CN102286575B

CN102286575B - 金属离子强化酶法合成异槲皮苷的方法

Info

Publication number: CN102286575B
Application number: CN 201110269958
Authority: CN
Inventors: 王俊; 吴福安; 张旭东; 夏睿
Original assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Current assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Priority date: 2011-09-14
Filing date: 2011-09-14
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2031-09-14
Also published as: CN102286575A

Abstract

金属离子强化酶法合成异槲皮苷的方法，在酶促合成异槲皮苷的体系中添加金属离子来强化合成效率，该方法操作简便，反应条件温和，产物得率高，对环境友好，克服了传统糖苷酶催化合成效率较低的缺点，易于工业化生产高纯度异槲皮苷。

Description

金属离子强化酶法合成异槲皮苷的方法

技术领域

本发明属于酶法合成食品添加剂领域，具体涉及一种金属离子强化酶法合成异槲皮苷的方法。

背景技术

现有技术：异槲皮苷(Isoquercitrin)，即槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(Quercetin-3-glucose)，是自然界中非常罕见的一种具有显著的抗氧化性、抗肿瘤等生物活性的黄酮类化合物，也是国际上各大医药食品公司竞相开发的高级食品添加剂、辅助药物或药物有效成分。

专利CN 101985639A介绍了异槲皮苷的制备方法主要有提取法和水解法两种：(1)异槲皮苷在自然界中的分布较少，其含量仅有几万分之一甚至是十万分之几，直接从自然界植物中提取难以制备异槲皮苷；(2)酸催化水解法的水解温度较高，使用的酸对设备腐蚀严重，并产生大量的酸性废水，且芦丁的水解过程中槲皮素和异槲皮苷共存，必须对水解产物采用分离手段才能获得异槲皮苷(African Journal of Biotechnology，2011，10(8)：1460-1466)。因此，以酶促水解芦丁公认是制备异槲皮苷的有效途径。即，以自然界分布广泛、来源丰富的芦丁为原料，经糖苷酶催化水解反应制备异槲皮苷，建立生物转化芦丁定向合成异槲皮苷的酶促水解工艺是今后规模化制备异槲皮苷的唯一选择。

在酶促反应中，酶作为高效催化剂使得反应以极快的速度或在一般情况无法反应的条件下进行。所以采取适当的方法对酶促反应过程进行调控，就显得格外重要。金属离子在酶催化反应中可以通过多种方式扮演着重要角色，如金属离子可以直接与过渡态的功能基团配位来稳定过渡态的几何结构和电荷，或通过内、外界配位机理来稳定过渡态，还可以通过长程的静电作用来稳定过渡态电荷，最终金属离子引起底物等相关物质pKa的改变，从而活化底物分子中的碱基或糖基，表观上表现为对酶促反应的促进或抑制活性。

因此，本专利在酶促合成异槲皮苷的体系中添加金属离子来强化合成效率，该方法操作简便，反应条件温和，产物得率高，对环境友好，从而可以克服传统糖苷酶催化合成效率较低和底物溶解度较低的缺点，易于工业化生产高纯度异槲皮苷，为今后大规模工业化生物合成异槲皮苷的应用奠定了基础，为推动其在医药、食品、化妆品等工业中的广泛应用具有十分重要的意义。

发明内容

技术问题：针对现有技术中所述的不足，本发明提供了一种金属离子强化酶法合成异槲皮苷的方法。该方法在酶促合成异槲皮苷的体系中添加金属离子，可大大强化合成效率。

技术方案：

强化酶法合成异槲皮苷的方法，包括α-L-鼠李糖苷酶催化水解芦丁合成异槲皮苷的反应体系，该体系中加入金属离子，所述金属离子为CoCl₂、CuSO₄、FeSO₄、ZnSO₄、Li₂SO₄、MnSO₄、K₂SO₄、AlCl₃、MgSO₄、CaCl₂、Na₂SO₄或螯合剂EDTA。

配制芦丁母液的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液浓度为0.01～1mol/L。

配制芦丁母液的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH值为5～9。

芦丁母液的浓度为0.01～1g/L。

在芦丁母液中按体积比1～50％加入α-L-鼠李糖苷酶液。

在芦丁母液中加入α-L-鼠李糖苷酶液的浓度为0.1～100g/L。

在芦丁酶促反应体系中加入金属离子的浓度为0.1～100mmol/L。

芦丁酶促反应温度范围为10～60℃。

芦丁酶促反应的振荡转速范围为50～200r/min。

芦丁酶促反应时间范围为1～48h。

有益效果：

在酶促合成异槲皮苷的体系中添加金属离子来强化合成效率，该方法反应条件温和，产物得率高，对环境友好，克服了传统糖苷酶催化合成效率较低和底物溶解度较低的缺点，易于工业化生产高纯度异槲皮苷。此外，整个酶促反应工艺基本上无废弃物产生，无环境污染，具有非常良好的工业化应用前景，可以满足迅速发展的医药工业和日化工业的需要。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明实施例中使用同时检测芦丁和异槲皮苷的测定方法为高效液相色谱法，色谱条件：Alltima C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：0.02％磷酸-乙腈(80∶20，v/v)；检测波长：360nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL。

其中，产物异槲皮苷的转化率计算方法为：

α-L-鼠李糖苷酶液的制备参见专利CN 101985639A。

实施例1

以0.01mol/L磷酸氢二钠-0.01mol/L柠檬酸缓冲液，配制pH＝5的0.01g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比1％加入0.1g/L α-L-鼠李糖苷酶液，加入CoCl₂至Co²⁺浓度为0.1mmol/L，在10℃条件下50r/min振荡反应1h。反应结束后，HPLC检测产物异槲皮苷的转化率计算相对酶活提高了0.1％。

实施例2

以1mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配制pH＝9的1g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比50％加入100g/L α-L-鼠李糖苷酶液，加入Na₂SO₄至Na⁺浓度为100mmol/L，在60℃、200r/min条件下振荡反应48h。反应结束后，HPLC检测产物异槲皮苷的转化率计算相对酶活提高了0.1％。

实施例3

以0.2mol/L磷酸氢二钠-0.1mol/L柠檬酸缓冲液，配制pH＝7的0.3g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比5％加入10g/L α-L-鼠李糖苷酶液，加入AlCl₃至Al³⁺浓度为1.0mmol/L，在40℃条件下120r/min振荡反应20h。反应结束后，HPLC检测产物异槲皮苷的转化率计算相对酶活提高了8％。

实施例4

以0.2mol/L磷酸氢二钠-0.1mol/L柠檬酸缓冲液，配制pH＝7的0.3g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比5％加入10g/L α-L-鼠李糖苷酶液，加入EDTA至浓度为1.0mmol/L，在40℃条件下120r/min振荡反应20h。反应结束后，HPLC检测产物异槲皮苷的转化率计算相对酶活提高了19％。

实施例5

以0.2mol/L磷酸氢二钠-0.1mol/L柠檬酸缓冲液，配制pH＝7的0.3g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比5％加入10g/L α-L-鼠李糖苷酶液，加入K₂SO₄至K⁺浓度为1.0mmol/L，在40℃条件下120r/min振荡反应10h。反应结束后，HPLC检测产物异槲皮苷的转化率计算相对酶活提高了8％。

实施例6

以0.2mol/L磷酸氢二钠-0.1mol/L柠檬酸缓冲液，配制pH＝7的0.3g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比5％加入10g/L α-L-鼠李糖苷酶液，加入Li₂SO₄至Li⁺浓度为1.0mmol/L，在40℃条件下120r/min振荡反应10h。反应结束后，HPLC检测产物异槲皮苷的转化率计算相对酶活提高了4％。

实施例7

以0.2mol/L磷酸氢二钠-0.1mol/L柠檬酸缓冲液，配制pH＝7的0.3g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比5％加入10g/Lα-L-鼠李糖苷酶液，加入MgSO₄至Mg²⁺浓度为1.0mmol/L，在40℃条件下120r/min振荡反应10h。反应结束后，HPLC检测产物异槲皮苷的转化率计算相对酶活提高了18％。

实施例8

以0.2mol/L磷酸氢二钠-0.1mol/L柠檬酸缓冲液，配制pH＝7的0.3g/L的芦丁母液。在芦丁母液中按体积比5％加入10g/L α-L-鼠李糖苷酶液，加入ZnSO₄至Zn²⁺浓度为1.0mmol/L，在40℃条件下120r/min振荡反应10h。反应结束后，HPLC检测产物异槲皮苷的转化率计算相对酶活提高了53％。

Claims

1.强化酶法合成异槲皮苷的方法，其特征在于以0.2mol/L磷酸氢二钠-0.1mol/L柠檬酸缓冲液，配制pH=7的0.3g/L的芦丁母液；在芦丁母液中按体积比5%加入10g/Lα-L-鼠李糖苷酶液，加入ZnSO₄至Zn²⁺浓度为1.0mmol/L，在40℃条件下120r/min振荡反应10h。