CN101709323B

CN101709323B - 生物催化与分离耦合法生产r-扁桃酸

Info

Publication number: CN101709323B
Application number: CN2009101552287A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 薛亚平; 柳志强; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2009-12-10
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2029-12-10
Also published as: CN101709323A

Abstract

本发明提供了一种生物催化与分离耦合法生产R-扁桃酸的方法，所述方法包括：在以外消旋扁桃腈为底物、以腈水解酶为催化剂的反应体系中，于反应开始0～1小时添加10～50g/L的强碱性阴离子交换树脂，于pH8.0～8.5、20～60℃下进行水解反应，当转化体系中的底物外消旋扁桃腈的浓度较低时，在反应体系中继续加入10～100mmol/L的外消旋扁桃腈和10～50g/L的强碱性阴离子交换树脂，在相同条件下进行下一批次的水解反应。本发明提供了一种高效生产R-扁桃酸的方法，通过腈水解酶生物催化与分离偶和技术制备R-扁桃酸，有效解除了产物的抑制作用，利用树脂吸附R-扁桃酸进行耦合转化后，腈水解酶生物催化剂的催化产率大幅度提高，并有利于产物的后续分离。因此，本发明技术具有良好的工业化应用前景。

Description

生物催化与分离耦合法生产R-扁桃酸

(一)技术领域

本发明涉及一种生物催化与分离耦合法生产R-扁桃酸的方法。

(二)背景技术

R-扁桃酸是一种重要的药物中间体，广泛地应用于多种药物的合成，如头孢菌素，青霉素，抗肿瘤制剂，抗肥胖药物、光学纯的氨基酸、血管紧张肽转化酶抑制剂、辅酶A等，还可以用来制成手性溶剂。研究表明，单一构型的扁桃酸(或扁桃酸的衍生物)所合成的药物与外消旋的扁桃酸或其衍生物合成的药物相比，不仅药效更高，更关键的是副作用下降了，因此在许多药物合成方面应用必须要求是单一型化合物；R-扁桃酸由于具有很好的生物分解性，是目前最受瞩目的酸性光学拆分剂，可使多数外消旋体胺类和氨基酸类经非对映体异构盐形成法进行光学拆分，如治咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物可由R型扁桃酸拆分。R-扁桃酸新的用途正在不断被开发，市场需求日益扩大。据不完全统计，国外扁桃酸主要生产公司有德国瓦克公司、日本山川药品公司和日东化学公司等。目前国际市场上光学活性的扁桃酸需求约以年均10％以上的速度增长，已成为热点的精细化工中间体。

制备R-扁桃酸的旋光性单体大致有以下三种方法：不对称合成法、光学异构体拆分法、生物合成法，其中生物合成法为最理想的方法

1、不对称合成法是直接利用化学合成的方法来合成扁桃酸的异构体的一种方法。Blacker等人采用不对称合成法，以TMSCN为氰化剂，Jacobsen催化剂合成了扁桃酸及其衍生物。所得产物的e.e％为65％～85％。但是该法所采用的催化剂价格昂贵，且回收不便，反应条件的要求也比较严格，造成成本过高，难以工业化生产。吴珊珊等人用自制的手性相转移催化剂来催化苯甲醛和氯仿合成手性扁桃酸，但是所得的扁桃酸e.e％都不高，最大的仅为3.4％。

2、光学异构体的拆分是先合成扁桃酸的外消旋体，再采用一定的方法对其进行拆分。国内外已有很多学者尝试用各种途径来制备该物质。其中通过对外消旋扁桃酸的拆分可以得到R-扁桃酸。但是不管用那种拆分的方法，理论收率也只有50％。

3、生物法制备R-扁桃酸大致有三种方法：(1)先合成扁桃酸外消旋体，而后酯化或氨解，获得扁桃酸酯或扁桃酸酰胺，再在酯化水解酶或酰胺水解酶的作用下，得到单一对映体扁桃酸。Ganapati等人首先将外消旋体扁桃酸用交换树脂催化转变为扁桃酸甲酯，而后用假丝酵母中的水解酶立体水解成R-扁桃酸，光学纯度只有78％。(2)以苯乙酮酸为底物直接利用具有氧化还原酶的微生物催化合成手性扁桃酸，多数是形成R-(-)-扁桃酸。Takao M等人利用链球菌、假丝酵母、肠球菌、红酵母、酵母等中的还原酶将苯乙酮酸立体还原为R-扁桃酸，但是收率较低。(3)以扁桃腈，在腈水解酶的作用下，得到R-扁桃酸。目前已报导的含有能催化扁桃腈生产R-扁桃酸腈水解酶的微生物主要有：Alcaligenes faecalisATCC 8750，AlcaligenesECU0401，Pseudomonas putida MTCC 5110等。最近，浙江工业大学郑裕国等人土壤中筛选出一株扁桃腈水解酶菌种，通过诱变育种，得到一株遗传稳定的高活性菌株Alcaligenes faecalisZJUTB10，成功开发了立体选择性腈水解酶生物催化制备R-扁桃酸的工艺。

目前R-扁桃酸的工业生产主要采用化学拆分方法，其生产过程反应步骤多，周期长，反应条件苛刻，副产物多，环境污染大，收率低(＜50％)。利用腈水解酶生物催化外消旋的扁桃腈制备光学活性R-扁桃酸是一种最具前景的方法，外消旋的底物的理论转化率可以达到100％，原料得到充分利用，符合原子经济的要求，具有节省资源的意义。

然而在现有的腈水解酶生物催化外消旋的扁桃腈生产R-扁桃酸的过程中，虽然反应温和、反应速度快，但是通过研究发现，产物扁桃酸对腈水解酶有较强的抑制作用，使菌体使用的批次下降，产物累计浓度不高。如果能及时从反应体系中移去反应产物，可以加快生物催化的速度，提高菌体的使用批次。有效地提高催化剂的催化产率。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种生物催化与原位吸附耦合技术制备R-扁桃酸的方法，该方法能及时的使目标产物R-扁桃酸吸附到树脂上，有效解除产物R-扁桃酸对腈水解酶的抑制作用，实现产物的原位分离，显著提高生物催化剂的催化产率，降低生产成本。

本发明采用的技术方案是：

生物催化与分离耦合法生产R-扁桃酸的方法，所述方法包括：在以外消旋扁桃腈为底物、以腈水解酶为催化剂的反应体系中，于反应开始0～1小时(反应开始前与底物同时添加，或者反应开始后再添加)添加10～50g/L的强碱性阴离子交换树脂，于pH8.0～8.5、20～60℃下进行水解反应，反应结束后，收集强碱性阴离子交换树脂，对强碱性阴离子交换树脂进行洗脱获得所述R-扁桃酸；

所述强碱性阴离子交换树脂的官能团为下列之一：

本发明利用生物催化与分离耦合技术提高R-扁桃酸的产率并同时将产物R-扁桃酸吸附到树脂上，实现产物的原位分离。其原理如下：

所述强碱性阴离子交换树脂为本领域常规含有三甲胺基(I)或二甲基-β-羟基-乙基胺基基团(II型)的强碱性阴离子交换树脂。优选的，所述强碱性阴离子交换树脂为下列之一：HZ202型树脂、201×4型树脂、201×7型树脂、D201型树脂、D202型树脂。本发明利用树脂吸附转化产物以解除产物对腈水解酶的抑制作用，从而提高腈水解酶的催化效率和重复利用的批次，所用的树脂再生后可以重复利用。

当转化体系中的底物外消旋的扁桃腈的浓度低于1mmol/L时，可以在反应体系中在加入10～100mmol/L的底物外消旋的扁桃腈和10～50g/L的阴离子交换树脂，在同样的条件下利用腈水解酶进行转化，重复使用腈水解酶。

所述腈水解酶可由产酶菌株经培养获得，催化剂可以为纯化后的酶液，也可直接以含酶细胞形式参与反应。

所述粪产碱杆菌CCTCC No：M 208168为粪产碱杆菌的突变株粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ZJUTB10，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 208168，保藏日期2008年10月22日，该菌株已作为新菌株在在先申请“微生物催化法生产亚氨基二乙酸及其菌株”(申请号CN200810122191.3)中予以保护。

所述反应体系中底物外消旋扁桃腈的初始浓度为10～100mmol/L。

所述反应体系的溶剂为pH8.0～8.5的水溶液或磷酸盐缓冲液。

所述腈水解酶来自粪产碱杆菌CCTCC No：M 208168培养获得的含酶细胞，反应体系中含酶细胞加入量以所述含酶细胞湿重计1～10g/L。

所述腈水解酶可重复使用，当转化体系中的底物外消旋扁桃腈的浓度低于1mmol/L时，在反应体系中继续加入10～100mmol/L的外消旋扁桃腈和10～50g/L的强碱性阴离子交换树脂，在相同条件下进行下一批次的水解反应。

水解反应结束后，收集强碱性阴离子交换树脂，用质量浓度1～10％的HCl溶液进行洗脱(洗脱速度为0.5～2.0BV/h)，收集含R-扁桃酸的洗脱液，70～100℃真空浓缩，使溶液中的R-扁桃酸浓度达到400mg/ml以上，冷却到0～4℃结晶得到所述R-扁桃酸的晶体。

所述含酶细胞由如下方法制备得到：粪产碱杆菌CCTCC No：M208168接种至适用于粪产碱杆菌的发酵培养基，在培养开始后0～6小时(即培养开始6小时内添加)加入1～5g/L的诱导剂，于20～40℃下培养20～96小时，培养得到的发酵液经分离，得到所述含酶细胞；所述诱导剂为下列之一：正丁腈、异丁腈、己内酰胺。

具体的，所述方法如下：

(1)粪产碱杆菌CCTCC No：M 208168接种至发酵培养基，于20～40℃下培养20～96小时，培养得到的发酵液经分离，得到所述含酶细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下(诱导剂正丁腈直接加入培养基中)：醋酸铵12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠1g/L，硫酸镁0.2g/L，pH7.5，溶剂为水；

(2)将强碱性阴离子交换树脂先用水洗去色素和杂质，然后用体积为树脂体积2倍的1mol/L HCl溶液浸泡24h，用水洗至中性，再用11mol/LNaOH浸泡24h，水洗至中性，用抽滤装置抽干，备用；

(3)将底物外消旋扁桃腈和步骤(1)含酶细胞加入至pH8.0～8.5的水溶液或磷酸盐缓冲液中，底物初始浓度为10～100mmol/L，含酶细胞加入量为1～10g/L，反应开始0～1小时添加10～50g/L的步骤(2)经处理的强碱性阴离子交换树脂，于20～60℃、pH8.0～8.5下进行水解反应；

(4)水解反应结束后，收集强碱性阴离子交换树脂，用质量浓度1～10％的HCl溶液进行洗脱(洗脱速度为0.5～2.0BV/h)，收集含R-扁桃酸的洗脱液，70～100℃真空浓缩，使溶液中的R-扁桃酸浓度达到420mg/ml，冷却到0～4℃下结晶得到所述R-扁桃酸的晶体。

树脂再生方法：洗脱完毕后，用水洗至中性，再3～4倍体积3～5％的氢氧化钠对树脂进行再生，接着以净水清洗至pH值为中性，备用。

本发明中催化剂的催化产率定义为：每小时每克含腈水解酶细胞催化外消旋的扁桃腈生产R-扁桃酸的量。其单位为：mM/(g·h)

本发明中产物的测定方法：

采用高效液相色谱法检测，产物和底物浓度的测定具体色谱条件为：色谱柱为C18硅胶柱(250mm×4.60mm)；流动相组成为10mM磷酸二氢铵∶甲醇(v/v)＝4∶1。柱温为室温；检测波长228nm；流动相流速1ml·min^-1。

产物R-扁桃酸的光学活性采用OD-H手性柱来测定：取离心得到的转化液，用浓盐酸调节pH至1.5，加入等体积乙酸乙酯萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥，干燥后将残余固体溶解于所用的流动相，用于色谱分析。具体色谱条件为：色谱柱为OD-H手性柱(250mm×4.60mm，5μm；Diacel Co.，Japan)；流动相组成为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸(v/v)＝90∶10∶0.1。柱温为室温；检测波长228nm；流动相流速0.8ml·min^-1。R-(-)-扁桃酸的光学纯度通过计算对映体过量值(e.e.％)来评价。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种高效生产R-扁桃酸的方法，通过腈水解酶生物催化与分离偶和技术制备R-扁桃酸，有效解除了产物的抑制作用，利用树脂吸附R-扁桃酸进行耦合转化后，腈水解酶生物催化剂的催化产率大幅度提高。树脂再生后也可以重复使用，因此，本发明技术具有良好的工业化应用前景。

(四)附图说明

图1为转化体系中添加树脂与不添加树脂的生物催化结果对比；

图2为反应体系中补加底物和树脂的生物催化过程。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：含腈水解酶细胞的培养

种子培养基终浓度组成：醋酸铵10g/L，酵母膏6g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠1g/L，硫酸镁0.2g/L，溶剂为水。将CCTCC No：M 208168菌株接种至种子培养基，30℃培养28h，得种子液。

产酶发酵培养基终浓度组成：醋酸铵12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠1g/L，硫酸镁0.2g/L，溶剂为水。

种子液以6％(v/v)的接种量转接至上述发酵培养基中，15L发酵罐中装液量为8L。培养温度为30℃，转速为150rpm，通气量为0.4vvm。培养20h，离心，得到含腈水解酶的菌体。

实施例2：不同树脂型号对催化剂的催化产率的影响。

阴离子树脂的预处理：先用水洗去色素和杂质，然后用两倍体积的1N HCl浸泡24h，用水洗至中性，再用1N NaOH浸泡24h，转化成OH型，水洗至中性，用抽滤装置抽干，备用。

pH8.0的水溶液(用NaOH调节)中加入的湿菌体浓度为5g/l，底物浓度为20mM，然后加入20g/L的不同树脂(购自上海华震科技有限公司)，在30℃，150rpm的条件下进行生物催化反应1h。测定溶液中的R-扁桃酸浓度和ee值，并计算催化剂的催化产率及其产物的光学活性，得到的结果见下表：

树脂型号	HZ202	201×7	201×4	D201	D202
						催化剂是催化产率(mM/g·h)	3.42	3.12	3.02	2.96	2.94
R-扁桃酸的光学活性，ee(％)	＞99	＞99	＞99	＞99	＞99

从以上结果可以看出，添加树脂到转化体系中，产物R-的光学活性都在99％以上。其中，添加HZ202树脂的效果最好。

实施例3：转化体系中不同树脂添加量催化剂的催化产率的影响

pH8.5的磷酸盐缓冲液中加入的湿菌体浓度为5g/l，底物浓度为20mM，然后再分别加入10，20，30，40，50g/L预处理好的HZ202湿树脂，在30℃，150rpm的条件下反应，每隔5分钟取样分析产物和底物的浓度。当底物消耗完毕时停止反应并记录底物转化完所需的反应时间，结果见下表：

添加树脂的量(g/L)	10	20	30	40	50
						底物转化完所需要的时间(min)	90	60	55	55	55
催化剂是催化产率(mM/g·h)	2.28	3.42	3.24	3.22	3.36

实施例4：转化体系中添加树脂与不添加树脂的生物催化过程

为了说明树脂对生物催化过程的影响，进行了催化树脂的反应体系和未加树脂的反应体系中生物催化过程的研究。

加入树脂的反应体系：湿菌体浓度为5g/l，底物浓度为20mM，HZ202加入量为20g/L，溶剂为pH8.5的水溶液(用NaOH调节)。

不加入树脂反应体系：湿菌体浓度为5g/l，底物浓度为20mM，溶剂为pH8.5的水溶液。

以上两种反应体系在30℃，150rpm的条件下反应2h。每隔30分钟取样分析产物浓度，得到的结果如图1：

从图1可以看出，添加树脂的反应体系中，反应60分钟R-扁桃酸的浓度就达到了最大值，催化剂的催化产率是3.42mM/g·h，而在未添加树脂的反应体系中，则需要反应120分钟R-扁桃酸的浓度才达到了最大值，催化剂是催化产率只有1.86mM/g·h。说明添加树脂HZ202后，可以有效抑制产物对生物催化剂的抑制作用，生物催化剂催化反应的速度加快。

实施例5：反应体系中补加底物和树脂的生物催化过程

在1L的体系中进行反应，湿菌体浓度为5g/l，底物浓度为20mM，HZ202加入量为20g/L，溶剂为pH 8.3的水(用NaOH调节)。在30℃，150rpm的条件下反应，每隔1h，向体系中加入2.4ml扁桃腈和2g HZ202树脂继续转化。补料10次，得到的结果如图2。

从图2可以看出，添加树脂后，催化剂可以重复使用，增加了细胞重复利用的批次。产物可以大量积累，有利于工业化生产，并节约了成本。

实施例6：

pH8.5的磷酸盐缓冲液1L中加入的湿菌体5g，底物浓度为20mM，然后再分别加入20g预处理好的HZ202湿树脂，在30℃，150rpm的条件下反应60min；

水解反应结束后，收集强碱性阴离子交换树脂，用质量浓度4％HCl溶液进行洗脱(洗脱速度为2.0BV/h，BV为树脂柱体积)，收集含R-扁桃酸的洗脱液，70～100℃真空浓缩，使溶液中的R-扁桃酸浓度达到420mg/mL，冷却到0～4℃下结晶，得到R-扁桃酸的晶体，收率81％。

Claims

1.生物催化与分离耦合法生产R-扁桃酸的方法，所述方法包括：在以外消旋扁桃腈为底物、以腈水解酶为催化剂的反应体系中，于反应开始0～1小时添加10～50g/L的强碱性阴离子交换树脂，于pH8.0～8.5、20～60℃下进行水解反应，反应结束后，收集强碱性阴离子交换树脂，对强碱性阴离子交换树脂进行洗脱获得所述R-扁桃酸；

所述腈水解酶来自粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)CCTCC No：M208168培养获得的含酶细胞，反应体系中含酶细胞加入量以所述含酶细胞湿重计为1～10g/L；

所述强碱性阴离子交换树脂的官能团为下列之一：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述强碱性阴离子交换树脂为下列之一：HZ202型树脂、201×4型树脂、201×7型树脂、D201型树脂、D202型树脂。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应体系中底物外消旋扁桃腈的初始浓度为10～100mmol/L。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应体系的溶剂为pH8.0～8.5的水溶液或磷酸盐缓冲液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述腈水解酶重复使用，当转化体系中的底物外消旋扁桃腈的浓度低于1mmol/L时，在反应体系中继续加入10～100mmol/L的外消旋扁桃腈和10～50g/L的强碱性阴离子交换树脂，在相同条件下进行下一批次的水解反应。

6.如权利要求1所述的方法，特征在于所述方法进一步包括：收集含R-扁桃酸的洗脱液，70～100℃真空浓缩，使溶液中的R-扁桃酸浓度达到400mg/ml以上，冷却到0～4℃下结晶得到所述R-扁桃酸的晶体。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述含酶细胞由如下方法制备得到：粪产碱杆菌CCTCC No：M 208168接种至适用于粪产碱杆菌的发酵培养基，在培养开始后0～6小时加入1～5g/L的诱导剂，于20～40℃下培养20～96小时，培养得到的发酵液经分离，得到所述含酶细胞；所述诱导剂为下列之一：正丁腈、异丁腈、己内酰胺。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)粪产碱杆菌CCTCCNo：M 208168接种至发酵培养基，于20～40℃下培养20～96小时，培养得到的发酵液经分离，得到所述含酶细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下：醋酸铵12.14g/L，酵母膏7.79g/L，正丁腈3.29g/L，磷酸氢二钾5g/L，氯化钠1g/L，硫酸镁0.2g/L，pH7.5，溶剂为水；

(4)水解反应结束后，收集强碱性阴离子交换树脂，用质量浓度1～10％的HCl溶液进行洗脱，收集含R-扁桃酸的洗脱液，70～100℃真空浓缩，使溶液中的R-扁桃酸浓度达到420mg/ml，冷却到0～4℃下结晶得到所述R-扁桃酸的晶体。