CN105567584A - 一种能拆分（＋/-）γ-内酰胺得到（+）γ-内酰胺的芽孢杆菌及其筛选和应用 - Google Patents

一种能拆分（＋/-）γ-内酰胺得到（+）γ-内酰胺的芽孢杆菌及其筛选和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌及用其拆分(+/-)γ-内酰胺的方法；本发明方法利用从土壤中筛选获得的能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的微生物菌株，鉴定为阿氏芽胞杆菌(Bacillus？aryabhattai？C4)；其在水相体系中立体选择性水解(+/-)γ-内酰胺，制备(+)γ-内酰胺。在300g/L底物浓度条件下，经萃取、干燥、蒸发浓缩、冷却结晶得到产物(+)γ-内酰胺的光学纯度(Ee值)为95.0％～99.9％，化学纯度为95％～99％。该微生物催化不对称水解(+/-)γ-内酰胺制备(+)γ-内酰胺的方法具有高立体选择性、高反应产率和高产物浓度的特点。

Description

一种能拆分（＋/-）γ-内酰胺得到（+）γ-内酰胺的芽孢杆菌及其筛选和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌，该芽孢杆菌为阿氏芽胞杆菌(BacillusaryabhattaiC4)。
背景技术
γ-内酰胺的两个光学对映体都是许多碳环核苷类似物合成的手性前体。趋化因子受体抗结剂MK-0812和糖尿病候选药物美格列汀，可由(+)γ-内酰胺合成。产物(+)γ-内酰胺经溴化进行骨架重排生成(-)γ-内酰胺，以光学纯的(-)γ-内酰胺为起始化合物的酶化学合成方法，是合成阿巴卡韦和帕拉米韦这两种治疗艾滋病和禽流感及甲流感的特效药物的最简便、经济的方法。
在发现微生物能选择性拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺之前，文献报道的制备光学纯的(+)γ-内酰胺一般采用化学不对称合成的方法。使用这种方法的缺点在于：原料昂贵，步骤烦琐，成本较高，且会造成较严重的环境污染，同时产物中通常含有金属杂质。与此形成鲜明对比的是，用微生物进行催化合成光学纯的(+)γ-内酰胺具有反应条件温和效率高，产物纯度高及对环境友好的特点。有关该方法的研究主要集中在筛选高对映选择性的拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的生产菌株，暂无相关报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的之一在于提供一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌。
该芽孢杆菌为阿氏芽胞杆菌(BacillusaryabhattaiC4)，于2015年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM2015597，保藏 单位地址：中国武汉武汉大学。
本发明的目的之二是提供了所述能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌的培养方法。
本发明的目的之三是提供了所述芽孢杆菌拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌；其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCCM2015597。
所述芽孢杆菌的筛选，具体为：
(1)初培养：从湖底取污泥，用无菌水稀释后涂布于培养基上，30℃培养2天；
所述初筛培养的培养基为：NH4CL2.0～10g，KH2PO40.01～10g，Na2HPO40.01～10g，MgSO40.01～1g，CaCL20.01～0.5g，(+/-)γ-内酰胺1～10g，微量元素100μL，琼脂粉10～30g；其中微量元素按照每升加入量计算包括：CaCL2·2H2O3.6g，ZnO2.0g，CuCL·2H2O0.85g，NaMoO·2H2O4.8g，MnCL2·4H2O2.0g，FeCL3.6H2O5.4g，CoCL2.6H2O2.4g；
(2)挑取单菌落再次在筛选培养基上划线分离纯化单菌落；
挑取单菌落形态特征为：菌落扁平，边缘锯齿状，黄色，菌落内部有一圆形结构，革兰氏染色呈阳性，显微镜下呈棒状，有中生芽孢；
(3)发酵产酶培养：先将步骤(2)中所述挑取出来的单菌落继续进行发酵产酶培养1～3天，所述发酵产酶培养基组成以g/L计为：葡萄糖5.0g，NH4CL2.0～10g，KH2PO40.01～10g，Na2HPO40.01～10g，MgSO40.01～1g，CaCL20.01～0.5g，(+/-)γ-内酰胺2g，FeSO40.08g；
(4)将上述发酵产酶培养的菌液进行离心获得所述能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌，备用。
较佳地，步骤(1)中所述污泥取自艾溪湖。
较佳地，所述步骤(1)中其中初培养的温度20～40℃，pH3～10。
能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的方法，采用能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的微生物菌株，在水相体系中，以(+/-)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备得到所述(+)γ-内酰胺。
具体步骤如下：
(1)微生物菌株：所述能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌；
(2)先将步骤(1)中所述的芽孢杆菌进行离心获得湿菌体备用；
(3)拆分体系的配制：用磷酸盐缓冲液配制2g/L～600g/L的(+/-)γ-内酰胺；
(4)拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺：将步骤(3)的配制好的(+/-)γ-内酰胺加入到在步骤(2)的湿菌体中进行反应；
(5)拆分液的处理和分析：将步骤(4)中所得微生物拆分反应之后的液体，离心除去菌体，取上清液采用乙酸乙酯萃取，萃取液稀释后进行手性HPLC检测；色谱柱型号为Daicel公司CHIRALPAKAS-H250×4.6mm；流动相为异丙醇/乙腈(v/v)＝80/20；流速0.5mL/min；检测波长230nm。
(6)产物的分离提取：采用二氯甲烷萃取步骤(5)中所得菌体，并依次经过干燥、蒸发浓缩、冷却结晶，最后得到所述的(+)γ-内酰胺。
较佳地，所述步骤(3)中磷酸盐缓冲液的pH3～10，浓度为0.01～0.5mol/L。
较佳地，所述步骤(4)中菌体终浓度为0.5g/L～100g/L湿菌体，反应温度为20～60℃，反应时间为1～24h，摇床转速为100～300rpm。
较佳地，所述步骤(5)中在20～80℃下蒸发浓缩、1～4℃下冷却结晶。
较佳地，所述步骤(6)中所述(+)γ-内酰胺的光学纯度(Ee值)95.0％～100％，化学纯度为95％～99％。
本发明利用筛选获得的具有高对映选择性的拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌(BacillusaryabhattaiC4)，在水相体系中选择性水解外消旋γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺，在300g/L底物浓度条件下，产物(+)γ-内酰胺的光学纯度(Ee值)达到100％，产物经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶得到光学纯的(+)γ-内酰胺，产物光学纯度(Ee值)为95.0％～99.9％，化学纯度为95％～99％。该微生物催化不对称水解制备(+)γ-内酰胺的方法具有高立体选择性、高反应产率、高产物浓度的特点。
附图说明
图1为本发明中芽孢杆菌的显微镜(1000X)观察照片，
图2为本发明芽孢杆菌的平板菌落形态。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式做一个详细的说明。
实施例1
1.能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌的筛选：
(1)初培养：从艾溪湖底取污泥，用无菌水稀释后涂布于培养基上，30℃培养2天；
所述初筛培养基为：NH4CL2.0g，KH2PO41.5g，Na2HPO41.5g，MgSO40.2g，CaCL20.1g，(+/-)γ-内酰胺2g，微量元素100μL，琼脂粉20g；其中微量元素按照每升加入量计算包括：CaCL2·2H2O3.6g，ZnO2.0g，CuCL·2H2O0.85g，NaMoO·2H2O4.8g，MnCL2·4H2O2.0g，FeCL3.6H2O5.4g，CoCL2·6H2O2.4g；
(2)挑取单菌落再次在筛选培养基上划线分离纯化单菌落；
挑取单菌落形态特征为：菌落扁平，边缘锯齿状，黄色，菌落内部有一圆形结构，革兰氏染色呈阳性，显微镜下呈棒状，有中生芽孢；
(3)发酵产酶培养：先将步骤(2)中所述挑取出来的单菌落继续进行发酵产酶培养1～3天，所述发酵产酶培养基组成以g/L计为：葡萄糖5g，NH4CL2.0g，KH2PO42g，Na2HPO47g，MgSO40.4g，CaCL20.01g，(+/-)γ-内酰胺2g，FeSO40.08g；再将上述发酵液离心获得湿菌体备用；
(4)将上述发酵产酶培养的菌液进行离心获得所述能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌，备用。
2.拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的方法：
(1)微生物菌株：上述芽孢杆菌；
(2)先将步骤(1)中所述的芽孢杆菌进行离心获得湿菌体备用；
(3)拆分体系的配制：用磷酸盐缓冲液配制2g/L的(+/-)γ-内酰胺；磷酸盐缓冲液的pH7，浓度为0.5mol/L。
(4)拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺：将步骤(3)的配制好的(+/-)γ-内酰胺加入到在步骤(2)的湿菌体中进行反应；菌体终浓度为60g/L湿菌体，反应温度为30℃，反应时间为5h，摇床转速为200rpm；
(5)拆分液的处理和分析：将步骤(4)中所得微生物拆分反应之后的液体，离心除去菌体，取上清液采用乙酸乙酯萃取，萃取液稀释后进行手性HPLC检测；色谱柱型号为Daicel公司CHIRALPAKAS-H250×4.6mm；流动相为异丙醇/乙腈(v/v)＝80/20；流速0.5mL/min；检测波长230nm。
(6)产物的分离提取：采用二氯甲烷萃取步骤(5)中所得菌体，并依次经过干燥、在40℃下蒸发浓缩、2℃下冷却结晶，最后得到所述的(+)γ-内酰胺；其光学纯度(Ee值)为95.0％～100％，化学纯度为95％～99％。
实施例2
同实施例1，不同之处在于：
1.能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌的筛选：
所述初筛培养基为：NH4CL10g，KH2PO40.01g，Na2HPO40.01g，MgSO40.01g，CaCL20.01g，(+/-)γ-内酰胺1g。
所述的芽孢杆菌进行微生物发酵产酶培养1天，培养温度40℃，pH3，所述微生物发酵产酶培养基组成以g/L计为：葡萄糖5.0g，NH4CL10g，KH2PO40.01g，Na2HPO40.01g，MgSO40.01g，CaCL20.01g，(+/-)γ-内酰胺2g，FeSO40.08g；再将上述发酵液离心获得湿菌体备用。
2.拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的方法：
(3)拆分体系的配制：用磷酸盐缓冲液配制600g/L的(+/-)γ-内酰胺；磷酸盐缓冲液的pH3，浓度为0.01mol/L。
(4)拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺：将步骤(3)的配制好的(+/-)γ-内酰胺加入到在步骤(2)的湿菌体中进行反应；菌体终浓度为0.5g/L湿菌体，反应温度为20℃，反应时间为1h，摇床转速为100rpm。
(6)在20℃下蒸发浓缩、1℃下冷却结晶。
实施例3
同实施例1，不同之处在于：
1.能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌的筛选：
所述初筛培养基为：NH4CL2.0g，KH2PO410g，Na2HPO410g，MgSO4～1g，CaCL20.01g，(+/-)γ-内酰胺1g。
所述的芽孢杆菌进行微生物发酵产酶培养1～3天，培养温度20℃，pH10，所述微生物发酵产酶培养基组成以g/L计为：葡萄糖5.0g，NH4CL10g，KH2PO410g，Na2HPO40.01g，MgSO40.01g，CaCL20.5g，(+/-)γ-内酰胺2g，FeSO40.08g；再将上述发酵液离心获得湿菌体备用。
2.拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的方法：
(3)拆分体系的配制：用磷酸盐缓冲液配制2g/L的(+/-)γ-内酰胺；磷酸盐缓冲液的pH10，浓度为0.5mol/L。
(4)拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺：将步骤(3)的配制好的(+/-)γ-内酰胺加入到在步骤(2)的湿菌体中进行反应；菌体终浓度为100g/L湿菌体，反应温度为60℃，反应时间为24h，摇床转速为300rpm。
(6)在80℃下蒸发浓缩、4℃下冷却结晶。
实施例4
同实施例1，不同之处在于：
1.能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌的筛选：
所述初筛培养基为：NH4CL5g，KH2PO41g，Na2HPO45g，MgSO42g，CaCL20.2g，(+/-)γ-内酰胺2g。
所述的芽孢杆菌进行微生物发酵产酶培养2天，培养温度35℃，pH5，所述微生物发酵产酶培养基组成以g/L计为：葡萄糖5.0g，NH4CL5g，KH2PO45g，Na2HPO45g，MgSO40.5g，CaCL20.1g，(+/-)γ-内酰胺2g，FeSO40.08g；再将上述发酵液离心获得湿菌体备用。
2.拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的方法：
(3)拆分体系的配制：用磷酸盐缓冲液配制20g/L的(+/-)γ-内酰胺；磷酸盐缓冲液的pH5，浓度为0.2mol/L。
(4)拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺：将步骤(3)的配制好的(+/-)γ-内酰胺加入到在步骤(2)的湿菌体中进行反应；菌体终浓度为20g/L湿菌体，反应温度为50℃，反应时间为7h，摇床转速为250rpm。
(6)在68℃下蒸发浓缩、3℃下冷却结晶。
上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述的特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求范围之内。
相关实验：
一、不同碳源对发酵产酶的影响
产酶培养基以2g/lNH4CL为氮源，按5g/L浓度分别添加下列碳源:乳糖、淀粉、棉子糖、葡萄糖、牛肉膏、柠檬酸、蔗糖、柠檬酸钠、木糖和甘油。30℃、220r/min培养48h的菌体进行拆分转化实验。考察不同碳源对菌株芽孢杆菌(BacillusaryabhattaiC4)发酵产酶、产物光学纯度和底物转化率的影响。
表1碳源对发酵产酶的影响
由表1可以看出：碳源对菌体的生物量影响较大，对Ee值和转化率都有较大影响。其中产酶培养基以葡萄糖、牛肉膏、柠檬酸、柠檬酸钠、木糖和甘油为碳源时菌体都不生长，而以淀粉、棉子糖和蔗糖为碳源生物量较比较高，以乳糖为碳源的生物量要小很多。其中蔗糖为碳源的产酶培养基培养后的菌体的转化Ee值达到96.7％，转化率达到71.4％。
二、不同氮源对发酵产酶的影响
产酶培养基以5g/l葡萄糖为碳源，按2g/l分别添加下列氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵、销酸铵、磷酸氢二铵、硝酸钾、草酸铵、柠檬酸氢二铵和碳酸氢铵。30℃、220r/min培养48h的菌体进行拆分转化实验。考察不同氮源对菌株芽孢杆菌(BacillusaryabhattaiC4)发酵产酶、产物光学纯度和底物转化率的影响。结果见表2。
表2氮源对发酵产酶的影响
从表2可以看出：氮源对菌体的生物量影响较大，对Ee值和转化率都有较大影响。其中产酶培养基以牛肉膏、尿素、销酸铵、磷酸氢二铵、硝酸钾、草酸铵和柠檬酸氢二铵为氮源，菌体不生长。以硫酸铵为氮源时，菌体生物量较小，Ee值为63％和转化率为58.8％，以蛋白胨为氮源时，菌体生物量较高，Ee值达到100％，转化率为65.9％。
三、培养温度对发酵产酶的影响
温度是影响细胞生长和发酵产酶的一个重要因素，考察了不同发酵温度对芽孢杆菌(BacillusaryabhattaiC4)菌株的菌体产量及酶活的影响，结果见表3。
表3培养温度对发酵产酶的影响
表3可以看出：温度对生物量和酶活均有一定的影响，当菌体培养温度为30℃时，生物量和酶活最高，故以30℃为最适发酵温度。
四、培养基初始pH对发酵产酶的影响
细胞生长以及菌体各种酶的活性都会受到培养基的初始pH的调节作用。为考察初始pH对芽孢杆菌(BacillusaryabhattaiC4)菌株产酶的影响，将发酵培养基调至不同的pH，对培养获得的菌体进行拆分(+/-)γ-内酰胺的实验。
表4培养基初始pH对菌体生长和产酶的影响
结果见表4，从表中可看出：培养基的初始pH对芽孢杆菌的生物量和转化率影响比较大，从pH5.0～10.0的培养基菌体都能生长，且Ee值和转化率以PH7最高。
五、转化温度对菌株拆分(+/-)γ-内酰胺产生(+)γ-内酰胺的影响
转化温度对菌株拆分(+/-)γ-内酰胺产生(+)γ-内酰胺的影响结果见表5。
表5转化温度对拆分(+/-)γ-内酰胺产生(+)γ-内酰胺的影响
从表5可看出，30℃是最适宜的转化温度，随着温度的逐渐升高，Ee值和转化率都逐渐下降。
六、配制转化底物(+/-)γ-内酰胺的缓冲液的pH值对拆分(+/-)γ-内酰胺产生(+)γ-内酰胺的影响
配制转化底物(+/-)γ-内酰胺的缓冲液的pH值对拆分(+/-)γ-内酰胺产生(+)γ-内酰胺的影响的结果见表6。
表6缓冲液的pH值对拆分(+/-)γ-内酰胺产生(+)γ-内酰胺的影响
从表6可见：配制转化底物(+/-)γ-内酰胺的缓冲液的最适pH为8，略偏碱性的条件下催化效果最好。过高或过低pH都对转化不利。当pH<6时，Ee值和转化率都非常低。
七、产物的分离提取
芽孢杆菌(BacillusaryabhattaiC4)湿菌体浓度为40g/L，底物浓度为300g/L，反应体系为2L，在5L的反应釜中进行不对称水解拆分反应。水解拆分反应的温度30℃、pH8.0、200rpm。微生物催化反应之后的转化液，离心除去菌体，用1L的二氯甲烷萃取3次，3次萃取液混合在一起用无水硫酸钠干燥。将萃取液进行抽真空旋转蒸发，蒸发温度为30℃，加正己烷冷却结晶温度为4℃将得到的晶体溶于乙酸乙酯，手性HPLC测定(+)γ-内酰胺的光学纯度(Ee值)大于99.5％，产物化学纯度大于99％。
申请人：江西省科学院微生物研究所
发明名称：一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌及其筛选和应用
16SrRNA基因序列：
CATGGCGGCTGCTATACATGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAGGATCTTCTCCTTCATGGGAGATGATTGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGGCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTAGAGATAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCTGCAAGACCGCGAGGTCAAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGAGTAACCGTAAGGAGCTAGCCGCATAAGTGAACA

Claims (10)

1.一种能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌为阿氏芽胞杆菌(BacillusaryabhattaiC4)，于2015年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM2015597。
2.如权利要求1中所述芽孢杆菌的筛选，其特征在于：具体为，
(1)初培养：从湖底取污泥，用无菌水稀释后涂布于培养基上，30℃培养2天；
所述初筛培养的培养基为：NH4CL2.0～10g，KH2PO40.01～10g，Na2HPO40.01～10g，MgSO40.01～1g，CaCL20.01～0.5g，(+/-)γ-内酰胺1～10g，微量元素100μL，琼脂粉10～30g；其中微量元素按照每升加入量计算包括：CaCL2·2H2O3.6g，ZnO2.0g，CuCL·2H2O0.85g，NaMoO·2H2O4.8g，MnCL2·4H2O2.0g，FeCL3·6H2O5.4g，CoCL2·6H2O2.4g；
(2)挑取单菌落再次在筛选培养基上划线分离纯化单菌落；
挑取单菌落形态特征为：菌落扁平，边缘锯齿状，黄色，菌落内部有一圆形结构，革兰氏染色呈阳性，显微镜下呈棒状，有中生芽孢；
(3)发酵产酶培养：先将步骤(2)中所述挑取出来的单菌落继续进行发酵产酶培养1～3天，所述发酵产酶培养基组成以g/L计为：葡萄糖5.0g，NH4CL2.0～10g，KH2PO40.01～10g，Na2HPO40.01～10g，MgSO40.01～1g，CaCL20.01～0.5g，(+/-)γ-内酰胺2g，FeSO40.08g；
(4)将上述发酵产酶培养的菌液进行离心获得所述能拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺的芽孢杆菌，备用。
3.如权利要求2中所述芽孢杆菌的筛选，其特征在于：步骤(1)中所述污泥取自艾溪湖。
4.如权利要求2中所述芽孢杆菌的筛选，其特征在于，所述步骤(1)中其中初培养的温度20～40℃，pH3～10。
5.一种用权利要求1-4中任意一种所述芽孢杆菌的应用，其特征在于，采用所述芽孢杆菌，在水相体系中，以(+/-)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备得到所述(+)γ-内酰胺。
6.如权利要求5中所述芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述以(+/-)γ-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备得到所述(+)γ-内酰胺的具体步骤如下：
(1)微生物菌株：权利要求1-5中任意一项所述的芽孢杆菌；
(2)先将步骤(1)中所述的芽孢杆菌进行离心获得湿菌体备用；
(3)拆分体系的配制：用磷酸盐缓冲液配制2g/L～600g/L的(+/-)γ-内酰胺；
(4)拆分(+/-)γ-内酰胺得到(+)γ-内酰胺：将步骤(3)的配制好的(+/-)γ-内酰胺加入到在步骤(2)的湿菌体中进行反应；
(5)拆分液的处理和分析：将步骤(4)中所得微生物拆分反应之后的液体，离心除去菌体，取上清液采用乙酸乙酯萃取，萃取液稀释后进行手性HPLC检测；
(6)产物的分离提取：采用二氯甲烷萃取步骤(5)中所得菌体，并依次经过干燥、蒸发浓缩、冷却结晶，最后得到所述的(+)γ-内酰胺。
7.如权利要求6中所述芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述步骤(3)中磷酸盐缓冲液的pH3～10，浓度为0.01～0.5mol/L。
8.如权利要求6中所述芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述步骤(4)中菌体终浓度为0.5g/L～100g/L湿菌体，反应温度为20～60℃，反应时间为1～24h，摇床转速为100～300rpm。
9.如权利要求6中所述芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述步骤(5)中在20～80℃下蒸发浓缩、1～4℃下冷却结晶。
10.如权利要求6中所述芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述步骤(6)中所述(+)γ-内酰胺的光学纯度为95.0％～100％，化学纯度为95％～99％。
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