CN103146591A

CN103146591A - 生物还原制备他汀侧链6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯及菌株

Info

Publication number: CN103146591A
Application number: CN2013100416169A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 王亚军; 罗希; 盛骏桢; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2013-01-30
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2033-01-30
Also published as: CN103146591B

Abstract

本发明提供了一株具有反-Prelog非对映体选择性羰基还原酶活性的黏红酵母（Rhodotorula glutinis）ZJB-09224，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号为CCTCC No：M 2012412，保藏日期为2012年10月18日。利用该菌产生的羰基还原酶转化(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备光学纯6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，酶活为13.6U/L，d.e.值>90%，立体选择性高，反应条件温和，环境友好。

Description

生物还原制备他汀侧链6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯及菌株

（一）技术领域

本发明涉及一株具有反-Prelog非对映体选择性羰基还原酶活性的菌株——黏红酵母（Rhodotorula glutinis）ZJB-09224，及其在生物不对称还原制备光学纯6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用。

（二）背景技术

心血管疾病已成为对人类最具威胁的疾病之一，其发病率和死亡率均已超过恶性肿瘤而跃居第一。据世界卫生组织统计，全世界每年有3000多万人死于心脑血管疾病，约占全部死亡人数的一半。中国每年因心脑血管疾病及并发症死亡病例超过300万。研究表明，血脂异常引发的大动脉和中型动脉粥样硬化是心脑血管疾病的最主要病因。人体高血脂症主要是极低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）增多，临床上血清胆固醇含量高于2.30g/L、甘油三酯高于1.40g/L统称为高血脂症。调节血液中脂蛋白的比例并维持在相对恒定的浓度，是预防和消除动脉粥样硬化的关键。人体内的胆固醇主要来自于肝脏内源性生物合成，肝脏细胞细胞质中胆固醇合成途径需要26步生物合成反应，其中，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-COA）还原酶催化HMG-COA还原生成甲羟戊酸反应是人体内胆固醇合成的限速性步骤。

他汀类药物是HMG-COA还原酶的竞争性抑制剂，能强烈抑制人体内胆固醇的合成。此外，他汀类药物还能反馈性上调细胞表面低密度脂蛋白受体表达，促进循环血液中极低密度脂蛋白胆固醇残粒和低密度脂蛋白的清除，最终降低血清中总胆固醇和低密度脂蛋白的水平，有效防止动脉粥样硬化和冠心病的发生，产生较好的降血脂疗效。全球开发和在研的他汀类药物已有十多个品种。第一代他汀药物包括辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀，是一类结构类似的真菌代谢物。第二代他汀包括化学合成的外消旋氟伐他汀。第三代他汀是合成的光学纯他汀药物，如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀。他汀类降脂药占世界降脂药物市场的85%以上份额，并仍具有提升空间。2003年，阿托伐他汀成为全球首个年销售额超过百亿美元的药物，近年来的销售额仍稳居世界前列。国内他汀类药物市场前景广阔。

他汀类药物往往都含有3,5-二羟基己酸酯侧链结构，该结构含有两个手性中心，只有一种立体异构体（(3R,5R)-或者(3R,5S)-二羟基己酸酯）具有HMG-COA还原酶抑制活性。由于各国药监部门要求药物e.e.值大于99.5%，d.e.值大于99%，他汀类药物的手性侧链的光学纯度将决定药物的质量。作为他汀类药物的关键合成砌块——6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯生产技术备受关注。广泛采用的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯化学合成方法存在诸多缺陷，合成需要使用剧毒的三乙基硼和-85℃深冷条件，而且非对映诱导不充分，产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯d.e.值低，该反应形成的硼化物废物处理需要经过繁琐的反复甲醇淬灭、真空蒸馏等。与化学合成方法相比，生物催化法制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯具有许多不可比拟的潜在优势，包括反应体选择性高，反应条件温和，革除有毒溶剂使用等等。迄今为止，文献报道的具有不对称还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯活性的微生物菌种有Beauveria bassiana ATCC 7159、Hansenulanonfermentans CBS 5764、Saccharomyces cerevisiae，Pichia angusta NCYC495、Pichia angusta NCYC R320、Pichia angusta NCYC R322、Pichiahaplophila CBS 2028、Pichia pastoris BPCC 260、Pichia pastoris BPCC443、Pichia pastoris NCYC R321、Pichia membranefaciens、Pichiaguilliermondii、Candida humicola CBS 1897、Candida solani CBS 1908、Candida diddensiae ATCC 20213、Candida friedrichii ATCC 22970、Kluyveromyces drosophilarum CBS 2105、Torulaspora hansenii ATCC20220。目前，未见Rhodotorula glutinis具有(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯非对映选择性(R)-羰基还原酶活性的报道。

（三）发明内容

本发明提供一种从土壤中富集、筛选具有高立体选择性羰基还原酶活性微生物菌种——黏红酵母（Rhodotorula glutinis）ZJB-09224，及其在生物不对称还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一株具有反-Prelog非对映体选择性羰基还原酶活性的黏红酵母（Rhodotorula glutinis）ZJB-09224，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号为CCTCC No：M2012412，保藏日期为2012年10月18日。经鉴定该菌株属于红酵母属（Rhodotorula）的glutinis种，菌株编号为ZJB-09224，命名为Rhodotorula glutinis ZJB-09224。

该菌株菌落形态：菌落呈粉红色，边缘整齐，圆形，隆起，表面光滑，不透明（菌落照片见图1）。

生理生化特征：利用Vitek2微生物自动鉴定系统测定菌株ZJB-09224对46种鉴定试验的鉴定结果，经Vitek2读数仪分析代谢指纹，确定菌株ZJB-09224属于红酵母属（Rhodotorula）的gutinis种，同源性98%（详见表1）。

表1：利用Vitek2微生物自动鉴定系统分析菌种ZJB-09224结果

注：＋，阳性；-，阴性。

18S rDNA序列分析：以提取到的细胞总DNA为模板，利用设计的引物：pITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和pITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'扩增菌株ZJB-09224的18S rDNA序列。扩增的片段克隆到T载体后，抽提质粒后的含有本实验获得的18S rDNA片段的重组质粒，经测序分别确认三个片段实际长度为616bp，序列如下：TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA GTGAATATAGGACGTCCAAC TTAACTTGGA GTCCGAACTC TCACTTTCTAACCCTGTGCA CTTGTTTGGG ATAGTAACTC TCGCAAGAGAGCGAACTCCT ATTCACTTAT AAACACAAAG TCTATGAATGTATTAAATTT TATAACAAAA TAAAACTTTC AACAACGGATCTCTTGGCTC TCGCATCGAT GAAGAACGCA GCGAAATGCGATAAGTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGA ATCATCGAATCTTTGAACGC ACCTTGCGCT CCATGGTATT CCGTGGAGCATGCCTGTTTG AGTGTCATGA ATACTTCAAC CCTCCTCTTTCTTAATGATT GAAGAGGTGT TTGGTTTCTG AGCGCTGCTGGCCTTTACGG TCTAGCTCGT TCGTAATGCA TTAGCATCCGCAATCGAACT TCGGATTGAC TTGGCGTAAT AGACTATTCGCTGAGGAATT CTAGTCTTCG GACTAGAGCC GGGTTGGGTTAAAGGAAGCT TCTAATCAGA ATGTCTACAT TTTAAGATTAGATCTCAAAT CAGGTAGGAC TACCCGCTGA ACTTAAGCATATCAATAAGC GGAGGA。

将获得的序列与GenBank中保存的数据进行相似性分析发现，本实验所鉴定微生物ZJB-09224与Rhodotorulasp.（HQ832802.1）同源性最高（homology，100%/641bps,based on 18S rDNA），根据微生物分子遗传学鉴定原则，基于18S rDNA序列的同源性高于95%，鉴定菌基本属于对照菌。因此，本实验鉴定的微生物属于Rhodotorula属，中文名称为红酵母。

综上所述：经分子遗传学鉴定，菌株ZJB-09224属于黏红酵母，拉丁名为Rhodotorulaglutinis。

本发明涉及的微生物菌株是通过以下程序筛选获得：

1）富集培养

富集培养基（豆芽汁培养基）：新鲜豆芽汁（新鲜黄豆芽按100.0g/L加水煮沸30min，过滤取豆芽汁，补水至初始体积）100.0mL/L，葡萄糖50.0g/L，自然pH值，250mL摇瓶分装，装液量50.0mL，115℃灭菌30min。添加无菌(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，浓度分别为0.40g/L、0.80g/L、1.20g/L、1.60g/L和2.00g/L。

将采集于全国各地的土样用生理盐水按一定的比例分散后接种至含有0.40g/L(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的富集培养基中，在30℃、150rpm条件下，摇床振荡培养直至培养液变浑浊后，按照2.0%（v/v）接种量转接到含有0.80g/L(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的富集培养基中，继续在30℃、150rpm条件下培养。依次提高富集培养基中(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯浓度，直至2.00g/L。

2）稀释涂布挑取单菌落

固体培养基：豆芽汁培养基，添加20g/L琼脂，自然pH值。

制作若干斜面和平板。将最后一次的富集培养液逐级稀释、涂布到平板培养基上30℃培养至形成可观察到单菌落。挑取单菌落转接至无菌斜面，30℃培养2天，斜面置于4℃冰箱保藏。

3）菌株活性测定

发酵培养基：葡萄糖15.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，KH₂PO₄0.50g/L，K₂HPO₄0.50g/L，MgSO₄0.50g/L，NaCl1.0g/L，pH7.0，115℃灭菌30min。将保藏在试管斜面中的菌株逐一接种到发酵培养基中，在30℃、150rpm条件下培养48h。分别移取20.0mL培养物，离心，收集菌体，并用50.0mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）洗涤菌体3次。将菌体分散于10.0mL上述缓冲液中，添加(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，使其终浓度达到5.0~20.0g/L，35℃转化2h，转化液经离心、微滤后采用液相色谱分析羰基还原酶活性。

羰基还原酶活力定义为：35℃，pH7.5条件下，每分钟催化生成1μmol6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯所需的酶量定义为1个酶活单位。在分离得到的200余株菌中，ZJB-09224可用于催化制备光学纯6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。

本发明还涉及所述的菌株在生物不对称还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用。涉及的反应式如下：

具体的，所述应用为：在以(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物、黏红酵母经发酵获得的含酶菌体细胞为催化剂、pH6~8磷酸盐缓冲液为溶剂的反应体系中，于25~40℃下进行转化反应，于反应液中获得所述6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。反应体系中，底物添加量为5~20g/L，含酶菌体细胞添加量为0.25~0.50g DCW/L。

所述含酶菌体细胞可按如下方法获得：将黏红酵母（Rhodotorulaglutinis）ZJB-09224接种至适宜黏红酵母的发酵培养基，于pH6~8、26~30℃下振荡培养2~3天，发酵液离心，收集菌体生理盐水洗涤，即得所述含酶菌体细胞。

所述发酵培养基组成可如下：葡萄糖10~30g/L，蛋白胨2~10g/L，酵母抽提物2~10g/L，KH₂PO₄0.1~1.0g/L，K₂HPO₄0.1~1.0g/L，MgSO₄00.1~1.0g/L，NaCl0.5~2.0g/L，pH6.0~8.0。

优选的，所述不对称还原在pH7~8、25~35℃下进行。

本发明中(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯和6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯及其差向异构体6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯定量分析及构型分析分别采用高效液相色谱、气相色谱方法。高效液相色谱定分析条件：依利特Hypersil ODS2C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相组成：乙腈:水=25:75(v/v)；检测波长220nm。在此分析条件下，底物(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的保留时间分别为3分钟、8.3分钟。气相色谱构型分析条件：HP-5气相色谱柱；柱箱温180℃维持5分钟，然后以升温速度5℃/分钟升温至250℃，保持5分；检测器温度250℃，进样口温度230℃。在此分析条件下，6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的保留时间为6.685分钟。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一株具有非对映选择性羰基还原酶活性的微生物新菌种—黏红酵母（Rhodotorrula glutinis)，利用该菌产生的羰基还原酶转化(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备光学纯6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，酶活为13.6U/L，d.e.值>90%，立体选择性高，反应条件温和，环境友好。

（四）附图说明

图1为菌株菌落形态照片；

图2为发酵培养基初始pH对Rhodotorula glutinis羰基还原酶体积酶活及非对映选择性的影响；

图3为发酵培养温度对Rhodotorula glutinis羰基还原酶体积酶活及非对映选择性的影响；

图4为pH对催化反应工艺的影响；

图5为温度对催化反应工艺的影响；

图6为细胞用量对催化反应工艺的影响；

图7为底物浓度对催化反应工艺的影响。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：筛选具有催化(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯还原活性微生物菌株

将采集于全国各地的土样用生理盐水按一定的比例分散后接种至含有0.40g/L(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的富集培养基（配制：100.0g黄豆芽煮沸30分钟、过滤，滤液加入50.0g葡萄糖、0.40g(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，加水补足至1.0L，不调节pH值）中，在30℃、150rpm条件下，摇床振荡培养直至培养液变浑浊后，按照2.0%（v/v）接种量转接到含有0.80g/L(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的富集培养基中，继续在30℃、150rpm条件下培养。依次提高富集培养基中(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯浓度，直至达到2.00g/L。

将最后一次的富集培养液逐级稀释、涂布到平板培养基上30℃培养至形成可观察到的单菌落。挑取单菌落转接至无菌斜面（配制：100.0g黄豆芽煮沸30分钟、过滤，滤液加入50.0g葡萄糖、20.0g琼脂，加水补足至1.0L，不调节培养基pH值；115℃灭菌30分钟，冷却制成斜面），30℃培养2天，斜面置于4℃冰箱保藏。

将保藏在试管斜面中的菌株逐一接种到发酵培养基（配制：葡萄糖15.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，KH₂PO₄0.50g/L，K₂HPO₄0.50g/L，MgSO₄0.50g/L，NaCl1.00g/L，pH8.0，115℃灭菌30分钟）中，在30℃、150rpm条件下培养48小时。分别移取20.0mL培养物，离心，收集菌体，并用50.0mM磷酸钾缓冲液（pH7.5）洗涤菌体3次。将菌体分散于10.0mL上述缓冲液中，添加的(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，使其终浓度达到5.0~20.0g/L，35℃转化2小时，转化液经离心、微滤后采用液相色谱分析羰基还原酶活性。在筛选菌株中，Rhodotorula glutinis ZJB-09224，即CCTCC No：M2012412，活力最强，非对映体选择性最高。

羰基还原酶活力定义为：35℃，pH7.5条件下，每分钟催化生成1μmol6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯所需的酶量定义为1个酶活单位。

实施例2：发酵培养基初始pH值对Rhodotorula glutinis羰基还原酶体积酶活及非对映选择性的影响

将保存在试管斜面的Rhodotorula glutinis菌种挑取一环接种到无菌发酵培养基中，发酵培养基配方如下：葡萄糖15.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，KH₂PO₄0.50g/L，K₂HPO₄0.50g/L，MgSO₄0.50g/L，NaCl1.0g/L。培养温度28℃，发酵培养基初始pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，150rpm条件下培养2天，收集发酵液。

分别移取20.0mL培养物，离心，收集菌体，并用50.0mM磷酸钾缓冲液（pH7.5）洗涤菌体3次。将菌体分散于10.0mL上述缓冲液中，添加的(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，使其终浓度达到10.0g/L，置于水浴摇床35℃转化2小时。转化液经离心、微滤后采用液相色谱分析羰基还原酶活性。取1.0mL转化液，12000rpm离心10分钟，上清液采用0.45μm微滤膜过滤。得到的澄清的滤液进行液相色谱分析6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯浓度，计算各条件下的羰基还原酶活力，气相色谱分析非对映体选择性，结果示于图2。结果表明，在pH8.0条件下，体积酶活最高，达到13.6U/L，d.e.值90.2%。

实施例3：发酵培养温度对Rhodotorula glutinis羰基还原酶体积酶活及非对映选择性的影响

将保存在试管斜面的Rhodotorula glutinis菌种（CCTCC No：M2012412）挑取一环接种到无菌发酵培养基中，发酵培养基配方如下：葡萄糖15.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，KH₂PO₄0.50g/L，K₂HPO₄0.50g/L，MgSO₄0.50g/L，NaCl1.00g/L。培养温度分别为25℃、28℃、32℃、36℃，发酵培养基初始pH值为8.0，150rpm条件下培养2天，收集发酵液。

分别移取20.0mL培养物，12000rpm离心，收集菌体，并用50.0mM磷酸钾缓冲液（pH7.5）洗涤菌体3次。将菌体分散于10.0mL上述缓冲液中，添加的(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，使其终浓度达到10.0g/L，置于水浴摇床35℃转化2小时。转化液经离心、微滤后采用液相色谱分析羰基还原酶活性。取1.0mL转化液，12000rpm离心10分钟，上清液采用0.45μm微滤膜过滤。得到的澄清的滤液进行液相色谱分析6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯浓度，计算各条件下的羰基还原酶活力，气相色谱分析非对映体选择性，结果示于图3。结果表明，在28℃条件下，体积酶活最高，达到13.6U/L，d.e.值90.2%。

实施例4：生物催化剂Rhodotorula glutinis细胞制备

从本发明选育得到的新羰基还原酶产生菌种Rhodotorula glutinis的试管斜面上挑取一环菌体，接种至50.0mL无菌种子培养基（配制：葡萄糖15.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，KH₂PO₄0.50g/L，K₂HPO₄0.50g/L，MgSO₄0.50g/L，NaCl1.0g/L，pH8.0，115℃灭菌30分钟）中，28℃、150rpm条件下振荡培养基12小时，获得种子液。1.0mL种子液接种至50.0mL无菌发酵培养液（配制：葡萄糖15.0g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，KH₂PO₄0.50g/L，K₂HPO₄0.50g/L，MgSO₄0.50g/L，NaCl1.0g/L，pH8.0，115℃灭菌30分钟），28℃，150rpm条件下培养48小时，收集发酵液。发酵液12000rpm离心10分钟后，弃上清收集菌体，用50.0mM磷酸钾缓冲液（pH7.5）洗涤菌体3次，1.0L培养基收集获得12.0g Rhodotorula glutinis（DCW），该菌体对(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯具有反-Prelog非对映选择性羰基还原酶活性。

实施案例5：pH对催化反应工艺的影响

选用本发明实施例4制备的生物催化剂Rhodotorula glutinis菌体细胞。转化体系选择10.0mL、pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0磷酸钾缓冲液（50.0mM），Rhodotorula glutinis细胞终浓度为25.0g DCW/L，添加(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯至终浓度为10.0g/L，35℃转化2小时。经液相和气相分别检测6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯浓度和d.e.值，结果如图4所示，pH7.5条件下反应生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的得率为28.15％，d.e.值95.5％。

实施案例6：温度对催化反应工艺的影响

选用本发明实施例4制备的生物催化剂Rhodotorula glutinis菌体细胞。转化体系选择10.0mL、pH为7.5磷酸钾缓冲液（50.0mM），Rhodotorula glutinis细胞终浓度为25.0g DCW/L，添加(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯至终浓度为10.0g/L，25℃、30℃、35℃、40℃温度下分别转化2小时。经液相和气相分别检测6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯浓度和d.e.值，结果如图5，如图所示35℃条件下反应生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的得率为13.50％，d.e.值92.5%。

实施案例7：细胞用量对催化反应工艺的影响

选用本发明实施例4制备的生物催化剂Rhodotorula glutinis菌体细胞。转化体系选择10.0mL、pH7.5磷酸钾缓冲液（50.0mM），Rhodotorulaglutinis细胞终浓度分别为12.5g DCW/L、25.0g DCW/L、37.5gDCW/L、50.0g DCW/L，添加(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯至终浓度为10.0g/L，35℃转化2小时。经液相和气相分别检测6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯浓度和d.e.值，结果如图6，如图所示细胞终浓度为37.5g DCW/L时反应生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的得率为34.40%，d.e.值97.1%。

实施案例8：底物浓度对催化反应工艺的影响

选用本发明实施例4制备的生物催化剂Rhodotorula glutinis菌体细胞。转化体系选择10.0mL、pH为7.5磷酸钾缓冲液（50.0mM），Rhodotorula glutinis细胞终浓度为37.5g DCW/L，添加(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯至终浓度分别为为5.0g/L、10.0g/L、15.0g/L、20.0g/L，35℃转化2小时。经液相和气相分别检测6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯浓度和d.e.值，结果如图7，如图所示底物浓度为15.0g/L时反应生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的得率为73.51%，d.e.值92.6%。

Claims

1.一株具有反-Prelog非对映体选择性羰基还原酶活性的黏红酵母（Rhodotorula gutinis）ZJB-09224，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号为CCTCCNo：M 2012412，保藏日期为2012年10月18日。

2.如权利要求1所述的菌株，其特征在于该菌株的18S rDNA序列如下：TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA GTGAATATAGGACGTCCAAC TTAACTTGGA GTCCGAACTC TCACTTTCTAACCCTGTGCA CTTGTTTGGG ATAGTAACTC TCGCAAGAGAGCGAACTCCT ATTCACTTAT AAACACAAAG TCTATGAATGTATTAAATTT TATAACAAAA TAAAACTTTC AACAACGGATCTCTTGGCTC TCGCATCGAT GAAGAACGCA GCGAAATGCGATAAGTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGA ATCATCGAATCTTTGAACGC ACCTTGCGCT CCATGGTATT CCGTGGAGCATGCCTGTTTG AGTGTCATGA ATACTTCAAC CCTCCTCTTTCTTAATGATT GAAGAGGTGT TTGGTTTCTG AGCGCTGCTGGCCTTTACGG TCTAGCTCGT TCGTAATGCA TTAGCATCCGCAATCGAACT TCGGATTGAC TTGGCGTAAT AGACTATTCGCTGAGGAATT CTAGTCTTCG GACTAGAGCC GGGTTGGGTTAAAGGAAGCT TCTAATCAGA ATGTCTACAT TTTAAGATTAGATCTCAAAT CAGGTAGGAC TACCCGCTGA ACTTAAGCATATCAATAAGC GGAGGA。

3.如权利要求1所述的菌株在生物不对称还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述不对称还原在pH7~8、25~35℃下进行。