KR20070094638A - 케르세틴 배당체 조성물 및 그의 제조방법 - Google Patents

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노리후미 다테이시
마사미츠 모리와키
가즈히로 에무라
슈지 오쿠야마
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산토리 가부시키가이샤
산에이겐 에후.에후. 아이. 가부시키가이샤
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Abstract

체내흡수성이 우수하고 그 결과, 체내에서 우수한 항산화활성을 발휘하는 α-글리코실 이소케르시트린의 신규 조성물을 제공한다. 또한 상기 조성물의 조제방법을 제공한다. 화학식(1):
[화학식 1]
Figure 112007055115626-PCT00021
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 0 또는 1 이상의 정수를 의미한다.)
로 표시되는 케르세틴 배당체의 혼합물로 이루어지는 조성물로서, 적어도 n=3인 케르세틴 배당체를 포함하며, 또한 하기 (a)의 요건을 만족하는 케르세틴 배당체 조성물: (a) 상기 조성물 중에 포함되는 n=1~3인 케르세틴 배당체의 총량이 50몰% 이상이며, 또한 n이 4 이상인 케르세틴 배당체의 총량이 15몰% 이하이다. 상기 조성물은 효소처리 이소케르시트린을 β-아밀라아제로 처리함으로써 조제할 수 있다.
케르세틴 배당체, 효소처리 이소케르시트린, 아밀라아제, 체내흡수성, 항산화활성

Description

케르세틴 배당체 조성물 및 그의 제조방법{QUERCETIN GLYCOSIDE COMPOSITION AND METHOD OF PREPARING THE SAME}
본 발명은 산화방지제, 퇴색방지제 및 향미변화방지제 등으로서 식품 분야나 향장품 분야 등에서 널리 사용되고 있는 이소케르시트린(isoquercitrin)이나 α-글리코실 이소케르시트린(α-glycosyl isoquercitrin)(이하, 이들은 총칭하여 "케르세틴 배당체(quercetin glycoside)" 라고 함)의 혼합물로 이루어지는 신규 조성물에 관한다. 또한 본 발명은 이러한 조성물의 제조방법에 관한다. 본 발명의 조성물은 경구 흡수성 및 항산화 작용이 우수하므로, 생체용 항산화제로서 바람직하게 식품에 적용될 수 있다.
최근, 활성 산소나 자유 라디칼에 의한 산화 스트레스가 생활습관병을 시작으로 하는 다양한 질병의 원인으로 되는 것이 알려지고 있다. 산소는 살아가기 위한 에너지를 생산하기 위하여 필수 분자인 한편, 과잉의 산소가 매우 반응성이 높은 활성 산소로 변화하여 생체에 손해를 주고 있는 것도 사실이다. 활성 산소로서 는 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 라디칼(·O2 -), 과산화수소(H2O2), OH 라디칼(·OH) 및 여기분자종인 일중항산소(single oxygen)(1O2) 등이 있다. 생물은 원래 이들 활성 산소에 의한 산화 장해를 방지하는 능력을 가지고 있으며, 비타민 E 또는 항산화효소가 이를 맡고 있다. 그러나 나이를 드는 것 등의 요인에 의하여 산화 장해를 막는 능력이 저하하거나, 또는 과격한 운동이나 스트레스 부하 등의 요인에 의하여 방어 능력 이상의 활성 산소가 발생하는 경우에는 소거되지 않은 활성 산소가 표적 분자를 산화하고, 그 결과 생체 성분은 장해를 받아 노화가 일어나게 된다.
따라서, 활성 산소 또는 자유 라디칼을 소거하는 항산화물질을 효율적으로 섭취하고, 산화 스트레스로부터 방어하는 것이 다양한 질병의 예방 또는 치료의 관점에서 매우 중요한 것으로 생각되고 있다. 특히, 식품로부터 산화적 장해에 대한 방어기능성분을 적극적으로 섭취함으로써, 보다 효율적으로 이러한 장해를 제어, 소거할 수 있는 것으로 생각되기 때문에, 항산화작용을 갖는 다양한 식품 성분에 주목이 집중되고 있다.
플라보노이드(flavonoid)는 일상적으로 섭취하는 식품 중에 다종다양한 형태로 포함되어 있으며, 강한 항산화활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 그러나 그 항산화활성은 생체외에서는 유효하지만, 경구흡수성이 낮기 때문에 생체 내에서는 활성 산소나 자유 라디칼을 소거하기에는 충분하지 않다. 따라서, 플라보노이드(헤 스페리딘(hesperidine), 디오스민(diosmin), 나린진(naringin), 네오헤스페리딘(neohesperidine))에 당을 결합시킴으로써 흡수성을 높이는 방법이 제안되고 있다(일본국 특허공개공보 제2000-78956호 참조). 또한, 메밀에 포함되는 루틴(rutin)에 당전이하여 얻어진 α-글리코실 루틴(α-glycosyl rutin)이 루틴과 비교하여 그 흡수성이 향상하는 것이 보고되어 있다(일본국 특허공개공보 제2004-59522호 및 Shimoi K. et al., J Agric Food Chem., 51, 2785-2789, 2003 참조).
루틴의 아글리콘(aglycone)인 케르세틴(Quercetin: 3,3′,4′,5,7-펜타하이드록시플라본(3,3′,4′,5,7-pentahydroxyflavone))은 강력한 항산화활성(Middlton EJ. et al., Pharmacol Rev., 52, 673-751, 2000 참조) 외에, 혈소판의 응집 억제 및 접착 억제 작용, 혈관 확장 작용, 항암 작용 등 다양한 생리기능을 갖는 것이 알려져 있다. 이 케르세틴에 대해서도, 양파에 많이 함유된 케르세틴 배당체(케르세틴-4′-β-D-글루코사이드(Quercetin-4′-β-D-glucoside), 케르세틴-3,4′-β-D-글루코사이드(Quercetin-3,4′-β-D-glucoside)) 쪽이 흡수성이 우수한 것으로 보고되어 있다(Hollman PC et al., Arch Toxicol Suppl., 20, 237-248, 1998). 또한, 유사하게 케르세틴의 3위치에 글루코오스가 β결합한 이소케르시트린(케르세틴-3-β-D-글루코사이드(Quercetin-3-β-D-glucoside))은 케르세틴이나 루틴보다도 흡수성이 높은 것으로 보고되어 있다(Morand C et al., Free Raf Res., 33, 667-676, 2000).
이와 같이 이소케르시트린은 케르세틴이나 루틴보다 흡수성이 우수한 성분이지만, 물에 난용성이므로 식품이나 음료 등의 수계(水系) 조성물에 대하여 이용이 제한된다고 하는 문제를 가지고 있다. 따라서, 이러한 문제점을 해소하는 방법으로서 당전이 효소를 이용하여 기질의 글루코오스 잔기를 이소케르시트린의 글루코오스 잔기 부위에 전이시켜 α-글리코실 이소케르시트린(α-glycosyl isoquercitrin)을 제조하는 방법이 제안되어 있다(일본국 특허공개공보 평1-213293호 참조). 이와 같이 하여 조제된 α-글리코실 이소케르시트린은 이소케르시트린의 작용은 그대로 나타내면서, 물에의 용해성이 개선된 물에 쉽게 용해되는 물질이며, San-Ei Gen F.F.I., INC.로부터 식품용 산화방지제(식품 첨가물)로서 "SANMELIN® AO-1007" 및 "SANMELIN® powder C-10" 명칭으로 시판되고 있다.
상기한 바와 같이, 배당체화에 의하여 경구흡수성이 향상되는 것은 많은 플라보노이드에서 확인되었으나, 그 효과는 아직 충분한 것은 아니다.
따라서 본 발명은 플라보노이드의 일종인 이소케르시트린 또는 α-글리코실 이소케르시트린 등의 케르세틴 배당체에 대하여 그 경구흡수성을 더욱 높이는 것을 목적으로 한다. 구체적으로 본 발명은 경구흡수성이 개선된 케르세틴 배당체의 혼합물로 이루어지는 신규 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 이러한 신규 조성물의 조제방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 케르세틴 배당체 조성물에 대하여 종래의 효소처리 이소케르시트린보다도 경구흡수성을 높이는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구한 결과, 하기 화학식(1)
[화학식 1]
Figure 112007055115626-PCT00001
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 0 또는 1 이상의 정수를 의미한다.)
로 표시되는 케르세틴 배당체(Gn)의 글루코오스 잔기의 α위치에 결합하는 당(글루코오스)의 수(n)에 따라 케르세틴 배당체(Gn)의 경구흡수성에 차이가 생기는 것을 발견하였다. 구체적으로는, 상기 글루코오스 수(n)가 0인 이소케르시트린(G0) 및 상기 글루코오스 수(n)가 1~7인 α-글리코실 이소케르시트린(G1, G2, ..., G7)의 혼합물로부터 G0, G1, G2, G3 및 G4를 풍부하게 포함하는 획분을 분리하여 취하여 경구흡수성을 조사한 결과, 놀랍게도 G3를 풍부하게 포함한 획분에 있어서 경구흡수성이 가장 높았으며, 상세하게는 글루코오스 수(n)가 1, 2 및 3으로 증가할수록 경구흡수성이 높아지고, 글루코오스 수(n)가 4로 되면 경구흡수성이 저하하는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 더욱 검토를 계속하여, 효소처리 이소케르세틴을 원료로 하여 글루코오스 수(n)가 4 이상인 α-글리코실 이소케르시트린(G(4≤))의 양을 저감하는 처리를 행함으로써 경구흡수성이 향상되고, 또한 글루코오스 수(n)가 0인 이소케르시트린(G0)의 양을 저감하는 처리를 행하는 것으로, 더욱 경구흡수성이 향상되는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명자들은 상기 글루코오스 수(n)가 1~3의 범위인 α-글리코실 이소케르시트린(G1-3)를 많이 포함하며, 상기 글루코오스 수(n)가 4 이상인 α-글리코실 이소케르시트린(G(4≤)) 또는 n이 0인 이소케르시트린(G0)의 함유량이 적은 조성물(케르세틴 배당체의 혼합물)이 종래 공지의 효소처리 이소케르세틴보다 높은 경구흡수성을 가지며, 그 결과 생체 내에서 우수한 항산화 작용을 발취하는 것을 확인하였다.
또한 본 발명자들은 이와 같은 조성물은 효소처리 이소케르시트린(이소케르시트린 배당체)를 아밀라아제, 특히 β-아밀라아제로 처리함으로써 비교적 간단하고 안정적으로 조제할 수 있음을 발견하고, 경구흡수성이 우수한 상기 케르세틴 배당체 조성물을 공업적으로 대량 제조할 수 있음을 확인하였다. 본 발명은 이러한 발견에 근거하여 완성한 것이다.
즉, 본 발명은 하기 태양을 가진다:
(1) 케르세틴 배당체 조성물
(1-1) 하기 화학식(1)
[화학식 1]
Figure 112007055115626-PCT00002
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 0 또는 1 이상의 정수를 의미한다.)
로 표시되는 케르세틴 배당체의 혼합물로 이루어지는 조성물로서, 적어도 n=3인 케르세틴 배당체를 포함하며, 또한, 하기 (a)의 요건을 만족하는 케르세틴 배당체 조성물:
(a) 상기 조성물 중에 포함되는 n=1~3인 케르세틴 배당체의 총량이 50몰% 이상이며, 또한 n이 4 이상인 케르세틴 배당체의 총량이 15몰% 이하이다.
(1-2) n이 4 이상인 케르세틴 배당체의 총량이 10몰% 이하인 (1-1) 기재의 케르세틴 배당체 조성물.
(1-3) n=1~3인 케르세틴 배당체의 총량이 60몰% 이상인 (1-1) 또는 (1-2) 기재의 케르세틴 배당체 조성물.
(1-4) n=1~3인 케르세틴 배당체의 총량이 70몰% 이상인 (1-1) 또는 (1-2) 기재의 케르세틴 배당체 조성물.
(1-5) 하기 (b) 및 (c)의 적어도 하나의 요건을 만족하는 (1-1) 내지 (1-4)의 어느 하나에 기재된 케르세틴 배당체 조성물:
(b) 상기 조성물 중에 포함되는 n=0인 케르세틴 배당체가 20몰% 이하,
(c) n=2 및 3인 케르세틴 배당체를 포함하며, 그들의 총량이 50몰% 이상.
(1-6) 하기 (d)의 요건을 만족하는 (1-1) 내지 (1-5)의 어느 하나에 기재된 케르세틴 배당체 조성물:
(d) 상기 조성물 중에 포함되는 n=1~3인 케르세틴 배당체의 총량이 60몰% 이상이며, 또한 n=0인 케르세틴 배당체가 20몰% 이하.
(1-7) 하기 (e)의 요건을 만족하는 (1-1) 내지 (1-6)의 어느 하나에 기재된 케르세틴 배당체 조성물:
(e) 상기 조성물 중에 포함되는 n=1~3인 케르세틴 배당체의 총량이 70몰% 이상이며, 또한 n이 4 이상인 케르세틴 배당체의 총량이 10몰% 이하, 및 n이 0인 케르세틴 배당체가 20몰% 이하.
(1-8) 하기 (f)의 요건을 만족하는 (1-1) 내지 (1-7)의 어느 하나에 기재된 케르세틴 배당체 조성물:
(f) n=1, 2 및 3인 케르세틴 배당체를 포함한다.
(1-9) 효소처리 이소케르시트린을 아밀라아제로 처리하여 조제되는 (1-1) 내지 (1-8)의 어느 하나에 기재된 케르세틴 배당체 조성물.
(1-10) 효소처리 이소케르시트린을 아밀라아제 처리한 후에 이소케르시트린을 제거하거나, 또는 효소처리 이소케르시트린으로부터 이소케르시트린을 제거한 후에 아밀라아제 처리함으로써 조제되는 (1-1) 내지 (1-8)의 어느 하나에 기재된 케르세틴 배당체 조성물.
(1-11) 아밀라아제가 β-아밀라아제인 (1-9) 또는 (1-10)에 기재된 케르세틴 배당체 조성물.
(2) 식품
(2-1) (1-1) 내지 (1-11)의 어느 하나에 기재된 케르세틴 배당체 조성물을 포함하는 식품.
(3) 경구 흡수성이 높은 케르세틴 배당체 조성물을 조제하는 방법
(3-1) 효소처리 이소케르시트린을 원료로 하여, 하기 화학식(2):
[화학식 2]
Figure 112007055115626-PCT00003
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 4 이상의 정수를 의미한다.)
로 표시되는 케르세틴 배당체의 양을 저감하여 그 총량을 15몰% 이하로 하는 공정을 가지는, 효소처리 이소케르시트린보다도 경구흡수성이 높은 상기 (1-1)에 기재된 케르세틴 배당체 조성물을 조제하는 방법.
(3-2) 상기 화학식(2)로 표시되는 케르세틴 배당체의 양을 저감하는 공정이 효소처리 이소케르시트린을 아밀라아제로 처리하는 조작을 포함하는 것인, (3-1) 기재의 방법.
(3-3) 아밀라아제가 β-아밀라아제인 (3-2) 기재의 방법.
(3-4) 하기 화학식(3)
[화학식 3]
Figure 112007055115626-PCT00004
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 0을 의미한다.)
로 표시되는 이소케르시트린의 양을 저감하는 공정을 갖는, (3-1) 내지 (3-3)의 어느 하나에 기재된 방법.
(3-5) 효소처리 이소케르시트린을 아밀라아제로 처리하는 공정의 전후에 이소케르시트린을 제거하는 공정을 갖는, (3-4)에 기재된 케르세틴 배당체 조성물의 조제방법.
(4) 경구흡수성을 높이는 방법
(4-1) 효소처리 이소케르시트린을 원료로 하여, 하기 화학식(2):
[화학식 2]
Figure 112007055115626-PCT00005
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 4 이상의 정수를 의미한다.)
로 표시되는 케르세틴 배당체의 양을 저감하는 공정을 갖는, 케르세틴 배당체 조성물의 경구흡수성을 높이는 방법.
(4-2) 상기 화학식(2)로 표시되는 케르세틴 배당체의 양을 저감하는 공정이 효소처리 이소케르시트린을 아밀라아제로 처리하는 조작을 포함하는 것인, (4-1) 기재의 방법.
(4-3) 아밀라아제가 β-아밀라아제인 (4-2) 기재의 방법.
(4-4) 하기 화학식(3):
[화학식 3]
Figure 112007055115626-PCT00006
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 0을 의미한다.)
로 표시되는 이소케르시트린의 양을 저감하는 공정을 갖는, (4-1) 내지 (4-3)의 어느 하나에 기재된 방법.
(4-5) 효소처리 이소케르시트린을 아밀라아제로 처리하는 공정의 전후에, 이소케르시트린을 제거하는 공정을 갖는, (4-4)에 기재된 방법.
(4-6) 효소처리 이소케르시트린을 아밀라아제로 처리하여, 하기 화학식(1)
[화학식 1]
Figure 112007055115626-PCT00007
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 0 또는 1 이상의 정수를 의미한다.)
로 표시되는 케르세틴 배당체의 혼합물로 이루어지는 조성물로서, 하기 (ⅰ) 및 (ⅱ)의 요건을 만족하는 조성물을 조제하는 것을 특징으로 하는 케르세틴 배당체 조성물의 경구흡수성을 높이는 방법:
(ⅰ) 적어도 n=3인 케르세틴 배당체를 포함하며,
(ⅱ) 상기 조성물 중에 포함되는 n=1~3인 케르세틴 배당체의 총량이 50몰% 이상이며, 또한 n이 4 이상인 케르세틴 배당체의 총량이 15몰% 이하이다.
(4-7) 하기 (ⅲ)의 요건을 만족하는 케르세틴 배당체 조성물을 조제하는 것을 특징으로 하는 (4-6)에 기재된 방법:
(ⅲ) 상기 조성물 중에 포함되는 n=1~3인 케르세틴 배당체의 총량이 60몰% 이상이며, 또한, n이 0인 케르세틴 배당체가 20몰% 이하이다.
(4-8) 하기 (ⅳ)의 요건을 만족하는 케르세틴 배당체 조성물을 조제하는 공정을 갖는 (4-6) 또는 (4-7)에 기재된 방법:
(ⅳ) 상기 조성물 중에 포함되는 n=1~3인 케르세틴 배당체의 총량이 70몰% 이상이며, 또한 n이 4 이상인 케르세틴 배당체의 총량이 10몰% 이하이며, n이 0인 케르세틴 배당체가 20몰% 이하이다.
(4-9) 하기 (ⅴ)의 요건을 만족하는 케르세틴 배당체 조성물을 조제하는 공정을 갖는 (4-6) 내지 (4-8)의 어느 하나에 기재된 방법:
(ⅴ) 상기 조성물 중에 n=2 및 3인 케르세틴 배당체를 포함하며, 그들의 총량이 50몰% 이상이다.
Ⅰ. 용어의 설명
(Ⅰ-1) 케르세틴 배당체 및 케르세틴 배당체 조성물
본 발명에 있어서 케르세틴 배당체는, 하기 화학식(4)로 표시되는 케르세틴의 3위치에 글루코오스가 β 결합한 이소케르시트린(케르세틴 3-O-β-D-글루코피라노사이드(quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside))(이하, 「IQC」라고도 함), 및 상기 IQC의 글루코오스 잔기에 글루코오스가 α-1,4 결합으로 1~15 정도 부가한 각각의 α-글리코실 이소케르시트린을 의미한다.
[화학식 4]
Figure 112007055115626-PCT00008
상기 IQC 및 α-글리코실 이소케르시트린은 양자 모두 케르세틴의 배당체이므로, 본 명세서에서는 이들을 총칭하여 또는 양자를 구별하는 것 없이 「케르세틴 배당체」로 칭한다. 또한 α-글리코실 이소케르시트린은 IQC의 배당체에 상당하므로, 본 명세서에서는 이를 IQC와 구별하는 의미에서 「IQC 배당체」로 칭하는 경우도 있다.
본 발명이 대상으로 하는 케르세틴 배당체 조성물은 이들 IQC와 각종 IQC 배당체를 임의의 비율로 조합하여 함유하는 혼합물이다.
본 발명의 케르세틴 배당체 조성물은 구체적으로는 하기 화학식(1)로 표시되는 케르세틴 배당체의 혼합물로서, 적어도 n=3인 α-글리코실 이소케르시트린을 포함하는 것이다.
[화학식 1]
Figure 112007055115626-PCT00009
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 나타내며, n은 0 또는 1 이상의 정수를 나타낸다.)
본 명세서에서는, 설명의 편의상 상기 화학식(1) 중, n=0으로 표시되는 IQC를 「G0」또는 「IQC-G0」, n=1로 표시되는 IQC 배당체(IQC에 글루코오스가 α-1,4 결합으로 1개 결합한 배당체)를 「G1」또는 「IQC-G1」, n=2로 표시되는 IQC 배당체(IQC에 글루코오스가 α-1,4 결합으로 2개 결합한 배당체)를 「G2」또는 「IQC-G2」, n=3으로 표시되는 IQC 배당체(IQC에 글루코오스가 α-1,4 결합으로 3개 결합한 배당체)를 「G3」또는 「IQC-G3」, n=4로 표시되는 IQC 배당체(IQC에 글루코오스가 α-1,4 결합으로 4개 결합한 배당체)를 「G4」또는 「IQC-G4」, n=5로 표시되는 IQC 배당체(IQC에 글루코오스가 α-1,4 결합으로 5개 결합한 배당체)를 「G5」또는 「IQC-G5」, n=6으로 표시되는 IQC 배당체(IQC에 글루코오스가 α-1,4 결합으로 6개 결합한 배당체)를 「G6」또는 「IQC-G6」, ‥‥ 및 n이 m으로 표시되는 IQC 배당체(IQC에 글루코오스가 α-1,4 결합으로 m개 결합한 배당체)를 「Gm」또는 「IQC-Gm」(m은 7이상의 정수를 의미한다)로 기재하는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서, IQC, IQC 배당체, 케르세틴 배당체, G0, G1(또는 「IQC-G1」), G2(또는 「IQC-G2」), G3(또는 「IQC-G3」), G4((또는 「IQC-G4」), ‥‥ Gm((또는 「IQC-Gm」)이라는 용어는 단일 화합물을 의미하거나, 또는 이들 화합물을 총칭하는 의미로 이용된다. 한편, 각각의 케르세틴 배당체(G0, G1, G2, ‥‥ Gm)의 임의의 조합으로 이루어지는 혼합물을 의미하는 경우는「케르세틴 배당체 조성물」 또는 「케르세틴 배당체 혼합물」로 칭한다.
또한 본 명세서에 있어서, 「이소케르시트린 G(1-3)의 총량」 또는 「IQC- G(1-3)의 총량」은 대상으로 하는 케르세틴 배당체 조성물 중에 포함되어 있는 n이 1인 케르세틴 배당체(G1), n이 2인 케르세틴 배당체(G2), 및 n이 3인 케르세틴 배당체(G3)의 총량을 의미한다. 또한 본 명세서에 있어서, 「이소케르시트린 G(4≤)의 총량」 또는 「IQC- G(4≤)의 총량」은 대상으로 하는 케르세틴 배당체 조성물 중에 포함되는 n이 4 이상인 케르세틴 배당체의 총량을 의미한다.
(Ⅰ-2) 효소처리 이소케르시트린
본 발명에서 「효소처리 이소케르시트린」은 관용 방법에 따라 IQC에 당공여체(글루코오스원)의 존재하, 글루코오스 잔기 전이 효소를 작용시켜 얻어지는 것으로, 하기 식으로 표시되는, IQC와 다양한 정도로 글루코실화된 α-글리코실 이소케르시트린의 혼합물을 의미한다(예를 들면, FFI Journal Vol. 209, No.7, 2004, pp. 622-628; 및 Syokuhin Eisei Gaku Zasshi (Journal of Food Hygienics), Vol. 41, No.1, pp.54-60 등 참조).
Figure 112007055115626-PCT00010
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 0 또는 1 이상의 정수를 나타낸다.)
구체적으로는 「효소처리 이소케르시트린」은 상기 식에서 α-1,4 결합의 글루코오스 수(n)가 0인 IQC와 α-1,4 결합의 글루코오스 수(n)가 1 이상, 통상 1~15, 바람직하게는 1~10의 범위인 α-글리코실 이소케르시트린의 혼합물이다.
여기서, IQC의 배당화 처리에 사용되는 글루코오스 잔기 전이효소로서는 예를 들어, α-아밀라아제(E.C.3.2.1.1)나 α-글루코시다아제(E.C.3.2.1.20) 등의 글루코시다아제(glucosidase); 또는 사이클로덱스트린글루카노트랜스페라아제(cyclodextrin glucanotransferase)(E.C.2.4.1.19)(이하 CGTase로 생략하여 기재한다) 등의 트랜스글루코시다아제(transglucosidase)를 들 수 있다.
이들 당전이효소는 모두 상업적으로 입수할 수 있는 효소이다. 시판되는 효소제로서는 예를 들어 콘티자임(Contizyme, 상품명)(Amano Enzyme Inc. 제품)을 예시할 수 있다. 또한, 당전이효소의 사용량은 CGTase[효소비활성 약 100단위(가용성 전분으로부터 β-사이클로덱스트린을 1분 동안 1㎎ 생성하는 효소량을 1단위로 한다)]를 예로 들면, 이소케르시트린 1중량부에 대하여 당전이효소 0.001~20중량부 범위를 들 수 있다. 바람직하게는 0.005~10중량부 정도, 보다 바람직하게는 0.01~5중량부 정도이다.
배당화에 이용되는 당 공여체(글루코오스원)로서는, 그 글루코오스 잔기의 1분자 이상이 IQC 1분자에 전이될 수 있는 것이면 된다. 예를 들어, 글루코오스, 말토오스, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 전분이나 전분 액화물, 전분 당화물 및 사이클로덱스트린 등을 들 수 있다. 이러한 글루코오스원의 사용량은 반응계에 존재하는 이소케르시트린 1중량부에 대하여 통상 0.1~20중량부의 비율, 바람직하게는 0.5~15중량부, 보다 바람직하게는 1~10중량부의 비율을 들 수 있다.
「효소처리 이소케르시트린」은 사용하는 효소의 종류에 따라 다르지만, 예를 들어, 80℃ 이하, 바람직하게는 약 20~80℃, 보다 바람직하게는 약 40~75℃, 또한 통상 pH 3~11 정도, 바람직하게는 pH 4~8의 조건에서, 상기 당 공여체(글루코오스원)의 존재하, IQC에 글루코오스 잔기 전이효소를 작용시킴으로써 조제할 수 있으며, 통상 하기 조성을 가지고 있다.
G0 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8이상
몰비(%) 23±8 22±3 24±4 12±2 8±2 5±2 3±2 2±1 1±1
상기 반응은 정치, 교반 또는 진탕하면서 행할 수 있다. 반응중의 산화를 방지하기 위하여, 반응계의 헤드스페이스를 질소 등의 불활성기체로 치환하여도 좋으며, 또는 아스코르빈산 등의 산화방지제를 반응계에 첨가하는 것도 가능하다.
효소처리 이소케르시트린은 상기와 같이 이소케르시트린을 원료로 하는 이외에, 루틴으로부터 출발하여 조제하는 것도 가능하다. 이 경우, 루틴에 α-1,6-람노시다아제(rhamnosidase)(E.C.3.2.1.40)를 작용시켜 이소케르시트린으로 변환시켜, 상기 방법에 따라 효소처리 이소케르시트린을 조제할 수 있다. α-1,6-람노시다아제는 그 활성을 가지는 것이면 되고, 시판품으로서는 헤스페리디나아제(hesperidinase)나 나린지나아제(naringinase)(Tanabe Seiyaku Co., Ltd. 제품) 및 셀룰라아제 A 「아마노」 3(cellulase A "Amano" 3)(Amano Enzyme Inc. 제품)를 예시할 수 있다.
Ⅱ. 케르세틴 배당체 조성물
본 발명이 대상으로 하는 케르세틴 배당체 조성물은 하기 화학식(1)로 표시되는, 케르세틴 배당체의 혼합물로서 적어도 n=3인 α-글리코실 이소케르시트린을 포함하는 것이다.
[화학식 1]
Figure 112007055115626-PCT00011
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 나타내며, n은 0 또는 1 이상의 정수를 나타낸다.)
보다 상세하게는, 본 발명의 케르세틴 배당체 조성물은 상기 화학식(1) 중 n=3인 α-글리코실 이소케르시트린(G3)을 포함하며, 하기 (a)의 요건을 만족하는 것이다:
(a) 상기 조성물 중에 포함되는 n=1~3인 케르세틴 배당체(IQC-G(1-3))의 총량이 50몰% 이상이며, 또한, n이 4 이상인 케르세틴 배당체(IQC-G(4≤)의 총량이 15몰% 이하이다.
후술하는 실험예 1~3, 5, 7 및 8에 나타낸 바와 같이, IQC에 α-1,4 결합한 글루코오스 수(n)가 1~3인 α-글리코실 이소케르시트린(G1, G2, G3)을 다량 포함하는 조성물은 공지의 효소처리 이소케르시트린, 글루코오스 수(n)가 4~6인 α-글리코실 이소케르시트린(G4, G5, G6)을 다량 포함하는 조성물, 또는 글루코오스 수(n)가 3~6인 α-글리코실 이소케르시트린(G3, G4, G5, G6)을 다량 포함하는 조성물에 비하여 경구투여에 의한 체내 흡수성(혈중이행성)이 높으며, 그 결과 경구투여한 경우에, 체내에서 우수한 항산화능을 발휘한다. 글루코오스 수(n)가 1~3인 α-글리코실 이소케르시트린 중에서도, 특히 글루코오스 수(n)가 3인 α-글리코실 이소케르시트린(G3), 다음으로 글루코오스 수(n)가 2인 α-글리코실 이소케르시트린(G2)은 높은 체내 흡수성(혈중이행성)을 가지고 있다. 한편, 글루코오스 수(n)가 4인 α-글리코실 이소케르시트린(G4)으로 되면, 글루코오스 수(n)가 3인 α-글리코실 이소케르시트린(G3)에 비하여 체내 흡수성(혈중이행성)이 저하하는 경향이 있다(실험예 1, 도 2 참조).
따라서, 본 발명의 케르세틴 배당체 조성물은 상기한 바와 같이, G3을 포함하며, IQC-G(4≤)의 총량이 15몰% 이하인 조성물로서, IQC-G(1-3)을 총량으로서 전체의 50몰% 이상, 바람직하게는 55몰% 이상, 보다 바람직하게는 60몰% 이상, 더욱 바람직하게는 65몰% 이상, 더욱 더 바람직하게는 70몰% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 75몰% 이상, 특히 바람직하게는 80몰% 이상, 특히 더 바람직하게는 85몰% 이상의 비율로 포함하는 것이다.
상기와 같이, 케르세틴 배당체 조성물은 n이 4 이상인 α-글리코실 이소케르시트린[IQC-G(4≤)]을 높은 비율로 함유하면 체내 흡수성(혈중이행성)이 저하하는 경향이 있다. 이 때문에, 본 발명의 케르세틴 배당체 조성물 중의 IQC-G(4≤)의 함유 비율(총량)은 15몰% 보다도 더 낮은 것이 바람직하다. 예를 들어, IQC-G(4≤)의 함유 비율로서 10몰% 이하, 바람직하게는 6몰% 이하를 예시할 수 있다.
본 발명의 케르세틴 배당체 조성물은 n이 0인 이소케르시트린(IQC)(G0)을 함유하는 것이어도 좋다. 다만, IQC(G0)의 함유 비율은 낮은 편이 케르세틴 배당체 조성물의 전체에 차지하는 n=1~3인 α-글리코실 이소케르시트린(IQC-G(1-3))의 총량을 한층 높일 수 있기 때문에 바람직하다. 본 발명의 케르세틴 배당체 조성물 중에 포함되는 IQC(G0)의 비율로서는 예를 들어, 45몰% 이하, 바람직하게는 30몰% 이하, 보다 바람직하게는 20몰% 이하, 더욱 바람직하게는 10몰% 이하를 예시할 수 있다.
본 발명의 케르세틴 배당체 조성물은 바람직하게는 상기 (a)의 요건에 더하여 하기 (b)의 요건을 만족하는 것이다:
(b) 상기 조성물 중에 포함되는 n이 0인 케르세틴 배당체의 양이 20몰% 이하.
또한, 본 발명의 케르세틴 배당체 조성물의 다른 적절한 태양으로서, 상기 (a) 요건에 더하여, 또는 상기 (a) 및 (b)의 요건에 더하여, 하기 (c)의 요건을 만족하는 것을 들 수 있다:
(c) n=2 및 3인 α-글리코실 이소케르시트린(G2 및 G3)을 포함하며, 이들 (IQC-G(2-3))의 총량이 전체의 50몰% 이상.
IQC-G(2-3)의 총량으로서 보다 바람직하게는 55몰% 이상, 60몰% 이상, 65몰% 이상, 70몰% 이상, 75몰% 이상을 들 수 있다.
또한 본 발명의 케르세틴 배당체 조성물의 다른 적절한 태양으로서, G3을 포함하며, IQC-G(4≤)의 총량이 15몰% 이하이며, 하기 (d)의 요건을 만족하는 것을 들 수 있다:
(d) 상기 조성물 중에 포함되는 n=1~3인 케르세틴 배당체(IQC-G(1-3))의 총량이 60몰% 이상이며, 또한 n이 0인 케르세틴 배당체(IQC 또는 G0)가 20몰% 이하.
상기 요건 (d)를 만족하는 케르세틴 배당체 조성물로서, 보다 바람직하게는 n=1~3인 케르세틴 배당체(IQC-G(1-3))의 총량이 70몰% 이상, 바람직하게는 80몰% 이상, 보다 바람직하게는 85몰% 이상이다. 또한, 바람직하게는 n이 4 이상인 케르세틴 배당체의 총량이 10몰% 이하, 바람직하게는 6몰% 이하이다. 더욱 바람직하게는 n이 0인 케르세틴 배당체(IQC 또는 G0)가 10몰% 이하이다.
본 발명의 케르세틴 배당체 조성물의 다른 별개의 태양으로서, 상기 화학식(1) 중, n=3인 α-글리코실 이소케르시트린(G3)을 포함하며, 하기 (e)의 요건을 만족하는 것을 들 수 있다.
(e) 상기 조성물 중에 포함되는 n=1~3인 케르세틴 배당체(IQC-G(1-3))의 총량이 70몰% 이상이며, 또한, n이 4 이상인 케르세틴 배당체(IQC-G(4≤))의 총량이 10몰% 이하, 및 n이 0인 케르세틴 배당체(IQC 또는 G0)가 20몰% 이하.
상기 요건 (e)를 만족하는 케르세틴 배당체 조성물로서, 보다 바람직하게는 IQC-G(1-3)의 총량이 75몰% 이상, 바람직하게는 80몰% 이상, 보다 바람직하게는 85몰% 이다. 또한 바람직하게는 IQC-G(4≤)의 총량이 6몰% 이하이다. 더욱 바람직하게는 n이 0인 케르세틴 배당체(G0)가 10몰% 이하인 것을 들 수 있다.
Ⅲ. 케르세틴 배당체 조성물의 조제방법
경구흡수성이 높은 본 발명의 케르세틴 배당체 조성물은 효소처리 이소케르시트린을 원료로서, 하기 화학식(2)
[화학식 2]
Figure 112007055115626-PCT00012
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 4 이상의 정수를 의미한다.)
로 표시되는 케르세틴 배당체(IQC-G(4≤))의 양을 저감하여 그 총량을 20몰% 이하로 하는 공정을 거쳐 조제할 수 있다.
여기서, IQC-G(4≤)의 양을 저감하는 방법은 어떠한 것이어도 좋으며, 예를 들어 효소처리 이소케르시트린으로부터 IQC-G(4≤)를 분획 제거하는 방법, 효소처리 이소케르시트린 중에 포함되는 IQC-G(4≤)를 분해하는 방법 등의 어떠한 방법을 이용할 수 있다. 바람직하게는 효소처리 이소케르시트린을 아밀라아제로 처리하는 방법을 들 수 있다.
여기서 사용되는 아밀라아제는 아밀라아제 활성을 가지는 효소이면 좋고, 그 기원을 특히 제한하는 것은 아니다. 예를 들어, α-아밀라아제(E.C.3.2.1.1), β-아밀라아제(E.C.3.2.1.2), α-글루코시다아제(E.C.3.2.1.20), 글루코아밀라아제(E.C.3.2.1.3), 말토트리오하이드롤라아제(maltotriohydrolase) 등의 말토올리고당 생성효소를 들 수 있다.
적절하게는 β-아밀라아제를 들 수 있다. 아밀라아제로서 β-아밀라아제를 이용한 경우, 선택적으로 α-1,4 결합의 글루코오스 잔기 수(n)가 4 이상인 α-글리코실 이소케르시트린(IQC-G(4≤)의 함유비율을 저감시켜, 조성물 중에 포함되는 n=1~3인 α-글리코실 이소케르시트린(IQC-G(1-3))의 함유량을 증가시킬 수 있다. 따라서, G3를 포함하며, 하기 (a)의 요건을 만족하는 발명의 케르세틴 배당체 조성물을 간단하게 조제할 수 있다.
(a) 상기 조성물 중에 포함되는 IQC-G(1-3)의 총량이 50몰% 이상이며, 또한 IQC-G(4≤)의 총량이 15몰% 이하이다.
상기 본 발명에서 적절하게 사용되는 β-아밀라아제로서는, 대두(soybean), 대맥(barley), 소맥(wheat), 무, 고구마, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 등에 포함되어 있는 것이 알려져 있고, 모두 이 발명에 자유로이 사용할 수 있다. β-아밀라아제는 상업적으로 입수할 수 있는 효소이며, 예를 들어 대두 유래의 β-아밀라아제로서는 「β-아밀라아제 #1500(β-Amylase #1500)」(Nagase ChemteX Corporation 제품), 「바이오짐 M5(Biozyme M5)」(Amano Enzyme Inc. 제품); 대맥 유래의 β-아밀라아제로서는 「β-아밀라아제 L(β-Amylase L)」(Nagase ChemteX Corporation 제품), 「바이오짐/ML(Biozyme/ML)」(Amano Enzyme Inc. 제품) 및 「말토팀206」(Nagase ChemteX Corporation 제품); 배아 유래의 β-아밀라아제로서는 「바이오짐 M(Biozyme M)」(Amano Enzyme Inc. 제품); 아스퍼질러스 오리재 유래의 β-아밀라아제로서는 「유니아제 L(Uniase L)」(Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. 제품)를 예시할 수 있다.
β-아밀라아제로서는 반드시 정제할 필요는 없고, 본 발명의 목적이 달성될 수 있는 한 조(粗)정제물이어도 좋다. 예를 들어, 효소처리 이소케르시트린과 β-아밀라아제를 포함하는 획분(예를 들어, 대두 또는 대맥 등의 추출물)을 혼합하여 반응시켜도 좋다. 또한, β-아밀라아제를 고정화하여, 이를 뱃치(batch)식 또는 연속식으로 효소처리 이소케르시트린과 반응시켜도 좋다.
β-아밀라아제의 반응조건은 효소처리 이소케르시트린에 β-아밀라아제가 작용하는 조건이면 특히 제한되지 않는다. 바람직하게는 G3를 포함하며, IQC-G(4≤)의 총량이 15몰% 이하이며, IQC-G(1-3)을 총량으로서 전체의 50몰% 이상, 바람직하게는 55몰% 이상, 보다 바람직하게는 60몰% 이상, 더욱 바람직하게는 65몰% 이상, 더욱 더 바람직하게는 70몰% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 75몰% 이상, 특히 바람직하게는 80몰% 이상, 특히 더욱 바람직하게는 85몰% 이상의 비율로 포함하는 케르세틴 배당체 조성물을 생성하는 조건을 들 수 있다. 또한, IQC-G(4≤)의 함유 비율(총량)이 15몰%보다도 작은, 예를 들어 10몰% 이하, 바람직하게는 6몰% 이하의 비율로 포함하는 케르세틴 배당체 조성물을 생성하는 조건을 들 수 있다.
β-아밀라아제의 반응조건으로서, 예를 들어, 4000U/g의 효소를 사용한 경우의 β-아밀라아제의 사용량은 효소처리 이소케르시트린 1중량부에 대하여 0.0001~0.5중량부의 범위에서 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 0.0005~0.4중량부 정도, 보다 바람직하게는 0.001~0.3중량부 정도이다. 또한, 반응계 중의 효소처리 이소케르시트린의 양은 특히 제한되지는 않으나, 반응을 효율 좋게 행하는 목적에서는 반응계 100중량% 중에 통상 0.1~20중량%, 바람직하게는 0.5~10중량%, 보다 바람직하게는 1~10중량%의 비율로 포함하는 것이 바람직하다.
반응온도로서는 약 80℃ 이하의 범위를 들 수 있으며, 이 범위에서 적절하게 선택하여 이용할 수 있다. 이 범위 내에서 공업적으로 유리한 것은 약 20~80℃, 바람직하게는 약 40~75℃이다. 또한, pH 조건은 통상 pH 3~11 정도 이하, 바람직하게는 pH 4~8이다.
반응은 정치, 교반 또는 진탕하면서 행할 수 있다. 반응중의 산화를 방지하기 위하여, 반응계의 헤드스페이스를 질소 등의 불활성 기체로 치환하여도 좋으며, 또는 아스코르빈산 등의 산화방지제를 반응계에 첨가하는 것도 가능하다.
또한, 필요에 따라, 상기 방법에 의하여 얻어지는 반응 생성물에 대하여 추가로 이소케르시트린을 저감하는 공정을 행할 수 있다. 이러한 방법으로서는, 상기 방법으로 얻어지는 반응 생성물 중에서 이소케르시트린(IQC)(G0)을 제거·탈리할 수 있는 방법이면 특히 제한되지 않으며, 관용의 정제방법을 임의로 조합하여 행할 수 있다.
예를 들어, 상기 반응물을 산성으로 조정하여 냉각함으로써 IQC(G0)를 석출 침전시켜 제거하는 방법, 각종의 수지 처리법(흡착법, 이온교환법, 겔여과법 등), 막 처리법(한외여과막 처리법, 역침투막 처리법, 이온교환막 처리법, 제타전위막 처리법 등), 전기투석법, 염석, 산석, 재결정, 용매분획법 및 활성탄 처리법 등을 예시할 수 있다.
또한, IQC의 제거공정은 상기와 같이 아밀라아제 처리 후의 반응생성물에 대하여 행하여도 되며, 또는 아밀라아제 처리 전에 예를 들어 효소처리 이소케르시트린에 대하여 행할 수도 있다. 특히, 아밀라아제로서 β-아밀라아제를 이용하는 경우는 아밀라아제 처리 전후에 IQC 함유량에 거의 변동이 없다. 이 때문에 미리 효소처리 이소케르시트린으로부터 IQC를 제거 저감시킨 후에 β-아밀라아제 처리를 하여도 효소처리 이소케르시트린을 β-아밀라아제로 처리한 후에 IQC를 제거 저감시킨 경우와 수득된 반응 생성물에 거의 차이가 없다.
이렇게 하여 수득된 케르세틴 배당체 조성물은 IQC-G(4≤) 및 IQC(G0)의 함유비율이 저감하는 결과, 전체에 차지하는 IQC-G(1-3)의 비율을 한층 높일 수 있다. 이러한 케르세틴 배당체 조성물로서 적절하게는 IQC-G(1-3)의 비율이 전체(100몰%)의 60몰% 이상, 바람직하게는 65몰% 이상, 보다 바람직하게는 70몰% 이상, 더욱 바람직하게는 75몰% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80몰% 이상, 특히 바람직하게는 85몰% 이상의 조성물을 들 수 있다. 그 중에서도 IQC-G(2-3)의 비율이 전체(100몰%)의 50몰% 이상, 바람직하게는 55몰% 이상, 보다 바람직하게는 60몰% 이상, 더욱 바람직하게는 65몰% 이상의 조성물, 더욱 더 바람직하게는 70몰% 이상, 특히 바람직하게는 75몰% 이상을 차지하는 케르세틴 배당체 조성물은 체내 흡수성의 관점에서 보다 적절한 조성물이다. 이러한 케르세틴 배당체 조성물 중의 IQC-G(4≤) 및 IQC(G0)의 비율은 상기 IQC-G(1-3)의 함유량에 따라 정해질 수 있으나, 통상 IQC-G(4≤)의 비율로서 10몰% 이하, 바람직하게는 2몰% 이하, IQC(G0)의 비율로서 20몰% 이하, 바람직하게는 10몰% 이하를 적절하게 예시할 수 있다.
Ⅳ. 케르세틴 배당체 조성물의 용도
본 발명의 케르세틴 배당체 조성물은 후술하는 실험예에서 나타난 바와 같이, 이소케르시트린 및 효소처리 이소케르시트린에 비하여 경구 투여에 의한 체내 흡수성(혈중이행성)(경구흡수성)이 우수하고, 그 결과 경구 투여한 경우에 체내에서 우수한 항산화능을 발휘하는 특징을 가진다.
따라서, 본 발명은 상기 본 발명의 케르세틴 배당체 조성물을 유효 성분으로 하는 항산화제, 특히 생체에 대한 항산화제(이하, 「생체내 항산화제」로 함); 및 본 발명의 케르세틴 배당체 조성물을 함유함으로써 항산화 기능(활성산소 소거 기능)을 가지게 되는 식품을 제공하는 것이다.
상기 생체내 항산화제로서는 그 형태를 특히 제한하는 것은 아니며, 예를 들어, 분말 형태, 과립 형태, 정제 형태, 캡슐 형태 등의 고체 형태; 액체 형태, 현탁액 등의 용액 형태; 또는 페이스트 형태 등의 반고체 형태 등의 경구 투여에 적합한 임의의 형태로 조제할 수 있다.
상기 항산화제에 배합되는 케르세틴 배당체 조성물의 비율은 특히 제한되지 않으며, 0.01~100중량%의 범위에서 적절하게 선택할 수 있다. 또한, 상기 항산화제의 사용량으로서는 생체내에서 항산화 효과를 나타내는 한 특히 제한되지 않으나, 체중 60㎏의 성인의 경우, 1회 투여 당 항산화제 중에 케르세틴 배당체 조성물을 1㎎~30g의 비율로 포함하는 범위에서 적절하게 선택할 수 있다.
항산화제는 케르세틴 배당체 조성물에 추가적으로 희석제, 담체 또는 첨가제 등의 성분을 배합하여 임의의 제제화 처리를 행하여, 제제로서 조제할 수 있다. 여기서, 희석제 또는 담체로서는 본 발명의 효과를 저해하지 않으면, 특히 제한되지 않으나, 예를 들어 수크로오스, 글루코오스, 과당, 말토오스, 트레할로스, 유당, 올리고당, 덱스트린, 덱스트란, 사이클로덱스트린, 전분, 물엿, 이성화 액당 등의 당류; 에탄올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등의 알코올류; 소르비톨, 만니톨, 에리스리톨, 락티톨, 자일리톨, 말티톨, 환원 팔라티노스(palatinose), 환원 전분 분해물 등의 당알코올류; 트리아세틴 등의 용제; 아라비아검, 카라기난, 크산탄검, 구아검, 젤란검 등의 다당류; 또는 물을 들 수 있다. 또한, 첨가제로서는 킬레이트제 등의 보조제, 향료, 향신료 추출물, 방부제 등을 들 수 있다.
사용상의 편리 등에서 이들 희석제, 담체 또는 첨가제를 이용하여 상기 제제를 조제하는 경우는 케르세틴 배당체 조성물이 제제 100중량% 중에 0.01~100중량%, 바람직하게는 0.1~50중량%의 비율로 포함되도록 조제하는 것이 바람직하다.
항산화 기능(활성산소 소거 기능)을 가지게 되는 식품으로서는, 본 발명의 케르세틴 배당체 조성물 그 자체 또는 케르세틴 배당체 조성물에 상기 희석제, 담체 또는 첨가제 등을 첨가 배합하여 조제되는 제제(예를 들어, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액제, 드링크제 등) 등의 예를 들어, 보조식품(supplement) 및 일반적인 식품에 상기 본 발명의 케르세틴 배당체 조성물을 1성분으로 하여 배합하여 그 식품에 생체에 대한 항산화 기능(활성산소 소거 기능)을 부가하여 되는 기능성 식품(특정 보건용 식품 또는 조건부 특정 보건용 식품이 포함된다)을 들 수 있다. 또한, 이들 식품에는 상기 본 발명의 케르세틴 배당체 조성물을 함유하고, 생체 항산화작용(활성산소 소거작용)을 가지는 것을 특징으로 하는 것으로서, 생체에서 산화반응 또는 그에 의해 발생하는 장해를 예방 또는 억제하기 위하여 이용된다는 표시를 부가하여 되는 식품이 포함된다.
항산화 기능(활성산소 소거기능)을 가지는 식품의 경우, 상기 식품에 배합되는 케르세틴 배당체 조성물의 비율은 그 기능을 가지는 한 특히 제한되지 않으나, 통상 0.001~100중량% 범위에서 적절하게 선택할 수 있다.
대상으로 하는 식품으로서는 제한은 없으나, 아이스크림, 아이스밀크, 락티스(lactice), 샤베트, 빙과 등의 냉과류; 유음료, 유산균 음료, 청량음료(과즙이 함유된 것을 포함한다), 탄산음료, 과즙음료, 야채음료, 야채·과실 음료, 스포츠음료, 분말음료 등의 음료류; 리큐르 등의 알코올음료; 커피음료, 홍차음료 등의 차음료류; 콘소메 스프, 포타지 스프 등의 스프류; 카스타드 푸딩, 밀크 푸딩, 과즙 함유 푸딩 등의 푸딩류, 젤리, 바발로아(babaloa) 및 요구르트 등의 디저트류; 츄잉검이나 풍선검 등의 검류(스틱검, 당코팅된 검볼); 마블 쵸콜렛 등의 코팅된 쵸콜렛 외에 딸기 쵸콜렛, 블루베리 쵸콜렛 및 멜론 쵸콜렛 등의 풍미를 부가한 쵸콜렛 등의 쵸콜렛류; 경질 사탕(hard candy)(봉봉, 버터볼, 마블 등을 포함), 연질 사탕(soft candy)(캬라멜, 누가(nougat), 구미캔디(gummy candy), 마쉬멜로우(marshmallow) 등을 포함), 드로프(drop), 태피(taffy) 등의 캬라멜류; 하드비스켓, 쿠키, 오카키(okaki, 쌀 크래커), 전병(sembei, 쌀 크래커) 등의 구운 과자류; 아사쯔케(asa-zuke, 말린무 절임), 쇼유쯔케(shoyu-zuke, 간장 절임), 시오쯔케(shio-zuke, 소금 절임), 미소쯔케(miso-zuke, 된장 절임), 가수쯔케(kasu-zuke, 술지게미에 절인 식품), 코지쯔케(koji-zuke, 코지 절임), 누카쯔케(nuka-zuke, 쌀겨 절임), 스쯔케(su-zuke, 식초 절임), 카라시쯔케(karashi-zuke, 겨자 절임), 모로미쯔케(moromi-zuke, 거르지 않은 술 절임), 우메쯔케(ume-zuke, 매실 절임), 후쿠진쯔케(fukujin-zuke, 야채 절임), 시바쯔케(shiba-zuke), 쇼가쯔케(shoga-zuke, 생강 절임), 쵸센쯔케(chosen-zuke, 한국김치), 우메즈쯔케(umezu-zuke, 매실식초 절임) 등의 절임식품류; 세퍼레이트 드레싱, 오일 프리 드레싱, 케첩, 딥, 소스 등의 소스류; 딸기잼, 블루베리잼, 마말레이드, 사과잼, 살구잼, 설탕조림과일(preserves) 등의 잼류; 적포도주 등의 과실주; 시럽에 조린 체리, 살구, 사과, 딸기, 배 등의 가공용 과실; 햄, 소시지, 로스트 포크 등의 육류 가공품; 어육햄, 어육소시지, 어육 필레(fillet), 어묵, 치쿠와(chikuwa, 가운데가 뚫린 길죽한 모양의 어묵), 한펜(hanpen, 생선살 반죽을 도톰한 반달모양으로 찐 어묵), 사츠마게(satsumaage, 튀긴 어묵), 다테마키(datemaki, 생선 오믈렛), 고래 베이컨 등의 수산물 반죽가공제품(processed fish cake); 치즈 등의 낙농 제품류; 우동, 냉국수, 소면, 메밀국수, 중국식 메밀국수, 스파게티, 마카로니, 쌀국수(bifun), 당면 및 만두국 등의 면류; 이외 각종 부식 및 밀개떡, 덴부(denbu) 등의 다양한 가공 식품을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 식품의 섭취량으로서는 섭취하여 체내에서 항산화 효과를 나타내는 한 특히 제한되지는 않으나, 예를 들어 체중 60㎏의 성인의 경우, 1회 섭취 식품 중에 케르세틴 배당체 조성물을 1㎎~30g의 비율로 포함하는 범위에서 적절하게 선택할 수 있다.
Ⅴ. 케르시트린 배당체 조성물의 경구흡수성을 높이는 방법
본 발명은 케르시트린 배당체 조성물의 경구흡수성을 높이는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의하면, 항산화 작용이 알려져 있는 케르시트린 배당체 조성물에 대하여 종래 공지의 효소처리 이소케르시트린보다도 경구흡수성을 높일 수 있다. 그 결과, 케르시트린 배당체 조성물의 생체내에서의 항산화 작용을 높이는 것이 가능하다.
본 발명의 방법은 효소처리 이소케르시트린을 원료로서 하기 화학식(2)
[화학식 2]
Figure 112007055115626-PCT00013
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 4 이상의 정수를 의미한다.)
로 표시되는 케르세틴 배당체(IQC-G(4≤))의 양을 저감하는 공정을 거쳐 행할 수 있다.
여기서, IQC-G(4≤)의 양을 저감하는 방법은 묻지 않으며, 예를 들어, 효소처리 이소케르시트린으로부터 IQC-G(4≤)를 분획제거하는 방법, 효소처리 이소케르시트린 중에 포함되는 IQC-G(4≤)를 분해하는 방법 등의 어떠한 방법도 이용할 수 있다. 바람직하게는 효소처리 이소케르시트린을 아밀라아제, 바람직하게는 β-아밀라아제로 처리하는 방법을 들 수 있다. 효소처리 이소케르시트린에 대한 아밀라아제의 반응조건은 상기 Ⅲ에 기재한 조건을 같이 사용할 수 있다.
또한, IQC-G(4≤)의 저감의 정도로서는 최종 케르세틴 배당체 조성물 중의 IQC-G(4≤)의 함유비율(총량)이 15몰% 이하로 되는 비율을 들 수 있다. 바람직하게는 10몰% 이하, 더욱 바람직하게는 6몰% 이하이다.
경구흡수성의 향상에는, 추가적으로 하기 화학식(3)
[화학식 3]
Figure 112007055115626-PCT00014
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 0을 의미한다.)
로 표시되는 이소케르시트린(IQC 또는 G0)의 양을 저감하는 공정을 행할 수 있다. 이러한 방법으로서는, 상기 IQC-G(4≤) 저감처리에서 얻어진 반응생성물 중에서 이소케르시트린(IQC 또는 G0)을 저감, 제거 또는 탈리할 수 있는 방법이면 특히 제한되지 않으며, 관용 정제방법을 임의로 조합하여 행할 수 있다. 구체적으로는 상기 Ⅲ에 기재한 방법을 들 수 있다.
또한, IQC의 저감·제거 공정은 상기와 같이 아밀라아제 처리 후의 반응생성물에 대하여 행하여도 좋으며, 또는 아밀라아제 처리 전의 예를 들어 효소처리 이소케르시트린에 대하여 행할 수도 있다.
본 발명의 방법은 적절하게는 효소처리 이소케르시트린에 대하여 상기 조작(아밀라아제 처리, 또는 아밀라아제 처리+IQC의 제거저감)을 실시하여, 상기 효소처리 이소케르시트린을 하기의 케르세틴 배당체 조성물로 변환함으로써 행할 수 있다.
화학식(1)
[화학식 1]
Figure 112007055115626-PCT00015
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 0 또는 1이상의 정수를 의미한다.)
로 표시되는 케르세틴 배당체의 혼합물로 이루어지는 조성물로서, 하기 (1) 및 (2)의 요건을 만족하는 조성물:
(1) 적어도 n=3의 케르세틴 배당체를 포함하며,
(2) 상기 조성물 중에 포함되는 n=1~3의 케르세틴 배당체의 총량이 50몰% 이상이며, 또한 n이 4 이상인 케르세틴 배당체의 총량이 15몰% 이하이다.
이러한 조성물은, 추가로 하기 (3)의 요건을 만족하고 있는 것이 바람직하다:
(3) 상기 조성물 중에 포함되는 n=1~3인 케르세틴 배당체의 총량이 60몰% 이상이며, 또한 n이 0인 케르세틴 배당체가 20몰% 이하이다.
또한, 상기 조성물은 추가로 하기 (4)의 요건을 만족하고 있는 것이 바람직하다:
(4) 상기 조성물 중에 포함되는 n=1~3인 케르세틴 배당체의 총량이 70몰% 이상이며, 또한, n이 4 이상인 케르세틴 배당체의 총량이 10몰% 이하이며, n이 0인 케르세틴 배당체가 20몰% 이하이다.
또한, 상기 조성물은 추가로 하기 (5)의 요건을 만족하고 있는 것이 바람직하다:
(5) 상기 조성물 중에 n=2 및 3인 케르세틴 배당체를 포함하며, 그들의 총량이 50몰% 이상이다.
이러한 방법에 의하면 경구투여한 경우에 효소처리 이소케르시트린을 효소처리 이소케르시트린에 비하여 1.3배 이상의 체내흡수성을 나타내는 케르세틴 배당체 조성물로 변환할 수 있다. 바람직하게는 1.01~5배, 보다 바람직하게는 1.01~2배 이다.
도 1은 효소처리 이소케르시트린을 β-아밀라아제 처리하여 얻어지는 각종 케르시트린 배당체 조성물을 조성[IQC, 각 IQC 배당체(IQC-G1, IQC-G2, IQC-G3, IQC-G4, IQC-G5, IQC-G6)의 몰비(%)]를 나타낸다(조제예 6).
도 2는 조제예 1에서 얻어진 G0 획분, G1 획분, G2 획분, G3 획분 및 G4 획분의 경구흡수성을 나타내는 결과이다(실험예 1). 구체적으로는, 이들 각 획분을 경구투여한 랫트 혈장 중의 케르세틴 ·글루크론산 포합체(抱合體) 농도와 케르세틴 농도의 각 곡선하면적으로부터 산출된 AUC(Area under the curve)(0-3hrs)(㎍/㎖·hr)을 나타낸다.
도 3은 효소처리 이소케르시트린(IQC-G(mix)), 이소케르시트린 G(1-3) 획분[IQC-G(1-3)획분], 이소케르시트린 G(3-6) 획분[IQC-G(3-6) 획분], 및 이소케르시트린(IQC)의 경구흡수성을 나타내는 결과이다(실험예 2). 도 3a 및 b는 이들 각 성분을 경구투여한 랫트 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도 및 케르세틴 농도의 경시적 변화를 각각 나타낸다.
도 4는 도 3(a) 및 (b)에 나타낸 혈장 케르세틴·글루크론산 포합체 농도 및 혈장 케르세틴 농도의 각 곡선하면적으로부터 산출한, 각 IQC-G(mix), IQC-G(1-3) 획분, IQC-G(3-6) 획분 및 IQC의 AUC(Area under the curve)(0-3hrs)((㎍/㎖·hr)를 나타낸다.
도 5는 조제예 3에서 얻어진 효소처리 이소케르시트린(IQC-G(mix)) 및 이소케르시트린 G(4-6) 획분[IQC-G(4-6) 획분]의 경구흡수성을 나타내는 결과이다(실험예 3). 구체적으로는 이들 각 획분을 경구 투여한 랫트 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도와 케르세틴 농도의 각 곡선하면적으로부터 산출한 AUC(Area under the curve)(0-3hrs)((㎍/㎖·hr)를 나타낸다.
도 6은 도 3 및 4에 나타낸 각 IQC-G(mix), IQC-G(1-3) 획분, IQC-G(3-6) 획분 및 IQC, 및 대조로서 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)를 경구투여한 랫트 혈장의 항산화능을 혈장의 FRAP(혈장의 철 환원 활성, Ferrous Reducing Activity of Plasma) 활성으로부터 평가한 결과를 나타낸다(실험예 4).
도 7은 조제예 4에서 얻어진 시료 1(IQC-G(mix)), 시료 3~5의 경구흡수성을 나타내는 결과이다(실험예 5). 구체적으로는 이들 각 획분을 경구투여한 랫트 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도와 케르세틴 농도의 각 곡선하면적으로부터 산출한 AUC(Area under the curve)(0-3hrs)((㎍/㎖·hr)를 나타낸다.
도 8은 조제예 5에서 얻어진 시료 6~9의 경구흡수성을 나타내는 결과이다(실험예 6). 구체적으로는 이들 각 획분을 경구투여한 랫트 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도와 케르세틴 농도의 각 곡선하면적으로부터 산출한 AUC(Area under the curve)(0-3hrs)((㎍/㎖·hr)를 나타낸다.
도 9는 조제예 4에서 얻어진 시료 1(IQC-G(mix))과 시료 2의 경구흡수성을 나타내는 결과이다(실험예 7). 구체적으로는 이들 각 획분을 경구투여한 랫트 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도와 케르세틴 농도의 각 곡선하면적으로부터 산출한 AUC(Area under the curve)(0-3hrs)((㎍/㎖·hr)를 나타낸다.
도 10은 조제예 7에서 얻어진 시료 A(IQC-G(mix)) 및 시료 B~D의 경구흡수성을 나타내는 결과이다(실험예 8). 구체적으로는 이들 각 획분을 경구투여한 랫트 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도와 케르세틴 농도의 각 곡선하면적으 로부터 산출한 AUC(Area under the curve)(0-3hrs)((㎍/㎖·hr)를 나타낸다.
이하, 조제예, 실험예 및 실시예를 들어 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 그들에 한정되는 것은 아니다.
참고조제예 1 효소처리 이소케르시트린의 조제
(1) 이소케르시트린의 조제
콩과 식물인 회화나무 꽃봉오리 250g을 2500㎖의 열수(95℃ 이상)에 2시간 침지한 후, 여과하여 분리한 여액을 「제1 추출액」으로서 취득하였다. 한편, 여과하여 분리한 잔사를 다시 열수에 침지하여 추출하고, 「제2 추출액」을 얻었다. 이들 제1 및 제2 추출액을 합하고, 30℃ 이하로 냉각하여 침전된 성분을 여과하여 분리하고, 침전부를 물로 세척하고, 재결정 및 건조함으로써 순도 95% 이상의 루틴 22.8g을 수득하였다.
이 루틴 20g을 물 400㎖에 분산시키고, pH 조정제를 이용하여 pH 4.9로 조정하였다. 이에 나린지나아제(Amano Enzyme Inc. 제품, 상품명 「naringinase "Amano"」, 3000U/g)를 0.12g 첨가하여 반응을 개시하고, 이를 72℃에서 24시간 유지하였다. 그 후, 반응액을 20℃로 냉각하고, 냉각에 의하여 발생한 침전물을 여과하여 분리하였다. 얻어진 침전물(고형분)을 물로 세척한 후, 건조하고, 이소케르시트린 13.4g을 회수하였다.
(2) 효소처리 이소케르시트린의 조제
상기에서 얻어진 이소케르시트린 10g에 500㎖의 물을 가하고, 콘스타치 40g을 첨가하여 분산시켰다. 이에 사이클로덱스트린글루카노트랜스페라제(CGTase : Amano Enzyme Inc. 제품, 상품명「Contizyme」, 600U/㎖) 15g을 첨가하여 반응을 개시하고, 이를 pH 7.25, 60℃의 조건 하, 24시간 유지하였다. 수득된 반응액을 냉각한 후, 다이아이온 HP-20(Diaion® HP-20)(Mitsubishi Chemical Co. 제품)의 컬럼(Φ3.0×40㎝)에 부가하고, 1000㎖의 물로 세정하였다. 다음으로 컬럼에 600㎖의 50용량%의 에탄올 수용액을 공급하여 얻어진 용출액을 저압 농축한 후, 동결건조하여 효소처리 이소케르시트린(이하, 이를 「이소케르시트린 G(mix)」 또는 「IQC-G(mix)」로 칭함) 12.8g을 취득하였다. 이를 하기 조건의 HPLC에 공급하여 각성분을 분리하여 수득하고, 각 성분을 질량분석장치(LC/MS/MS, Japan Water Corporation, 형식 Quattro Micro)를 사용하여 분석하였다.
<HPLC 조건>
컬럼 : Inertsil ODS-2 Φ4.6×250㎜(GL Science Inc. 제품)
용리액 : 물/아세토니트릴/TFA = 850/15/2
검출 : 파장 351㎚에서 흡광도 측정
유속 : 0.8㎖/min
그 결과, 상기 효소처리 이소케르시트린(IQC-G(mix))는 하기 식으로 표시되는 IQC와 각종 IQC 배당체의 혼합물로 이루어지는 것이 확인되었다.
Figure 112007055115626-PCT00016
(식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 나타내며, n은 0 또는 1이상의 정수를 나타낸다.)
HPLC 분석결과로부터 하기 식에 근거하여 상기 혼합물에 포함되는 IQC 및 각 IQC 배당체의 몰비(%)를 산출한 바, 표 2에 나타낸 것과 같은 조성이다.
IQC 또는 IQC 배당체의 몰비(%)=
IQC 또는 IQC 배당체의 각 피크면적/IQC 및 IQC 배당체의 총 피크면적 ×100
몰비(%)
G0 이소케르시트린 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7
IQC-G(mix) (1) 33 23 19 9 7 5 3 1
조제예 1 IQC 배당체(Gn)의 정제
참고조제예 1에서 얻어진 효소처리 이소케르시트린 G(mix)(IQC-G(mix))를 하기 조건의 HPLC에 공급하여 이소케르시트린(G0)을 풍부하게 포함하는 획분(G0 획분), G1을 풍부하게 포함하는 획분(G1 획분), G2를 풍부하게 포함하는 획분(G2 획분), G3을 풍부하게 포함하는 획분(G3 획분), 및 G4를 풍부하게 포함하는 획분(G4 획분)을 각각 분리하여 취하였다.
<HPLC 분취 조건>
컬럼 : Develosil ODS-UG-15/30, 5㎝×50㎝
용매 : A 용매; 1용량% 아세트산 함유 수용액
B 용매; 1용량% 아세트산 및 90용량% CH3CN 함유 수용액
용출 : B 용매 18용량%과 A 용매 82용량%를 혼합하여 일정용매(isocratic) 조건에서 유속 32㎖/min으로 용출
검출 : 360㎚에서 흡광도 검출.
구체적으로는 용출 시간 40분부터 113분까지를 1분 동안에 1 분획(fraction) 비율로 73 분획으로 분리하여 분취하고, 분획 17-24를 G4 획분, 분획 26-33을 G3 획분, 분획 35-43을 G2 획분, 분획 45-53을 G1 획분, 분획 55-73을 G0 획분으로서 회수하였다. 각 획분을 동결건조하여 고형분으로서 각각 약 300㎎씩을 얻었다.
다음으로 얻어진 G0 획분, G1 획분, G2 획분, G3 획분 및 G4 획분을 각각 하기 조건의 HPLC 분석에 제공하여, 각 획분에 포함되는 IQC 및 각 IQC 배당체의 몰비(%)와 평균분자량을 산출하였다. 몰비(%)의 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타낸 바와 같이, G0 획분, G1 획분, G2 획분, G3 획분 및 G4 획분은 각각 IQC(G0), IQC 배당체 G1, G2, G3 및 G4를 73% 이상 포함하였다.
<HPLC 분석조건>
컬럼 : Develosil C30-UG-5 (4.6 × 150㎜)
용매 : A 용매; 0.05용량% TFA 함유 수용액,
B 용매; 0.05용량% TFA/CH3CN
용출 : B 용매 10용량% → 80용량%(0-20min), B 용매 80용량% → 80용량%(20-25min), B 용매 80용량% → 10용량%(25-25.1min), B 용매 10용량%(25.1-32min)의 경사(gradient) 용출
검출 : 파장 370㎚에서 흡광도 검출
컬럼 온도 : 40℃
몰비(%)
분획샘플 G0 이소케르시트린 G1 G2 G3 G4 G5 G6
G0 획분 73.5 15.8 6.7 1.9 1.1 0.7 0
G1 획분 0 83.1 13.2 2.4 0.9 0.4 0
G2 획분 0 0 88.9 9.2 1.9 0 0
G3 획분 0 0 0 92.9 5.8 1.3 0
G4 획분 0 0 0 0 90.2 9.0 0.9
조제예 2 이소케르시트린 G(1-3) 획분 및 이소케르시트린 G(3-6) 획분의 조제
참고조제예 1에서 얻어진 효소처리 이소케르시트린(IQC-G(mix)) 0.65g을 함수메탄올에 용해하고, 겔여과수지(Sephadex LH-20 : Amersham Bioscience K.K.)를 이용하여 겔여과 크로마토그래피를 행하였다. 통과액을 일정량씩 분취한 후, 상기 참고조제예 1에 기재된 조건에서 HPLC 분석을 행하여, IQC에 글루코오스가 3개 α-1,4 결합한 G3, 4개 결합한 G4, 5개 결합한 G5 및 6개 결합한 G6을 풍부하게 포함하는 획분(이하, 「이소케르시트린 G(3-6) 획분」 또는 「IQC-G(3-6) 획분」으로 칭함)과, IQC에 글루코오스가 1개 α-1,4 결합한 G1, 2개 결합한 G2 및 3개 결합한 G3를 풍부하게 포함하는 획분(이하, 「이소케르시트린 G(1-3) 획분」 또는 「IQC-G(1-3) 획분」으로 칭함)의 2획분으로 분리하였다. 다음으로, 이들 2획분을 각각 감압농축에 의하여 용매를 제거한 후, 동결건조하여 「이소케르시트린 G(3-6) 획분」(「IQC-G(3-6) 획분」) 0.15g 및 「이소케르시트린 G(1-3) 획분」(「IQC-G(1-3) 획분」) 0.1g을 얻었다. 이들 획분에 대하여 전술한 참고조제예 1에 기재된 조건의 HPLC 분석을 행하여 각 획분에 포함되는 IQC 및 각 IQC 배당체의 몰비(%)를 산출하였다.
결과를 표 4에 나타낸다. 표 4로부터 확인할 수 있는 바와 같이 IQC-G(1-3) 획분 중에 포함되는 G1, G2 및 G3의 비율은 총량으로 94%, IQC-G(3-6) 획분 중에 포함되는 G3, G4, G5 및 G6의 비율은 총량으로 86%이었다.
몰비(%)
G0 이소케르시트린 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7
IQC-G(1-3) 획분 5 43 39 12 1 0 0 0
IQC-G(3-6) 획분 0 1 6 22 30 21 13 7
조제예 3 효소처리 이소케르시트린 G(mix) 및 이소케르시트린 G(4-6) 획분의 조제
참고조제예 1과 전부 동일한 방법으로 효소처리 이소케르시트린을 조제하였다(IQC-G(mix)(2)). 이를 조제예 2와 같이 함수 메탄올에 용해하고 겔여과 크로마토그래피 및 HPLC 분석을 행하여, IQC에 글루코오스가 4개 α-1,4 결합한 G4, 5개 결합한 G5 및 6개 결합한 G6를 풍부하게 포함하는 획분(이하, 「이소케르시트린 G(4-6) 획분」 또는 「IQC-G(4-6) 획분」으로 칭함)을 얻었으며, 이 획분을 각각 감압농축함으로써 용매를 제거한 후, 동결건조하여 「이소케르시트린 G(4-6) 획분」(「IQC-G(4-6) 획분」) 0.1g을 얻었다. 상기 IQC-G(mix)(2) 및 「IQC-G(4-6) 획분」에 대하여 전술한 참고조제예 1에 기재된 조건의 HPLC 분석을 행하여 IQC 및 각 IQC 배당체의 몰비(%)를 산출하였다.
결과를 표 5에 나타낸다. IQC-G(4-6) 획분 중에 포함되는 G4, G5 및 G6의 비율은 총량으로 83%이었다.
몰비(%)
G0 이소케르시트린 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7
IQC-G(mix)(2) 29 23 21 10 8 5 3 1
IQC-G(4-6) 획분 0 0 0 3 23 33 27 14
조제예 4 시료 1~5의 조제
(1) 시료 1의 조제
참고조제예 (1) 및 (2)에 따라 효소처리 이소케르시트린(IQC-G(mix))을 조제하였다(시료: IQC-G(mix)(3)).
(2) 시료 2의 조제
시료 1(0.5g)을 50㎖ 이온교환수에 용해하고, 교반조건하, 냉각여과한 후, 흡착수지 컬럼(Mitsubishi Chemical Co., 제품, Diaion® SP-207)에 통과시켰다. 흡착수지를 충분히 물로 세척하여 당질 등의 불순물을 제거한 후, 60용량% 에틸알코올 수용액을 통과시켜 용출액을 회수하였다. 회수한 용출액을 감압농축한 후, 동결건조하였다(시료 2).
(3) 시료 3의 조제
시료 1 및 이소케르시트린(IQC)을 각각 메탄올에 용해하고, IQC의 몰비가 약 45%로 되도록 혼합하였다. 다음으로 이 획분을 감압농축함으로써 용매를 제거한 후, 동결건조하였다(시료 3).
(4) 시료 4의 조제
시료 3(0.5g)을 50㎖ 이온교환수에 용해하고, β-아밀라아제(Amano Enzyme Inc. 제품, 상품명 "바이오짐 M(Biozyme M), 4000U/g)을 2.5㎎ 첨가하여 50℃, pH 5.0에서 1.5시간 유지하였다. 가열처리에 의해 효소를 실활(失活)시킨 후, 흡착수지 컬럼(Mitsubishi Chemical Co., 제품, Diaion® SP-207)에 통과시켰다. 흡착수지를 충분히 물로 세척하여 당질 등의 불순물을 제거한 후, 60용량% 에틸알코올 수용액을 통과시켜 용출액을 회수하였다. 회수한 용출액을 감압농축한 후, 동결건조하여 0.3g의 시료(시료 4)를 얻었다.
(5) 시료 5의 조제
시료 1(5g)을 함수 메탄올에 용해하고, 겔여과수지((Sephadex LH-20 : Amersham Bioscience K.K.)를 이용하여 겔여과 크로마토그래피를 행하였다. 통과액을 일정량씩 분취한 후, 상기 참고조제예 1에 기재된 조건으로 HPLC 분석을 행하여, G4, G5, G6 및 G7을 풍부하게 포함하는 획분을 회수하였다. 다음으로, 이 획분을 감압농축함으로써 용매를 제거한 후 동결건조하였다. 이것의 1.0g을 50㎖ 이온교환수에 용해하고, β-아밀라아제(Amano Enzyme Inc. 제품, 상품명 "바이오짐 M(Biozyme M), 4000U/g)를 7㎎ 첨가하여, 50℃, pH 5.0에서 2시간 유지하였다. 가열처리에 의해 효소를 실활(失活)시킨 후, 흡착수지 컬럼(Mitsubishi Chemical Co., 제품, Diaion® SP-207)에 통과시켰다. 흡착수지를 충분히 물로 세척하여 당질 등의 불순물을 제거한 후, 60용량% 에틸알코올 수용액을 통과시켜 용출액을 회수하였다. 회수한 용출액을 감압농축한 후, 동결건조하였다(시료 5, 0.2g).
상기의 시료 1~5에 대하여 상술한 참고조제예 1에 기재된 조건으로 HPLC를 행하여, 시료 중의 IQC 및 각 IQC 배당체의 몰비(%)를 산출한 바, 다음에 나타내는 것과 같은 조성이었다.
몰비(%)
G0 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7
시료 1 IQC-G(mix)(3) 28.8 22.7 21.4 10.6 7.5 4.9 2.8 1.3
시료 2 15.4 23.9 26.0 13.4 9.7 6.4 3.6 1.7
시료 3 45.1 20.9 16.3 7.8 4.6 2.9 1.7 0.7
시료 4 42.9 25.8 20.6 9.3 0.5 0.3 0.5 0
시료 5 7.5 14.2 41.9 31.5 2.6 2.4 0 0
조제예 5 시료 6~9의 조제
(1) 시료 6의 조제
참고조제예 1(1) 및 (2)에 따라 효소처리 이소케르시트린(IQC-G(mix))을 조제하였다. 이 IQC-G(mix) 및 이소케르시트린(IQC)을 각각 메탄올에 용해하고, IQC 몰비가 약 45%로 되도록 혼합하였다. 다음으로 이 획분을 감압농축함으로써 용매를 제거한 후, 동결건조하였다(시료 6).
(2) 시료 7, 8 및 9의 조제
조제예 1과 같이 조제하여 시료 1을 HPLC에 공급하여 G1을 풍부하게 포함하는 획분(G1 획분), G2를 풍부하게 포함하는 획분(G2 획분) 및 G3을 풍부하게 포함하는 획분(G3 획분)을 회수하였다. 다음으로, 이들 획분 및 시료 6을 각각 메탄올에 용해하고 IQC-G(1-3)의 총량이 몰비로 약 54%, 64%, 80%로 되도록 혼합하였다. 다음으로 이 획분을 감압농축함으로써 용매를 제거한 후, 동결건조하였다(시료 7, 8, 9).
상기 시료 6~9에 대하여 상술한 참고조제예 1에 기재된 조건으로 HPLC를 행하여, 시료 중에 포함된 IQC 및 각 IQC 배당체의 몰비(%)를 산출한 바, 다음에 나타낸 것과 같은 조성이었다.
몰비(%)
G0 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7
시료 6 45.1 20.9 16.3 7.8 4.6 2.9 1.7 0.7
시료 7 37.0 24.5 20.1 9.8 3.9 2.5 1.6 0.6
시료 8 24.9 23.7 27.2 13.3 4.6 3.2 1.9 1.2
시료 9 16.5 24.5 37.7 17.3 0.9 1.2 0.8 1.1
참고조제예 2 효소처리 이소케르시트린의 조제
(1) 이소케르시트린의 조제
물 100ℓ에 루틴 5㎏을 분산시키고, pH 조정제를 이용하여 pH를 4.9로 조정한 것에 나린지나아제(Amano Enzyme Inc., 상품명 「Naringinase "Amano"」, 3000U/g)를 30g 첨가하여 반응을 개시하고, 이를 24시간 72℃로 유지하였다. 그 후, 반응액을 30℃로 냉각하고, 냉각에 의하여 침전된 성분을 여과하여 분리하였다. 얻어진 고형분을 물로 세척한 후, 건조하여 이소케르시트린을 회수하였다.
(2) 효소처리 이소케르시트린의 조제
얻어진 이소케르시트린 2㎏에 100ℓ의 물을 가하고, 콘스타치 8㎏을 첨가하여 분산시켰다. 이것에 CGTase(Amano Enzyme Inc., 상품명 「Contizyme」, 600U/㎖) 3ℓ를 첨가하고, 60℃, pH 7.25에서 24시간 유지하였다. 이 액체를 냉각한 후, 여과하여 효소처리 이소케르시트린(「이소케르시트린 G(mix)」 또는 「IQC-G(mix)」로 칭함)(액상)을 얻었다. 이 IQC-G(mix)에 대하여 전술한 참고조제예 1에 기재된 조건의 HPLC에 공급하여 분석하고, 몰비(%)를 산출하였다. 그 결과, 표 8에 나타낸 조성의 IQC 및 각종 IQC 배당체의 혼합물로 이루어진 것으로 확인되었다. HPLC 분석을 행하여, IQC-G(mix)에 포함된 IQC 및 IQC 배당체의 몰비(%)를 산출하였다.
몰비(%)
G0 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8
IQC-G(mix)(5) 22 21 20 13 9 6 4 2 3
조제예 6 β-아밀라아제 처리의 제어
참고조제예 2의 (1) 및 (2)의 방법에 따라 효소처리 이소케르시트린(반응액)을 조제하였다. 이 반응액 50ℓ에 β-아밀라아제(Amano Enzyme Inc. 제품, 상품명 "바이오짐 M(Biozyme M), 4000U/g)를 4g 첨가하고, 50℃, pH 5.0에서 일정 시간 유지한 후, 일부 반응액을 채취하였다. 채취한 반응액을 가열처리함으로써 효소를 실활시킨 후, 흡착수지 컬럼(Mitsubishi Chemical Co., 제품, Diaion® SP-207)에 통과시켰다. 흡착수지를 충분히 물로 세척하여 당질 등의 불순물을 제거한 후, 60용량% 에틸알코올 수용액을 통과시켜 용출액을 회수하였다. 회수한 용출액을 감압농축한 후, 동결건조함으로써 β-아밀라아제를 상이한 시간 작용시켜 조제한 다양한 케르세틴 배당체 조성물을 얻었다. 이를 참고조제예 1에 기재된 조건에서 HPLC를 행하여 IQC 및 각 IQC 배당체의 몰비(%)를 산출하였다.
결과를 표 9 및 도 1에 나타낸다. 반응시간에 상관없이 이소케르시트린(IQC)의 몰비는 거의 일정하며, 반응이 진행됨에 따라 IQC에 글루코오스가 1개 α-1,4 결합한 G1 및 IQC에 글루코오스가 2개 α-1,4 결합한 G2의 비율(IQC-G(1-2))은 증가하였다. 따라서, 최종적으로는 G0, G1 및 G2로 구성되는 케르세틴 배당체 조성물로 되었다(도시하거나 표기하지 않음). IQC에 글루코오스가 3개 α-1,4 결합한 G3는 반응초기에서는 IQC에 글루코오스가 4개 이상 α-1,4 결합한 G(4≤)가 분해되어 그 일부가 G3으로 되기 때문에, IQC-G3의 몰비는 반응 도중까지는 증가하지만, G(4≤)가 소실되면(반응시간 : 약 60분), 이어서 G3의 분해가 일어나기 때문에 IQC-G3의 몰비는 서서히 감소하였다.
몰비(%)
반응시간 G0 G1 G2 G3 G4 G5 G6
0분 20.0 24.9 23.3 12.7 9.1 6.1 3.9
15분 19.8 25.9 29.3 15.4 4.5 2.9 2.2
30분 19.8 27.3 32.4 15.7 2.1 1.3 1.4
60분 20.0 30.5 35.2 14.3 0.0 0.0 0.0
90분 19.9 32.4 35.4 12.3 0.0 0.0 0.0
120분 19.8 33.7 35.5 10.9 0.0 0.0 0.0
180분 19.8 35.4 35.5 9.3 0.0 0.0 0.0
240분 19.7 36.2 35.6 8.5 0.0 0.0 0.0
300분 19.6 36.7 35.6 8.0 0.0 0.0 0.0
360분 19.6 37.1 35.6 7.7 0.0 0.0 0.0
420분 19.6 37.3 35.6 7.5 0.0 0.0 0.0
조제예 7 시료 A~D의 조제
(1) 시료 A의 조제
참고조제예 2의 (1) 및 (2)의 방법에 따라 조제한 효소처리 이소케르시트린을 흡착수지 컬럼(Mitsubishi Chemical Co., 제품, Diaion® SP-207)에 통과시켰다. 흡착수지를 충분히 물로 세척하여 미반응의 당질 등의 불순물을 제거한 후, 60용량% 에틸알코올 수용액을 통과시켜 용출액을 회수하였다. 회수한 용출액을 감압농축한 후, 건조 및 분쇄하여 분말 형태로 하였다(시료 A : IQC-G(mix)).
(2) 시료 B의 조제
시료 A(반응액)을 교반조건하, 냉각여과한 후 흡착수지 컬럼(Mitsubishi Chemical Co., 제품, Diaion® SP-207)에 통과시켰다. 흡착수지를 충분히 물로 세척하여 당질 등의 불순물을 제거한 후, 60용량% 에틸알코올 수용액을 통과시켜 용출액을 회수하였다. 회수한 용출액을 감압농축한 후 동결건조하여 시료 B를 얻었다.
(3) 시료 C 및 D의 조제
시료 A(반응액) 50ℓ를 교반조건하, 냉각여과한 후, β-아밀라아제(Amano Enzyme Inc. 제품, 상품명 "바이오짐 M(Biozyme M), 4000U/g)를 4g 첨가하고, 50℃, pH 5.0에서 30분 또는 420분 유지하였다. 그 후, 각각을 가열처리함으로써 효소를 실활시킨 후, 흡착수지 컬럼(Mitsubishi Chemical Co., 제품, Diaion® SP-207)에 통과시켰다. 흡착수지를 충분히 물로 세척하여 당질 등의 불순물을 제거한 후, 60용량% 에틸알코올 수용액을 통과시켜 용출액을 회수하였다. 회수한 용출액을 감압농축한 후, 동결건조하여 시료 C(β-아밀라아제 처리 30분) 및 시료 D(β-아밀라아제 처리 420분)을 얻었다.
시료 A~D에 대하여, 참고조제예 1에 기재된 조건으로 HPLC를 행하여 시료 중에 포함된 IQC 및 각 IQC 배당체의 몰비(%)를 산출한 바, 표 10에 나타낸 것과 같은 조성이었다.
몰비(%)
G0 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7
시료 A 30.1 22.9 20.5 10.2 7.3 4.8 2.9 1.3
시료 B 17.1 21.3 22.8 13.2 10.7 7.7 4.9 2.3
시료 C 16.5 24.4 34.3 17.0 2.4 3.7 1.8 0.0
시료 D 16.9 44.4 38.2 0.5 0.0 0.0 0.0 0.0
조제예 8
참고조제예 2에서 조제한 IQC-G(mix)(5) 50ℓ에 β-아밀라아제(Amano Enzyme Inc. 제품, 상품명 "바이오짐 M(Biozyme M), 4000U/g)를 15g 첨가하고, 50℃, pH 5.0에서 3시간 유지한 후, 가열처리에 의하여 효소를 실활시켰다. 이 반응액(β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(1))을 전술한 참고조제예 1에 기재된 조건의 HPLC에 공급하여 분석하고, 몰비(%)를 산출하였다. 그 결과, 하기 조성의 IQC 및 각종 IQC 배당체의 혼합물로 이루어진 것을 확인하였다.
몰비(%)
G0 G1 G2 G3 G4 이상
β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(1) 23 40 32 3 2
조제예 9
참고조제예 2에서 얻어진 IQC-G(mix)(5) 50ℓ에 β-아밀라아제(Amano Enzyme Inc. 제품, 상품명 "바이오짐 M(Biozyme M), 4000U/g)를 4g 첨가하고, 50℃, pH 5.0에서 1시간 유지한 후, 가열처리에 의하여 효소를 실활시켰다. 이 반응액(β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(2))을 전술한 조건의 HPLC에 공급하여 분석하고, 몰비(%)를 산출하였다. 그 결과, 하기 조성의 IQC 및 각종 IQC 배당체의 혼합물로 이루어진 것을 확인하였다.
몰비(%)
G0 G1 G2 G3 G4 이상
β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(2) 22 24 29 19 6
조제예 10
참고조제예 1에서 얻어진 IQC-G(mix)(5) 50ℓ에 β-아밀라아제(Amano Enzyme Inc. 제품, 상품명 "바이오짐 M(Biozyme M), 4000U/g)를 15g 첨가하고, 50℃, pH 5.0에서 3시간 유지한 후, 가열처리에 의하여 효소를 실활시켰다. 이 반응액을 교반조건하, 냉각 여과한 후, 흡착수지 컬럼(Mitsubishi Chemical Co., 제품, Diaion® SP-207)에 공급하였다. 흡착수지 컬럼을 충분히 물로 세척한 후 60용량% 에틸알코올 수용액을 통과시켜 용출액을 회수하였다. 용출액(β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(3))을 전술한 조건의 HPLC에 공급하여 분석하고 몰비(%)를 산출하였다. 그 결과 하기 조성의 IQC 및 IQC 배당체의 혼합물로 이루어진 것을 확인하였다.
몰비(%)
G0 G1 G2 G3 G4 이상
β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(3) 14 20 64 1 1
조제예 11
참고조제예 2에서 얻어진 IQC-G(mix)(5) 50ℓ에 β-아밀라아제(Amano Enzyme Inc. 제품, 상품명 "바이오짐 M(Biozyme M), 4000U/g)를 4g 첨가하고, 50℃, pH 5.0에서 1시간 유지한 후, 가열처리에 의하여 효소를 실활시켰다. 이 반응액을 교반조건하, 냉각 여과한 후, 흡착수지 컬럼(Mitsubishi Chemical Co., 제품, Diaion® SP-207)에 공급하였다. 흡착수지 컬럼을 충분히 물로 세척한 후 60용량% 에틸알코올 수용액을 통과시켜 용출액을 회수하였다. 용출액(β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(4))을 전술한 조건의 HPLC에 공급하여 분석하고 몰비(%)를 산출하였다. 그 결과 하기 조성의 IQC 및 IQC 배당체의 혼합물로 이루어진 것을 확인하였다.
몰비(%)
G0 G1 G2 G3 G4 이상
β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(4) 12 24 43 20 1
조제예 12
참고조제예 2에서 얻어진 IQC-G(mix)(5) 50ℓ에 β-아밀라아제(Amano Enzyme Inc. 제품, 상품명 "바이오짐 M(Biozyme M), 4000U/g)를 15g 첨가하고, 50℃, pH 5.0에서 3시간 유지한 후, 가열처리에 의하여 효소를 실활시켰다. 이 반응액을 교반조건하, 냉각 여과하였다. 얻어진 여액을 분획분자량 10000의 UF막(Asahi Kasei Chemicals Corporation 제품, SEP-3053)에 공급하고, 막투과액을 회수하여 이 액체를 다시 분획분자량 1000의 UF막(Nihon Pall Ltd. 제품, Pall Filtron 한외여과막, Nova 시리즈)에 공급하여 농축액을 조제하였다. 이 액체를 물로 50ℓ로 되도록 희석 조제한 후, 흡착수지 컬럼(Mitsubishi Chemical Co., 제품, Diaion® SP-207)에 공급하였다. 이 흡착수지 컬럼을 충분히 물로 세척한 후 60용량% 에틸알코올 수용액을 통과시켜 용출액을 회수하였다. 이 용출액(β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(5))을 전술한 조건의 HPLC에 공급하여 분석하고 몰비(%)를 산출하였다. 그 결과 하기 조성의 IQC 및 IQC 배당체의 혼합물로 이루어진 것을 확인하였다.
몰비(%)
G0 G1 G2 G3 G4 이상
β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(5) 14 19 65 1 1
조제예 13
참고조제예 2에서 얻어진 IQC-G(mix)(5) 50ℓ에 β-아밀라아제(β-아밀라아제(Amano Enzyme Inc. 제품, 상품명 "바이오짐 M(Biozyme M), 4000U/g)를 4g 첨가하고, 50℃, pH 5.0에서 1시간 유지한 후, 가열처리에 의하여 효소를 실활시켰다. 이 반응액을 교반조건하, 냉각시킨 후 여과하였다. 얻어진 여액을 분획분자량 10000의 UF막(Asahi Kasei Chemicals Corporation 제품, SEP-3053)에 공급하고, 막투과액을 회수하여 이 액체를 다시 분획분자량 1000의 UF막(Nihon Pall Ltd. 제품, Pall Filtron 한외여과막, Nova 시리즈)에 공급하여 농축액을 조제하였다. 이 액체를 물로 50ℓ로 희석 조제한 후, 흡착수지 컬럼(Mitsubishi Chemical Co., 제품, Diaion® SP-207)에 공급하였다. 이 흡착수지 컬럼을 충분히 물로 세척한 후 60용량% 에틸알코올 수용액을 통과시켜 용출액을 회수하였다. 이 용출액(β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(6))을 전술한 조건의 HPLC에 공급하여 분석하고 몰비(%)를 산출하였다. 그 결과 하기 조성의 IQC 및 IQC 배당체의 혼합물로 이루어진 것을 확인하였다.
몰비(%)
G0 G1 G2 G3 G4 이상
β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(6) 16 25 42 16 1
조제예 14
참고조제예 2에서 얻어진 IQC-G(mix)(5) 50ℓ에 β-아밀라아제((Nagase ChemTex Corporation 제품, β-아밀라아제 #1500, 15000U/g)를 1g 첨가하고, 50℃, pH 5.0에서 3시간 유지한 후, 가열처리에 의하여 효소를 실활시켰다. 이 반응액을 교반조건하, 냉각시킨 후 여과하였다. 얻어진 여액을 감압농축기에서 Brix70 까지 농축하였다. 이 농축액에 8배량의 95용량% 에탄올을 교반하면서 투입하고, 냉각하여 당 등의 불순물을 침전시킨 후, 상청을 회수하였다. 이 상청(β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(7))을 전술한 조건의 HPLC에 공급하여 분석하고, 몰비를 산출하였다. 그 결과 하기 조성의 IQC 및 IQC 배당체의 혼합물로 이루어진 것을 확인하였다.
몰비(%)
G0 G1 G2 G3 G4 이상
β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(7) 15 21 63 1 0
조제예 15
참고조제예 2에서 얻어진 IQC-G(mix)(5) 50ℓ에 β-아밀라아제((Nagase ChemTex Corporation 제품, β-아밀라아제 #1500, 15000U/g)를 5g 첨가하고, 50℃, pH 5.0에서 1시간 유지한 후, 가열처리에 의하여 효소를 실활시켰다. 이 반응액을 교반조건하, 냉각시킨 후 여과하였다. 얻어진 여액을 감압농축기에서 Brix70 까지 농축하였다. 이 농축액에 8배량의 95용량% 에탄올을 교반시 투입하고, 냉각하여 당 등의 불순물을 침전시킨 후, 상청을 회수하였다. 이 상청(β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(8))을 전술한 조건의 HPLC에 공급하여 분석하고, 몰비를 산출하였다. 그 결과 하기 조성의 IQC 및 IQC 배당체의 혼합물로 이루어진 것을 확인하였다.
몰비(%)
G0 G1 G2 G3 G4 이상
β-아밀라아제 처리 IQC-G(mix)(8) 16 24 43 17 0
실험예
실험예 1 혈중이행성(경구흡수성)의 측정(1)
조제예 1에서 얻어진 G0 획분, G1 획분, G2 획분, G3 획분 및 G4 획분에 대하여, 경구흡수성을 조사하였다. 구체적으로는 전날 밤부터 절식시켜 둔 SD계 수컷 랫트(7~9주령) 30필을 5군(각 군 6필씩)으로 나누어, 각각 G0 획분, G1 획분, G2 획분, G3 획분 및 G4 획분을 각 150μmol/㎏의 용량으로 경구투여하였다. 0분(투여전), 및 투여로부터 30분, 1시간 및 3시간 후에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여, 이것에 헤파린을 첨가하고 원심분리하여 상청으로부터 헤파린 혈장 샘플을 조제하였다. 조제한 헤파린 혈장 샘플에 포함되는 케르세틴·글루크론산 포합체 및 케르세틴의 농도의 각각을 하기 조건의 HPLC에 의하여 계측하였다. 그 다음에 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도(㎍/㎖)의 곡선하면적 및 혈장 중의 케르세틴 농도(㎍/㎖)의 곡선하면적으로부터 AUC(Area under the curve)(0-3hr)(㎍/㎖·hr)을 산출하였다. 또한, 케르세틴·글루크론산 포합체 및 케르세틴은 모두 이소케르시트린의 생체내 대사산물이다. 따라서, 이하의 실험에서는 이들 양쪽의 AUC 총량에 근거하여 경구흡수성을 평가하였다.
<HPLC 조건>
컬럼 : Develosil C30-UG-5(4.6 × 150 ㎜)
용매 : A용매; 0.05용량% TFA 함유 수용액, B용매; 0.05용량% TFA/CH3CN
용출 : B용매 10용량% → 80용량%(0-20분), B용매 80용량% → 80용량%(20-25분), B용매 80용량% → 10용량%(25-25.1분), B용매 10용량%(25.1-32분)의 경사(gradient) 용출
검출 : 파장 370㎚에서 흡광도 검출
컬럼 온도 : 40℃
결과를 도 2에 나타낸다. 도 2로부터 명확한 바와 같이, IQC에 α-1,4 결합한 글루코오스 잔기의 수에 따라 그 경구흡수성(혈중이행성)에 차이가 있음이 판명되었다. 구체적으로는 G0 획분과 비교하여 G1 획분, G2 획분 및 G3 획분으로 되면, IQC에 α-1,4 결합한 글루코오스 수(n)가 1, 2 및 3으로 증가함에 따라 혈중이행성(경구흡수성)이 높아지게 되며, 글루코오스 수(n)가 4로 되면 혈중이행성(경구흡수성)이 저하하였다. 즉, IQC에 글루코오스가 3개, 2개 및 1개 결합한 IQC-G3, IQC-G2 및 IQC-G1은 이 순서로 흡수성이 우수하며, 글루코오스 수가 너무 적어도(G0) 또한 너무 많아도(G4 이상) 흡수성이 악화되는 것이 명확하였다.
실험예 2 혈중이행성(경구흡수성)의 측정(2)
참고조제예 1에서 조제한 이소케르시트린(IQC) 및 IQC-G(mix), 및 조제예 2에서 조제한 IQC-G(3-6) 획분 및 IQC-G(1-3) 획분에 대하여 경구흡수성을 조사하였다.
구체적으로는 전날 밤부터 절식시켜 둔 SD계 랫트(7-9주령) 24필을 4군(각군 6필씩)으로 나누어 각각에 참고조제예 1에서 조제한 IQC, IQC-G(mix), 조제예 2에서 조제한 IQC-G(3-6) 획분 또는 IQC-G(1-3) 획분을 각 198μmol/㎏의 용량으로 경구투여하였다. 다음으로, 실험예 1과 같이 혈장을 조제하여 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 및 케르세틴의 농도를 HPLC로 계측하였다. 또한, 콘트롤로서 어떠한 것도 투여하지 않은 군에 대하여도 같은 계측을 행하였다.
결과를 도 3에 나타낸다. 도 3a는 각 시료를 투여한 경우의 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도(㎍/㎖)의 경시적 변화를, 또한 도 3b는 각 시료를 투여한 경우의 혈장 중의 케르세틴의 농도(㎍/㎖)의 경시적 변화를 나타낸 것이다.
도 3으로부터 확인할 수 있는 바와 같이, IQC-G(1-3) 획분을 경구투여한 경우에는 IQC 뿐만 아니라 효소처리 이소케르시트린(IQC-G(mix)) 및 IQC-G(1-3) 획분을 경구투여한 경우에 비하여 혈액 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도 및 케르세틴 농도가 모두 유의하게 높게 상승하였다.
도 3a에 나타낸 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도(㎍/㎖)의 곡선하면적 및 도 3b에 나타낸 혈장 중의 케르세틴의 농도(㎍/㎖)의 곡선하면적으로부터 산출된 AUC(Area under the curve)(0-3hr)을 도 4에 나타낸다. 도 4로부터, IQC-G(1-3) 획분은 IQC-G(mix) 및 IQC-G(3-6) 획분에 비하여 AUC가 1.4~1.5배상승하는 것을 확인하였다.
실험예 3 혈장이행성(경구흡수성)의 측정(3)
조제예 3에서 조제한 IQC-G(mix)(2) 및 IQC-G(4-6) 획분에 대하여 경구흡수성을 조사하였다. 구체적으로는 전날 밤부터 절식시켜 둔 SD계 랫트(7-9주령) 12필을 2군(각군 6필씩)으로 나누어 각각에 참고조제예 1에서 조제한 이소케르시트린 및 조제예 1에서 조제한 IQC-G(4-6) 획분을 각 198μmol/㎏의 용량으로 경구투여하였다. 다음으로, 실험예 1과 같이 혈장을 조제하여 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 및 케르세틴의 농도를 HPLC로 계측하였다. 다음으로, 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도(㎍/㎖)의 곡선하면적 및 혈장 중의 케르세틴 농도(㎍/㎖)의 곡선하면적으로부터 AUC(Area under the curve)(0-3hr)((㎍/㎖·hr)을 산출하였다.
결과를 도 5에 나타낸다. 도 5로부터 확인할 수 있는 바와 같이, IQC-G(4-6) 획분을 경구투여한 경우는 효소처리 이소케르시트린(IQC-G(mix))을 경구투여한 경우에 비하여 혈액 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도 및 케르세틴 농도가 저하하였다.
도 4 및 도 5의 결과로부터, IQC-G(mix)를 경구투여한 경우에 비하여 IQC-G(4-6) 획분을 경구투여한 경우에는 혈액 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도 및 케르세틴 농도가 저하하는 것에 대하여, IQC-G(3-6) 획분을 경구투여한 경우에는 AUC가 변화하지 않으므로, IQC에 글루코오스가 3개 결합한 IQC-G3이 체내흡수성에 관련되어 있음이 시사되었다. 또한, IQC에 글루코오스가 4~6개 결합한 IQC-G(4-6)이 적은 케르세틴 배당체 조성물 및/또는 IQC에 글루코오스가 1~3개 결합한 IQC-G(1-3)이 많은 케르세틴 배당체 조성물은 경구투여한 경우에 종래의 효소처리 이소케르시트린(IQC-G(mix)) 보다도 혈중이행성(경구흡수성)이 높은 것이 시사되었다.
실험예 4 항산화능의 측정
상기 실험예 2에 있어서, 각 시료 투여전(0분), 경구투여후 30분, 1시간 및 3시간째에 채취한 혈장의 항산화능(FRAP; 혈장의 철 환원 활성, Ferrous Reducing Acitivity of Plasma)을 조사하여, IQC, 효소처리 이소케르시트린(IQC-G(mix)), IQC-G(3-6) 획분 및 IQC-G(1-3) 획분을 각각 경구투여한 경우의 생체내에서의 유효성을 평가하였다. 또한, FRAP는 Iris 등의 방법(Iris F. F. Benzie et al., Analytical Biochemistry 239, 70-76(1996))에 따라 철 3가로부터 2가로의 환원능력을 측정함으로써 구하였다.
구체적으로는 990㎕의 FRAP 시약(100mM TPTZ(2,4,6-트리(2-피리딜)-s-트리아진), 300mM 아세테이트 버퍼(pH 3.6) 중의 20mM FeCl3·6H2O)에 각 피험혈장 40㎕를 첨가한 후, 곧바로 593㎚에서 흡광도를 4분 동안 모니터링하였다. 콘트롤 시약으로서 IQC나 IQC 배당체 혼합물 대신에 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스(CMC)를 경구투여한 랫트의 혈장의 항산화능을 측정하였다. 각 피험혈장의 FRAP 활성(μmol/ℓ)은 표준물로서 FeSO4(100~1000μM)를 이용하여 작성한 검량선을 기초로 하여 산출하였다.
결과를 도 6에 도시한다. 또한, 결과는 시료 경구투여전(0분)의 FRAP 활성(μmol/ℓ) 값을 100%로 하여, 시료 경구투여후(30분, 1시간, 3시간)의 FRAP 활성을 그에 대한 상대활성(%)으로 표시하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이 혈장의 항산화능은 실험예 1 및 2에서 체내흡수성이 가장 우수한 것으로 확인된 IQC-G(1-3) 획분이 그 외의 IQC-G(3-6) 획분, IQC-G(mix) 및 IQC에 비하여 유의하게 높은 값을 나타내는 것을 확인하였다.
실험예 5 혈중이행성(경구흡수성)의 측정(4)
조제예 4에서 얻어진 효소처리 이소케르시트린(시료 1: IQC-G(mix)(3)), 및시료 3, 시료 4 및 시료 5에 대하여 실험예 1의 방법에 따라 경구흡수성을 조사하였다. 구체적으로는 전날밤부터 절식시켜 둔 SD계 수컷 랫트(7~9주령) 24필을 4군(각군 6필씩)으로 나누어 각각 시료 1~3을 198μmol/㎏의 용량으로 경구투여하였다. 다음으로, 실험예 1과 같이 혈장을 조제하여 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 및 케르세틴의 농도를 HPLC로 계측하였다.
혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도(㎍/㎖)의 곡선하면적 및 혈장 중의 케르세틴 농도(㎍/㎖)의 곡선하면적으로부터 산출한 AUC(Area under the curve)(0-3hr)((㎍/㎖·hr)의 결과를 도 7에 나타낸다.
이 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, G3을 포함하는 IQC-G(1-3)을 총량으로 55몰% 이상 포함하며, IQC-G(4≤)의 총량이 5몰% 이하인 시료 4 및 시료 5는 종래의 효소처리 이소케르시트린(시료 1)보다 유의하게 높은 체내흡수성을 나타내었다. 특히 체내흡수성이 높았던 시료 5는 IQC-G(2-3)을 총량으로 50몰% 이상 포함하고 있었다. 한편, 시료 3은 G3을 포함하며, IQC-G(4≤)의 총량이 10몰% 이하로 적지만, IQC-G(1-3)의 총량으로 50몰% 이하이기 때문에 종래의 효소처리 이소케르시트린(시료 1)보다 체내흡수성이 저하되었다.
각 시료의 비교로부터 이하의 것이 시사된다.
(ⅰ) 시료 1 및 시료 3 : 이소케르시트린(IQC)의 총량이 증가하면 체내흡수가 저하된다.
(ⅱ) 시료 3 및 시료 4 : 효소처리 이소케르시트린(IQC-G(mix))에 β-아밀라아제를 작용시키면 체내흡수가 높아진다.
(ⅲ) 시료 3, 시료 4 및 시료 5 : IQC-G(mix)에 β-아밀라아제를 작용시키면 체내흡수가 높아지고, 또한 이소케르시트린(IQC)을 저감시키면 보다 체내흡수가 높아진다.
실험예 6 혈중이생성(경구흡수성)(5)
조제예 5에서 얻어진 시료 6, 시료 7, 시료 8 및 시료 9에 대하여, 전술한 실험예 5와 같은 실험을 행하여 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도(㎍/㎖)의 곡선하면적 및 혈장 중의 케르세틴 농도(㎍/㎖)의 곡선하면적으로부터 AUC(Area under the curve)(0-3hr)((㎍/㎖·hr)를 산출하였다.
결과를 도 8에 나타낸다. 체내흡수성은 시료 6 < 시료 7 < 시료 8 < 시료 9의 순으로 높아졌다. 이 결과로부터 체내흡수성은 IQC-G3의 총량 및 IQC-G(1-3)의 총량이 관계되어 있음이 시사된다.
각 시료에 있어서 IQC-G의 총량 및 IQC-G(1-3)의 총량은 다음과 같다: 시료 6(G3: 7.8몰%, G(1-3): 45.1몰%), 시료 7(G3: 9.8몰%, G(1-3): 54.4몰%), 시료 8(G3: 13.3몰%, G(1-3): 64.2몰%), 시료 9(G3: 17.3몰%, G(1-3): 79.6몰%).
실험예 7 혈중이행성(경구흡수성)의 측정(6)
조제예 4에서 얻어진 효소처리 이소케르시트린(시료 1: IQC-G(mix)(3)) 및 시료 2에 대하여 전술한 실험예 5와 같은 실험을 행하여, 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도(㎍/㎖)의 곡선하면적 및 혈장 중의 케르세틴 농도(㎍/㎖)의 곡선하면적으로부터 AUC(Area under the curve)(0-3hr)((㎍/㎖·hr)를 산출하였다. 결과를 도 9에 나타낸다. 시료 1(IQC-G(mix))을 경구투여한 경우에 비하여, 시료 1에서 IQC를 저감한 케르세틴 배당체 조성물인 시료 2를 경구투여한 경우에 체내흡수성은 약간 높아졌다.
실험예 8 혈중이행성(경구흡수성)의 측정(7)
조제예 7에서 얻어진 효소처리 이소케르시트린[시료 A(IQC-G(mix))] 및 시료 B, 시료 C 및 시료 D에 대하여 실험예 1의 방법에 따라 경구흡수성을 조사하였다. 구체적으로는 전날밤부터 절식시켜 둔 SD계 수컷 랫트(7~9주령) 17필을 4군(1군 당 3~5필)으로 나누어 각각 시료 A 및 B를 198μmol/㎏의 용량으로 경구투여하였다. 다음으로, 실험예 1과 같이 혈장을 조제하여 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 및 케르세틴의 농도를 HPLC로 계측하였다. 혈장 중의 케르세틴·글루크론산 포합체 농도(㎍/㎖)의 곡선하면적 및 혈장 중의 케르세틴 농도(㎍/㎖)의 곡선하면적으로부터 산출한 AUC(Area under the curve)(0-3hr)((㎍/㎖·hr)의 결과를 도 10에 나타낸다.
이 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, G3을 포함하는 IQC-G(1-3)을 총량으로 75몰% 이상 포함하며, IQC-G(4≤)의 총량이 10몰% 이하인 시료 C 및 시료 D는 종래의 효소처리 이소케르시트린(시료 A: IQC-G(mix))보다 유의하게 높은 체내흡수성을 나타내었다. 특히 체내흡수성이 높았던 시료 C는 IQC-G(2-3)을 총량으로 50몰% 이상 포함한다. 한편 G3을 포함하는 IQC-G(1-3)을 총량으로 50몰% 이상 포함하지만, IQC-G(4≤)의 총량이 26몰%로 비교적 많이 포함하는 시료 B는 종래의 효소처리 이소케르시트린(시료 A)보다 체내흡수성이 낮아졌다.
도 9의 시료 1과 시료 2, 도 10의 시료 A와 시료 B는 모두 효소처리 이소케르시트린(IQC-G(mix))로부터 이소케르시트린(IQC)을 저감시킨 것이다. 시료 2를 경구투여한 경우에는 시료 1을 경구투여한 경우에 비하여 체내흡수성이 높지만, 시료 B를 경구투여한 경우에는 시료 A를 경구투여한 경우에 비하여 체내흡수성이 낮아졌다. 이 결과로부터 G3를 포함하는, IQC-G(4≤)의 총량이 15몰% 이하, 또한 IQC-G(1-3)의 총량이 60몰% 이상의 경우에, 종래의 효소처리 이소케르시트린(시료 1 또는 시료 A)보다 체내흡수성이 높아지는 것이 시사된다.
또한, 도 1 및 도 10의 결과로부터 효소처리 이소케르시트린(IQC-G(mix))에 아밀라아제 처리 등을 행하면, IQC-G(4≤)의 총량이 저감되어 상대적으로 IQC-G(1-3)의 총량(비율)이 높아지므로, 체내흡수성을 높일 수 있다. 아밀라아제 처리가 진행되어 G(4≤)가 소실되면, 이어서 G3의 분해가 시작되고 IQC-G3의 총량(비율)이 저감한다. 따라서, IQC-G1의 총량 및 IQC-G(4≤)의 총량이 일정한 조건하에서는 IQC-G3의 총량이 많은 편이 체내흡수성은 높아지므로 아밀라아제 반응이 진행됨에 따라 체내흡수성은 저하된다.
실시예 1 정제
IQC-G(1-3) 획분(조제예 2) 18중량%
유당 78중량%
수크로오스지방산에스테르 4중량%
상기 각 성분을 균일하게 혼합하여 1알 250㎎의 정제로 하였다.
실시예 2 산제 및 과립제
IQC-G(1-3) 획분(조제예 2) 18중량%
유당 60중량%
전분 22중량%
상기 각 성분을 균일하게 혼합하여 산제 또는 과립제로 하였다.
실시예 3 캡슐제
젤라틴 70.0중량%
글리세린 22.9중량%
메틸파라옥시벤조에이트 0.15중량%
프로필파라옥시벤조에이트 0.35중량%
물 적정량
합계 100.00중량%
상기 성분으로 이루어진 소프트캡슐제 껍질 중에 실시예 2에서 조제한 과립제를 상법에 따라 충전하여 1알 250㎎의 소프트캡슐을 얻었다.
실시예 4 드링크제
정미(taste component): 소듐 DL-타르트레이트 0.10g
숙신산 0.009g
감미(sweet component): 액당 800.00g
산미(sour taste component): 시트르산 12.00g
비타민: 비타민 C 10.00g
IQC-G(1-3) 획분(조제예 2) 1.80g
비타민 E 30.00g
사이클로덱스트린 5.00g
향료 15.00㎖
염화칼륨 1.00g
황산마그네슘 0.50g
상기 성분을 배합하고 물을 가하여 10리터로 하였다. 이 드링크제는 1회 당 투여용량이 약 250㎖로 되도록 조제되었다.
실시예 5 사탕
설탕 98g
물엿(Brix 75) 91g
IQC-G(1-3) 획분(조제예 2)의 농축액(Brix 40) 75g
상기 각 성분을 잘 혼합하고 수분이 2%로 될 때까지 바짝 졸여서 1알 당 2g의 사탕을 제작하였다.
본 발명의 케르세틴 배당체 조성물은 이소케르시트린이나 종래의 효소처리 이소케르시트린에 비하여 경구투여에 의한 체내흡수성이 우수하며, 그 결과 생체내에서 높은 항산화작용을 발휘할 수 있다. 이 때문에 본 발명의 케르세틴 배당체 조성물 및 상기 조성물을 함유하는 식품에 의하면 신체의 각 부위에서 활성산소를 소거하고, 세포장해나 노화를 예방할 수 있으며, 활성산소에 의하여 발생되는 다양한 질병을 예방, 치료 및 개선하는 것이 가능한 것으로 생각된다.

Claims (15)

  1. 화학식(1):
    [화학식 1]
    Figure 112007055115626-PCT00017
    (식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 0 또는 1 이상의 정수를 의미한다.)
    로 표시되는 케르세틴 배당체의 혼합물로 이루어지는 조성물로서, 적어도 n=3인 케르세틴 배당체를 포함하며, 또한, 하기 (a)의 요건을 만족하는 케르세틴 배당체 조성물:
    (a) 상기 조성물 중에 포함되는 n=1~3인 케르세틴 배당체의 총량이 50몰% 이상이며, 또한 n=4 이상인 케르세틴 배당체 조성물의 총량이 15몰% 이하이다.
  2. 제1항에 있어서,
    n=4 이상인 케르세틴 배당체의 총량이 10몰% 이하인
    케르세틴 배당체 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    n=1~3인 케르세틴 배당체의 총량이 60몰% 이상인
    케르세틴 배당체 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    n=1~3인 케르세틴 배당체의 총량이 70몰% 이상인
    케르세틴 배당체 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    하기 (b) 또는 (c)의 적어도 한쪽의 요건을 더 만족하는 케르세틴 배당체 조성물:
    (b) 상기 조성물 중에 포함되는 n이 0인 케르세틴 배당체가 20몰% 이하,
    (c) n=2 및 3인 케르세틴 배당체를 포함하며, 그들의 총량이 50몰% 이상.
  6. 제1항에 있어서,
    효소처리 이소케르시트린을 아밀라아제 처리하여 조제되는
    케르세틴 배당체 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 아밀라아제가 β-아밀라아제인
    케르세틴 배당체 조성물.
  8. 제1항 기재의 케르세틴 배당체 조성물을 포함하는 식품.
  9. 효소처리 이소케르시트린을 원료로 하여, 화학식(2):
    [화학식 2]
    Figure 112007055115626-PCT00018
    (식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 4 이상의 정수를 의미한다.)
    로 표시되는 케르세틴 배당체의 양을 저감하여 그 총량을 15몰% 이하로 하는 공정을 갖는, 효소처리 이소케르시트린보다 경구흡수성이 높은, 제1항 기재의 케르세틴 배당체 조성물을 조제하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 화학식(2)로 표시되는 케르세틴 배당체의 양을 저감하는 공정이 효소처리 이소케르시트린을 아밀라아제 처리하는 조작을 포함하는 것인
    방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 아밀라아제가 β-아밀라아제인
    방법.
  12. 효소처리 이소케르시트린을 원료로 하여, 화학식(2):
    [화학식 2]
    Figure 112007055115626-PCT00019
    (식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 4 이상의 정수를 의미한다.)
    로 표시되는 케르세틴 배당체의 양을 저감하는 공정을 갖는, 케르세틴 배당체 조성물의 경구흡수성을 높이는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 화학식(2)로 표시되는 케르세틴 배당체의 양을 저감하는 공정이 효소처리 이소케르시트린을 아밀라아제 처리하는 조작을 포함하는 것인
    방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 아밀라아제가 β-아밀라아제인
    방법.
  15. 제12항에 있어서,
    화학식(3):
    [화학식 3]
    Figure 112007055115626-PCT00020
    (식 중, Glc는 글루코오스 잔기를 의미하며, n은 0을 의미한다.)
    로 표시되는 이소케르시트린의 양을 저감하는 공정을 더 갖는
    방법.
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