KR20130014192A - 루부소사이드 생산하는 신규 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비스코자임 또는 나린기나아제 또는 둘 다를 처리하는 단계를 포함하여 스테비오사이드로부터 루부소사이드를 제조하는 방법, 비스코자임, 나린기나아제 또는 둘 다를 유효성분으로 함유하는 스테비오사이드의 글루코스 분해용 조성물, 스테비오사이드 및 비스코자임, 나린기나아제 또는 둘 다를 함유하는 복합체 및 상기의 복합체를 함유하는 식품조성물, 약학조성물 또는 화장품에 관한 것이다. 본 발명은 시판 중인 효소로부터 스테비오사이드를 기질로 하여 루부소사이드를 생성할 수 있는 효소를 발굴한 것이다.

Description

루부소사이드 생산하는 신규 제조방법 {New method for producing rubusoside}
본 발명은 비스코자임 또는 나린기나아제 또는 둘 다를 처리하는 단계를 포함하여 스테비오사이드로부터 루부소사이드를 제조하는 방법, 비스코자임, 나린기나아제 또는 둘 다를 유효성분으로 함유하는 스테비오사이드의 글루코스 분해용 조성물, 스테비오사이드 및 비스코자임, 나린기나아제 또는 둘 다를 함유하는 복합체 및 상기의 복합체를 함유하는 식품조성물, 약학조성물 또는 화장품에 관한 것이다.
최근, 인공감미료인 싸이클라메이트, 사카린과 그의 염 등이 안정성의 면에서 일반 식품에의 사용이 금지되거나 사용 제한이 강화되고 있으며, 한편 설탕의 섭취는 건강상의 문제로 사용을 기피하고 있는 상황에서 이들을 대체할 수 있는 천연 감미료의 개발이 시급히 요구되고 있다.
이런 시점에서 스테비오사이드는 설탕에 비하여 저칼로리 감미료이며 감미도는 설탕의 약 200-300배로 높아 그의 수용가 급속하게 높아지고 있다. 스테비오사이드는 남미 파라과이가 원산지인 국화과 다년생 초본인 스테비아 레바우디아나 베르토니 (Stevia rebaudiana BERTONI)로부터 추출한 감미성분으로 스테비오사이드, 레바우디오사이드 A, B, C, E 등으로 되어 있다. 장미과의 루버스 수아비씨엄(Rubus suavissium S. LEE)는 중국과 일본에서 "첨차"라는 이름으로 오래전부터 음용되고 있는 차의 일종으로 폴리페놀성분(탄닌, 플라보노이드 등)과 루부소사이드(Rubusoside)라는 배당체를 다량 함유하고 있으며, 루부소사이드는 설탕의 약 150-200배 정도의 감미를 지니고 있으며, 무칼로리, 충치 방지 및 청정감(시원한맛) 지닌 감미소재이다. 이소스테비올 골격에 어글리콘의 베타-글루코실 배당체로 되어 있다.
스테비오사이드 시장은 지난 90년부터 시행된 정부의 사카린 사용규제조치에 따라 시장이 형성되기 시작했으며, 현재는 사카린 대체감미료 및 저칼로리 감미료로 주로 사용되고 있다. 스테비오사이드는 생체내 흡수가 되지 않는 무칼로리 다이어트 감미료로, 특히 온도 및 pH 변화에 안정, 소주 등에 다량 사용되고 있다. 또한, 5~18%의 식염수에서 침전을 형성, 감미변화가 없어 절임 식품과 비발효성으로 각종 가공식품류에 사용이 적합한 것으로 알려지고 있다. 하지만, 뒷맛이 오래 남으며 단맛 이외에 쓴맛, 불쾌감 등이 있는 단점을 지니고 있다. 그로 인해 사용량 및 용도의 한계가 발생하는 문제점이 있어 스테비오사이드의 미질을 개선하려는 필요를 느끼게 되었다.
종래 스테비오사이드의 감미질 개선 방법은 (1) 설탕, 포도당, 과당 등과 같은 천연 당질 감미료를 1종 또는 그 이상을 첨가하는 방법, (2) 아미노산 또는 아미노산의 염과 배합하는 방법, (3) 싸이클로덱스트린과 같이 포접능을 갖는 환형 당질에 물리적으로 결합시키는 방법(일본공개특허공보 소60-98957)등이 있다. 그러나 이상의 방법은 첨가물을 상당히 많은 양을 첨가하여야 하며 결국 스테비오사이드가 저칼로리 감미료라는 특징을 잃어버리는 단점이 있다. 또 다른 미질 개선 방법으로 생물전환 당전이 효소 기술을 활용하여 감미도와 감미질이 우수한 모델이였던 "레바우디오사이드 A"유사체를 만들려고 하였다. 현재 시판중인 CGTase를 이용하여 스테비오사이드의 13-OH 또는 19-OH 부위에 무작위로 포도당이 1-12개까지 부가된 효소처리 스테비오사이드가 유일하게 시판 중에 있다. 하지만, CGTase를 이용한 방법으로는 선택적으로 한 개의 포도당만 부가할 수가 없고, 부가된 포도당이 장내 미생물에 의해 모두 분해되어 에너지원으로 전환된다면 가수 분해된 포도당 숫자만큼의 칼로리가 상승한다는 단점을 지니고 있다.
현재까지 스테비오사이드를 분해하는 유일한 효소로는 Clavibacter 속에서 유래된 베타-글루코시다제가 있으며 글루코실 에테르의 분해 능력이 높은 효소이다. 글루코실 에테르는 스테비오사이드를 비누화반응 (sponification)하여 얻을 수 있다.
이에 본 발명자들은 본 연구에서는 루부소사이드에 비해 상대적으로 값이 싼 소재인 스테비오사이드를 기질로 사용하고, 경제적인 방법으로 청량감이 좋으며, 피부 자극완화 및 보습효과도 뛰어난 소재인 루부소사이드를 선택적으로 생산하는 효소를 개발하고, 생물 공학적 기술을 통하여 대량생산 하고자 하였다.
본 발명의 주된 목적은 스테비오사이드에 비스코자임(Viscozyme) 효소, 나린기나아제(Naringinase) 효소 또는 둘 다를 처리하는 단계를 포함하여, 하나 이상의 글루코스가 제거된 스테비오사이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 비스코자임 효소, 나린기나아제 효소 또는 둘 다를 유효성분으로 함유하는 스테비오사이드의 글루코스 분해용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품에 비스코자임 효소 또는 나린기나아제 효소를 처리하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품의 감미질 개선 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스테비오사이드; 및 비스코자임 효소, 나린기나아제 효소 또는 둘 다를 함유하는 복합체를 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 스테비오사이드에 비스코자임 효소, 나린기나아제 효소 또는 둘 다를 처리하는 단계를 포함하여, 하나 이상의 글루코스가 제거된 스테비오사이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 글루코스가 제거된 스테비오사이드는 루부소사이드, 스테비올 모노글로코사이드, 및 스테비올로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 것이 바람직하다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 비스코자임 효소, 나린기나아제 효소 또는 둘 다를 유효성분으로 함유하는 스테비오사이드의 글루코스 분해용 조성물을 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품에 비스코자임 효소 또는 나린기나아제 효소를 처리하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품의 감미질 개선 방법을 제공한다.
본 발명에서, 비스코자임 효소 또는 나린기나아제 효소를 처리하는 것은 이들 효소 자체를 처리하거나; 비스코자임 효소 또는 나린기나아제 효소를 생산하는 미생물을 처리할 수 있다.
베타-글루코시다아제활성을 갖는 효소가 모두 스테비오사이드를 기질로 하여 최종 생성물로 루부소사이드를 형성하는 것은 아니다.
본 발명자들은 생리식염수에 현탁된 스테비오사이드 현탁액에 완충용액을 가하고, 다양한 효소(Tricoderma logibrachiatum cellulase, Amano사 Visozyme, Aspergillus niger naringinase, A. niger hemicellulase, A. niger hersperdinase, Amano사 Ultraflo, A. niger cellulase, Amano사 celluclast, Almond beta-glucosidase)를 첨가하여 각각의 최적온도에서 반응시키고, 반응물을 박막크로마토그래피 또는 고성능 액체 크로마토그래피에 적용하여, 루부소사이드의 생산여부를 조사한 결과, Viscozyme 및 Naringinase가 루부소사이드를 생성할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 스테비오사이드의 13-OH위치의 글루코스를 선택적으로 가수분해하는 효소원으로 비스코자임과 나린기나아제 효소를 선발하였고, 본 발명은 이들 효소를 사용하여 루부소사이드 및 스테비올 모노글루코사이드를 제조하는 것이 특징이다. (도 1).
"스테비오사이드"는 국화과의 다년생 식물인 스테비아(stevia)의 잎에 함유되어 있는 감미물질이다. 스테비아 감미료는 설탕의 수백 배 우수한 감미도를 갖지만, 설탕에 비교하여 감미의 발현이 느린 특징, 이른바 감미의 상승이 느린 특징과, 뒷맛(後味)으로서 감미가 비교적 오래 남는 특징, 이른바 감미의 마무리가 나쁜 특징이 있다. 또, 상기 스테비아 감미료에 다량 포함되는 스테비오사이드에는 감미와는 별도로 뒷맛에 독특한 떫은맛이나 쓴맛을 수반하는 결점이 있어, 커피 음료나 청량 음료수에 이용하면 명확히 위화감을 느낀다. 따라서, 본 발명은 상대적으로 값이 싼 소재인 스테비오사이드로부터 감미질이 개선된 루부소사이드를 제조하고자 한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기의 화학식 1은 스테비오사이드(stevioside) 나타내는 것으로, 글루코스 2분자와 글루코스 1분자가 각각 스테비올에 연결된 모식도로 표현하였다.
한편, "루부소사이드"는 장미과의 다류 원료인 첨차(Rubus suavissium S. LEE)의 잎에서 5% 이상의 수득률로 얻을 수 있으며, 설탕의 약 115배에 달하는 감미도를 지닌 무칼로리, 충치 방지 및 청점감(시원한 맛)을 지닌 감미소재이다. 설탕의 대체품으로써 비만증, 당뇨병, 심혈관병, 신장 등의 질병을 지니고 있는 사람들에게 양호한 보조효과를 낼 수 있다. 또한, 루부소사이드는 di-terfan 배당체로써 피부자극완화 작용이 우수하며, 천연 보습인자와 아미노산을 함유하여 보습효과가 탁월하여 화장품 소재로서 응용도 가능하다.
[화학식 2]
Figure pat00002
상기의 화학식 2는 루부소사이드(rubusoside) 나타내는 것으로, 글루코스 1분자와 글루코스 1분자가 각각 스테비올에 연결된 모식도로 표현하였다.
"비스코자임"이란 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 곰팡이로부터 생산되는 당 분해효소이다. 본 발명에서 상기 비스코자임은 Aspergillus aculeatus에서 유래된 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경우에 따라서는 상기 비스코자임을 생산 및 분비할 수 있는 미생물을 이용하여 스테비오사이드로부터 루부소사이드를 제조할 수 있다. 이때, 상기 비스코자임의 처리조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, pH 4 내지 5 및 40 내지 50℃의 조건에서 비스코자임을 스테비오사이드에 처리하여 루부소사이드를 제조함이 바람직하다.
"나린기나아제"란 나린긴 가수분해효소로, 나린긴의 람노오스와 글루오스와의 사이의 결합을 절단함으로써 쓴맛을 제거할 수 있는 효소이다. 상기 나린기나아제는 Penicillium decumbens에서 유래된 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경우에 따라서는 상기 나린기나아제를 생산 및 분비할 수 있는 미생물을 이용하여 스테비오사이드로부터 루부소사이드를 제조할 수 있다. 이때, 상기 나린기나아제의 처리조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 pH 4.5~ 5.5, 35-50℃에서, 더욱 바람직하게는 pH 5.0~ 5.4, 37 ℃의 조건에서 나린기나아제를 스테비오사이드에 처리하여 루부소사이드를 제조한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 스테비오사이드; 및 비스코자임 효소, 나린기나아제 효소 또는 둘 다를 함유하는 복합체를 제공한다.
이때, 스테비오사이드는 스테비오사이드 자체 또는 이의 혼합물이거나, 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품일 수 있다. 또한, 본 발명의 복합체는 스테비오사이드에 비스코자임 효소, 나린기나아제 효소 또는 둘 다에 의한 효소반응이 작용하여 스테비오사이드의 분해산물을 형성하는 형태일 수도 있다.
본 발명의 복합체는 비스코자임 효소 또는 나린기나아제 효소에 의해 스테비오사이드로부터 글루코스를 분해한 후 비스코자임 효소 또는 나린기나아제 효소가 제거된 것일 수도 있다.
상기의 스테비오사이드의 분해산물은 루부소사이드, 스테비올 모노 글루코사이드 또는 둘 다를 함유할 수도 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 복합체를 함유하는 감미료 조성물을 제공한다.
본 발명에 제공되는 감미료 조성물에 대한 적합한 용도는 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예컨대, 상기 감미료 조성물은 사료, 식품, 음료, 약제, 담배, 기능성 식품, 구강 위생용품/화장품 등의 가당 조성물 중의 기존의 감미료 대신에 사용될 수 있다.
감미료 조성물은 상기 가당 조성물 중에 상기 가당 조성물에 목적하는 당도를 부여하는 데 충분한 양으로 존재할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 복합체를 감미료를 함유하는 식품 조성물을 제공한다.
"식품 조성물"은 보호성 하이드로콜로이드(예컨대, 검, 단백질, 개질된 전분), 결합제, 막-형성제, 캡슐화제/캡슐화 물질, 벽/외피 물질, 매트릭스 화합물, 코팅물, 에멀젼화제, 계면활성제, 가용화제(오일, 지방, 왁스, 레시틴 등), 흡착제, 담체, 충전제, 보조-화합물, 분산제, 습윤화제, 가공 보조제(용매), 유동화제, 맛-가리움제, 가중제, 젤리화제, 겔-형성제, 산화방지제 및 항균제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 일부 식이요법에서 누락되는 적정량의 필수 영양분을 수득하기 위해 종합 비타민 및 미네랄 보충제가 본 발명의 식품 조성물에 첨가될 수 있다. 종합 비타민 및 미네랄 보충제는 또한 질환 예방, 및 생활 패턴으로 인한 영양 손실 및 결핍으로부터의 보호에 유용할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 복합체를 함유하는 충치 방지용 약학 또는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 복합체는 신체에 투여하기에 적합한 임의의 형태, 특히 경구 투여를 위한 통상적인 임의의 형태, 예를 들어 식품 또는 사료(를 위한 첨가제/보충제), 식품 또는 사료 예비혼합물, 강화 식품 또는 사료, 정제, 환제, 과립, 당의정, 캡슐 및 비등성 제형, 예컨대 분말 및 정제와 같은 고체 형태; 또는 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예를 들어, 음료, 페이스트 및 유성 현탁액과 같은 액체 형태일 수 있다. 페이스트는 경질 또는 연질 외피 캡슐에 혼입될 수 있고, 이에 의해 캡슐은, 예를 들어 (어류, 돼지, 가금류, 소) 젤라틴, 식물 단백질 또는 리그닌설폰에이트로 이루어진 매트릭스일 수 있다. 다른 적용 형태의 예는 경피, 비경구 또는 주사 투여 형태이다. 식이 및 약학 조성물은 조절된(지연된) 방출 제형의 형태일 수 있다.
본 발명에서 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 보조제를 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition Williams & Wilkins, PA, USA]에 개시된 표준 기술이 상기 제형화에 사용될 수 있다. 경구 투여의 경우, 적절한 결합제, 예를 들어 젤라틴 또는 폴리비닐 피롤리돈, 적절한 충전제, 예를 들어 락토스 또는 전분, 적절한 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 및 선택적인 추가 첨가제를 함유하는 정제 및 캡슐이 바람직하게 사용된다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기된 복합체를 함유하는 화장품을 제공한다. 본 발명에서 보습효과를 발휘하는 것이 특징인 화장품이 바람직하다.
화장품류의 형태로 이용되는 경우에는, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 소르비토, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 및 1,3-부틸렌글리콜 등에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 보습제를 배합하여 사용할 수 있다.
비스코자임 및/또는 나린기나아제를 이용하여 값싼 스테비오사이드로부터 미료의 형질을 개선하여 식품, 화장품, 의약품 등에 적용가능한 루부소사이드를 대량 생산할 수 있다. 본 발명의 제조방법으로 제조되는 루부소사이드 또는 스테비올 모노 글루코사이드는 보통 일반 식품 및 다이어트 식품, 의약품, 의약부외품 등의 감미원으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 간장, 된장, 분말장류 등과 같은 각종 장류, 커피, 탄산 음료, 유산균 음료, 유 음료 등의 각종 청량 음료수, 소주, 과실주, 양주 등과 같은 각종 주류, 단무지, 장아찌 등과 같은 각종 절임 식품류, 아이스크림, 샤베트 등과 같은 각종 빙과류 등과 같이 각종 음식물, 화장품 등에도 사용될 수 있다.
도 1은 시판중인 β-Glucosidases를 이용하여 stevioside을 기질로하여 rubusoside의 생성 효소를 선발한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 각기 다른 pH조건으로부터 루부소사이드의 생산수율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 g 단위의 루부소사이드와 스테비올 글루코사이드 생산을 위한 Viscozyme 또는 Naringinase와 스테비오사이드 반응 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에서 제조 및 정제한 루부소사이드의 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, HMBC, H-H COZY, DEPT 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에서 제조 및 정제한 스테비올 모노 글루코사이드의 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, HMBC, H-H COZY, DEPT 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
실시예 1. 다양한 효소자원으로부터 루부소사이드 생성 효소의 선발
루부소사이드(rubusoside)를 생산하는 효소를 선발하기 위하여 2 g의 스테비오사이드(stevioside)를 생리식염수 10 ㎖에 현탁하고, 현탁액의 적당량을 취하여 20 mM 소듐아세테이트 완충용액 (pH 5.2)과 소듐포스페이트 완충용액 (pH 7.0)을 첨가하였다. 여기에서 시판중인 β-Glucosidases인 다양한 효소(Tricoderma logibrachiatum cellulase, Amano사 Visozyme, Aspergillus niger naringinase, A. niger hemicellulase, A. niger hersperdinase, Amano사 Ultraflo, A. niger cellulase, Amano사 celluclast, Almond beta-glucosidase)를 첨가하여 각각의 최적온도에서 반응시켰다. 24시간 후, 각각의 반응산물 중 10 ㎖를 취하여 박막크로마토그래피 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 루부소사이드 생산여부를 조사하였다. 이들 중 대부분의 효소는 스테비오사이드에 대해 촉매로서 작용하지 못하였으나, 비스코자임과 나린기나아제는 루부소사이드 생성효소임을 확인하였다. (도 1)
실시예 2. 상기 선발된 효소의 최적 반응 조건의 확립
상기 실시예 1에서 선발된 비스코자임을 이용하여 다양한 온도와 pH 조건에서 생성효소의 최적 조건을 확인하였다. 최적의 pH와 pH 안정성을 조사하기 위해서 빅톤-로빈슨 완충용액(32 mM, pH 3-11)과 효소를 잘 섞은 후, 24시간 동안 냉장고에서 방치한 후 그 잔존 활성을 조사해본 결과, 비스코자임은 pH 3.5-pH 7.5에서 안정함을 확인하였고, 최적의 반응 pH는 pH 4.0에서 확인되었다. 최적의 온도와 온도 안정성을 조사해본 결과, 비스코자임은 60 ℃ 이상에서 급격하게 불안정하였으며, 40~50 ℃에서 최적의 반응 온도임을 확인할 수 있었다. 또한, 나린기나아제는 pH 3.5-pH 7.5에서 안정함을 확인하였고, 최적의 반응 pH는 pH 5.2에서 확인되었다. 최적의 온도와 온도 안정성을 조사해본 결과, 나린기나아제는 55℃ 이상에서 급격하게 불안정하였으며, 35~50℃에서 최적의 반응 온도임을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 생성된 루부소사이드 생성 최적 조건의 확립
5 ㎎ 스테비오사이드 50 mM 브릭톤 로빈손 완충용액 (pH 3.0-pH 11.0)을 포함한 시료 0.2 ㎖를 45 ℃에서 16시간 반응시켰다. pH 4.0, 5.0, 6.0, 8.0의 HPLC를 통해 분석한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 각기 다른 pH조건으로부터 루부소사이드의 생산수율을 나타낸 것으로, 도 2에서 보듯이, 비스코자임은 pH 가 산성인 조건에서 생산량이 증가하는 경향을 보였고, pH 4.0-pH 5.0에서 최적의 루부소사이드 생산량을 보였다.
또한, 초기 첨가해주는 스테비오사이드의 양에 대한 영향을 조사하기 위하여 1-6%의 스테비오사이드를 첨가하여 반응을 수행한 결과, 1-2% 첨가했을 때 최적의 루부소사이드 생성량을 보였다.
온도의 영향을 조사해본 결과 효소의 최적 반응 온도의 결과와 비슷하게 50℃ 이상의 온도에서는 급격하게 루부소사이드 생성이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 생성된 루부소사이드 및 스테비올 모노 글루코사이드의 정제
최적의 루부소사이드 생성조건인 pH 3.0-5.2에서 100 g 스테비오사이드와 20 mM 소듐아세테이트 완충용액 (pH 4.0), 20000 U의 비스코자임과 나린기나아제을 각각 첨가하고 45도에서 2주간 반응시켰다. 반응시킨 결과 반응 초기에 투명하던 효소 반응액은 우윳빛을 띠는 반응액을 잘 교반한 후, HPLC로 분석한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 g 단위의 루부소사이드와 스테비올 글루코사이드 생산을 위한 Visocozyme 또는 Naringinase, 과 스테비오사이드 반응 결과를 나타낸 것으로 A, B는 각각 Narininase, Viscozyme을 처리한 결과를 나타낸 것이고 C, D, E는 각각 Stevioside, Rubusosoide, Steviol의 위치를 나타낸 것이다. 도 3에서 보듯이 예비 실험과 동일하게 반응산물에는 메인 산물인 루부소사이드와 두 번째로 많은 스테비올 모노 글루코사이드를 생성함을 확인할 수 있었다. 상기 반응액을 AW 90수지에 통과하여 잔존 단백질 및 염을 제거하고, Diaion HP-20이나 C18컬럼 크로마토그래피를 에탄올 농도구배 (0-80%)를 이용하여 분리 정제하여 최종적으로 루부소사이드 24 g과 스테비올 모노 글루코사이드 20 g을 얻었다.
각각 얻어진 루부소사이드와 스테비올 모노 글루코사이드의 구조를 파악하기 위하여 상기 실시예 3에서 얻은 화합물의 분자량 및 분자식을 LC/MS를 사용하여 결정하였다. 또한, 핵자기공명(NMR) 분석(Bruker AM 500)을 통하여 1H NMR, 13C NMR, 호모-코지(HOMO-COSY), HMQC (1H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization) 스펙트럼을 얻어, 분자구조를 결정하였다. 상기 실험에서 수득한 반응산물의 구조를 13C-NMR 분광기로 분석하였다. 분석시료는 상기 실험에서 분리 및 정제한 시료 루부소사이드와 스테비올 모노글루코사이드를 각각 40 ㎎씩 D2O에 용해시켜 사용하였다.
도 4와 도 5는 본 발명에서 제조 및 정제한 루부소사이드와 스테비올 모노 글루코사이드의 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, HMBC, H-H COZY, DEPT 스펙트럼을 나타낸 것으로, 도 4와 도 5의 모든 NMR분석결과 비스코자임이 스테비오사이드로부터 생산한 산물은 루부소사이드와 스테비올 모노 글루코사이드 임을 알 수 있었다.

Claims (22)

  1. 스테비오사이드에 비스코자임 효소(Viscozyme), 나린기나아제 효소(Naringinase) 또는 둘 다를 처리하는 단계를 포함하여, 하나 이상의 글루코스가 제거된 스테비오사이드를 제조하는 방법
  2. 제 1항에 있어서,
    하나 이상의 글루코스가 제거된 스테비오사이드는 루부소사이드, 스테비올 모노글루코사이드, 및 스테비올로 구성된 군에서 하나 이상 선택된 것이 특징인 제조 방법
  3. 제 2항에 있어서,
    비스코자임 효소 또는 나린기나아제 효소에 의해 스테비오사이드로부터 루부소사이드를 제조하는 방법
  4. 제 2항에 있어서,
    비스코자임 효소 또는 나린기나아제 효소에 의해 스테비오사이드로부터 스테비올 모노글루코사이드를 제조하는 방법
  5. 제 1항에 있어서,
    비스코자임 효소 또는 나린기나아제 효소는 스테비오사이드의 13-OH위치의 글루코스를 선택적으로 가수분해하는 것이 특징인 제조 방법
  6. 제1항에 있어서,
    비스코자임 효소는 Aspergillus aculeatus에서 유래된 것이 특징인 제조 방법
  7. 제1항에 있어서,
    나린기나아제 효소는 Penicillium decumbens에서 유래된 것이 특징인 제조 방법
  8. 제 1항에 있어서,
    비스코자임 효소 또는 나린기나아제 효소를 처리하는 것은 이들 효소 자체를 처리하거나; 비스코자임 효소 또는 나린기나아제 효소를 발현하는 미생물을 처리하는 것이 특징인 제조 방법
  9. 제 1항에 있어서,
    비스코자임 효소에 의한 효소반응은 pH 4 ~ 5 및 40 ~ 50도에서 수행하는 것이 특징인 제조 방법
  10. 제 1항에 있어서,
    나린기나아제 효소에 의한 효소반응은 pH 4.5 ~ 5.5 및 35 ~ 50도에서 수행하는 것이 특징인 제조 방법
  11. 비스코자임 효소, 나린기나아제 효소 또는 둘 다를 유효성분으로 함유하는 스테비오사이드의 글루코스 분해용 조성물
  12. 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품에 비스코자임 효소 또는 나린기나아제 효소를 처리하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품의 감미질 개선 방법
  13. 스테비오사이드; 및 비스코자임 효소, 나린기나아제 효소 또는 둘 다를 함유하는 복합체
  14. 제 13항에 있어서,
    스테비오사이드는 스테비오사이드 자체 또는 이의 혼합물이거나, 스테비오사이드 함유 식물 또는 식품인 것이 특징인 복합체
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 스테비오사이드에 비스코자임 효소, 나린기나아제 효소 또는 둘 다에 의한 효소반응이 작용하여 스테비오사이드의 분해산물이 형성된 형태인 것이 특징인 복합체
  16. 제 15항에 있어서,
    비스코자임 효소 또는 나린기나아제 효소에 의해 스테비오사이드로부터 글루코스를 분해시킨 후 비스코자임 효소 또는 나린기나아제 효소가 제거된 것이 특징인 복합체
  17. 제 15항에 있어서,
    스테비오사이드의 분해산물은 루부소사이드, 스테비올 모노 글루코사이드 또는 둘 다를 함유하는 것이 특징인 복합체
  18. 제 13항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 함유하는 감미료 조성물
  19. 제 13항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 감미료로 함유하는 식품 조성물
  20. 제 13항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 함유하는 충치 방지용 약학 또는 식품 조성물
  21. 제 13항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 기재된 복합체를 함유하는 화장품
  22. 제 21항에 있어서,
    보습효과를 발휘하는 것이 특징인 화장품
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