CN101597626A - 生物催化制备(s)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸的方法 - Google Patents
生物催化制备(s)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种生物催化制备(S)－(+)－2，2－二甲基环丙烷甲酸的新方法，所述方法以2，2－二甲基环丙烷甲酸乙酯为底物，以Novozym 435脂肪酶为生物催化剂，在水相反应体系中于pH 6.0～8.0、25～45℃下进行生物催化不对称水解反应，反应完全后，反应液经分离得到(S)－(+)－2，2－二甲基环丙烷甲酸。采用Novozym 435脂肪酶催化2，2－二甲基环丙烷甲酸乙酯的不对称水解反应，酶的专一性强，催化效率高，无副产物形成，且产物的光学纯度和产率均较化学法高。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种脂肪酶酶法催化2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解合成西司他丁关键手性中间体(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的方法。
(二)背景技术
S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸是合成西司他丁的重要手性中间体。西司他丁(Cilsatatin)化学名：(+)-(Z)-7-[(2R)-(2-氨基-2-羧基乙基)硫]-2-[(1S)-(2，2-二甲基环丙烷甲酰胺基)]-2-庚烯酸，是第一个应用于临床的肾脱氢二肽酶抑制剂。西司他丁与碳青霉烯类抗生素亚胺培南(Imipenem)制成的复合剂泰能(Tienam)既有极强的广谱抗菌活性，又具β-内酰胺酶抑制作用，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、需氧菌和厌氧菌均有较强的抗菌作用，特别适用于治疗多种菌联合感染以及需氧菌和厌氧菌的混合感染，是目前临床应用最广泛的抗生素和治疗未知重症感染的王牌药物之一。泰能于1985年11月由美国默沙东公司首先上市。2006年该产品的世界市场销售额为7.05亿美元，在全球畅销处方药排名第146位；2007年世界市场销售额达7.46亿美元，比上年增长8％；2008年上半年为4.4亿美元，比上年同期增长6％。目前国内该药品主要依赖进口。西司他丁作为一种特异性酶抑制剂，本身没有抗菌活性，它不但能有效地保护亚胺培南免遭体内肾脱氢肽酶(DPH-I)的破坏，继而增加泌尿道中未经改变的亚胺培南浓度，同时增强了亚胺培南的抗菌活性。西司他丁还可阻抑亚胺培南进入肾小管上皮组织，减少亚胺培南的排泄并减轻药物的肾毒性。
2，2-二甲基环丙烷甲酸衍生物也是合成拟除虫菊酯类杀虫剂的关键中间体，目前已有近50个品种，产量已占杀虫剂类产量的20％，发展前景广阔。
光学纯2，2-二甲基环丙烷甲酸的制备技术已成为近年来的研究热点。国内目前多采用化学法合成消旋产物，然后通过拆分得到S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸。如有报道以异戊烯酸为原料，经酸的酯化、烯键的环丙烷化、酯水解制得2，2-二甲基环丙烷甲酸，收率为44.1％。其中，环丙烷化反应采用锌粉/氯化亚铜-乙酰氯作为催化剂，二溴甲烷作为环丙烷化试剂，这样可以在温和的条件下进行反应，降低成本。此外用L-肉碱草酸盐作为手性拆分试剂，经酰化、成盐、部分结晶、水解得到S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸，收率为16.7％，手性纯度大于95％。此路线环境友好、成本较低，但工艺步骤多，收率非常低。近年来也有采用微生物水解其它种类底物得到S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸或S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺的报道，如：王梅祥等人(Enzymatic synthesis of optically active2-methyl-and 2，2-dimethylcyclopropanecarboxylic acids and theirderivatives.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 2002，18：267-272)利用从土壤中筛选的Rhodococcus sp.AJ270菌种水解2，2-二甲基环丙烷甲腈得到S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸，产物e.e.值和水解拆分率分别为82％和39％。金少军等(R-enantioselective hydrolysisof 2，2-dimethylcyclopropanecar-boxamide by amidase from a newlyisolated strain Brevibacterium epidermidis ZJB-07021.Journal ofApplied Microbiology 2008，105：1150-1157)以2，2-二甲基环丙烷甲酰胺为底物，利用产R型专一性酰胺酶的表皮短杆菌Brevibacteriumepidermidis进行不对称拆分得到S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺，拆分得率为41.1％，目标物e.e.值为99％。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种利用具有高立体选择性、专一性强的脂肪酶不对称水解2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯制备(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的新方法。
本发明采用的技术方案是：
一种生物催化不对称水解制备式(I)所示(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的新方法，所述方法以式(II)所示的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯为底物，以Novozym 435脂肪酶为生物催化剂，在水相反应体系中于pH 6.0～8.0、25～45℃下进行生物催化不对称水解反应，反应完全后，反应液经分离得到(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸产物。本发明催化2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解的反应过程如下：
(II) (I)
所述的Novozym 435脂肪酶购自丹麦诺维信公司(Novozymes，Denmark)。
本发明所述的水相反应体系通常可以是pH 6.0～8.0的磷酸盐缓冲液体系，即所述的反应是将2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯与Novozym435脂肪酶加入pH值为6.0～8.0的磷酸缓冲液中进行反应，通常反应条件为：摇床转速为200r/min，pH 6.0～8.0、25～45℃，所述的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的添加量为25mmol～140mmol/L磷酸缓冲液，所述的Novozym 435脂肪酶添加量为10g～28g/L磷酸缓冲液。
为提高本发明的反应速率，通常在本发明所述的水相反应体系中加入一定量的表面活性剂来制备得到(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸产物。加入表面活性剂后使表面活性剂在反应体系中的终浓度为1％～5％(wt，重量百分数)。所述的表面活性剂为下列之一：四丁基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠(AOT)、十二烷基硫酸钠(SDS)、吐温-20(Tween-20)、吐温-60(Tween-60)、吐温-80(Tween-80)、辛基苯酚聚氧乙烯醚(乳化剂OP-10)。
进一步，本发明优选的表面活性剂为2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠(AOT)。优选所述的反应体系中加入AOT的终浓度为2.5％wt。
再进一步本发明反应体系中所述的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的添加量优选为100mol/L磷酸缓冲液，所述的Novozym 435脂肪酶添加量优选为16g/L磷酸缓冲液。
本发明进行生物催化不对称水解反应后，所述的分离纯化方法为：用碱液调节反应液pH值至9.0左右，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取萃余液，用酸调节萃余液pH至2.0左右，加入与萃余液等体积的乙酸乙酯萃取一次或两次，取乙酸乙酯层，挥发除去乙酸乙酯后即得产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸。
具体的，所述方法为：以2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯为底物，以Novozym 435脂肪酶为生物催化剂，首先将一定量的表面活性剂(2.5％wt)溶于1.0mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0～8.0，优选为pH 7.2)中，然后加入一定量的酶和底物2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯，酶加量优选为16g/L缓冲液，底物添加量优选为100mmol/L缓冲液，摇床转速为200r/min，于30℃下进行生物催化不对称水解反应；反应完全后，以浓度为2mol/L的NaOH溶液调节反应液pH至9.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取萃余液，然后以浓度为2mol/L的HCl溶液调节萃余液pH至2.0，加入与萃余液等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，挥发除去乙酸乙酯后即得所述的(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸产物。
本发明的有益效果在于，采用脂肪酶催化2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的不对称水解反应时，酶的专一性强，催化效率高，无副产物形成，且产物的光学纯度和产率均较化学法高。由于底物2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的溶解性偏低，加入表面活性剂有利于底物增溶，尽管所得产物的光学纯度略有降低，但达到相近产率所需的反应时间可由64h缩短至20h。
本发明中所述的产物产率和产物e.e.值测定采用气相色谱法。反应结束后反应液用等体积乙酸乙酯萃取，定容后采用气相色谱分析。
本发明中所用手性色谱柱为CP-Chirasil-Dex CB(25m×0.25mm；Varian Co.，USA)。
色谱条件为：
载气为氮气；检测器为氢火焰离子检测器；进样口温度和检测器温度为250℃；柱温为程序升温：80℃保留3min，然后以8℃/min升温至180℃，保留3min；流速为2ml/min；分流比为15。
底物和产物e.e.值计算方法为：
反应后的底物e.e.值：eeS＝|(SS-SR)/(SS+SR)|×100％。
产物e.e.值：eeP＝|(SSP-SRP)/(SSP+SRP)|×100％。
SS为反应后S型底物的峰面积；SR为反应后R型底物的峰面积；SSP为反应后S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的峰面积；SRP为反应后R-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的峰面积。
产率计算方法为：
内标法：以十二烷为内标物，测得产物浓度标准曲线。测定时在样品中加入一定量的十二烷为内标物，根据内标物浓度计算得出产物浓度。
产率＝np/nso×100％
np为S-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸浓度，ns0为初始底物浓度。
底物和产物标准品的气相色谱图见图1。
(四)附图说明
图1为底物和产物标准品的气相色谱图，S型产物为目标产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸；
图中S型底物，R型底物，S型产物，R型产物的保留时间分别约为：3.69min、3.92min、9.42min和9.77min。
图2为实施例1所得产物的气相色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所有的实施例都是指在10ml磷酸缓冲液体系中进行的反应。
实施例1：(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的制备
平行称取三份150mg Novozym 435脂肪酶置25ml锥形瓶中，分别加入10ml pH为7.0的磷酸缓冲液，然后各加入0.25mmol的底物2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯进行不对称水解反应。反应条件为：摇床转速200r/min，转化温度30℃，转化时间40h。反应结束后，合并三份反应液，取10ml反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次，定容至20ml，以气相色谱分析，如图2所示。产率的计算采用内标法，产物e.e.值和产率分别为94.65％和38.36％。余下的反应液按以下方法分离：以浓度为2mol/L的NaOH溶液调节反应液pH至9.0，加入与反应液等体积的乙酸乙酯萃取，弃乙酸乙酯层，取萃余液，然后用2mol/L的HCl溶液调节萃余液pH至2.0，加入与萃余液等体积的乙酸乙酯萃取两次，取乙酸乙酯层，挥发除去乙酸乙酯得产物。
实施例2～7：
参照实施例1的方法，加入表1中所列不同浓度的底物，其他条件相同，摇床转速200r/min，考察底物浓度对不对称水解反应的影响，表1中底物浓度为每1升磷酸缓冲液加入2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的毫摩尔数，酶浓度为每1升磷酸缓冲液加入Novozym 435脂肪酶的克数，pH值为磷酸缓冲液的初始pH，表中的转化时间即反应时间，转化温度即反应温度。反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次后定容至20ml，采用气相色谱分析，结果见表1：
表1
实施例8～14
参照实施例1方法，在反应体系中加入Novozym 435脂肪酶的浓度不同，具体如表2中所列，其他条件相同，摇床转速200r/min，考察酶浓度对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解反应的影响，表2中底物浓度为每1升磷酸缓冲液加入2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的毫摩尔数，酶浓度为每1升磷酸缓冲液加入Novozym 435脂肪酶的克数，pH值为磷酸缓冲液的初始pH。反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次后定容至20ml，采用气相色谱分析，结果见表2：
表2
实施例15～21
参照实施例1的方法，改变反应体系中初始磷酸缓冲液的pH值，如表3所示，其他条件相同，摇床转速200r/min，考察缓冲液pH值对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解反应的影响，表3中底物浓度为每1升磷酸缓冲液加入2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的毫摩尔数，酶浓度为每1升磷酸缓冲液加入Novozym 435脂肪酶的克数，pH值为磷酸缓冲液的初始pH。反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次后定容至20ml，采用气相色谱分析，结果见表3：
表3
实施例22～26
参照实施例1的方法，改变反应体系的转化温度，其他条件相同，摇床转速200r/min，考察转化温度对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解反应的影响，表4中底物浓度为每1升磷酸缓冲液加入2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的毫摩尔数，酶浓度为每1升磷酸缓冲液加入Novozym 435脂肪酶的克数，pH值为磷酸缓冲液的初始pH。反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次后定容至20ml，采用气相色谱分析，结果见表4：
表4
实施例27～33
参照实施例1的方法，改变水解反应的时间如表5所示，其他条件相同，摇床转速200r/min，考察转化时间对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解的影响，表5中底物浓度为每1升磷酸缓冲液加入2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的毫摩尔数，酶浓度为每1升磷酸缓冲液加入Novozym 435脂肪酶的克数，pH值为磷酸缓冲液的初始pH。反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次后定容至20ml，采用气相色谱分析，结果见表5：
表5
实施例34～39
参照实施例1的方法，转化反应结束后，通过过滤法回收固定化酶，经磷酸缓冲液洗涤后将其用于再次的不对称水解反应，其他反应条件相同，摇床转速200r/min，考察固定化脂肪酶催化2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解反应的重复利用情况，表6中底物浓度为每1升磷酸缓冲液加入2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的毫摩尔数，酶浓度为每1升磷酸缓冲液加入Novozym 435脂肪酶的克数，pH值为磷酸缓冲液的初始pH。反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次后定容至20ml，采用气相色谱分析，结果见表6：
表6
实施例40添加表面活性剂四丁基溴化铵以增加底物溶解性，提高酶催化不对称水解2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的反应速率。
称取100mg四丁基溴化铵溶于10ml pH 7.2的磷酸缓冲液中，加入100mmol的底物2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯，酶加量为160mg，在25ml锥形瓶中进行酶催化反应。反应温度为30℃，摇床转速200r/min，反应24h。反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次，定容至20ml，进行气相色谱分析，产物e.e.值为96.25％，产率为42.32％。
实施例41～47
参照实施例40的方法，改变表面活性剂种类，摇床转速200r/min，考察不同表面活性剂种类对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解反应的影响，表7中底物浓度为每1升磷酸缓冲液加入2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的毫摩尔数，酶浓度为每1升磷酸缓冲液加入Novozym435脂肪酶的克数，磷酸缓冲液的初始pH均为7.2。反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次后定容至20ml，采用气相色谱分析，结果见表7：
表7
实施例48～53
参照实施例40的方法，在反应体系中加入表面活性剂AOT的终浓度不同，考察AOT加量对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解反应的影响，表8中底物浓度为每1升磷酸缓冲液加入2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的毫摩尔数，酶浓度为每1升磷酸缓冲液加入Novozym435脂肪酶的克数，磷酸缓冲液的初始pH均为7.2。反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次后定容至20ml，采用气相色谱分析，结果见表8：
表8
实施例54～58
参照实施例40的方法，在反应体系中加入终浓度相同的表面活性剂AOT，改变加入的底物浓度，考察底物浓度对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解反应的影响，表9中底物浓度为每1升磷酸缓冲液加入2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的毫摩尔数，酶浓度为每1升磷酸缓冲液加入Novozym 435脂肪酶的克数，磷酸缓冲液的初始pH均为7.2。反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次后定容至20ml，采用气相色谱分析，结果见表9：
表9
实施例59～63
参照实施例40的方法，改变生物转化反应的时间，考察转化时间对2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称水解反应的影响，表10中底物浓度为每1升磷酸缓冲液加入2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的毫摩尔数，酶浓度为每1升磷酸缓冲液加入Novozym 435脂肪酶的克数，磷酸缓冲液的初始pH均为7.2。反应结束后，反应液用等体积乙酸乙酯萃取两次后定容至20ml，采用气相色谱分析，结果见表10：
表10
本发明为一种生物催化不对称水解制备(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的方法，以脂肪酶Novozym 435为生物催化剂，在1.0mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液中加入16g/L的脂肪酶Novozym 435和65mmol/L的底物2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯，在30℃、200r/min下反应64h，产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的e.e.值为99.16％，产率达45.57％。当在缓冲液中加入终浓度为2.5％wt的阴离子表面活性剂AOT时，可以提高底物2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯在磷酸盐缓冲液中的溶解性，并提高脂肪酶Novozym 435的催化反应速率。当脂肪酶Novozym 435加量为16g/L，底物2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯浓度为100mmol/L时，30℃、200r/min条件下转化20h，产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的e.e.值为98.74％，产率达45.13％。
Claims (10)
1.一种生物催化制备式(I)所示(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸的新方法，所述方法以式(II)所示的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯为底物，以Novozym 435脂肪酶为生物催化剂，在水相反应体系中于pH 6.0～8.0、25～45℃下进行生物催化不对称水解反应，反应完全后，反应液经分离得到(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸产物，
2.如权利要求1所述的新方法，其特征在于所述的反应是将2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯与Novozym 435脂肪酶加入pH值为6.0～8.0的磷酸缓冲液中反应，所述的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的添加量为25mmol～140mmol/L磷酸缓冲液，所述的Novozym 435脂肪酶添加量为10g～28g/L磷酸缓冲液。
3.如权利要求1或2所述的新方法，其特征在于所述的反应体系中还加入终浓度为1％～5％wt的表面活性剂。
4.如权利要求3所述的新方法，其特征在于所述的表面活性剂为下列之一：四丁基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、吐温-20、吐温-60、吐温-80、辛基苯酚聚氧乙烯醚。
5.如权利要求4所述的新方法，其特征在于所述的优选的表面活性剂为2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠。
6.如权利要求3所述的新方法，其特征在于所述的反应体系中加入2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠的终浓度为2.5％wt。
7.如权利要求3所述的新方法，其特征在于所述的2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的添加量为100mmol/L磷酸缓冲液，所述的Novozym 435脂肪酶添加量为16g/L磷酸缓冲液，所述的磷酸缓冲液的摩尔浓度为1.0mol/L。
8.如权利要求1～7所述的新方法，其特征在于所述的反应时间为12～88h。
9.如权利要求1所述的新方法，其特征在于所述的分离方法为：调节反应液pH至9.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取萃余液，然后调节萃余液pH至2.0，加入与萃余液等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，挥发除去乙酸乙酯后即得所述的(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸。
10.如权利要求9所述的新方法，其特征在于所述的分离方法在调节萃余液pH至2.0后，加入与萃余液等体积的乙酸乙酯萃取两次，取乙酸乙酯层，挥发除去乙酸乙酯后即得所述的(S)-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20091209 |