CN101432435A - 对映体选择性酶还原羟基酮化合物的方法 - Google Patents

对映体选择性酶还原羟基酮化合物的方法 Download PDF

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Abstract

对映体选择性酶还原通式I之羟基酮的方法,所述通式I中,R1=C1-C6烷基,R2=-Cl,-CN,-OH,-H或者C1-C6烷基,以得到通式II的手性二醇,其中R1与R2与通式I中的含义相同。在NADH或者NADPH作为辅因子的条件下,用氧化还原酶还原羟基酮,其中a)所述羟基酮在反应混合物中的浓度为>50g/l,b)通过氧化通式RXRYCHOH的二级醇持续再生所得的氧化辅因子NAD或者NADP,其中RX,RY彼此独立是氢、支链或者无支链C1-C8烷基,且C总数≥3,并且c)羟基酮的还原和二级醇的氧化是由相同的氧化还原酶催化的。

Description

对映体选择性酶还原羟基酮化合物的方法
本发明涉及对映体选择性酶还原通式I之羟基酮的方法:
Figure A200680047754D00051
所述通式I中,R1=C1-C6烷基,R2=-Cl,-CN,-OH,-H或者C1-C6烷基,以得到通式II的手性二醇:
Figure A200680047754D00052
其中R1与R2与通式I中的含义相同,在辅因子的条件下,用氧化还原酶还原羟基酮。
通式II的手性二醇是药品生产,特别是HMG-CoA-还原酶抑制剂生产过程中的重要中间化合物。所述手性二醇是例如叔-丁基(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸酯、叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯或者叔-丁基(5S,3R)-3,5,6-三羟基己酸酯。
这种类型的二醇特别是通过对映体选择性还原相应的通式I羟基酮,例如叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯、叔-丁基(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯或者叔-丁基(5S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸酯而形成。这种化学催化还原反应的缺点是,一方面,苛刻的反应条件会形成副产物,另一方面,形成不需要的对映体或者非对映异构体过量,并且该技术的成本非常高。
由于上述原因,人们一直在探索生物催化方法,以便用所述方法对映体选择性还原所述的羟基酮。生物催化方法通常在温和的条件下完成,期待着在没有进一步的副产物形成的情况下,还原已经很不稳定的5-羟基-3-氧代己酸酯衍生物。但是,迄今一直没有找到适宜的生物催化剂,用所述催化剂能够有效地酶促还原所述的5-羟基-3-氧代己酸酯并且是用分离的酶。
美国专利6001615和国际专利申请WO01/85975 A1例如描述了用来自白僵菌(Beauvaria)、Pichia、念珠菌、克鲁维酵母菌、Torulaspora的不同酵母还原叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯或者者叔-丁基(5S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸酯的方法。但是所述转化使用野生菌株的整个细胞,并且在远低于5%的很小浓度下完成。这是由于迄今为止,尚未鉴定出与转化有关的酶以及其DNA序列。
此外,在EP 0569 998 B1中描述了微生物转化结构相似的化合物。其中从Acinetobacter calcoaceticus ATCC 33305中纯化了NADH依赖性酶,并以与葡萄糖脱氢酶一起分离的形式,用于辅酶再生。在所述方法中,所述底物的浓度为1%,NADH的“总转化数”仅为10。因此,尚未描述适于工业应用的方法。
在美国专利6645746 B1中公开了Candida magnoliae的一种氨基酸序列,用所述氨基酸序列可以有助于NADPH还原叔-丁基(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯至叔-丁基(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸酯。在该文献的说明书中,优选将所述酶与共表达的巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶一起使用,葡萄糖脱氢酶有助于辅因子NADPH的再生,且葡萄糖作为共底物而产生。
本发明面对该任务,提供了一种方法,该方法可以经济地以高产率和高对映体纯度,且没有副产物而产生通式II的纯对映体二醇。
根据本发明,由前述类型的方法而完成了所述任务,即在NADH或者NADPH作为辅因子的条件下,通过氧化还原酶还原而实现,其特征在于,其中,
a)羟基酮在反应混合物中的浓度≥50g/l,
b)通过通式RXRYCHOH的二级醇氧化持续再生所得的氧化辅因子NAD或者NADP,其中RXRY彼此独立是氢、支链或者无支链C1-C8烷基,且C总数≥3,和
c)羟基酮的还原和二级醇的氧化由相同的氧化还原酶催化。
因此,所述方法优选实施方案的特征在于,所述氧化还原酶
a)含有氨基酸序列,其中至少50%的氨基酸与氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或者SEQ ID NO:14的那些相同,
b)由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13或者SEQ ID NO:15的核酸序列编码,或者
c)由在严格条件下,与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或者SEQ ID NO:15杂交的核酸序列编码。
根据本发明,上述任务还可以通过前述类型的方法完成,其中,所用氧化还原酶
a)含有氨基酸序列,其中至少50%的氨基酸与氨基酸序列SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或者SEQ ID NO:14的那些相同,
b)由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13或者SEQ ID NO:15的核酸序列编码,或者
c)由在严格条件下,与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或者SEQ ID NO:15杂交的核酸序列编码。
已发现具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11氨基酸序列的多肽具有氧化还原酶活性,并可用于以>99%的非对映异构体过量将叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯还原为叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯。用同样的方法,用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11氨基酸序列可以还原通式I的其他羟基酮。
另外,所述氧化还原酶所具有的优点是,能够将在还原反应过程中形成的氧化的辅因子,通过二级醇的还原而再生。即,所述氧化还原酶的一种特别经济的优点也是,与现有技术的方法(US6645746 B和EP0569998 B)相比,不必再用其他酶使辅因子再生。
编码SEQ ID NO:1之多肽的DNA序列SEQ ID NO:2例如来自喜木聚糖红色杆菌(Rubrobacter xylanophilus)DSM 9941的基因组。此外,还发现,可以用DNA序列SEQ ID NO:3,以便在大肠杆菌中表达SEQ ID NO:1的多肽。
编码SEQ ID NO:8之多肽的DNA序列SEQ ID NO:9例如来自Geobacillusthermodenitrificans DSM 465的基因组。此外,还发现,可以用DNA序列SEQ IDNO:10,以便在大肠杆菌中表达SEQ ID NO:8的多肽。
编码SEQ ID NO:11之多肽的DNA序列SEQ ID NO:12来自橙色绿屈挠菌DSM 635的基因组。
编码SEQ ID NO:14之多肽的DNA序列SEQ ID NO:15来自Candidamagnoliae CBS 6396。
因此,本发明还涉及用氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:11或者SEQ ID NO:14之多肽,或者含有与氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQID NO:8、SEQ ID NO:11或者SEQ ID NO:14的氨基酸序列有至少50%的同一性的氨基酸序列的多肽,即通过取代、插入、缺失或增加SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:11或者SEQ ID NO:14的至少一个氨基酸而获得的多肽,或者用由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12或者SEQ ID NO:15的核苷酸序列,或者由与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12或者SEQ IDNO:15的核苷酸序列在严格条件下杂交之核苷酸序列编码的多肽,将通式I的羟基酮还原成通式II的二醇的方法。
例如在严格条件下与SEQ ID NO:2杂交的核苷酸序列应理解为,是指用SEQID NO:2作为探针,通过菌落杂交方法、噬菌斑杂交方法、Southern杂交法或者类似的方法可以鉴定的多核苷酸。
为此目的,在0.7-1M NaCl溶液中,60℃,将在过滤器上固定的多核苷酸与SEQ ID NO:2杂交。用描述于例如,分子克隆(Molecular Cloning),实验室手册,第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)或者类似文献中的方法,完成所述杂交。最后,用0.1-2倍SSC溶液,于65℃冲洗所述过滤器,其中,1倍SSC溶液是一种混合物,由150mM NaCl和15mM柠檬酸钠组成。
根据本发明方法,含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或者SEQID NO:14序列之多肽,或者由所述多肽衍生的多肽可以以完全纯化、部分纯化或者以含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQIDNO:11或者SEQ ID NO:14多肽之细胞的形式使用。这里所用的细胞可以是天然的、渗透性的或者溶解形式。优选在一种适宜的宿主生物,例如大肠杆菌中,过表达含有SEQ ID NO:1、SEQIDNO:8、SEQ ID NO:11或者SEQ ID NO:14序列的多肽或者其衍生物,然后用重组多肽还原通式I的羟基酮。
每公斤待转化的通式I的化合物使用5000至10Mio U氧化还原酶SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或者SEQ ID NO:14或其衍生物(如上所公开的)。这里酶单位1U是每分钟(min)转化1μmol式I的羟基酮所需要的酶量。
根据本发明的酶促还原反应在温和的条件下进行,使得通常不稳定的羟基酮的降解和因此不需要的副产物的形成可以在很大程度上受到抑制。根据本发明方法,手性二醇形成的时间长,且非对映异构体的纯度通常>99%。
本发明优选实施方案的特征在于,在所述方法中用共底物持续地还原所用的辅因子。
优选用NAD(P)H作为辅因子,其中在还原反应中形成的NAD(P)由共底物再次还原成NAD(P)H。
这里,优选用二级醇,例如2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、3-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-庚醇、2-辛醇或者环己醇作为共底物。根据特别优选的实施方案,将2-丙醇用于辅酶再生。再生所用的共底物含量可占总体积的5-95Vol%。
同样例如用含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或者SEQ IDNO:14的多肽完成辅酶再生。
根据本发明方法,优选通式I的羟基酮占总体积的5重量%-50重量%(50g/l-50g/l),优选8重量%-40重量%,更优选10重量%-25重量%。
一个特别优选的实施方案的特征在于,用叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯、叔-丁基(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯或者叔-丁基(5S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸酯作为通式I的羟基酮。
优选本发明方法在水-有机两相系统中完成。
其中进行酶促还原反应的反应混合物的水部分,优选含有pH为5-10,优选pH6-9的缓冲液,例如磷酸钙-、Tris/HCl-或者三乙醇胺-缓冲液。为了稳定或者激活酶,所述缓冲液还可以含有离子,例如锌离子或者镁离子。
合适地,本发明方法的反应温度为大约10℃-70℃,优选20℃-45℃。
在本发明方法进一步优选的实施方案中,所述酶促转化在与水不混溶或仅与水有限可混溶的有机溶剂存在下进行。所述溶剂是例如对称或者不对称二(C1-C6)烷基醚,直链(geradkettiges)或者支链烷或者环烷或者水溶性二级醇,同时,形成共底物。优选的有机溶剂是乙醚、叔-丁基甲基醚、二异丙基醚、二丁基醚、乙酸丁酯、庚烷、己烷、2-辛醇、2-庚醇、4-甲基-2-戊醇和环己醇。后者所述二级醇的情况下溶剂可同时可作为共底物使辅因子再生。
在加入水溶性溶剂或者共底物时,反应混合物由水和有机相组成。所述羟基酮根据其相应的溶解性分散在有机相和水相之间。所述有机相通常占总反应体积的5-95%,优选10-90%比例。优选将所述两个液相进行机械混合,这样在两相之间形成一个大上层。例如在本实施方案中,酶促还原反应形成的NAD还可用共底物,如上所述,再还原成NADH。
辅因子,特别是NADH或者NADPH在水相中的浓度通常为0.001mM-10mM,特别是0.01mM-1mM。
根据本发明方法,还可以使用氧化还原酶/脱氢酶的稳定剂。适宜的稳定剂是例如甘油、山梨醇、1,4-DL-二硫苏糖醇(DTT)或者二甲亚砜(DMSO)。
本发明方法例如在密封的玻璃或者金属反应容器中完成。所述组分分别转移到所述反应容器中,并在气体,例如氮气或空气下搅拌。
根据本发明进一步可能的实施方案,可以将氧化的共底物(例如丙酮)不断除去,和/或不断补充新的共底物(例如2-丙醇),以便反应向反应产物(通式II的二醇)方向进行。
在另一实施方案中,在反应过程中逐渐加入SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或者SEQ ID NO:14的氧化还原酶和/或共底物。
反应结束后,处理反应混合物。如果需要,将水相与有机相分离,然后过滤含产物的有机相。如果需要还可以提取水相,如同进一步处理有机相一样。然后,蒸发有机相的溶剂,其中含有作为粗产物的通式II的二醇。可以进一步纯化所述粗产物,或者直接用于下面产物的合成。
下列实施例将用于进一步说明本发明。
实施例1
从喜木聚糖红色杆菌DSM 9941中克隆氧化还原酶
A)培养喜木聚糖红色杆菌DSM 9941
在细菌振荡培养箱中,将喜木聚糖红色杆菌DSM 9941细胞于50℃(pH7.2),以140rpm,在下列介质中培养:0.1%酵母提取物、0.1% Trypton、0.004% CaSO4x2H2O、0.02% MgCl2x6H2O、0.01%次氮基三乙酸、100mg磷酸盐缓冲液[5.44g/lKH2PO4,43g/l Na2HPO4 x12H2O]、500μl/l 0.01M柠檬酸铁、500μl/l示踪元素[500μl/l H2SO4,2.28g/l MnSO4 x H2O,500mg/l ZnSO4 x7H2O,500mg H3BO3,25mg/l CuSO4 x 5H2O,25mg/l Na2MoO4 x2H2O,45mg/l CoCl2x 6H2O]。在培养第6天后,将培养介质离心分离细胞,然后于-80℃贮存。
B)扩增编码选择性氧化还原酶的基因
按照Manniatis & Sambrook在“分子克隆”中的描述方法提取基因组DNA。用所得的核酸作为聚合酶链反应(PCR)反应的模板,这里使用NCBI数据库中46106817公开的基因序列衍生的特异性引物。这里,引物在5’-末端提供有用于核酸内切酶Nole 1和Hind III的限制性切割位,以用于随后克隆到表达载体。(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7)。
在PCR缓冲液[10mM Tris-HCl,(pH8.0);50mM KCl;10mM MgSO4;1mMdNTP Mix;每20 pMol引物和2.5U铂Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)]中,使用500ng基因组DNA和下列温度循环进行扩增:
循环1:     94℃,2分钟
循环2 x 30:94℃,15秒
            54℃,30秒
            68℃,60秒
循环3:     68℃,7分钟
            4℃,∞
所得大小约750bp的PCR产物用1%琼脂糖凝胶纯化后,用核酸内切酶NdeI和Hind III或者SphI和Hind III限制切割,然后与用相同核酸内切酶处理过的pET21a载体主链(Novagen)或者pQE70载体(Qiagen)连接。转化2μl连接液至大肠杆菌Top 10F’细胞(Invitrogen)后,用核酸内切酶Nde I和Hind III或者SphI和Hind III限制分析检测质粒-DNA-氨苄青霉素-抗性菌落,检测750bp大小的插入片段的存在情况。对来自对所述片段正性的菌落的质粒制备物进行序列分析,然后转化至大肠杆菌BL21菌株(Invitrogen)或者大肠杆菌RB791(genetic stock,Yale)。
实施例2
在大肠杆菌细胞中有效表达SEQ ID NO:1多肽
为了在大肠杆菌细胞中有效表达SEQIDNO:1多肽,为了在表达载体中克隆,用编码DNA SEQ ID NO:3作为PCR反应中的模板。所述DNA序列与前述DNA序列(SEQ ID NO:2)的前160个碱基对有51个碱基不同。所述修饰是保守的,不会改变氨基酸序列。
在含50ng DNA SEQ ID NO:3作为模板的PCR缓冲液[10mM Tris-HCl,(pH8.0);50mM KCl;10mM MgSO4;1mM dNTP Mix;每20pMol引物(SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:5)和2.5U铂Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)]中,按下列温度循环完成扩增:
循环1:   94℃,2分钟
循环2x30:94℃,40秒
          56℃,30秒
          68℃,60秒
循环3:   68℃,7分钟
          4℃,∞
所得大小约750bp的PCR产物用1%琼脂糖凝胶纯化后,用核酸内切酶NdeI和Hind III在与用相同核酸内切酶处理过的pET21a载体(Novagen)主链中连接。转化2μl连接液至大肠杆菌Top 10F’细胞(Invitrogen)后,用核酸内切酶Nde I和Hind III限制分析检测质粒-DNA-氨苄青霉素-抗性菌落,检测750bp大小的插入片段的存在情况。对来自对所述片段正性的菌落的质粒制备物进行序列分析,然后转化至大肠杆菌BL21菌株(Invitrogen)
实施例3
来自喜木聚糖红色杆菌DSM 9941的氧化还原酶的制备
将表达构建体转化的大肠杆菌菌株BL21 Star(Invitrogen,Karlsruhe,德国)或者RB791(大肠杆菌genetic stock,Yale,USA)在含氨苄青霉素(50μg/ml)的培养基(1% Tryptone,0.5%酵母提取物,1% NaCl)中培养,直到光密度可达到0.5在550nm下测量。通过加入0.1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达。在25℃,220rpm诱导后16小时,收集细胞,并冷冻于-20℃。
为了进行酶提取,将30g细胞悬浮于150ml三乙醇胺缓冲液(100mM,pH=7,2mM MgCl2,10%甘油)中,然后用高压匀浆机分解。然后,将所述酶溶液用150ml甘油混合,并于-20℃贮存。
将这样获得的酶溶液用于合成叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯。
在稀释的情况下,所得的酶溶液也用于相应的酶测量。活性检测按如下:870μl 100mM TEA-缓冲液,pH7.0,160μg NAD(P)H,10μl稀释的细胞溶解物。通过向反应混合物中加入100μl 100mM叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯溶液而启动反应。
实施例4
用氧化还原酶SEQ ID NO:1将叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯转化为 叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯
为了将叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯转化为叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯,按Eppendorf反应设备中,将由下列物质组成的混合物在室温恒定混合下培养24小时:900μl缓冲液(100mM TEA,pH=7,1mM MgCl2),100μl 2-丙醇、10μl叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯粗产品(对映异构体纯度>99%)、0.1mg NAD和100μl酶悬浮液(见实施例3)。24小时后,96%所用叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯还原为叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯。剩余非对映异构体过量>99%。
用手性气相色谱跟踪测定转化率以及非对映异构体过量。为此,使用Shimadzu的Gax-Chromatograph GC-17A,其带有手性分离柱CP-Chirasil-DEXCB(Varian Chrompack,Darmstadt,德国),Flammen-Ionisations-Detektor,用氦作为载气。
在0.72bar,10分钟,50℃,5℃/分钟→200℃10分钟分离叔-丁基-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯。
保留时间为:(R-BCH)4.4分钟;(R,R-BCH)47.1分钟和(R,S-BCH)48.2分钟。
实施例5
用氧化还原酶SEQ ID NO:1从叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯合成为 叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯
为了进一步将叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯转化成为叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯,在Eppendorf反应设备中,将由下列物质组成的混合物培养:550μl缓冲液(100mM TEA,pH=7,1mM MgCl2),150μl 2-丙醇、200μl叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯粗产品(对映异构体纯度>99%)、0.1mg NAD和200μl酶悬浮液(见实施例3)。在反应过程中,产生的丙酮/2-丙醇混合物多次通入氮气蒸发,并加入新鲜的2-丙醇和50μl酶。24小时内重复2-3次后,>90%的所用叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯被还原为叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯。非对映异构体过量>99%。
实施例6
通过氧化还原酶SEQ ID NO:1从叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯合成 叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯
为了进一步将叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯转化为叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯,在反应容器中,在45℃培养下列混合物:6.7ml缓冲液(100mM TEA,pH=9),1.7ml 2-丙醇、2ml叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯粗产品(对映异构体纯度>99%)、1.0mg NAD和150mg冷冻的大肠杆菌BL21菌株细胞,所述细胞中含氧化还原酶SEQ ID NO:1(见实施例3)。24小时后,>90%的所用叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯被还原为叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯。非对映异构体过量>99%。
实施例7
通过氧化还原酶SEQ ID NO:8从叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯合成 叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯
为了进一步将叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯转化为叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯,在反应容器中,在40℃保温下列混合物:5.0ml缓冲液(100mM TEA,pH=7.5),2.0ml 2-丙醇、4.0ml叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯粗产品(对映异构体纯度>99%)、1.0mg NAD和250mg冷冻大肠杆菌RB791菌株细胞,所述细胞中含氧化还原酶SEQ ID NO:8(见相应实施例2和3)。24小时后,>90%的所用叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯被还原为叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯。非对映异构体过量>99%。
实施例8
通过氧化还原酶SEQ ID NO:11从叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯合成 叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯
为了将叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯转化为叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯,在Eppendorf反应容器中,在室温且恒定混合下,保温下列混合物48小时:350μl缓冲液(100mM磷酸钙,pH=7),150μl 2-丙醇、50μl叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯粗产品(对映异构体纯度>99%)、0.025mg NAD和15μl酶悬浮液SEQ ID NO:11(见实施例3)。48小时后,>80%的所用叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯被还原为叔-丁基(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸酯。非对映异构体过量>99%。
SEQ ID NO:1
1   mlegkvavit gagsgigrat alrfaregar vvvaelderr
41  geevvreile sggeavfvrt dvsefeqvea averaveeyg
81  tldvmfnnag ighyaplleh dpehydrvvr vnqygvyygi
121  laagrkmael enpgviinta svyaflaspg vigyhaskga
161  vkmmtqaaal elaphgirvv aiapggvdtp iiqgykdmgl
201  gerlargqmr rrlqtpeqla gavvllatee adaingsvvm
241  tddgyaefk
SEQ ID NO:2
1 atgctcgaggggaaggtcgcggtcatcacgggggccggca
41 gcggcataggccgggccaccgcgctcaggttcgcccgcga
81 aggggcccgggtggtcgtggcggagctcgacgagcggagg
121 ggggaggaggtcgtccgggagatcctcgagtccggcgggg
161 aggccgtcttcgtgaggacggacgtctcggagttcgagca
201 ggttgaggccgccgtcgagcgcgccgtcgaggagtacggg
241 acgctggacgtcatgttcaacaacgccggcatcgggcact
281 acgcccccctgctggagcacgacccggagcactacgaccg
321 ggtggtccgggtgaaccagtacggcgtctactacgggata
361 ctcgccgccggcaggaagatggccgagctggagaaccccg
401 gcgtgatcatcaacaccgcctcggtctacgctttcctggc
441 ctcccccggtgtgatcggctatcacgcttccaagggggcg
481 gtgaagatgatgacccaggccgcagccctggagctcgccc
521 cccacggcatacgggtcgtcgccatcgccccgggcggggt
561 ggacaccccgatcatccagggctacaaggacatgggcctc
601 ggtgagcggctggcccgcggccagatgcgtcgcaggctcc
641 agacccccgagcagatcgccggcgccgtcgtcctgctcgc
681 caccgaggaggcagacgccataaacggctcggtggtgatg
721 accgacgacggctacgcggagttcaagtaa
SEQ ID NO:3
1   atgctggaag gtaaagtggc agtcatcacc ggtgcaggca
41  gcggcattgg gcgtgccact gcgctgcgtt ttgcgcgtga
81  aggcgctcgc gtcgttgtgg ccgagctgga tgaacgtcgc
121 ggtgaggaag ttgtacgtga gattctggaa tctggcgggg
161 gggaggccgt cttcgtgagg acggacgtct cggagttcga
201 gcaggttgag gccgccgtcg agcgcgccgt cgaggagtac
241 gggacgctgg acgtcatgtt caacaacgcc ggcatcgggc
281 actacgcccc cctgctggag cacgacccgg agcactacga
321 ccgggtggtc cgggtgaacc agtacggcgt ctactacggg
361 atactcgccg ccggcaggaa gatggccgag ctggagaacc
401 ccggcgtgat catcaacacc gcctcggtct acgctttcct
441 ggcctccccc ggtgtgatcg gctatcacgc ttccaagggg
481 gcggtgaaga tgatgaccca ggccgcagcc ctggagctcg
521 ccccccacgg catacgggtc gtcgccatcg ccccgggcgg
561 ggtggacacc ccgatcatcc agggctacaa ggacatgggc
601 ctcggtgagc ggctggcccg cggccagatg cgtcgcaggc
641 tccagacccc cgagcagatc gccggcgccg tcgtcctgct
681 cgccaccgag gaggcagacg ccataaacgg ctcggtggtg
721 atgaccgacg acggctacgc ggagttcaag taa
SEQ ID NO:4
GGGAATTCCATATGATGCTCGAGGGGAAGGTCG
SEQ ID NO:5
CCCAAGCTTATTACTTGAACTCCGCGTAGCCGTC
SEQ ID NO:6
CCTAGCTAGCATGCTGGAAGGTAAAGTGGC
SEQ ID NO:7
CACATGCATGCGAATGCTCGAGGGGAAGGTC
SEQ ID NO:8
Geobacillus thermodenitrificans DSM 465蛋白质序列羰基还原酶
1   mrlkgkaaiv tggasgigra tairfaeega kvavsdinee ggeetvrlir ekggeaifvq
61  tdvadskqvs rlvqtavdaf gglhilfnna gighsevrst dlseeewdrv invnlkgvfl
121 gikyavpvmk qcgggaivnt ssllgikgkk yesaynaska gvilltknaa leygkfnirv
181 naiapgvidt niitpwkqde rkwpiiskan algrigtpee vanavlflas deasfitgat
241 lsvdgggltf
SEQ ID NO:9
Geobacillus thermodenitrificans DSM 465核酸序列羰基还原酶
1   atgaggctaa aaggaaaagc ggcgattgtc accggcggc gcgagcggcat cggccgggcg
61  acggcgattc gctttgcgga agaaggcgcc  aaagtggcgg tgagcgacat caatgaggaa
121 ggaggggaag aaacggtccg cctgattcgg gaaaaaggag gggaggcgat ttttgtccaa
181 acggacgtag ccgattccaa gcaagtgagc cgccttgtcc aaacggcgqt tgatgccttt
241 ggcggcctac atattctctt taacaatgcc ggcatcggcc attcggaagt gcggagcacc
301 gacttgtctg aagaagagtg ggaccgggtc atcaacgtta atttgaaagg agtgttcctt
361 ggcatcaaat acgcggtgcc cgtgatgaag caatgcggtg gcggggccat tgtcaacaca
421 tcgagcctgc ttggaatcaa agggaaaaag tacgaatcgg cctacaacgc ctcgaaggcc
481 ggggtgattt tgttgacgaa aaatgcagca ttggaatatg ggaagtttaa cattcgcgtc
541 aatgccattg caccgggggt cattgatacg  aacatcatca cgccgtggaa acaagatgag
601 cgcaaatggc cgatcatttc gaaagcgaac gccctcggcc gcatcgggac gccagaggaa
661 gtggcgaacg cggtgttgtt tttggcgtcc  gatgaagcgt cgtttatcac  cggcgcgaca
721 ttgtcggtcg acggcggcgg gctgacgttt tag
SEQ ID NO:10
Geobacillus thermodenitrificans DSM 465核酸序列合成基团
1   atgcgcctga aagggaaagc ggcaattgtg acgggtggcg ccagcggcat cgggcgcgcg
61  actgcgatcc gttttgcaga agagggtgcg aaagttgccg ttagcgacat taacgaggaa
121 ggcggtgagg aaaccgttcg cctgatccgt gaaaaaggcg gtgaggcaat cttcgtgcag
181 acggatgtgg ccgactcaaa acaggtatct cgtctggttc agaccgcggt cgacgcgttt
241 ggtggcctgc acatcctgtt caataacgcc ggcattggcc atagcgaagt gcgtagtact
301 gatctgagcg aggaagagtg ggatcgcgtg attaacgtga acctgaaagg tgtgtttctg
361 ggtattaagt atgcagtccc tgttatgaaa cagtgtggcg  gtggtgcgat tgtgaatacc
421 tctagtctgt tgggaatcaa agggaaaaag tatgaatcgg cctacaacgc atcgaaagcc
481 ggcgtcatcc tgctgaccaa aaatgcggcc ctggagtatg gcaagttcaa tattcgtgtc
541 aacgcgatcg ctccaggcgt tatcgatacc aacatcatta caccgtggaa gcaagatgaa
601 cgcaagtggc cgattatctc caaagctaat gcgctgggcc gtatcggtac gccggaagaa
661 gtggctaatg cggttctgtt tctggcaagc gacgaagcga gctttattac gggtgcaacc
721 ctctccgtag atgggggcgg gttaaccttc taa
SEQ ID NO:11
橙色绿屈挠菌 DSMz635 蛋白质序列羰基还原酶
1   meppfigkva lvtgaaagig rasalafare gakvvvadvn veggeetial cralntdamf
61  vrcdvsqrde verlialavd tfgridfahn nagiegvqam ladypeevwd rvieinlkgv
121 wlcmkyeirh mlkggggaiv ntssvaglag srgvsayvas khgivgitka aaleyarngi
181 rvnaicpgti htamidrftq gdpqllaqfa egepigrlgs peevanaviw lcsdkasfvt
241 gatlavdggr la
SEQ ID NO:12
橙色绿屈挠菌 DSMz 635 核酸序列羰基还原酶
1   atggagccac ctttcattgg gaaggttgcg ctggtcaccg gcgcagcagc cggtattggt
61  cgtgcttcag cactggcgtt tgcccgtgag ggtgccaagg ttgtcgttgc tgatgtgaat
121 gtcgagggcg gggaagagac gattgcgctg tgtcgggctt tgaataccga tgcaatgttc
181 gtgcgttgtg atgtttcgca acgcgatgaa gtggagcgat taattgctct ggcagttgac
241 acgttcggtc ggatcgactt tgcgcacaac aacgccggga ttgaaggcgt gcaggcaatg
301 ctggccgatt atcccgaaga ggtctgggat cgggtgatcg agatcaacct caaaggggtc
361 tggttgtgta tgaagtacga aatccggcac atgctcaagc agggtggcgg tgcgattgtg
421 aatacctcat cggtcgccgg tctggccgga tcacgtggcg tttcggcgta tgtagccagc
481 aagcacggta ttgttggtat taccaaagcg gcagcccttg agtatgcgcg taacggtatt
541 cgtgtcaacg caatctgtcc aggtacgatt catactgcga tgatcgaccg ctttacccag
601 ggtgatcccc aactgcttgc ccagttcgct gagggtgaac cgattggtcg gctcggctcg
661 cctgaagagg tcgccaatgc ggtgatctgg ctctgctcag ataaggcttc gtttgtgacc
721 ggagcgacac tggcggttga tggtggccgc ctggcgtaa
SEQ ID NO:13
橙色绿屈挠菌 DSMz635 核酸序列合成基团
1   atggagcccc catttatcgg gaaagttgcg ttagttacgg gggcagcggc agggatcggc
61  agggcgagtg ccctggcgtt tgctagagaa ggggccaagg tcgttgtggc agacgttaac
121 gtagagggtg gcgaagagac aattgcttta tgcagagctc tcaacactga tgccatgttc
181 gtccgctgtg atgtgtcaca gcgagacgaa gtcgaaaggc taatcgccct agcggtagac
241 acattcggcc gtattgactt tgctcataat aacgcgggca tagagggagt acaagcaatg
301 ttggctgact atcctgagga agtatgggat cgagtaattg aaatcaatct caagggggtt
361 tggctgtgta tgaagtacga aataaggcac atgctcaagc aaggtggcgg agcgatcgta
421 aacactagct ctgtcgccgg tctagcagga tctcgggggg tttccgcata cgtcgcctcg
481 aaacacggca ttgtagggat taccaaagct gcagcccttg agtatgcccg aaatggaata
541 agagtgaatg ctatctgccc aggcacaata catactgcaa tgatagatcg gtttacgcag
601 ggtgatccgc aacttttggc gcagttcgcc gaaggtgagc ctataggtcg ccttggtagc
661 ccggaagagg tcgctaatgc ggtgatttgg ttgtgttcag acaaagcaag tttcgtgacg
721 ggagctaccc tggcagtgga tggaggacgt ttagct
SEQ ID NO:14
Candida magnoliae CBS 6396蛋白质序列羰基还原酶
1   msatsnalit gasrgmgeat aiklalegys vtlasrgieq lnaikeklpi vkkgqqhyvw
61  qldlsdieaa stfkgaplpa ssydvffsna gvvdfapfad qsetaqkdlf tvnllspval
121 tktivkaiad kpretpahii ftssivgirg vpnvavysat kgaidsfars larefgpkni
181 hvncvnpgtt rtemtkgvdl aafgdvpikg wievdaiada vlflikskni tgqslvvdng
241 fgv
SEQ ID NO:15
Candida magnoliae CBS 6396核酸序列合成基团
1   atgtctgcta cttcgaacgc tcttatcact ggtgccagcc gcggaatggg cgaggccaca
61  gctattaagc ttgcccttga ggggtacagc gtcacccttg catcacgcgg tattgagcag
121 ctcaatgcca tcaaggaaaa actacccatc gtgaagaagg gccagcagca ctacgtttgg
181 cagctcgatc ttagtgacat cgaggcggct tccaccttca agggggctcc tctgcctgcc
241 agcagctacg acgtgttctt cagcaacgcc ggtgtggtgg actttgctcc gttcgcagac
301 caaagcgaga ctgcgcaaaa ggacctgttc acggttaacc tgctgtcgcc tgttgcgttg
361 accaagacca ttgttaaggc catcgccgac aagccccgcg agacgcctgc tcacattatc
421 ttcacctcgt ccattgtcgg aattcgcggt gttcccaacg tggcggtcta  cagcgccacc
481 aagggcgcga ttgacagctt tgcgcgctcg cttgctcgtg agttcggtcc caagaacatc
541 cacgttaact gcgtgaaccc gggcacgacg cgcaccgaga tgacaaaggg cgttgatctc
601 gcggctttcg gcgatgttcc tatcaagggc tggatcgaqq tcgatgcgat tgccgacgct
661 gtgctgtttt tgatcaagtc caagaacatc actggccagt cgctcgttgt tgacaacgga
721 ttcggtgttt aa
序列表
<110>IEP GmbH
<120>对映体选择性酶促还原羟基酮化合物的方法
<130>I9844
<150>AT A 2027/2005
<151>2005-12-19
<160>15
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>249
<212>PRT
<213>喜木聚糖红色杆菌DSM 9941
<400>1
Figure A200680047754D00201
Figure A200680047754D00211
<210>2
<211>750
<212>DNA
<213>喜木聚糖红色杆菌DSM 9941
<400>2
Figure A200680047754D00221
<210>3
<211>753
<212>DNA
<213>合成的构建体
<400>3
Figure A200680047754D00231
<210>4
<211>33
<212>DNA
<213>合成的构建体
<400>4
Figure A200680047754D00232
<210>5
<211>34
<212>DNA
<213>合成的构建体
<400>5
Figure A200680047754D00233
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>合成的构建体
<400>6
Figure A200680047754D00241
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>合成的构建体
<400>7
Figure A200680047754D00242
<210>8
<211>250
<212>PRT
<213>Geobacillus thermodeni trificans DSM 465
<400>8
Figure A200680047754D00243
<210>9
<211>753
<212>DNA
<213>geobacillus thermodenitrificans DSM 465
<400>9
Figure A200680047754D00261
<210>10
<211>753
<212>DNA
<213>合成的构建体
<400>10
Figure A200680047754D00262
Figure A200680047754D00271
<210>11
<211>252
<212>PRT
<213>橙色绿屈挠菌 DSM 635
<400>11
Figure A200680047754D00272
Figure A200680047754D00281
<210>12
<211>759
<212>DNA
<213>橙色绿屈挠菌 DSM 635
<400>12
Figure A200680047754D00291
<210>13
<211>756
<212>DNA
<213>合成的构建体
<400>13
Figure A200680047754D00292
<210>14
<211>243
<212>PRT
<213>Candida magnoliae CBS 6396
<400>14
Figure A200680047754D00311
Figure A200680047754D00321
<210>15
<211>732
<212>DNA
<213>Candi damagnol iae CBS 6396
<400>15
Figure A200680047754D00322

Claims (11)

1、对映体选择性酶促还原通式I羟基酮的方法
Figure A200680047754C00021
所述通式I中,R1=C1-C6烷基,R2=-Cl,-CN,-OH,-H或者C1-C6烷基,以得到通式II的手性二醇:
其中R1与R2与通式I中的含义相同,
其中在NADH或者NADPH作为辅因子的条件下,用氧化还原酶还原羟基酮,其特征在于
a)羟基酮在反应混合物中的浓度≥50g/l,
b)通过通式RXRYCHOH的二级醇氧化持续再生所得的氧化辅因子NAD或者NADP,其中RX,RY彼此独立是氢、支链或者无支链C1-C8烷基,且C总数≥3,和
c)羟基酮的还原和二级醇的氧化是由相同的氧化还原酶催化。
2、根据权利要求1的方法,其特征在于,所述氧化还原酶
a)含有氨基酸序列,其中至少50%的氨基酸与氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或者SEQ ID NO:14的那些相同,
b)由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13或者SEQ ID NO:15的核酸序列编码,或者
c)由在严格条件下,与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或者SEQ ID NO:15杂交的核酸序列编码。
3、对映体选择性酶促还原通式I羟基酮的方法
Figure A200680047754C00031
所述通式I中,R1=C1-C6烷基,R2=-Cl,-CN,-OH,-H或者C1-C6烷基,以得到通式II的手性二醇:
其中R1与R2与通式I中的含义相同,
其中在辅因子存在的条件下,用氧化还原酶还原羟基酮,其特征在于所述氧化还原酶
a)含有氨基酸序列,其中至少50%的氨基酸与氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11或者SEQ ID NO:14的那些相同,
b)由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13或者SEQ ID NO:15的核酸序列编码,或者
c)由在严格条件下,与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或者SEQ ID NO:15杂交的核酸序列编码。
4、根据权利要求3的方法,其特征在于,辅因子被共底物持续还原。
5、权利要求3或者4的方法,其特征在于用NAD(P)H作为辅因子。
6、权利要求1-5的任一项的方法,其特征在于用2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-庚醇或者2-辛醇作为共底物或者二级醇。
7、根据权利要求1-6的任一项的方法,其特征在于所述羟基酮占总反应体积的5-50重量%,优选8-40重量%,特别优选10-25重量%。
8、根据权利要求1-7的任一项的方法,其特征在于用叔-丁基(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸酯、叔-丁基(5S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸酯或者叔-丁基(5S)-5,6-二羟基-3-氧代己酸酯作为通式I的羟基酮。
9、根据权利要求1-8的任一项的方法,其特征在于TTN(总转化数=mol还原的羟基酮/mol所用的辅因子)≥103
10、根据权利要求1-9的任一项的方法,其特征在于所述方法在含水有机两相系统中进行。
11、根据权利要求1-10的任一项的方法,其特征在于别外地使用有机溶剂,如乙醚、叔-丁基甲基醚、二异丙基醚、二丁基醚、乙酸丁酯、庚烷、己烷或者环己醇。
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