CN104789505B - 还原制备顺式3,5‑二羟基己酸酯化合物的方法及菌种 - Google Patents

还原制备顺式3,5‑二羟基己酸酯化合物的方法及菌种 Download PDF

Info

Publication number
CN104789505B
CN104789505B CN201510195502.9A CN201510195502A CN104789505B CN 104789505 B CN104789505 B CN 104789505B CN 201510195502 A CN201510195502 A CN 201510195502A CN 104789505 B CN104789505 B CN 104789505B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacterial strain
reduction
carbonyl reductase
culture
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510195502.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104789505A (zh
Inventor
余宏
陈涛
王波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Meike Biotechnology Co., Ltd
Original Assignee
Suzhou Dong Sheng Chang Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Dong Sheng Chang Biotechnology Co ltd filed Critical Suzhou Dong Sheng Chang Biotechnology Co ltd
Priority to CN201510195502.9A priority Critical patent/CN104789505B/zh
Publication of CN104789505A publication Critical patent/CN104789505A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104789505B publication Critical patent/CN104789505B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Abstract

本发明还原制备顺式3,5‑二羟基己酸酯化合物的方法及菌种，提供了一种可产羧基还原酶的菌种，以及其在5‑羟基‑3‑氧代己酸酯对映体的还原以制备顺式3,5‑二羟基己酸酯化合物中的应用。所述菌种为Rhodococcus sp.SG‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC NO:M2014636，保藏时间2014年12月7日。本发明的菌株能实现5‑羟基‑3‑氧代己酸酯对映体的还原，生成顺式3.5‑二羟基己酸酯化合物。

Description

还原制备顺式3,5-二羟基己酸酯化合物的方法及菌种
技术领域
本发明涉及一种产羧基还原酶的菌种及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
利用酶或者微生物作为催化剂，可高度立体、位点和区域选择性的将化学合成的外消旋衍生物转化成手性产物，此方法具有反应条件温和、位点选择性强、副反应少、产物较单一、收率高、光学纯度高、无环境污染等特点。以酶作为生物催化剂，催化拆分反应制备光学活性化合物已经成为普遍采用的一种方法。
羰基还原酶(EC1.1.1.184)在酶学分类上属于短链脱氢/还原酶类，以NADPH为辅酶，催化还原许多在生理和药理上有活性的羰基化合物，并且大多数都为单亚基的胞内酶。
羰基还原酶是重要的生物催化剂，能将混旋底物转化成具有手性的重要医药中间体，因此在不对称合成的有机反应中起着重要的作用。许多手性醇可以通过羰基还原酶对潜手性酮的立体选择性还原得到。到目前为止，已分别报道了在Saccharomycescerevisiae，Candida magnoliae，Candida parapsilosis，Rhodococcus erythropolis等不同的微生物中分离得到了具有立体选择性的羰基还原酶，有的甚至已对其编码基因在不同的宿主中达到了高表达，并应用于生物催化领域。
发明内容
本发明提供一种能高立体选择性地催化还原反应的产羧基还原酶的菌种，以及一种利用该羧基还原酶催化5-羟基-3-氧代己酸酯对映体的还原生成顺式3,5-二羟基己酸酯化合物。
本发明的技术解决方案是：
一种产羧基还原酶的菌种，所述菌种为Rhodococcus sp.SG-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC NO:M2014636，保藏时间2014年12月7日。
优选地，所述的一种产羧基还原酶的菌种在5-羟基-3-氧代己酸酯对映体的还原以制备顺式3,5-二羟基己酸酯化合物中的应用。
优选地，一种产羧基还原酶的菌种在5-羟基-3-氧代己酸酯对映体的还原以制备顺式3,5-二羟基己酸酯化合物中的应用，所述应用包括如下步骤：
以5-羟基-3-氧代己酸酯对映体为底物，以产羧基还原酶的菌种在培养基中经培养获得的羧基还原酶为催化剂，在PH=5-8、浓度为0.01-1.0mol/L的缓冲液中进行5-羟基-3-氧代己酸酯对映体的还原，反应结束后经有效转化得到顺式3.5-二羟基己酸酯，所述反应条件控制在20-35℃，维持PH=7，反应时间控制在48-96小时之间。
优选地，所述的一种产羧基还原酶的菌种在5-羟基-3-氧代己酸酯对映体的还原以制备顺式3.5-二羟基己酸酯化合物中的应用，所述缓冲液的PH=6.5-7.5，浓度为0.05-0.2mol/L，反应条件控制在25℃，反应时间为72小时。
优选地，所述缓冲液为三乙醇胺（氯化物）缓冲液、磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液、磷酸二氢钾/磷酸氢二钾缓冲液）。0.1mol/L的三乙醇胺溶液，其pH值为7.0.配制方法如下：8.75g三乙醇胺纯液加入400ml水以及1.85g EDTA，盐酸调节pH 7.0后，水定容至500ml。
上述为500ml 0.1mol/L（pH7） 三乙醇胺配制方法，其他体积的配制按比例缩放即可。
优选地，所述缓冲液中还添加有还原性二型辅酶。
优选地，所述产羧基还原酶的菌种在培养基中，在30℃，200r/min，培养24h，将得到的培养物按5%的体积比转接到相同组分的新鲜培养基中继续培养12小时，经多次传代培养，并经过0.1mol/L的磷酸缓冲液洗涤2次，获得含羧基还原酶菌体的细胞，所述培养基PH调节范围为6.5-7.5之间，优选为PH为7，培养基终浓度组成如下：
其中，基本营养物质，其含量浮动范围能承受正负20%，而微量元素浮动范围则在5%之内。
该菌株的形态：好气、革兰氏阳性、多形态菌，可能形成雏形菌丝体，立即断裂为不规则细胞，不游动，可能部分抗酸，无气丝(有时有少量气丝)。
菌落特征：菌落粗糙或光滑、甚至粘液状，与分枝杆菌类似。一般呈浅橙黄色、粉色、橙色或红色，有无色变异型。
细胞形态：细胞壁Ⅳ型。
生理生化特性：DNA内G+C含量为61—68%。
本发明使用5-羟基-3-氧代己酸酯顺式对映体作为筛选培养基中的唯一碳源对采集的各种不同来源的土壤样本进行大量、广泛的筛选。
本发明突出的实质性特点和显著进步体现在以下几方面：
（1）具羰基还原酶活力的野生菌株。
（2）该菌株能实现5-羟基-3-氧代己酸酯对映体的还原，生成顺式3.5-二羟基己酸酯化合物，其羰基还原酶能催化根据下列结构式的5-羟基-3-氧代己酸酯对映体的还原，产生对应的顺式3.5-二羟基己酸酯化合物：
所产生的顺式3.5-二羟基己酸酯化合物可用作合成临床上重要的降胆固醇他汀药物如阿托伐他汀、罗舒伐他汀和匹伐他汀的中间体。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1 菌株的发酵培养
对沙土或黄土、植物根部土壤、堆肥、化工厂土壤等各种不同来源的土壤进行取样。
按照表1，配制含有合适组份的培养基。
为了对土壤微生物进行富集培养，取1克上述土壤样本接种到所述培养基中，在30℃，200r/min进行培养，24h后，培养物按5%的体积比转接到相同组分的新鲜培养基中继续培养12小时。
经过三次转接后，培养物在加了2%琼脂粉的含有相同组分的固体培养基按标准微生物分离方法进行划线分离。
经过在琼脂培养基上的多次划线分离，能分离得到微生物的纯培养菌落。
表1
实施例2 微生物转化
通过实施例1获得的一株纯培养微生物，通过多次传代培养，确认其能稳定的在上述培养基中生长。
通过对上述微生物的纯培养，获得了15g菌体并用100ml 0.1mol/L的pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤2次备用。
向配置有磁性搅拌棒和pH电极的50ml三颈烧瓶中注入20ml pH 7的0.1mol/L三乙醇胺（氯化物）缓冲液、5g上述菌体、0.2g 5-羟基-3-氧代己酸酯和1mg还原性二型辅酶（NADPH）于25℃下搅拌所述混合物。反应过程中通过添加2mol/L的NaOH来控制反应体系的酸碱度，使pH维持在7.0，同时，对反应体系定期取样，并将样品进行底物和产物的高效液相色谱分析以进行中控，计算其转化率。取样频率，一般72小时每隔5小时取样一次或72小时之内取样10次左右。本实施例中取样时间点分别为0、4、8、16、24、36、48、56、72小时，其具体转化率等见表2所示。
表2：本实施例中各个时间点取样检测后的数据结果。
产物检测：
高效液相色谱检测产物顺式3.5-二羟基己酸酯的方法：
仪器： Agilent1100
检测柱:Agilent SB C18 (50mm X 4.6mm, 5微米)
柱温 :室温
流速 :1毫升/分钟
流动相：50%的0.25%（体积比）醋酸水溶液，50%乙腈
背压： 60 bar
转化反应进程如下，可见，经过72小时的转化，92.4%的产物得到了有效转化，生成了相应的顺式3,5-二羟基己酸酯。

Claims (7)

1.一种产羰基还原酶的菌株，其特征在于：所述菌株为一种红球菌属的菌株（Rhodococcus sp. ）的菌株 SG-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC NO:M2014636，保藏时间2014年12月7日。
2.如权利要求1所述的一种产羰基还原酶的菌株的应用，其特征在于：以上所述的一种产羰基还原酶的菌株应用于5-羟基-3-氧代己酸酯对映体的还原制备顺式3,5-二羟基己酸酯化合物中。
3.如权利要求2所述的一种产羰基还原酶的菌株的应用，其特征在于：所述还原制备包括如下步骤：
以5-羟基-3-氧代己酸酯对映体为底物，以产羰基还原酶的菌株在培养基中经培养获得的羰基还原酶为催化剂，在PH=5-8、浓度为0.01-1.0mol/L的缓冲液中进行5-羟基-3-氧代己酸酯对映体的还原，反应结束后经有效转化得到顺式3,5-二羟基己酸酯，所述反应条件控制在20-35℃，维持PH=7，反应时间控制在48-96小时之间。
4.如权利要求3所述的一种产羰基还原酶的菌株的应用，其特征在于：所述缓冲液的PH=6.5-7.5，浓度为0.05-0.2mol/L，反应条件控制在25℃，反应时间为72小时。
5.如权利要求3所述的一种产羰基还原酶的菌株的应用，其特征在于：所述缓冲液为三乙醇胺与氯化物的复合缓冲液、磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液、磷酸二氢钾/磷酸氢二钾缓冲液。
6.如权利要求3所述的一种产羰基还原酶的菌株的应用，其特征在于：所述缓冲液中还添加有还原性二型辅酶。
7.如权利要求3所述的一种产羰基还原酶的菌株的应用，其特征在于：所述产羰基还原酶的菌株在培养基中，在30℃，200r/min，培养24h，将得到的培养物按5%的体积比转接到相同组分的新鲜培养基中继续培养12小时，经多次传代培养，并经过0.1mol/L的磷酸缓冲液洗涤2次，获得含羰基还原酶菌体的细胞，所述培养基调节至PH为6.5-7.5，所述培养基的浓度，组成如下：
组分 浓度，以毫克/升计 硫酸铵 2500 磷酸氢二钠 2200 磷酸二氢钾 1100 氯化钠 2800 六水氯化镁 400 5-羟基-3-氧代己酸酯 1000 生物素 0.002 二水氯化钙 12 盐酸吡哆醛 0.01 核黄素 0.005 泛酸 0.005 氨基苯甲酸 0.005 叶酸 0.002 维生素B12 0.005 七水硫酸锌 0.1 四水氯化锰 0.06 硼酸 0.25 六水氯化钴 0.01 二水钼酸钠 0.02 六水氯化镍 0.01 七水硫酸亚铁 0.002
。
CN201510195502.9A 2015-04-23 2015-04-23 还原制备顺式3,5‑二羟基己酸酯化合物的方法及菌种 Active CN104789505B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510195502.9A CN104789505B (zh) 2015-04-23 2015-04-23 还原制备顺式3,5‑二羟基己酸酯化合物的方法及菌种

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510195502.9A CN104789505B (zh) 2015-04-23 2015-04-23 还原制备顺式3,5‑二羟基己酸酯化合物的方法及菌种

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104789505A CN104789505A (zh) 2015-07-22
CN104789505B true CN104789505B (zh) 2018-03-06

Family

ID=53554700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510195502.9A Active CN104789505B (zh) 2015-04-23 2015-04-23 还原制备顺式3,5‑二羟基己酸酯化合物的方法及菌种

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104789505B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103146591A (zh) * 2013-01-30 2013-06-12 浙江工业大学 生物还原制备他汀侧链6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯及菌株
CN104328148A (zh) * 2014-11-04 2015-02-04 尚科生物医药（上海）有限公司 酶法制备(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69937374T2 (de) * 1998-08-05 2008-07-24 Kaneka Corp. Verfahren zur Herstellung von 3,5-dihydroxy substituierten Estern als Zwischenprodukte zur Herstellung optisch aktiver 2-(6-(Hydroxymethyl)-1,3-dioxan-4-yl)-essigsäure-Derivate
WO2008059366A2 (en) * 2006-11-17 2008-05-22 Pfizer Products Inc. Process for the preparation of cis-1, 3-diols from the corresponding beta-hydroxy ketones employing microbial ketone reductases

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103146591A (zh) * 2013-01-30 2013-06-12 浙江工业大学 生物还原制备他汀侧链6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯及菌株
CN104328148A (zh) * 2014-11-04 2015-02-04 尚科生物医药（上海）有限公司 酶法制备(3r,5s)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯

Also Published As

Publication number Publication date
CN104789505A (zh) 2015-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105112476B (zh) 一种发酵生产脂肽类生物表面活性剂的方法
CN111304106A (zh) 一株克劳氏芽孢杆菌及使用其生产四氢嘧啶的方法
CN104745513A (zh) 一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌及其应用
CN104561134B (zh) 一种微生物发酵法生产1,3-丙二醇的方法
CN103451137B (zh) 一种新的盐单胞菌及其生产四氢嘧啶的方法
CN107267422B (zh) 睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001及采用该菌株生产l-丙氨酸的方法
He et al. Production of coenzyme Q10 by purple non-sulfur bacteria: current development and future prospect
Yang et al. Production of erythritol from glucose by an osmophilic mutant of Candida magnoliae
CN107955791A (zh) 一种可一步催化得烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的菌种及其筛选方法和应用
CN103361289B (zh) 一株产l-赖氨酸的菌株及其生产l-赖氨酸的方法
CN108342437A (zh) 一种利用构巢曲霉发酵高产棘白菌素b的方法
CN103276019A (zh) 一种促进三孢布拉氏霉菌中番茄红素合成的方法
CN106011191B (zh) 一种全细胞生物催化生产5-氨基戊酸的方法
CN104789505B (zh) 还原制备顺式3,5‑二羟基己酸酯化合物的方法及菌种
CN105567584A (zh) 一种能拆分（＋/-）γ-内酰胺得到（+）γ-内酰胺的芽孢杆菌及其筛选和应用
JPH08501216A (ja) 不斉還元方法
CN104232696A (zh) 不对称还原前手性羰基化合物生产手性醇的方法
CN102747114A (zh) 一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法
CN103014092A (zh) 一种提高丝裂霉素c产率的制备方法
CN103103240A (zh) 一种提高那西肽产量的菌种培养方法
CN106676140A (zh) 一种生物法合成(r)‑邻氯扁桃酸的方法
CN106086090A (zh) 一种两步微生物转化法制备r‑扁桃酸的方法
CN106349056A (zh) 一种a‑酮戊二酸的分离纯化方法
CN102757924B (zh) 一种红球菌及其在制备(s)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸中的应用
CN106148240A (zh) 菌株mqo‑160的发酵培养基

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20201012

Address after: No.10, Yulan Avenue, Xuyi Economic Development Zone, Xuyi county, Huai'an City, Jiangsu Province

Patentee after: Jiangsu Meike Biotechnology Co., Ltd

Address before: 215600 No. 1 Park Road, Suzhou, Jiangsu, Zhangjiagang

Patentee before: SUZHOU DONG SHENG CHANG BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Patentee before: Yu Hong

TR01 Transfer of patent right