールゲルに吸着し、食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムから溶出した。溶出した酵素活性画分を回収した後、１Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、次に、ブチルトヨパール ６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）を行った。吸着したマルトース・トレハロース変換酵素を硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントによりカラムより溶出させ、酵素活性画分を回収した。
【００３３】
次に、トヨパール ＨＷ−５５Ｓ（東ソー株式会社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）を行い、溶出した酵素活性画分を回収した。
【００３４】
続いて、モノＱ ＨＲ５／５ カラム（スウェーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル量１．０ｍｌ）を行い、食塩０．１Ｍから０．３５Ｍのリニアグラジエントにより溶出した酵素活性画分を回収し、電気泳動的に単一なマルトース・トレハロース変換酵素標品を得た。精製酵素標品の比活性は、蛋白ｍｇ当たり１３５単位であった。
【００３５】
【実験３】
〈各種糖質への作用〉
各種糖質を用いて、マルトース・トレハロース変換酵素を糖質グラム当たり５０単位の作用量で反応させ、基質になりうるかどうかの試験をした。最終濃度５ｗ／ｖ％の、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、トレハロース、ネオトレハロース、コージビオース、イソマルトース、マルチトール、セロビオース、ゲンチオビオース、蔗糖、トレハルロース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、あるいはラクトース溶液を調製した。
【００３６】
これらの溶液に実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を基質固形物グラム当たりそれぞれ５０単位ずつ加え、５０℃、ｐＨ７．０で４８時間作用させた。酵素反応前後の反応液をキーゼルゲル６０（メルク社製；アルミプレート，２０×２０ｃｍ）を用いた薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略称する。）にかけ、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を確認した。ＴＬＣは展開溶媒に１−ブタノール：ピリジン：水＝６：４：１（容積比）を用い、室温で１回展開した。発色は２０ｖ／ｖ％硫酸−メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で１０分間加熱しておこなった。酵素反応により生成物を認めた反応液については、ガスクロマトグラフィー（以下、ＧＬＣと略称する。）でその糖組成を分析した。酵素反応液の一部を乾固し、ピリジンに溶解した後、オキシム化後トリメチルシリル化したものを分析試料とした。ガスクロマトグラフ装置はＧＣ−１６Ａ（株式会社島津製作所製）、カラムは２％ＯＶ−１７／クロモゾルブＷ（ジー・エル・サイエンス株式会社製）を充填したステンレスカラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは窒素ガスを流量４０ｍｌ／分で、カラムオーブン温度は１６０℃から３２０℃まで７．５℃／分の昇温速度で分析した。検出は水素炎イオン検出器を用いた。結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
表１の結果から明かなように、本発明に用いるマルトース・トレハロース変換酵素は、試験した多種の糖質のうち、マルトースとトレハロース以外に、ネオトレハロース、蔗糖、トレハルロース、ツラノース、マルツロース、パラチノースにも作用し、とりわけ、蔗糖によく作用するという意外な事実が判明した。
【００３９】
【実験４】
〈酵素の反応生成物〉
【００４０】
【実験４−１】
〈蔗糖からの生成物〉
最終濃度１０ｗ／ｖ％の蔗糖水溶液に実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を基質固形物グラム当たり１００単位加え、５０℃、ｐＨ６．５で４８時間作用させた。酵素反応液の糖組成は、実験３と同様、ＧＬＣで分析した。また、物質の確認のために、オキシム化処理していないトリメチルシリル誘導体も分析試料とした。その結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
表２の結果から明かなように、蔗糖から未知の糖質Ｘが多量に生成し、本糖質Ｘは、トリメチルシリル誘導体、及びオキシム化トリメチルシリル誘導体のいずれにおいても、それぞれの保持時間が標準のトレハルロースのそれらと一致することが判明した。さらに、糖質Ｘを同定するために、後述の実験８で調製した高純度糖質標品を用いて確認試験を行ったところ、以下のような結果を得た。
（１）構成糖
０．５Ｎ−硫酸で加水分解し、生成物をＧＬＣにて分析したところ、未分解の糖質Ｘの他に、グルコースとフルクトースが１：０．８３のモル比で検出された。ヘキソースとケトースの酸に対する安定性を考慮すると、等モルのグルコースとフルクトースとから構成される糖質と判断される。
（２）酵素による分解
酵母由来インベルターゼによって、分解されなかったが、酵母由来α−グルコシダーゼの作用により分解され、グルコースとフルクトースが１：１のモル比で生成した。
（３）質量
ＦＤ−ＭＳ分析により３４２。
（４）比旋光度
［α］D 20 ＋５７．７°（Ｈ2Ｏ、ｃ＝５）
（トレハルロース標準品；［α］D 20 ＋５７．１°（Ｈ2Ｏ、ｃ＝５））
【００４３】
糖質Ｘは、グルコースとフルクトースとからなる二糖類で、他の諸性質が標準のトレハルロースに一致したことから、トレハルロース（１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトース）であると判断される。また、マルトース・トレハロース変換酵素により蔗糖から生成する他のマイナーな成分は、ＧＬＣ分析における標準品の保持時間との比較から、パラチノースとツラノースであることが判った。
【００４４】
以上の結果から明かなように、マルトース・トレハロース変換酵素は、マルトースをトレハロースに、トレハロースをマルトースに変換するのみならず、蔗糖にも作用してトレハルロースに変換する。一方、トレハルロースに本酵素を作用させたが、トレハルロースから蔗糖への変換はほとんど認められなかった。
【００４５】
【実験４−２】
〈蔗糖からの生成物の組成〉
最終濃度１０ｗ／ｖ％の蔗糖水溶液に実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を基質固形物グラム当たり約３３０単位加え、４０〜７０℃、ｐＨ６．５で３０分間作用させた。酵素反応液の糖組成は、実験３と同様、ＧＬＣで分析した。その結果を表３に示す。
【００４６】
【表３】
【００４７】
表３の結果から明らかなように、本発明で用いるマルトース・トレハロース変換酵素は、トレハルロース含量が約４５〜８０％のトレハルロース含有糖質を生成した。トレハルロース生成量は、温度が低いほど高く、逆に温度が高くなるほど低くなる傾向を示した。本酵素は、パラチノースに対するトレハルロースの生成率が高く（トレハルロース／パラチノースの比は１４以上）、また、生成するトレハルロース高含有糖質のパラチノース含量が約４％以下という特徴を有していた。本酵素を用いて得られる本発明のトレハルロース含有糖質は、トレハルロース／パラチノースの比とパラチノース含量の点で、従来公知の酵素を用いて得られるトレハルロース含有糖質とは著しく相違していた。
【００４８】
【実験５】
〈トレハルロース生成に及ぼす酵素作用量の影響〉
蔗糖濃度を１０％で、温度４０℃、ｐＨ６．５にて、実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を蔗糖グラム当たり２単位、５単位、１０単位、２０単位、５０単位、１００単位、あるいは２００単位加えて反応させ、経時的に反応液を採取し、１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。酵素反応液の糖組成は、実験３と同様、ＧＬＣにて分析した。各酵素作用量、各時間でのトレハルロース含量を表４に示す。
【００４９】
【表４】
【００５０】
表４の結果から明らかなように、酵素作用量が蔗糖グラム当たり１０単位以上で蔗糖からのトレハルロース生成率が１０％以上となり、１００単位以上では８０％以上に達することが判った。１０単位の酵素作用量でも、更に長時間反応させれば、トレハルロース含量は３０％以上になることが予測される。
【００５１】
【実験６】
〈トレハルロース生成に及ぼす蔗糖濃度の影響〉
蔗糖濃度を２．５％、５％、１０％、２０％あるいは４０％で、温度４０℃、ｐＨ６．５にて、実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を蔗糖グラム当たり１００単位加えて９６時間反応させ、１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。酵素反応液の糖組成は、実験３と同様、ＧＬＣにて分析した。その結果を表５に示す。
【００５２】
【表５】
【００５３】
表５の結果から明かなように、蔗糖からのトレハルロース生成率は、蔗糖濃度２．５％でも、７０％以上の高率を示したが、蔗糖濃度が高いほど更に反応はよく進行し、蔗糖濃度１０％以上では、約８０％の高率を示した。
【００５４】
【実験７】
〈トレハルロース生成に及ぼす温度の影響〉
蔗糖濃度１０％で、ｐＨ６．５にして、実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を蔗糖グラム当たり１００単位加えて、温度２０℃、３０℃、４０℃、５０℃あるいは６０℃で反応させ、経時的に反応液を採取し、１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。酵素反応液の糖組成は、実験３と同様、ＧＬＣにて分析した。各温度、各時間でのトレハルロース含量を表６に示す。
【００５５】
【表６】
【００５６】
表６の結果から明らかなように、蔗糖からのトレハルロース生成率は、約３０乃至５０℃において約７０％以上の高率を示した。
【００５７】
【実験８】
〈蔗糖からのトレハルロースの調製〉
蔗糖１０重量部を水４０重量部に溶解し、温度４０℃、ｐＨ６．５にて、実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を蔗糖グラム当たり１００単位加えて９０時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、４０℃に冷却した。本溶液中に残存する蔗糖を分解するため、本溶液のｐＨを４．０に調整し、酵母由来のインベルターゼを糖質グラム当たり２０単位加えて４０℃で２４時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。本溶液には、トレハルロースを固形物当たり約８０％含有していた。本溶液を活性炭で脱色し、イオン交換樹脂（Ｈ型およびＯＨ型）にて脱塩して精製し、濃度約５０％に濃縮し、得られた糖液を原糖液とし、トレハルロースの含量を高めるため、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（ダウケミカル社販売、商品名『ダウエックス５０Ｗ×４』、Ｃａ++型）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付ステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ、樹脂層全長２０ｍとした。
【００５８】
カラム内温度４０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して、５ｖ／ｖ％加え、これに４０℃の温水をＳＶ０．２で流して分画し、フルクトース、グルコースなどの夾雑糖類を除去し、トレハルロース高含有画分を採取した。更に、精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、純度９８％のトレハルロース高含有糖質粉末を固形物当たり、約７０％の収率で得た。
【００５９】
【実験９】
〈他の微生物由来マルトース・トレハロース変換酵素による蔗糖からのトレハルロースの生成〉
実験１及び２の方法に準じて、ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１５）、シュードモナス・プチダ Ｈ２６２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７９）の各精製マルトース・トレハロース変換酵素、及び、サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ２７６３４、サーマス・ルーバー ＡＴＣＣ３５９４８、サーマス・スピーシーズ ＡＴＣＣ４３８１５、及びサーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３由来のＤＥＡＥ−トヨパール６５０カラムクロマトグラフィーによる部分精製マルトース・トレハロース変換酵素を調製し、表７に示すそれぞれの作用条件で、濃度２０％の蔗糖溶液中で９６時間作用させ、反応液の糖組成をＧＬＣにて分析した。各微生物起源の酵素による蔗糖からのトレハルロース生成率を表７に示した。
【００６０】
【表７】
【００６１】
いずれの微生物起源の酵素も蔗糖からトレハルロースを生成し、蔗糖からのトレハルロース生成率は７０％以上の高率に達することが判明した。
【００６２】
【実験１０】
〈生体内での利用試験〉
厚治等が、『臨床栄養』、第４１巻、第２号、２００乃至２０８頁（１９７２年）で報告している方法に準じて、実験８で調製したトレハルロース高含有糖質粉末（純度９８％）３０ｇを２０ｗ／ｖ％水溶液とし、これをボランティア３名（健康な２５才、２７才、３０才の男性）にそれぞれ経口投与し、経時的に採血して、血糖値およびインスリン値を測定した。対照としては、グルコースを用いた。その結果、トレハルロースは、血糖値、インスリン値ともに、グルコースの場合より半分程度の数値を示したが、投与後、約０．５乃至１時間で最大値を示した。トレハルロースはグルコースとフルクトースとから構成され、その比率が１：１であることを考慮に入れると、本糖質は、容易に消化吸収、代謝利用されて、エネルギー源になるものと判断される。
【００６３】
【実験１１】
〈急性毒性試験〉
７週齢のｄｄ系マウスを使用して、実験８で調製したトレハルロース高含有粉末（純度９８％）を経口投与して急性毒性テストしたところ、体重１Ｋｇ当たり１５ｇまでは死亡例は見られず、これ以上の投与は困難であった。従って、本糖質の毒性は極めて低い。
【００６４】
以下、本発明に用いるマルトース・トレハロース変換酵素の調製を参考例で示し、この変換酵素を作用させ得られるトレハロルース含有糖質を実施例Ａで、トレハルロース含有糖質を含有せしめた組成物を実施例Ｂで示す。
【００６５】
【参考例１】
ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１５）を、グルコース４．０ｗ／ｖ％、ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．５ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を用い、温度を２７℃とした以外は実験１の方法に準じて、ファーメンターで約６０時間、通気攪拌培養した。この培養液約１８ｌを、超高圧菌体破砕装置ミニラボ（大日本製薬株式会社製）で処理し、菌体を破砕した。この菌体破砕懸濁液を遠心分離機にかけ、その上清を回収し、更にその液をＵＦ膜濃縮し、マルトース・トレハロース変換酵素をｍｌ当たり約３０単位有する濃縮酵素液約３００ｍｌを回収した。
【００６６】
【参考例２】
シュードモナス・プチダ Ｈ２６２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７９）を、グルコース２．０ｗ／ｖ％、硫酸アンモニウム１．０ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．３ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を用い、温度を２７℃とした以外は実験１の方法に準じて、ファーメンターで約２０時間、通気攪拌培養した。この培養液約１８ｌを遠心分離にかけ、湿重量約０．４ｋｇの菌体を得た。これを４ｌの１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、超音波破砕機で処理し、菌体を破砕した。この菌体破砕懸濁液を遠心分離機にかけ、その上清を回収し、更にその液をＵＦ膜濃縮し、マルトース・トレハロース変換酵素をｍｌ当たり約１５単位有する濃縮酵素液約１００ｍｌを回収した。
【００６７】
【参考例３】
サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３を、実験１の方法に準じてファーメンターで約２０時間、通気攪拌培養した。この培養液約１８ｌから回収した湿重量０．１８ｋｇの菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸濁液約１．５ｌを、超音波破砕装置で処理し、菌体を破砕した。この菌体破砕懸濁液を遠心分離機にかけ、その上清を回収し、更にその液をＵＦ膜濃縮し、マルトース・トレハロース変換酵素をｍｌ当たり約５０単位有する濃縮酵素液約１００ｍｌを回収した。
【００６８】
【実施例Ａ−１】
最終濃度が３０ｗ／ｖ％になるよう蔗糖溶液を調製し、これに参考例１の方法で調製したマルトース・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり２５単位の割合で加え、１０℃、ｐＨ７．０で１５０時間反応させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のトレハルロース含有糖質シラップを固形物収率約９５％で得た。本品は、固形物当たりトレハルロースを約７５％含有していて、良質な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。更に、本品を水素添加して、トレハルロースを含む還元性糖質を対応する糖アルコールに換えて利用することも有利に実施できる。
【００６９】
【実施例Ａ−２】
最終濃度が２０ｗ／ｖ％になるよう蔗糖溶液を調製し、これに参考例２の方法で調製したマルトース・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり２０単位の割合で加え、２５℃、ｐＨ７．０で１２０時間反応させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、トレハルロース含有糖質粉末を固形物当たり、約９０％の収率で得た。本品は、固形物当たりトレハルロースを約７０％含有していて、良質な甘味を有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤、賦形剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【００７０】
【実施例Ａ−３】
実施例Ａ−１の方法で得たマルトース・トレハロース変換酵素による反応終了液をｐＨ４．５に調整し、インベルターゼを固形物グラム当たり５単位の割合で加え、４０℃で２４時間反応させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、濃度約５５％に濃縮して糖液を得た。本糖液を原糖液とし、アルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂（ダウエックス９９、Ｃａ++型、架橋度６％、ダウケミカル社製）を用いて、実験８と同様にカラムクロマトグラフィーにかけ、トレハルロース高含有画分を採取した。更に精製し、濃縮して濃度約７５％のトレハルロース高含有糖質シラップを固形物収率約６０％で得た。本品は、固形物当たりトレハルロースを約９５％含有していて、良質な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【００７１】
【実施例Ａ−４】
最終濃度が４０ｗ／ｖ％になるよう蔗糖溶液を調製し、これに参考例３の方法で調製したマルトース・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり５０単位の割合で加え、４０℃、ｐＨ６．５で９６時間反応させた。その反応終了液をｐＨ４．５に調整し、インベルターゼを固形物グラム当たり５単位の割合で加え、４０℃で２４時間反応させ、９５℃で１０分間保った後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、濃度約５５％に濃縮して糖液を得た。本糖液を原糖液とし、アルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂（ダウエックス９９、Ｃａ++型、架橋度６％、ダウケミカル社製）を用いて、実験８と同様にカラムクロマトグラフィーにかけ、トレハルロース高含有画分を採取した。更に精製し、濃縮し、噴霧乾燥して、トレハルロース高含有糖質粉末を固形物当たり、約６０％の収率で得た。本品は、固形物当たりトレハルロースを約９５％含有していて、良質な甘味を有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤、賦形剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【００７２】
【実施例 Ｂ−１】
〈甘味料〉
実施例Ａ−４の方法で得たトレハルロース高含有糖質粉末１重量部に、α−グリコシルステビオシド（東洋精糖株式会社販売、商品名αＧスイート）０．０５重量部を均一に混合し、顆粒成形機にかけて、顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有し、甘味度当りカロリーは、蔗糖の約１／２に低下している。本甘味料は、低カロリー甘味料として、カロリー摂取を制限している肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲食物などに対する甘味付に好適である。また、本甘味料は、虫歯誘発菌による酸の生成が少なく、不溶性グルカンの生成も少ないことより、虫歯を抑制する飲食物などに対する甘味付に好適である。
【００７３】
【実施例 Ｂ−２】
〈ハードキャンデー〉
濃度５５％蔗糖溶液１００重量部に実施例Ａ−１の方法で得たトレハルロース含有糖質シラップ３０重量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸１重量部および適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成形し、製品を得た。本品は、歯切れ、呈味良好で、蔗糖の晶出も起こらない高品質のハードキャンデーである。
【００７４】
【実施例 Ｂ−３】
〈いちごジャム〉
生いちご１５０重量部、蔗糖６０重量部、マルトース２０重量部、実施例Ａ−１の方法で得たトレハルロース含有糖質シラップ４０重量部、ペクチン５重量部およびクエン酸１重量部をなべで煮詰め、ビン詰めして製品を得た。本品は、風味、色調とも良好なジャムである。
【００７５】
【実施例 Ｂ−４】
〈乳酸飲料〉
脱脂乳１０重量部を８０℃で２０分間加熱殺菌した後、４０℃に冷却し、これにスターター０．３重量部を加えて約３７℃で１０時間醗酵させた。次いで、これをホモジナイズした後、実施例Ａ−２の方法で得たトレハルロース含有糖質粉末４重量部、蔗糖１重量部および異性化糖シラップ２重量部を加えて７０℃に保って殺菌した。これを冷却し、適量の香料を加え、ビン詰めして製品を得た。本品は、風味、甘味が酸味とよく調和した高品質の乳酸飲料である。
【００７６】
【実施例 Ｂ−５】
〈加糖練乳〉
原乳１００重量部に実施例Ａ−３の方法で得たトレハルロース高含有糖質シラップ３重量部および蔗糖１重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度約７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰めして製品を得た。本品は、温和な甘味で、風味もよく、乳幼児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【００７７】
【実施例 Ｂ−６】
〈チューインガム〉
ガムベース３重量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに蔗糖６重量部および実施例Ａ−４の方法で得たトレハルロース高含有糖質粉末１重量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、風味とも良好なチューインガムである。
【００７８】
【実施例 Ｂ−７】
〈カスタードクリーム〉
コーンスターチ１００重量部、実施例Ａ−３の方法で得たトレハルロース高含有糖質シラップ１００重量部、マルトース８０重量部、蔗糖２０重量部および食塩１重量部を充分に混合し、鶏卵２８０重量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳１０００重量部を徐々に加え、更に、これを火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、温和な甘味で美味である。
【００７９】
【実施例 Ｂ−８】
〈ういろうの素〉
米粉９０重量部に、コーンスターチ２０重量部、実施例Ａ−４の方法で得たトレハルロース高含有糖質粉末１２０重量部、プルラン４重量部を均一に混合してういろうの素を製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、これを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当りも良好で、風味も良い。また、澱粉の老化も抑制され、日持ちもよい。
【００８０】
【実施例 Ｂ−９】
〈流動食用固体製剤〉
実施例Ａ−４の方法で得たトレハルロース高含有糖質粉末５００重量部、粉末卵黄２７０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩化ナトリウム４．４重量部、塩化カリウム１．８５重量部、硫酸マグネシウム４重量部、チアミン０．０１重量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミンＥアセテート０．６重量部およびニコチン酸アミド０．０４重量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、１袋分を約１５０乃至３００ｍＬの水に溶解して流動食とし、経口的、または鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用される。
【００８１】
【実施例 Ｂ−１０】
〈外傷治療用膏薬〉
実施例Ａ−４の方法で得たトレハルロース高含有糖質粉末５００重量部に、ヨウ素３重量部を溶解したメタノール５０重量部を加え混合し、更に１０％プルラン水溶液２００重量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷冶療用膏薬を得た。本品は、治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【００８２】
【発明の効果】
上記から明らかなように、蔗糖を含有する水溶液にマルトース・トレハロース変換酵素を作用させ得られるトレハルロース含有糖質は、蔗糖からのトレハルロース生成率が高く、分離、精製も容易である。トレハルロースはグルコースとフルクトースからなる還元性二糖類で、上品で良質な甘味を有している。また、経口的または非経口的に使用され、毒性、副作用の懸念もなく、よく代謝利用される。
【００８３】
本発明のトレハルロース含有糖質は、液状で、又は粉末状でその取扱いが容易である。さらに、本糖質は、浸透圧調節性、賦型性、照り付与性、保湿性、粘性、他糖の晶出防止性、難発酵性などの諸性質を具備している。これらの諸性質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤などとして各種組成物の製造に有利に利用できる。従って、本発明のトレハルロース含有糖質とその製造方法並びに用途を確立したことは、食品、化粧品、医薬品分野などにおける工業的意義が極めて大きい。
【発明の属する技術分野】
本発明は、トレハルロース含有糖質とその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には蔗糖にマルトース・トレハロース変換酵素を作用させ得られるトレハルロース含有糖質、および蔗糖にマルトース・トレハロース変換酵素を作用させるトレハルロース含有糖質の製造方法、並びにこの糖質を含有せしめた組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トレハルロースは、グルコースとフルクトースとからなる二糖類であり、化学的には１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトースで示される還元性糖質で、天然界ではわずかながら蜂蜜中に存在している。トレハルロースは、非晶質であって水に対する溶解性が高く、しかも、う蝕を誘発しにくく、甘味度が蔗糖の約４０％の糖質であることから、種々の飲食物への利用が期待されており、特に甘味糖質を多く含む食品、例えば、ジャム、あん、羊羹等に利用するのに好適である。本糖質の調製方法としては、『精糖技術研究会誌』、第３４号、３７頁乃至第４４頁（１９８５年）に記載されているように、プロタミノバクター・ルブラム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｒｕｍ）のα−グルコシダーゼの糖転移作用によって、蔗糖から生成することが知られている。この酵素反応では、得られる主成分がパラチノース（６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトース）であり、トレハルロースは、パラチノース結晶製品の副産物として得られる。また、トレハルロースを主成分とする糖質の製造方法としては、例えば、特開平４−１６９１９０号公報で報告されているシュードモナス・メソアシドフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｓｏａｃｉｄｏｐｈｉｌａ）ＭＸ−４５や、特開平５−１３０８８６号公報で報告されているアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＭＸ−２３２の固定化菌体を用いて蔗糖から製造する方法が提案されているものの、酵素活性、温度安定性などが不充分で、未だ工業的に実現を見ていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、蔗糖からのトレハルロース生成率が高く、工業的実施の容易なトレハルロースの製造方法を提供するとともに、この製造方法により得られるトレハルロース含有糖質とこの糖質の用途を提供することを課題とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、トレハルロースの製造方法について鋭意検討してきた。その結果、本発明者等が先に特開平７−１７０９７７号公報で開示したマルトース・トレハロース変換酵素が、マルトースをトレハロースへ変換するのみならず、蔗糖からトレハルロースを容易に高率で生成する意外な事実を見いだし、蔗糖含有溶液にマルトース・トレハロース変換酵素を作用させることを特徴とするトレハルロース含有糖質の製造方法を確立し、併せて、この製造方法で得られるトレハルロース含有糖質とこの糖質を含有せしめた飲食物、化粧品、医薬品などの組成物を確立して本発明を完成した。
【０００５】
マルトース・トレハロース変換酵素は、特開平７−１７０９７７号公報で開示したように、ピメロバクター・スピーシーズ（Ｐｉｍｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｒ４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１５）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）Ｈ２６２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７９）、あるいはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する微生物により生産され、マルトースをトレハロースに変換、又は、トレハロースをマルトースに変換する分子内糖転移酵素である。この反応の平衡点はトレハロース側に片寄っており、マルトースを基質とした場合のトレハロース生成率は約８０ｗ／ｗ％（以下、特にことわらない限り、本明細書ではｗ／ｗ％を％と略記する。）にも達する。
【０００６】
本発明では、上記菌株の酵素のみならず、ピメロバクター属及びシュードモナス属、サーマス属に属し、マルトース・トレハロース変換酵素産生能を有する他の菌株やこれらの変異株などの酵素も適宜使用することができる。また、サーマス属に属する微生物としては、例えば、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ２５１０４、サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ２７６３４、サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３、サーマス・フィリホルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ４３２８０、サーマス・ルーバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）ＡＴＣＣ３５９４８、サーマス・スピーシーズ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．）ＡＴＣＣ４３８１４、およびサーマス・スピーシーズ ＡＴＣＣ４３８１５などが有利に利用できる。
【０００７】
マルトース・トレハロース変換酵素を産生する微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、本酵素を産生するものであればよく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が資化できる物であればよく、例えば、グルコース、フルクトース、糖蜜、トレハロース、ラクトース、蔗糖、マンニトール、ソルビトール、澱粉部分分解物などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸又はそれらの塩なども使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択される。例えば、グルコースを用いる場合には、その濃度は、４０ｗ／ｖ％以下が望ましく、とりわけ、微生物の生育及び増殖からは１０ｗ／ｖ％以下が好ましい。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物や、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物などが用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。
【０００８】
培養条件は、微生物が生育し、本発明に用いるマルトース・トレハロース変換酵素を産生する条件であればよく、通常、温度約４乃至８０℃、好ましくは２０乃至７５℃、ｐＨ５乃至９、好ましくはｐＨ６乃至８．５から選ばれる条件で、好気的に行われる。培養時間は微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは約１０乃至１００時間である。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、約０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、攪拌したり、酸素を使用したり、また、培養槽内の圧力を高めるなどの手段が採用される。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。
【０００９】
このようにして、微生物を培養した後、得られる培養物から酵素を回収する。マルトース・トレハロース変換酵素活性は、培養物の菌体外培養液及び菌体のいずれにも認められ、菌体外培養液及び菌体を粗酵素として回収すればよく、また、培養物全体を粗酵素として用いることもできる。菌体外培養液と菌体との分離には通常の固液分離手段が採用される。例えば、培養物そのものをそのまま遠心分離する手段、培養物に濾過助剤を加えたり、あるいは、プレコートすることにより濾過分離する手段、平膜、中空糸膜などを用いる膜濾過分離する手段などを適用し得る。菌体外培養液をそのまま粗酵素液として用いることができるが、好ましくは通常の手段で濃縮して用いる。例えば、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、平膜、中空糸膜などを用いる膜濃縮法などが採用される。
【００１０】
菌体内酵素は、通常の手段を用いて菌体から抽出し、粗酵素液として用いることができる。例えば、超音波による破砕法、ガラスビーズ及びアルミナによる機械的破砕法、フレンチプレスによる破砕法などで菌体から酵素を抽出し、遠心分離または膜濾過などで清澄な粗酵素液を得ることができる。
【００１１】
更に、菌体外培養液およびその濃縮物または菌体抽出液は、通常の手段で固定化することもできる。例えば、イオン交換体への結合法、樹脂および膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などが採用される。また、培養物から分離した菌体をそのまま粗酵素として用いることができるが、菌体を固定化し固定化酵素として用いてもよい。例えば、菌体をアルギン酸ナトリウムと混合して、塩化カルシウム溶液中に滴下して粒状にゲル化させ得られる粒状化菌体を、さらにポリエチレンイミン、グルタルアルデヒドで処理した固定化酵素として用いてもよい。
【００１２】
粗酵素はそのまま用いてもよいが、通常の手段によって精製することもできる。一例として、菌体破砕抽出液を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析後、ＤＥＡＥ−トヨパール樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、ブチルトヨパール樹脂を用いた疎水カラムクロマトグラフィー、モノＱ ＨＲ５／５樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、トヨパールＨＷ−５５樹脂を用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーなどを組合わせて電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。
【００１３】
本発明に用いるマルトース・トレハロース変換酵素の活性は次のようにして測定する。基質としてマルトース２０ｗ／ｖ％（１０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０）１ｍｌに酵素液１ｍｌを加え、反応温度を２５℃、３５℃あるいは６０℃とし、６０分間反応させた後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止させる。この反応液を５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．５で正確に１１倍に希釈し、その希釈液０．４ｍｌにトレハラーゼ含有溶液（１単位／ｍｌ）を０．１ｍｌ添加したものを４５℃、１２０分間インキュベートした後、この反応液中のグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量する。対照として、予め１００℃で１０分間加熱することにより失活させた酵素液およびトレハラーゼを用いて同様に測定する。上記の測定方法を用いて、増加するグルコース量からマルトース・トレハロース変換酵素により生成するトレハロース量を求め、その活性１単位は、１分間に１μｍｏｌｅのトレハロースを生成する酵素量と定義する。
なお、反応温度は、マルトース・トレハロース変換酵素が、ピメロバクター属に属する微生物由来の場合に２５℃とし、シュードモナス属に属する微生物由来の場合に３５℃とし、サーマス属に属する微生物由来の場合に６０℃とした。
【００１４】
本発明の基質濃度は特に限定されない。基質溶液として蔗糖濃度を、例えば、０．１％で用いた場合でも、５０％で用いた場合でも、本酵素の反応は進行し、トレハルロースを生成する。また、基質溶液中に完全に溶けきれない基質を含有する高濃度溶液であってもよい。反応温度は酵素が失活しない温度、すなわち８０℃付近までで行えばよいが、好ましくは約０乃至７０℃の範囲、とりわけサーマス属に属する微生物由来の酵素の場合には、約３０乃至５０℃の範囲において、蔗糖からのトレハルロース生成率が高く好都合である。反応ｐＨは、通常、５．５乃至９．０の範囲に調整すればよいが、好ましくはｐＨ約６．０乃至８．５の範囲に調整する。反応時間は、酵素反応の進行具合により適宜選択すればよく、通常、基質固形物グラム当たり約１０乃至１，０００単位の酵素使用量で約０．１乃至２００時間程度である。
【００１５】
このようにして得られる反応液のトレハルロース含量は、通常１０％以上、条件によっては３０％以上、最大で約８０％にも達することが判明した。
【００１６】
反応液は、常法により、瀘過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮し、シラップ状製品とすることも、更に、乾燥して粉末状製品にすることも随意である。
【００１７】
必要ならば、更に、高度な精製をすることも随意である。例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分画、活性炭カラムクロマトグラフィーによる分画、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画などの方法で精製することにより、高純度のトレハルロース製品を得ることも容易である。また、カラムクロマトグラフィーなどにより分離し得られる蔗糖を、再び、マルトース・トレハロース変換酵素の基質に用いてトレハルロース生成反応を行うことも有利に実施できる。
【００１８】
このようにして得られた本発明のトレハルロース含有糖質を、必要により、インベルターゼなどで加水分解したり、澱粉部分分解物などを加え、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼやグルコシルトランスフェラーゼなどで糖転移したりして、甘味性、粘性などを調整することも、また、酵母により発酵性糖質を除去することなど更なる加工処理を施すことも随意である。本発明のトレハルロース含有糖質から、前述の精製方法、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどにより、グルコース及びフルクトースを除去し、トレハルロース高含有画分を採取し、これを精製、濃縮して、シラップ状製品を得ることも、更に乾燥して粉末製品を得ることも有利に実施できる。
【００１９】
イオン交換カラムクロマトグラフィーとしては、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、夾雑糖類を除去してトレハルロース高含有画分を採取する方法が有利に実施できる。この際、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。
【００２０】
このようにして製造される本発明のトレハルロース高含有糖質は、水に対する溶解性が高く、良質で上品な甘味を有している。更に、トレハルロースは、小腸の加水分解酵素によりグルコースとフルクトースとに分解されることから、経口摂取した場合、容易に消化吸収され、カロリー源として利用される。また、虫歯誘発菌などによって、醗酵されにくく、虫歯誘発菌による蔗糖からの不溶性グルカン合成を阻害することから、非う蝕性甘味料としても利用できる。
【００２１】
従って、本発明のトレハルロース含有糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤などとして飲食物、嗜好物、飼料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００２２】
本発明のトレハルロース含有糖質は、そのまま甘味付けのための調味料として使用することができる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メイプルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、レバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の一種または二種以上の適量と混合して使用してもよく、また必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００２３】
また、本発明のトレハルロース含有糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００２４】
例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、たくあん漬の素、白菜漬の素、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味料として有利に使用できる。
【００２５】
また、例えば、せんべい、あられ、おこし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、キャンデーなどの洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リキュール、洋酒などの酒類、紅茶、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、また、品質改良などに有利に利用できる。
【００２６】
また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤として、更には、品質改良剤として有利に利用できる。
【００２７】
以上述べたような各種組成物にトレハルロース含有糖質を含有せしめる方法は、その製品が完成するまでの工程で含有せしめればよく、例えば、混和、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常、トレハルロースとして０．１％以上、望ましくは、１％以上含有せしめるのが好適である。次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００２８】
【実験１】
〈酵素の産生〉
ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、硝酸ナトリウム０．０７ｗ／ｖ％、リン酸二ナトリウム０．０１ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム０．０１ｗ／ｖ％、および水からなる液体培地を、ｐＨ７．５に調製した後、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２０℃で、２０分間滅菌し、冷却して、サーマス アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３を接種し、６０℃、２００ｒｐｍで２４時間回転振とう培養したものを種培養とした。
【００２９】
容量３０ｌのファーメンター２基に種培養の場合と同組成の培地をそれぞれ約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度６０℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度６０℃、ｐＨ６．５乃至８．０に保ちつつ、約２０時間通気攪拌培養した。
【００３０】
【実験２】
〈酵素の精製〉
実験１で得られた培養液を遠心分離して湿重量約０．２８ｋｇの菌体を回収し、これを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸濁液約１．９ｌを、超音波破砕機 モデルＵＳ３００（株式会社日本精機製作所製）で処理し、菌体を破砕した。この破砕処理液を遠心分離（１５，０００Ｇ、３０分間）することにより、約１．８ｌの上清を得た。その上清に飽和度０．７になるように硫安を加え溶解させ、４℃、一夜放置した後、遠心分離機にかけ、硫安塩析物を回収した。
【００３１】
得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透析液（１５６０ｍｌ）を、３回に分けて、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量５３０ｍｌ）にかけた。
【００３２】
マルトース・トレハロース変換酵素はＤＥＡＥ−トヨパールゲルに吸着し、食塩を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムから溶出した。溶出した酵素活性画分を回収した後、１Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、次に、ブチルトヨパール ６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）を行った。吸着したマルトース・トレハロース変換酵素を硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントによりカラムより溶出させ、酵素活性画分を回収した。
【００３３】
次に、トヨパール ＨＷ−５５Ｓ（東ソー株式会社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）を行い、溶出した酵素活性画分を回収した。
【００３４】
続いて、モノＱ ＨＲ５／５ カラム（スウェーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル量１．０ｍｌ）を行い、食塩０．１Ｍから０．３５Ｍのリニアグラジエントにより溶出した酵素活性画分を回収し、電気泳動的に単一なマルトース・トレハロース変換酵素標品を得た。精製酵素標品の比活性は、蛋白ｍｇ当たり１３５単位であった。
【００３５】
【実験３】
〈各種糖質への作用〉
各種糖質を用いて、マルトース・トレハロース変換酵素を糖質グラム当たり５０単位の作用量で反応させ、基質になりうるかどうかの試験をした。最終濃度５ｗ／ｖ％の、グルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、トレハロース、ネオトレハロース、コージビオース、イソマルトース、マルチトール、セロビオース、ゲンチオビオース、蔗糖、トレハルロース、ツラノース、マルツロース、パラチノース、あるいはラクトース溶液を調製した。
【００３６】
これらの溶液に実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を基質固形物グラム当たりそれぞれ５０単位ずつ加え、５０℃、ｐＨ７．０で４８時間作用させた。酵素反応前後の反応液をキーゼルゲル６０（メルク社製；アルミプレート，２０×２０ｃｍ）を用いた薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略称する。）にかけ、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を確認した。ＴＬＣは展開溶媒に１−ブタノール：ピリジン：水＝６：４：１（容積比）を用い、室温で１回展開した。発色は２０ｖ／ｖ％硫酸−メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で１０分間加熱しておこなった。酵素反応により生成物を認めた反応液については、ガスクロマトグラフィー（以下、ＧＬＣと略称する。）でその糖組成を分析した。酵素反応液の一部を乾固し、ピリジンに溶解した後、オキシム化後トリメチルシリル化したものを分析試料とした。ガスクロマトグラフ装置はＧＣ−１６Ａ（株式会社島津製作所製）、カラムは２％ＯＶ−１７／クロモゾルブＷ（ジー・エル・サイエンス株式会社製）を充填したステンレスカラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは窒素ガスを流量４０ｍｌ／分で、カラムオーブン温度は１６０℃から３２０℃まで７．５℃／分の昇温速度で分析した。検出は水素炎イオン検出器を用いた。結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
表１の結果から明かなように、本発明に用いるマルトース・トレハロース変換酵素は、試験した多種の糖質のうち、マルトースとトレハロース以外に、ネオトレハロース、蔗糖、トレハルロース、ツラノース、マルツロース、パラチノースにも作用し、とりわけ、蔗糖によく作用するという意外な事実が判明した。
【００３９】
【実験４】
〈酵素の反応生成物〉
【００４０】
【実験４−１】
〈蔗糖からの生成物〉
最終濃度１０ｗ／ｖ％の蔗糖水溶液に実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を基質固形物グラム当たり１００単位加え、５０℃、ｐＨ６．５で４８時間作用させた。酵素反応液の糖組成は、実験３と同様、ＧＬＣで分析した。また、物質の確認のために、オキシム化処理していないトリメチルシリル誘導体も分析試料とした。その結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
表２の結果から明かなように、蔗糖から未知の糖質Ｘが多量に生成し、本糖質Ｘは、トリメチルシリル誘導体、及びオキシム化トリメチルシリル誘導体のいずれにおいても、それぞれの保持時間が標準のトレハルロースのそれらと一致することが判明した。さらに、糖質Ｘを同定するために、後述の実験８で調製した高純度糖質標品を用いて確認試験を行ったところ、以下のような結果を得た。
（１）構成糖
０．５Ｎ−硫酸で加水分解し、生成物をＧＬＣにて分析したところ、未分解の糖質Ｘの他に、グルコースとフルクトースが１：０．８３のモル比で検出された。ヘキソースとケトースの酸に対する安定性を考慮すると、等モルのグルコースとフルクトースとから構成される糖質と判断される。
（２）酵素による分解
酵母由来インベルターゼによって、分解されなかったが、酵母由来α−グルコシダーゼの作用により分解され、グルコースとフルクトースが１：１のモル比で生成した。
（３）質量
ＦＤ−ＭＳ分析により３４２。
（４）比旋光度
［α］D 20 ＋５７．７°（Ｈ2Ｏ、ｃ＝５）
（トレハルロース標準品；［α］D 20 ＋５７．１°（Ｈ2Ｏ、ｃ＝５））
【００４３】
糖質Ｘは、グルコースとフルクトースとからなる二糖類で、他の諸性質が標準のトレハルロースに一致したことから、トレハルロース（１−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトース）であると判断される。また、マルトース・トレハロース変換酵素により蔗糖から生成する他のマイナーな成分は、ＧＬＣ分析における標準品の保持時間との比較から、パラチノースとツラノースであることが判った。
【００４４】
以上の結果から明かなように、マルトース・トレハロース変換酵素は、マルトースをトレハロースに、トレハロースをマルトースに変換するのみならず、蔗糖にも作用してトレハルロースに変換する。一方、トレハルロースに本酵素を作用させたが、トレハルロースから蔗糖への変換はほとんど認められなかった。
【００４５】
【実験４−２】
〈蔗糖からの生成物の組成〉
最終濃度１０ｗ／ｖ％の蔗糖水溶液に実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を基質固形物グラム当たり約３３０単位加え、４０〜７０℃、ｐＨ６．５で３０分間作用させた。酵素反応液の糖組成は、実験３と同様、ＧＬＣで分析した。その結果を表３に示す。
【００４６】
【表３】
表３の結果から明らかなように、本発明で用いるマルトース・トレハロース変換酵素は、トレハルロース含量が約４５〜８０％のトレハルロース含有糖質を生成した。トレハルロース生成量は、温度が低いほど高く、逆に温度が高くなるほど低くなる傾向を示した。本酵素は、パラチノースに対するトレハルロースの生成率が高く（トレハルロース／パラチノースの比は１４以上）、また、生成するトレハルロース高含有糖質のパラチノース含量が約４％以下という特徴を有していた。本酵素を用いて得られる本発明のトレハルロース含有糖質は、トレハルロース／パラチノースの比とパラチノース含量の点で、従来公知の酵素を用いて得られるトレハルロース含有糖質とは著しく相違していた。
【００４８】
【実験５】
〈トレハルロース生成に及ぼす酵素作用量の影響〉
蔗糖濃度を１０％で、温度４０℃、ｐＨ６．５にて、実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を蔗糖グラム当たり２単位、５単位、１０単位、２０単位、５０単位、１００単位、あるいは２００単位加えて反応させ、経時的に反応液を採取し、１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。酵素反応液の糖組成は、実験３と同様、ＧＬＣにて分析した。各酵素作用量、各時間でのトレハルロース含量を表４に示す。
【００４９】
【表４】
表４の結果から明らかなように、酵素作用量が蔗糖グラム当たり１０単位以上で蔗糖からのトレハルロース生成率が１０％以上となり、１００単位以上では８０％以上に達することが判った。１０単位の酵素作用量でも、更に長時間反応させれば、トレハルロース含量は３０％以上になることが予測される。
【００５１】
【実験６】
〈トレハルロース生成に及ぼす蔗糖濃度の影響〉
蔗糖濃度を２．５％、５％、１０％、２０％あるいは４０％で、温度４０℃、ｐＨ６．５にて、実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を蔗糖グラム当たり１００単位加えて９６時間反応させ、１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。酵素反応液の糖組成は、実験３と同様、ＧＬＣにて分析した。その結果を表５に示す。
【００５２】
【表５】
表５の結果から明かなように、蔗糖からのトレハルロース生成率は、蔗糖濃度２．５％でも、７０％以上の高率を示したが、蔗糖濃度が高いほど更に反応はよく進行し、蔗糖濃度１０％以上では、約８０％の高率を示した。
【００５４】
【実験７】
〈トレハルロース生成に及ぼす温度の影響〉
蔗糖濃度１０％で、ｐＨ６．５にして、実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を蔗糖グラム当たり１００単位加えて、温度２０℃、３０℃、４０℃、５０℃あるいは６０℃で反応させ、経時的に反応液を採取し、１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。酵素反応液の糖組成は、実験３と同様、ＧＬＣにて分析した。各温度、各時間でのトレハルロース含量を表６に示す。
【００５５】
【表６】
表６の結果から明らかなように、蔗糖からのトレハルロース生成率は、約３０乃至５０℃において約７０％以上の高率を示した。
【００５７】
【実験８】
〈蔗糖からのトレハルロースの調製〉
蔗糖１０重量部を水４０重量部に溶解し、温度４０℃、ｐＨ６．５にて、実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素を蔗糖グラム当たり１００単位加えて９０時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、４０℃に冷却した。本溶液中に残存する蔗糖を分解するため、本溶液のｐＨを４．０に調整し、酵母由来のインベルターゼを糖質グラム当たり２０単位加えて４０℃で２４時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。本溶液には、トレハルロースを固形物当たり約８０％含有していた。本溶液を活性炭で脱色し、イオン交換樹脂（Ｈ型およびＯＨ型）にて脱塩して精製し、濃度約５０％に濃縮し、得られた糖液を原糖液とし、トレハルロースの含量を高めるため、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（ダウケミカル社販売、商品名『ダウエックス５０Ｗ×４』、Ｃａ++型）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付ステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ、樹脂層全長２０ｍとした。
【００５８】
カラム内温度４０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して、５ｖ／ｖ％加え、これに４０℃の温水をＳＶ０．２で流して分画し、フルクトース、グルコースなどの夾雑糖類を除去し、トレハルロース高含有画分を採取した。更に、精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、純度９８％のトレハルロース高含有糖質粉末を固形物当たり、約７０％の収率で得た。
【００５９】
【実験９】
〈他の微生物由来マルトース・トレハロース変換酵素による蔗糖からのトレハルロースの生成〉
実験１及び２の方法に準じて、ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１５）、シュードモナス・プチダ Ｈ２６２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７９）の各精製マルトース・トレハロース変換酵素、及び、サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ２７６３４、サーマス・ルーバー ＡＴＣＣ３５９４８、サーマス・スピーシーズ ＡＴＣＣ４３８１５、及びサーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３由来のＤＥＡＥ−トヨパール６５０カラムクロマトグラフィーによる部分精製マルトース・トレハロース変換酵素を調製し、表７に示すそれぞれの作用条件で、濃度２０％の蔗糖溶液中で９６時間作用させ、反応液の糖組成をＧＬＣにて分析した。各微生物起源の酵素による蔗糖からのトレハルロース生成率を表７に示した。
【００６０】
【表７】
いずれの微生物起源の酵素も蔗糖からトレハルロースを生成し、蔗糖からのトレハルロース生成率は７０％以上の高率に達することが判明した。
【００６２】
【実験１０】
〈生体内での利用試験〉
厚治等が、『臨床栄養』、第４１巻、第２号、２００乃至２０８頁（１９７２年）で報告している方法に準じて、実験８で調製したトレハルロース高含有糖質粉末（純度９８％）３０ｇを２０ｗ／ｖ％水溶液とし、これをボランティア３名（健康な２５才、２７才、３０才の男性）にそれぞれ経口投与し、経時的に採血して、血糖値およびインスリン値を測定した。対照としては、グルコースを用いた。その結果、トレハルロースは、血糖値、インスリン値ともに、グルコースの場合より半分程度の数値を示したが、投与後、約０．５乃至１時間で最大値を示した。トレハルロースはグルコースとフルクトースとから構成され、その比率が１：１であることを考慮に入れると、本糖質は、容易に消化吸収、代謝利用されて、エネルギー源になるものと判断される。
【００６３】
【実験１１】
〈急性毒性試験〉
７週齢のｄｄ系マウスを使用して、実験８で調製したトレハルロース高含有粉末（純度９８％）を経口投与して急性毒性テストしたところ、体重１Ｋｇ当たり１５ｇまでは死亡例は見られず、これ以上の投与は困難であった。従って、本糖質の毒性は極めて低い。
【００６４】
以下、本発明に用いるマルトース・トレハロース変換酵素の調製を参考例で示し、この変換酵素を作用させ得られるトレハロルース含有糖質を実施例Ａで、トレハルロース含有糖質を含有せしめた組成物を実施例Ｂで示す。
【００６５】
【参考例１】
ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１５）を、グルコース４．０ｗ／ｖ％、ポリペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．５ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を用い、温度を２７℃とした以外は実験１の方法に準じて、ファーメンターで約６０時間、通気攪拌培養した。この培養液約１８ｌを、超高圧菌体破砕装置ミニラボ（大日本製薬株式会社製）で処理し、菌体を破砕した。この菌体破砕懸濁液を遠心分離機にかけ、その上清を回収し、更にその液をＵＦ膜濃縮し、マルトース・トレハロース変換酵素をｍｌ当たり約３０単位有する濃縮酵素液約３００ｍｌを回収した。
【００６６】
【参考例２】
シュードモナス・プチダ Ｈ２６２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７９）を、グルコース２．０ｗ／ｖ％、硫酸アンモニウム１．０ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．３ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を用い、温度を２７℃とした以外は実験１の方法に準じて、ファーメンターで約２０時間、通気攪拌培養した。この培養液約１８ｌを遠心分離にかけ、湿重量約０．４ｋｇの菌体を得た。これを４ｌの１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、超音波破砕機で処理し、菌体を破砕した。この菌体破砕懸濁液を遠心分離機にかけ、その上清を回収し、更にその液をＵＦ膜濃縮し、マルトース・トレハロース変換酵素をｍｌ当たり約１５単位有する濃縮酵素液約１００ｍｌを回収した。
【００６７】
【参考例３】
サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３を、実験１の方法に準じてファーメンターで約２０時間、通気攪拌培養した。この培養液約１８ｌから回収した湿重量０．１８ｋｇの菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸濁液約１．５ｌを、超音波破砕装置で処理し、菌体を破砕した。この菌体破砕懸濁液を遠心分離機にかけ、その上清を回収し、更にその液をＵＦ膜濃縮し、マルトース・トレハロース変換酵素をｍｌ当たり約５０単位有する濃縮酵素液約１００ｍｌを回収した。
【００６８】
【実施例Ａ−１】
最終濃度が３０ｗ／ｖ％になるよう蔗糖溶液を調製し、これに参考例１の方法で調製したマルトース・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり２５単位の割合で加え、１０℃、ｐＨ７．０で１５０時間反応させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のトレハルロース含有糖質シラップを固形物収率約９５％で得た。本品は、固形物当たりトレハルロースを約７５％含有していて、良質な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。更に、本品を水素添加して、トレハルロースを含む還元性糖質を対応する糖アルコールに換えて利用することも有利に実施できる。
【００６９】
【実施例Ａ−２】
最終濃度が２０ｗ／ｖ％になるよう蔗糖溶液を調製し、これに参考例２の方法で調製したマルトース・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり２０単位の割合で加え、２５℃、ｐＨ７．０で１２０時間反応させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、トレハルロース含有糖質粉末を固形物当たり、約９０％の収率で得た。本品は、固形物当たりトレハルロースを約７０％含有していて、良質な甘味を有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤、賦形剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【００７０】
【実施例Ａ−３】
実施例Ａ−１の方法で得たマルトース・トレハロース変換酵素による反応終了液をｐＨ４．５に調整し、インベルターゼを固形物グラム当たり５単位の割合で加え、４０℃で２４時間反応させた。その反応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、濃度約５５％に濃縮して糖液を得た。本糖液を原糖液とし、アルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂（ダウエックス９９、Ｃａ++型、架橋度６％、ダウケミカル社製）を用いて、実験８と同様にカラムクロマトグラフィーにかけ、トレハルロース高含有画分を採取した。更に精製し、濃縮して濃度約７５％のトレハルロース高含有糖質シラップを固形物収率約６０％で得た。本品は、固形物当たりトレハルロースを約９５％含有していて、良質な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【００７１】
【実施例Ａ−４】
最終濃度が４０ｗ／ｖ％になるよう蔗糖溶液を調製し、これに参考例３の方法で調製したマルトース・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり５０単位の割合で加え、４０℃、ｐＨ６．５で９６時間反応させた。その反応終了液をｐＨ４．５に調整し、インベルターゼを固形物グラム当たり５単位の割合で加え、４０℃で２４時間反応させ、９５℃で１０分間保った後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、濃度約５５％に濃縮して糖液を得た。本糖液を原糖液とし、アルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂（ダウエックス９９、Ｃａ++型、架橋度６％、ダウケミカル社製）を用いて、実験８と同様にカラムクロマトグラフィーにかけ、トレハルロース高含有画分を採取した。更に精製し、濃縮し、噴霧乾燥して、トレハルロース高含有糖質粉末を固形物当たり、約６０％の収率で得た。本品は、固形物当たりトレハルロースを約９５％含有していて、良質な甘味を有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤、賦形剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【００７２】
【実施例 Ｂ−１】
〈甘味料〉
実施例Ａ−４の方法で得たトレハルロース高含有糖質粉末１重量部に、α−グリコシルステビオシド（東洋精糖株式会社販売、商品名αＧスイート）０．０５重量部を均一に混合し、顆粒成形機にかけて、顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の約２倍の甘味度を有し、甘味度当りカロリーは、蔗糖の約１／２に低下している。本甘味料は、低カロリー甘味料として、カロリー摂取を制限している肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲食物などに対する甘味付に好適である。また、本甘味料は、虫歯誘発菌による酸の生成が少なく、不溶性グルカンの生成も少ないことより、虫歯を抑制する飲食物などに対する甘味付に好適である。
【００７３】
【実施例 Ｂ−２】
〈ハードキャンデー〉
濃度５５％蔗糖溶液１００重量部に実施例Ａ−１の方法で得たトレハルロース含有糖質シラップ３０重量部を加熱混合し、次いで減圧下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン酸１重量部および適量のレモン香料と着色料とを混和し、常法に従って成形し、製品を得た。本品は、歯切れ、呈味良好で、蔗糖の晶出も起こらない高品質のハードキャンデーである。
【００７４】
【実施例 Ｂ−３】
〈いちごジャム〉
生いちご１５０重量部、蔗糖６０重量部、マルトース２０重量部、実施例Ａ−１の方法で得たトレハルロース含有糖質シラップ４０重量部、ペクチン５重量部およびクエン酸１重量部をなべで煮詰め、ビン詰めして製品を得た。本品は、風味、色調とも良好なジャムである。
【００７５】
【実施例 Ｂ−４】
〈乳酸飲料〉
脱脂乳１０重量部を８０℃で２０分間加熱殺菌した後、４０℃に冷却し、これにスターター０．３重量部を加えて約３７℃で１０時間醗酵させた。次いで、これをホモジナイズした後、実施例Ａ−２の方法で得たトレハルロース含有糖質粉末４重量部、蔗糖１重量部および異性化糖シラップ２重量部を加えて７０℃に保って殺菌した。これを冷却し、適量の香料を加え、ビン詰めして製品を得た。本品は、風味、甘味が酸味とよく調和した高品質の乳酸飲料である。
【００７６】
【実施例 Ｂ−５】
〈加糖練乳〉
原乳１００重量部に実施例Ａ−３の方法で得たトレハルロース高含有糖質シラップ３重量部および蔗糖１重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度約７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰めして製品を得た。本品は、温和な甘味で、風味もよく、乳幼児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【００７７】
【実施例 Ｂ−６】
〈チューインガム〉
ガムベース３重量部を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに蔗糖６重量部および実施例Ａ−４の方法で得たトレハルロース高含有糖質粉末１重量部とを加え、更に適量の香料と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り合わせ、成形、包装して製品を得た。本品は、テクスチャー、風味とも良好なチューインガムである。
【００７８】
【実施例 Ｂ−７】
〈カスタードクリーム〉
コーンスターチ１００重量部、実施例Ａ−３の方法で得たトレハルロース高含有糖質シラップ１００重量部、マルトース８０重量部、蔗糖２０重量部および食塩１重量部を充分に混合し、鶏卵２８０重量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳１０００重量部を徐々に加え、更に、これを火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、温和な甘味で美味である。
【００７９】
【実施例 Ｂ−８】
〈ういろうの素〉
米粉９０重量部に、コーンスターチ２０重量部、実施例Ａ−４の方法で得たトレハルロース高含有糖質粉末１２０重量部、プルラン４重量部を均一に混合してういろうの素を製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、これを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当りも良好で、風味も良い。また、澱粉の老化も抑制され、日持ちもよい。
【００８０】
【実施例 Ｂ−９】
〈流動食用固体製剤〉
実施例Ａ−４の方法で得たトレハルロース高含有糖質粉末５００重量部、粉末卵黄２７０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩化ナトリウム４．４重量部、塩化カリウム１．８５重量部、硫酸マグネシウム４重量部、チアミン０．０１重量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミンＥアセテート０．６重量部およびニコチン酸アミド０．０４重量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、１袋分を約１５０乃至３００ｍＬの水に溶解して流動食とし、経口的、または鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用される。
【００８１】
【実施例 Ｂ−１０】
〈外傷治療用膏薬〉
実施例Ａ−４の方法で得たトレハルロース高含有糖質粉末５００重量部に、ヨウ素３重量部を溶解したメタノール５０重量部を加え混合し、更に１０％プルラン水溶液２００重量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷冶療用膏薬を得た。本品は、治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【００８２】
【発明の効果】
上記から明らかなように、蔗糖を含有する水溶液にマルトース・トレハロース変換酵素を作用させ得られるトレハルロース含有糖質は、蔗糖からのトレハルロース生成率が高く、分離、精製も容易である。トレハルロースはグルコースとフルクトースからなる還元性二糖類で、上品で良質な甘味を有している。また、経口的または非経口的に使用され、毒性、副作用の懸念もなく、よく代謝利用される。
【００８３】
本発明のトレハルロース含有糖質は、液状で、又は粉末状でその取扱いが容易である。さらに、本糖質は、浸透圧調節性、賦型性、照り付与性、保湿性、粘性、他糖の晶出防止性、難発酵性などの諸性質を具備している。これらの諸性質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤などとして各種組成物の製造に有利に利用できる。従って、本発明のトレハルロース含有糖質とその製造方法並びに用途を確立したことは、食品、化粧品、医薬品分野などにおける工業的意義が極めて大きい。
Claims (6)
- 蔗糖含有溶液にサーマス属微生物由来のマルトース・トレハロース変換酵素を作用させ得られる、固形物中のパラチノースに対するトレハルロースの比が１４以上であるトレハルロース含有糖質。
- 固形物当たりのパラチノース含量が４ｗ／ｗ％以下である請求項１記載のトレハルロース含有糖質。
- トレハルロース含有糖質が、トレハルロースを固形物当たり１０ｗ／ｗ％以上含有している請求項１又は２に記載のトレハルロース含有糖質。
- 蔗糖含有溶液にサーマス属微生物由来のマルトース・トレハロース変換酵素を４０乃至７０℃の温度で作用させてトレハルロースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするトレハルロースまたはトレハルロース含有糖質の製造方法。
- 蔗糖含有溶液にマルトース・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり１０単位以上作用させることを特徴とする請求項４に記載のトレハルロースまたはトレハルロース含有糖質の製造方法。
- 得られた酵素反応液にインベルターゼを作用させ、さらに、塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて、トレハルロース含量を高めることを特徴とする請求項４または５に記載のトレハルロースまたはトレハルロース含有糖質の製造方法。
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