KR101344605B1

KR101344605B1 - 하이드록시케토 화합물의 거울상이성질체선택성 효소적환원 방법

Info

Publication number: KR101344605B1
Application number: KR1020087017190A
Authority: KR
Inventors: 안트예 굽타; 마리아 보브코바; 앙케 췐쳐
Original assignee: 이에페 게엠베하
Priority date: 2005-12-19
Filing date: 2008-07-15
Publication date: 2013-12-26
Also published as: PT1963516E; US8980592B2; AT503017A4; EP1963516A1; CA2633583A1; EP1963516B1; AT503017B1; WO2007073875A1; DK1963516T3; TW200801196A; AU2006331069A1; KR20080087000A; JP5328365B2; PL1963516T3; DE502006008961D1; US9228214B2; ZA200805336B; US20150152451A1; JP2009519722A; CN101432435A

Abstract

일반식 (Ⅱ)의 키랄 디올을 얻기 위한, 일반식 (Ⅰ)의 하이드록시케톤의 거울상이성질체선택성(enantioselective) 효소적 환원 방법에서,

여기서 R₁ = C₁-C₆ 알킬 및 R₂ = -Cl, -CN, -OH, -H 또는 C₁-C₆ 알킬이고,

여기서 R₁ 및 R₂는 식 (Ⅰ)에서와 동일한 의미를 갖고,

상기 하이드록시케톤은 보조인자(cofactor)로서 NADH 또는 NADPH의 존재 하에 산화환원효소로 환원되며, 여기에서

a) 상기 하이드록시 케톤은 ≥50 g/l의 농도로 반응에 제공되고,

b) 형성된 산화된 보조인자 NAD 또는 NADP는 일반식 R_XR_YCHOH의 2차 알콜의 산화에 의해 지속적으로 재생되고, 여기서 R_X,R_Y는 독립적으로 수소, 분지 또는 비분지 C₁-C₈-알킬을 나타내며, C_total ≥ 3이고,

c) 상기 하이드록시 케톤의 환원 및 상기 2차 알콜의 산화는 동일한 산화환원효소에 의해 촉매된다.

Description

하이드록시케토 화합물의 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법{METHOD FOR THE ENANTIOSELECTIVE ENZYMATIC REDUCTION OF HYDROXYKETO COMPOUNDS}

본 발명은 일반식 (Ⅰ)의 하이드록시케톤의, 일반식 (Ⅱ)의 키랄 디올로의 거울상이성질체선택성(enantioselective) 효소적 환원 방법에 관한 것으로,

여기서 R₁ 및 R₂는 일반식 (Ⅰ)에서와 동일한 의미를 갖고, 상기 하이드록시케톤은 보조인자(cofactor)의 존재 하에 산화환원효소로 환원된다.

일반식 (Ⅱ)의 키랄 디올은 약학적 제품의 제조에서, 특히 HMG-CoA 환원효소 억제제의 제조에서 중요한 중간체이다. 그러한 키랄 디올은, 예를 들어, tert-부틸 (3R,5S)-6-클로로-3,5-디하이드록시헥사노에이트, tert-부틸 (3R,5R)-6-시아노- 3,5-디하이드록시헥사노에이트 또는 tert-부틸 (5S,3R)-3,5,6-트리하이드록시-헥사노에이트이다.

이러한 종류의 디올은 예를 들어, tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트, tert-부틸 (5S)-6-클로로-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트 또는 tert-부틸 (5S)-5,6-디하이드록시-3-옥소헥사노에이트와 같은 식 (Ⅰ)의 상응하는 하이드록시 케톤의 거울상이성질체선택성(enantioselective) 환원에 의해 제조된다. 그와 같이 행함에 있어서, 화학적으로 촉매된 환원은 한편으로는, 가혹한 반응 조건에 기인한 부산물을 초래할 수 있고, 다른 한편으로는, 불만족스러운 거울상 이성질체 및 부분입체이성질체 초과량을 각각 얻고, 매우 막대한 노력으로만 기술적으로 실현 가능하다는 단점을 갖는다.

이러한 이유로, 한동안 전술한 하이드록시 케톤의 거울상이성질체선택성 환원을 가능하게 하는 생촉매적 프로세스를 개발하기 위한 노력이 행해졌다. 생촉매적 프로세스는 통상적으로 온화한 조건 하에서 작동하며, 이는 이들이 추가의 부산물의 형성 없이, 결국 더욱 불안정한 5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트 유도체의 환원을 가능하게 할 것으로 기대될 수 있기 때문이다. 그러나, 지금까지는 전술한 5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트 유도체의 효소적 환원이, 유효한 방식으로 및 분리된 효소와 함께 실현 가능한 것에 의해, 적절한 생촉매를 발견하는 것이 불가능했다.

예를 들어, 미국 특허 제6,001,615호 및 국제특허출원 WO01/85975A1은 Beauvaria, Pichia , Candida , Kluyveromyces 및 Torulaspora 속(genus)의 다양한 효모와 함께, 각각 tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트 및 tert-부틸 (5S)-5,6-디하이드록시-3-옥소헥사노에이트의 환원을 기재하고 있다. 그러나, 그에 의해, 전화는 야생 주의 전체 세포로만 발생하고, 그에 따라 5%보다 훨씬 낮은 매우 낮은 농도에서만 수행될 수 있다. 지금까지 상기 전화의 원인이 되는 효소 및 DNA 서열을 동정하는 것은 가능하지 않았다.

또한 구조적으로 유사한 화합물의 미생물적 전화는 EP 0 569 998 B1에 기재되어 있다. 거기에는, Acinetobacter calcoaceticus ATCC 33305로부터 NADH-의존성 효소를 정제하는 것도 가능하며, 이는 또한 조효소 재생을 위해 글루코오스 탈수소효소와 함께 고립된 상태에서 사용된다. 기술된 프로세스에서, 기질은 1%의 농도로 사용되고, 단지 10의 NADH의 "전체 전환수(total turn over number)"가 달성된다. 산업적으로 적용가능한 프로세스는 제시되지 않았다.

미국 특허 명세서 제6,645,746 B1에서는, Candida magnoliae로부터의 아미노산 서열이 기재되어 있으며, 이는 NADPH의 보조로, tert-부틸 (5S)-6-클로로-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트를 tert-부틸 (3R,5S)-6-클로로-3,5-디하이드록시헥사노에이트로 환원시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 문헌의 명세서에서, 효소는 바람직하게는 Bacillus megaterium로부터의 글루코오스 탈수소효소와 동시발현된 상태에서 사용되며, 여기서 보조인자(cofactor) NADPH의 재생은 글루코오스 탈수소효소의 보조로 공동기질(cosubstrate)로서 글루코오스와 함께 발생한다.

본 발명의 목적은 어떠한 부산물도 없이 높은 거울상이성질체 순도로 및 높은 수율로, 일반식 (Ⅱ)의 거울상이성질체적으로 순수한 디올의 경제적인 생산을 가능하게 하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따라, 이러한 목적은 처음에 언급한 유형의 방법에 의해 달성되며, 여기서 산화환원효소는, 보조인자(cofactor)로서의 NADH 또는 NADPH의 존재 하에서 환원되고, 또한

a) 하이드록시 케톤은 ≥50 g/l의 농도로 반응에 제공되고,

c) 상기 하이드록시 케톤의 환원 및 상기 2차 알콜의 산화는 동일한 산화환원효소에 의해 촉매되는 것을 특징으로 한다.

상기 방법의 바람직한 구현예는 산화환원효소가,

a) 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산의 적어도 50%가, 아미노산 서열인 서열식별번호:1, 서열식별번호:8, 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:14의 아미노산과 동일한 것,

b) 핵산 서열인 서열식별번호:2, 서열식별번호:3, 서열식별번호:9, 서열식별번호:10, 서열식별번호:12, 서열식별번호:13 또는 서열식별번호:15에 의해 코딩되는 것, 또는

c) 엄격한 조건(stringent condition) 하에서 서열식별번호:2, 서열식별번호:3, 서열식별번호:9, 서열식별번호:10, 서열식별번호:12, 서열식별번호:13 또는 서열식별번호:15에 하이브리드하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 전술한 목적은 또한 처음에 언급한 유형의 방법에 의해 달성되며, 여기서 산화환원효소는,

a) 아미노산의 적어도 50%가, 아미노산 서열인 서열식별번호:1, 서열식별번호:8, 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:14의 아미노산과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것,

c) 엄격한 조건 하에서 서열식별번호:2, 서열식별번호:3, 서열식별번호:9, 서열식별번호:10, 서열식별번호:12, 서열식별번호:13 또는 서열식별번호:15에 하이브리드하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것임을 특징으로 한다.

아미노산 서열인 서열식별번호:1, 서열식별번호:8 및 서열식별번호:11을 포함하는 폴리펩티드는 산화환원효소 활성을 나타내고, > 99% 초과량의 부분입체이성질체와 함께 tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트를 tert-부틸 (3R,5R)-6-시아노-3,5-디하이드록시헥사노에이트로 환원하기 위해 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 일반식 (I)의 다른 하이드록시 케톤은 아미노산 서열인 서열식별번호:1, 서열식별번호:8 및 서열식별번호:11에 의해 동일한 방식으로 환원될 수 있다.

또한, 전술한 산화환원효소는 2차 알콜을 환원함으로써 환원 중 형성된 산화된 보조인자를 재생할 수 있다는 장점을 갖는다. 따라서, 상기 산화환원효소의 특별한 경제적 장점은 또한 종래 기술(US 6,645,746 B 및 EP 0 569 998 B)의 방법과는 대조적으로, 보조인자 재생을 위해 어떠한 효소도 요구되지 않는다는 점으로 구성된다.

서열식별번호:1을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열인 서열식별번호:2는, 예를 들어 생물 Rubrobacter xylanophilus DSM 9941의 게놈으로부터 얻을 수 있다. 또한 Escherichia에서 서열식별번호:1의 폴리펩티드를 발현하기 위해, DNA 서열인 서열식별번호:3이 사용될 수 있음이 밝혀졌다.

서열식별번호:8을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열인 서열식별번호:9는, 예를 들어 생물 Geobacillus thermodenitrificans DSM 465의 게놈으로부터 얻을 수 있다. 또한 Escherichia에서 서열식별번호:8의 폴리펩티드를 발현하기 위해, DNA 서열인 서열식별번호:10이 사용될 수 있음이 밝혀졌다.

서열식별번호:11을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열인 서열식별번호:12는, 예를 들어 생물 Chloroflexus aurantiacus DSM 635의 게놈으로부터 얻을 수 있다.

서열식별번호:14를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열인 서열식별번호:15는, 예를 들어 생물 Candida magnoliae CBS 6396의 게놈으로부터 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 아미노산 서열인 서열식별번호:1, 서열식별번호:8, 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:14를 포함하는 폴리펩티드, 또는 아미노산 서열인 서열식별번호:1, 서열식별번호:8, 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:14와 적어도 50% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 즉 서열식별번호:1, 서열식별번호:8, 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:14의 적어도 하나의 아미노산으로부터 치환, 삽입, 결실 또는 추가에 의해 유도될 수 있는 폴리펩티드를 사용하여, 또는 핵산 서열인 서열식별번호:2, 서열식별번호:9, 서열식별번호:12 또는 서열식별번호:15에 의해 코딩되거나, 또는 엄격한 조건 하에서 서열식별번호:2, 서열식별번호:9, 서열식별번호:12, 또는 서열식별번호:15에 하이브리드하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 사용한, 일반식 (I)인 하이드록시 케톤의 일반식 (Ⅱ)인 디올로의 환원 방법에 관한 것이다.

예를 들어, 엄격한 조건 하에서 서열식별번호:2에 하이브리드하는 핵산 서열에 의해, 폴리뉴클레오티드는 DNA 탐침으로서 서열식별번호:2를 사용하여, 콜로니 하이브리드화법, 플라크 하이브리드화법, 서던 하이브리드화법(Southern hybridization method), 또는 이들과 유사한 방법을 통해 동정될 수 있는 것으로 이해된다.

이를 위해, 필터 상에 고정된 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 60℃에서 0.7-1 M NaCl 용액 중에서 서열식별번호:2에 하이브리드화된다. 하이브리드화는 예를 들어, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 또는 이와 유사한 간행물에 기재된 바와 같이 수행된다. 후속적으로, 상기 필터는 65℃에서 0.1 내지 2배 SSC 용액으로 세척되며, 여기서 1배 SSC 용액은 150 mM NaCl 및 15 mM 구연산나트륨으로 구성된 혼합물인 것으로 이해된다.

본 발명에 따른 방법에서, 서열인 서열식별번호:1, 서열식별번호:8, 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:14를 포함하는 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드들로부터 유도 가능한 폴리펩티드는, 완전히 정제된 상태로, 부분적으로 정제된 상태로 또는 폴리펩티드 서열식별번호:1, 서열식별번호:8, 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:14를 포함하는 세포로서 각각 사용될 수 있다. 그에 의해, 사용되는 세포는 천연, 투과된(permeabilized) 또는 용해된(lysed) 상태로 제공될 수 있다. 바람직하게는 서열식별번호:1, 서열식별번호:8, 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:14인 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 그들로부터 유도 가능한 유도체는 각각 예를 들어, Escherichia coli와 같은 적절한 숙주 미생물에 과발현되고, 상기 재조합 폴리펩티드는 일반식 (I)의 하이드록시 케톤을 환원하기 위해 사용된다.

5,000 내지 10 밀리언 유닛(Mio U)의 산화환원효소 서열식별번호:1, 서열식별번호:8, 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:14 또는 유도체가, 각각 반응될 식 (I)의 화합물 kg 당 사용 사용된다(상향으로 열림). 여기에서, 효소 단위 1U은 1분당(min) 식 (I)의 하이드록시 케톤의 1 μmol을 반응시키는데 요구되는 효소 양에 해당된다.

본 발명에 따른 효소적 환원은, 종종 불안정한 하이드록시 케톤의 분해 및 그에 의한 바람직하지 않은 부산물의 형성이 크게 감소될 수 있도록 온화한 조건 하에서 진행된다. 본 발명에 따른 방법은 제조된 키랄 디올의 통상적으로 > 99%의 부분입체이성질체 순도 및 높은 사용 수명을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예는 상기 방법에 사용된 보조인자가 공동기질(cosubstrate)로 지속적으로 환원되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 NAD(P)H가 보조인자로서 사용되며, 환원에서 형성된 NAD(P)는 공동기질에 의해 다시 NAD(P)H로 환원된다.

그에 의해 2차 알콜, 예컨대 2-프로판올, 2-부탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-헵탄올, 2-옥탄올 또는 사이클로헥산올은 공동기질로서 바람직하게 사용된다. 특히 바람직한 구현예에 따르면, 2-프로판올은 조효소 재생을 위해 사용된다. 상기 재생을 위한 공동기질의 양은 전체 부피를 기준으로, 5 내지 95 부피%의 범위일 수 있다.

조효소 재생은, 예를 들어, 서열식별번호:1, 서열식별번호:8, 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:14를 포함하는 폴리펩티드를 통해 유사하게 달성된다.

본 발명에 따른 방법에서, 일반식(I)의 하이드록시 케톤은 바람직하게는 전체 부피를 기준으로, 5 내지 50 부피%(50 g/l 내지 50 g/l)의 양으로 사용되며, 더 바람직하게는 8 내지 40 부피%, 특히 바람직게는 10 내지 25 부피%로 사용된다.

특히 바람직한 구현예는 tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트, tert-부틸 (5S)-6-클로로-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트 또는 tert-부틸 (5S)-5,6-디하이드록시-3-옥소헥사노에이트가 일반식 (I)의 하이드록시 케톤으로서 사용되는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 방법이 수성 유기 2상 시스템에서 행해지는 것이다.

효소적 환원이 진행되는 상기 반응 혼합물의 수성 부분은 바람직하게는 pH 값이 5 내지 10, 바람직하게는 6 내지 9의 pH를 갖는 완충액, 예컨대, 인산칼륨, 트리스/HCl 또는 트리에탄올아민 완충액을 포함한다. 또한 상기 완충액은 효소를 안정화시키거나 또는 활성화시키기 위한 이온, 예컨대 아연 이온 또는 마그네슘 이온을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 방법을 수행할 때, 적절한 온도 범위는 약 10℃ 내지 70℃, 바람직하게는 20℃ 내지 45℃이다.

본 발명에 따른 방법의 추가의 바람직한 구현예에서, 효소적 전화는 물과 섞이지 않거나, 또는 제한된 정도로만 물과 섞이는 유기 용매의 존재 하에서 수행된다. 상기 용매는, 예를 들어, 대칭 또는 비대칭 디(C₁-C₆)알킬 에테르, 선형 사슬 또는 분지된 알칸 또는 사이클로알칸, 또는 수-불용성 2차 알콜이며, 이는 동시에 공동기질을 나타낸다. 바람직한 유기 용매는 디에틸 에테르, 3차 부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 부틸 아세테이트, 헵탄, 헥산, 2-옥탄올, 2-헵탄올, 4-메틸-2-펜탄올 및 사이클로헥산올이다. 마지막에 언급된 2차 알콜의 경우, 상기 용매는 동시에 보조 인자 재생을 위한 공동기질로서도 기능할 수도 있다.

만일 수-불용성 용매 및 공동기질이 각각 사용되는 경우, 반응 배치는 수성 상 및 유기 상으로 구성된다. 그 용해성에 따라서, 하이드록시 케톤은 유기 상 및 수성 상 간에 분배된다. 일반적으로, 유기 상은 전체 반응 부피 기준으로 약 5 내지 95%, 바람직하게는 10 내지 90%의 비율을 차지한다. 상기 두 액체 상은 그들 간에 큰 표면적이 생성되도록 바람직하게는 기계적으로 혼합된다. 또한 이 구현예에서, 효소적 환원에서 형성된 NAD는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 공동기질로 NADH로 또한 환원될 수 있다.

보조인자의 농도, 특히 NADH 또는 NADPH의 농도는 각각 수성 상에서, 일반적으로 0.001 mM 내지 10 mM, 특히 0.01 mM 내지 1 mM의 범위에 있다.

본 발명에 따른 방법에서, 산화환원효소/탈수소효소의 안정화제 또한 사용될 수 있다. 적절한 안정화제는, 예를 들어, 글리세롤, 소르비톨, 1,4-DL-디티오트레이톨(DTT) 또는 디메틸 술폭시드(DMSO)이다.

본 발명에 따른 방법은 예를 들어, 유리 또는 금속으로 만들어진 폐쇄된 반응 용기에서 수행된다. 이를 위해서, 상기 성분들은 반응 용기로 개별적으로 옮겨지고, 예를 들어 질소 또는 공기 분위기 하에서 교반된다.

본 발명의 또다른 가능한 구현예에 따르면, 반응 생성물(일반식 (Ⅱ)의 디올) 쪽으로 반응 평형을 이동시키기 위하여, 산화된 공동기질(예를 들어, 아세톤)은 지속적으로 제거될 수 있고, 및/또는 공동기질(예를 들어, 2-프로판올)은 지속적인 방식으로 새로 가해질 수 있다.

추가의 구현예에서, 서열식별번호:1, 서열식별번호:8, 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:14에 의한 산화환원효소 및/또는 공동기질의 첨가는 또한 상기 방법의 과정에서 점차 이루어질 수 있다.

환원의 완료 후, 반응 혼합물이 가공된다. 이를 위해서, 수성 상은 유기 상으로부터 임의로 분리되고, 생성물을 포함하는 유기 상은 여과된다. 임의로, 수성 상 또한 추출될 수 있고, 유기 상과 마찬가지로 추가로 가공될 수 있다. 그 결과, 용매는 유기 상으로부터 증발되고, 일반식 (Ⅱ)의 디올이 조 생성물로서 얻어진다. 조 생성물은 이어서 추가로 정제되거나, 또는 후속 생성물의 합성을 위해 직접 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다.

실시예 1

Rubrobacter xylanophilus DSM 9941로부터 산화환원효소의 클로닝

A) Rubrobacter xylanophilus DSM 9941의 배양

Rubrobacter xylanophilus DSM 9941의 세포를 50℃(pH 7.2)에서 박테리아 진탕기에서 140 rpm으로 하기 배지에서 배양하였다 : 0.1% 효모 추출물, 0.1% 트립톤, 0.004% CaSO₄ x 2 H₂O, 0.02% MgCl₂ x 6 H₂O, 0.01% 니트릴로트리아세트산, 100 ml 인산염 완충액 [5.44 g/l KH₂PO₄, 43 g/l Na₂HPO₄ x 12 H₂O], 500 μl/l 0.01 M 시트르산 Fe, 500 μl/l 추적 원소 [500 μl/l H₂SO₄, 2.28 g/l MnSO₄ x H₂O, 500 mg/l ZnSO₄ x 7 H₂O, 500 mg H₃BO₃, 25 mg/l CuSO₄ x 5 H₂O, 25 mg/l Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 45 mg/l CoCl₂ x 6 H₂O]. 배양 6일째, 원심분리에 의해 세포를 배양 배지로부터 분리하고 -80℃에서 보관했다.

B) 선택적 산화환원효소를 코딩하는 유전자의 증폭

Manniatis & Sambrook의 "Molecular Cloning"에 기재된 방법에 따라서 게놈 DNA를 추출하였다. 결과물인 핵산은, NCBI 데이터 베이스에서 46106817 번호로 간행된 유전자 서열로부터 유도된 특이적인 프라이머와 관련된 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 대한 주형으로서 기능했다. 그와 같이 하여, 발현 벡터로의 후속 클로닝을 위하여, 상기 프라이머의 5'-말단 위치에, 각각 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Hind III 또는 Sph I(서열식별번호:4, 서열식별번호:5, 서열식별번호:7)에 대한 제한 부위를 부여하였다.

증폭은 하기 온도 사이클에서 및 500 ng의 게놈 DNA와 함께 PCR 완충액[10 mM tris-HCl, (pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO₄; 1 mM dNTP Mix; 20 pMol의 프라이머 및 2.5 U의 Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen) 당] 중에서 행하였다.

사이클 1: 94℃, 2 분

사이클 2 x 30: 94℃, 15 초

54℃, 30 초

68℃, 60 초

사이클 3: 68℃, 7 분

4℃, ∞

결과물인 약 750 bp의 크기를 갖는 PCR 생성물을, 1% 아가로오스 겔 상 정제 후 각각 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Hind III 또는 Sph I 및 Hind III로 제한하고, 동일한 엔도뉴클레아제로 처리된 백본(backbone)인, pET21a 벡터(Novagen) 또는 pQE70 벡터(Qiagen)의 백본으로 각각 결찰하였다.

2 μl의 결찰 배치를 E. coli Top 10 F` 세포(Invitrogen)로 형질전환 후, 암피실린-내성 콜로니의 플라스미드 DNA를, 각각 엔도뉴클레아제 Nde I 및 Hind III 또는 Sph I 및 Hind III로 제한 분석(restriction analysis)하여, 750 bp의 크기를 갖는 삽입물의 존재에 대해 테스트하였다. 상기 단편에 대해 양성인 클론으로부터의 플라스미드 제제는 서열 분석을 행하고, 후속적으로 각각 Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen) 및 E. coli RB791 (genetic stock, Yale)로 형질전환하였다.

실시예 2

Escherichia coli 세포에서 폴리펩티드 서열식별번호:1의 효율적인 발현

Escherichia coli 세포에서 폴리펩티드 서열식별번호:1의 효율적인 발현을 얻기 위하여, 발현 벡터 코딩으로의 클로닝을 위해 DNA 서열식별번호:3을 PCR 반응의 주형으로서 사용했다. 제1의 160 염기쌍의 영역에서, 이러한 DNA 서열은 이전에 알려진 DNA 서열 (서열식별번호:2)과는 51 염기에서 상이했다. 이러한 변형은 보존적이고, 아미노산 서열에서의 변화를 초래하지는 않았다.

증폭은 하기 온도 사이클에서 및 주형으로서 50 ng의 DNA 서열식별번호:3과 함께 PCR 완충액[10 mM tris-HCl, (pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO₄; 1 mM dNTP Mix; 20 pMol의 프라이머(서열식별번호:6, 서열식별번호:5) 및 2.5 U의 Platinum Pfx DNA 중합효소(Invitrogen) 당] 중에서 행하였다.

사이클 1: 94℃, 2 분

사이클 2 x 30: 94℃, 40 초

56℃, 30 초

68℃, 60 초

사이클 3: 68℃, 7 분

4℃, ∞

결과물인 약 750 bp의 크기를 갖는 PCR 생성물을, 1% 아가로오스 겔 상 정제 후, 엔도뉴클레아제 Nhe I 및 Hind III로 동일한 엔도뉴클레아제로 처리된 백본인, pET21a 벡터(Novagen)의 백본으로 각각 결찰하였다.

2 μl의 결찰 배치를 E. coli Top 10 F` 세포(Invitrogen)로 형질전환 후, 암피실린-내성 콜로니의 플라스미드 DNA를, 엔도뉴클레아제 Nhe I 및 Hind III로 제한 분석하여, 750 bp의 크기를 갖는 삽입물의 존재에 대해 테스트하였다. 상기 단편에 대해 양성인 클론으로부터의 플라스미드 제제는 서열 분석을 행하고, 후속적으로 Escherichia coli BL21 Star (Invitrogen)로 형질전환하였다.

실시예 3

Rubrobacter xylanophilus DSM 9941로부터 산화환원효소의 제조

각각, 발현 구조물로 형질전환된 Escherichia coli 균주 BL21 Star (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) 및 RB791 (E. coli genetic stock, Yale, USA)를 550 nm에서 측정된 흡광도가 0.5에 도달할 때까지, 암피실린(50μg/ml)과 함께 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl)에서 배양하였다. 재조합 단백질의 발현은 0.1 mM 농도의 이소프로필티오갈락토사이드(IPTG)의 첨가로 유도되었다. 25℃ 및 220 rpm에서 유도 16 시간 후, 세포를 수확하고, -20℃에서 냉각하였다.

효소 회수를 위해, 30 g의 세포를 150 ml의 트리에탄올아민 완충액(100 mM, pH = 7.2 mM MgCl₂, 10% 글리세롤)에서 부유하고, 고압균질기로 파쇄하였다. 이어서, 상기 효소 용액을 150 ml의 글리세롤과 혼합하고, 20℃에서 보관하였다.

그에 의해 얻어진 효소 용액을 tert-부틸 (3R,5R)-6-시아노-3,5-디하이드록시헥사노에이트의 합성을 위해 사용하였다.

희석된 상태로, 얻어진 효소 용액은 또한 상응하는 효소적 측정을 위해 사용되었다. 그에 의해, 활성 테스트를 하기로 행했다 : 870 μl의 100 mM TEA 완충액, pH 7.0, 160 μg NAD(P)H, 10 μl 희석된 세포 용균물. 반응은 100 μl의 100 mM 기질 용액 tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트를 상기 반응 혼합물에 가함으로서 개시되었다.

실시예 4

산화환원효소 서열식별번호:1에 의한 tert -부틸 (5R)-6- 시아노 -5- 하이드록시 -3-옥 소헥사노에이트 의 tert -부틸 (3R,5R)-6- 시아노 -3,5- 디하이드록시헥사노에이트 로의 전화

tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트의 tert-부틸 (3R,5R)-6-시아노-3,5-디하이드록시헥사노에이트로의 전화를 위해서, 900 μl 완충액(100 mM TEA, pH = 7.1 mM MgCl₂), 100 μl 2-프로판올, 10 μl tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트 조 생성물(거울상이성질체 순도 > 99 %), 0.1 mg NAD 및 100 μl 효소 현탁액(실시예 3 참조)의 혼합물을, 지속적인 혼합 하, 실온에서 24시간 동안 에펜도르프 반응 용기(Eppendorf reaction vessel)에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 사용된 tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트 96%가 tert-부틸 (3R,5R)-6-시아노-3,5-디하이드록시헥사노에이트로 환원되었다. 부분입체이성질체 초과량은 > 99%의 양이었다.

전화 및 부분입체이성질체 초과량의 측정은 키랄 가스 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 이를 위해, 키랄 분리 칼럼 CP-Chirasil-DEX CB(Varian Chrompack, Darmstadt, Germany), 프레임 이온화 검출기(flame ionization detector) 및 운반체 가스로서 헬륨을 포함하는, Shimadzu로부터의 가스 크로마토그래프 GC-17A를 사용하였다.

tert-부틸-6-시아노-3,5-디하이드록시헥사노에이트의 분리는 0.72 바에서, 50℃에서 10분간, 5℃/분 → 10분간 200℃로 행했다.

정체 시간은 : (R-BCH) 4.4 분; (R,R-BCH) 47.1 분 및 (R,S-BCH) 48.2 분이었다.

실시예 5

산화환원효소 서열식별번호:1에 의해 tert -부틸 (5R)-6- 시아노 -5- 하이드록시 -3-옥 소헥사노에이트로부 터 tert -부틸 (3R,5R)-6- 시아노 -3,5- 디하이드록시헥사노에 이트의 합성

tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트의 tert-부틸 (3R,5R)-6-시아노-3,5-디하이드록시헥사노에이트로의 추가의 전화를 위하여, 550 μl 완충액(100 mM TEA, pH = 7.1 mM MgCl₂), 150 μl 2-프로판올, 200 μl tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트 조 생성물(거울상이성질체 순도 > 99 %), 0.1 mg NAD 및 200 μl 효소 현탁액(실시예 3 참조)의 혼합물을, 에펜도르프 반응 용기(Eppendorf reaction vessel)에서 인큐베이션하였다. 반응 과정 중, 형성된 아세톤/2-프로판올 혼합물을 질소의 도입에 의해 반복적으로 증발시키고, 새로운 2-프로판올 및 50 μl의 효소를 가하였다. 24시간 간격으로 2 내지 3회 반복 후, 사용된 tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트의 > 90%는 tert-부틸 (3R,5R)-6-시아노-3,5-디하이드록시-헥사노에이트로 환원되었다. 부분입체이성질체 초과량은 > 99%의 양이었다.

실시예 6

tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트의 tert-부틸 (3R,5R)-6-시아노-3,5-디하이드록시헥사노에이트로의 추가의 전화를 위하여, 6.7 ml 완충액(100 mM TEA, pH = 9), 1.7 ml 2-프로판올, 2 ml tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트 조 생성물(거울상이성질체 순도 > 99%), 1.0 mg NAD 및 산화환원효소 서열식별번호:1(실시예 3 참조)을 포함하는, 150 mg 동결된 세포 E. coli BL21 Star의 혼합물을 45℃에서 반응 용기에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 사용된 tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트의 > 90%는 tert-부틸 (3R,5R)-6-시아노-3,5-디하이드록시헥사노에이트로 환원되었다. 부분입체이성질체 초과량은 > 99%의 양이었다.

실시예 7

산화환원효소 서열식별번호:8에 의해 tert -부틸 (5R)-6- 시아노 -5- 하이드록시 -3-옥 소헥사노에이트로부 터 tert -부틸 (3R,5R)-6- 시아노 -3,5- 디하이드록시헥사노에이트의 합성

tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트의 tert-부틸 (3R,5R)-6-시아노-3,5-디하이드록시헥사노에이트로의 추가의 전화를 위하여, 5.0 ml 완충액(100 mM TEA, pH = 7.5), 2.0 ml 2-프로판올, 4 ml tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트 조 생성물(거울상이성질체 순도 > 99%), 1.0 mg NAD 및 산화환원효소 서열식별번호:8(실시예 2 및 실시예 3에 대응)을 포함하는, 250 mg 동결된 세포 E. coli RB 791의 혼합물을 40℃에서 반응 용기에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 사용된 tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트의 > 90%는 tert-부틸 (3R,5R)-6-시아노-3,5-디하이드록시헥사노에이트로 환원되었다. 부분입체이성질체 초과량은 > 99%의 양이었다.

실시예 8

산화환원효소 서열식별번호:11에 의해 tert -부틸 (5R)-6- 시아노 -5- 하이드록시 -3- 옥소헥사노에이트로부터 tert -부틸 (3R,5R)-6- 시아노 -3,5- 디하이드록시헥사노에이트의 합성

tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트의 tert-부틸 (3R,5R)-6-시아노-3,5-디하이드록시헥사노에이트로의 추가의 전화를 위하여, 350 μl 완충액(100 mM 인산칼륨, pH = 7), 150 μl 2-프로판올, 50 μl tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트 조 생성물(거울상이성질체 순도 > 99%), 0.025 mg NAD 및 15 μl 효소 현탁액 서열식별번호:11(실시예 3 참조) 혼합물을, 지속적인 혼합 하, 실온에서 48시간 동안 에펜도르프 반응 용기에서 인큐베이션하였다. 48시간 후, 사용된 tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥 사노에이트의 > 80%가, tert-부틸 (3R,5R)-6-시아노-3,5-디하이드록시헥사노에이트로 환원되었다. 부분입체이성질체 초과량은 > 99%의 양이었다.

서열 목록

서열식별번호:1

서열식별번호:2

서열식별번호:3

서열식별번호:4

서열식별번호:5

서열식별번호:6

서열식별번호:7

서열식별번호:8

Geobacillus thermodenitrificans DSM 465 단백질 서열 카르보닐 환원효소

서열식별번호:9

Geobacillus thermodenitrificans DSM 465 핵산 서열 카르보닐 환원효소

서열식별번호:10

Geobacillus thermodenitrificans DSM 465 핵산 서열 합성 유전자

서열식별번호:11

Chloroflexus auratiacus DSMZ 635 단백질 서열 카르보닐 환원효소

서열식별번호:12

Chloroflexus auratiacus DSMZ 635 핵산 서열 카르보닐 환원효소

서열식별번호:13

Chloroflexus auratiacus DSMZ 635 핵산 서열 합성 유전자

서열식별번호:14

Candida magnoliae CBS 6396 단백질 서열 카르보닐 환원효소

서열식별번호:15

Candida magnoliae CBS 6396 핵산 서열 합성 유전자

SEQUENCE LISTING <110> IEP GmbH <120> Process for the enantioselective enzymatic reduction of hydroxy keto compounds <130> I 9844 <150> AT A 2027/2005 <151> 2005-12-19 <160> 15 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 249 <212> PRT <213> Rubrobacter xylanophilus DSM 9941 <400> 1 Met Leu Glu Gly Lys Val Ala Val Ile Thr Gly Ala Gly Ser Gly Ile 1 5 10 15 Gly Arg Ala Thr Ala Leu Arg Phe Ala Arg Glu Gly Ala Arg Val Val 20 25 30 Val Ala Glu Leu Asp Glu Arg Arg Gly Glu Glu Val Val Arg Glu Ile 35 40 45 Leu Glu Ser Gly Gly Glu Ala Val Phe Val Arg Thr Asp Val Ser Glu 50 55 60 Phe Glu Gln Val Glu Ala Ala Val Glu Arg Ala Val Glu Glu Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Leu Asp Val Met Phe Asn Asn Ala Gly Ile Gly His Tyr Ala Pro 85 90 95 Leu Leu Glu His Asp Pro Glu His Tyr Asp Arg Val Val Arg Val Asn 100 105 110 Gln Tyr Gly Val Tyr Tyr Gly Ile Leu Ala Ala Gly Arg Lys Met Ala 115 120 125 Glu Leu Glu Asn Pro Gly Val Ile Ile Asn Thr Ala Ser Val Tyr Ala 130 135 140 Phe Leu Ala Ser Pro Gly Val Ile Gly Tyr His Ala 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gcgtgatcat caacaccgcc 420 tcggtctacg ctttcctggc ctcccccggt gtgatcggct atcacgcttc caagggggcg 480 gtgaagatga tgacccaggc cgcagccctg gagctcgccc cccacggcat acgggtcgtc 540 gccatcgccc cgggcggggt ggacaccccg atcatccagg gctacaagga catgggcctc 600 ggtgagcggc tggcccgcgg ccagatgcgt cgcaggctcc agacccccga gcagatcgcc 660 ggcgccgtcg tcctgctcgc caccgaggag gcagacgcca taaacggctc ggtggtgatg 720 accgacgacg gctacgcgga gttcaagtaa 750 <210> 3 <211> 753 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 3 atgctggaag gtaaagtggc agtcatcacc ggtgcaggca gcggcattgg gcgtgccact 60 gcgctgcgtt ttgcgcgtga aggcgctcgc gtcgttgtgg ccgagctgga tgaacgtcgc 120 ggtgaggaag ttgtacgtga gattctggaa tctggcgggg gggaggccgt cttcgtgagg 180 acggacgtct cggagttcga gcaggttgag gccgccgtcg agcgcgccgt cgaggagtac 240 gggacgctgg acgtcatgtt caacaacgcc ggcatcgggc actacgcccc cctgctggag 300 cacgacccgg agcactacga ccgggtggtc cgggtgaacc agtacggcgt ctactacggg 360 atactcgccg ccggcaggaa gatggccgag ctggagaacc ccggcgtgat catcaacacc 420 gcctcggtct acgctttcct ggcctccccc ggtgtgatcg gctatcacgc ttccaagggg 480 gcggtgaaga tgatgaccca ggccgcagcc ctggagctcg ccccccacgg catacgggtc 540 gtcgccatcg ccccgggcgg ggtggacacc ccgatcatcc agggctacaa ggacatgggc 600 ctcggtgagc ggctggcccg cggccagatg cgtcgcaggc tccagacccc cgagcagatc 660 gccggcgccg tcgtcctgct cgccaccgag gaggcagacg ccataaacgg ctcggtggtg 720 atgaccgacg acggctacgc ggagttcaag taa 753 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 4 gggaattcca tatgatgctc gaggggaagg tcg 33 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 5 cccaagctta ttacttgaac tccgcgtagc cgtc 34 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Synthetic construct <400> 6 cctagctagc atgctggaag gtaaagtggc 30 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 7 cacatgcatg cgaatgctcg aggggaaggt c 31 <210> 8 <211> 250 <212> PRT <213> Geobacillus thermodenitrificans DSM 465 <400> 8 Met Arg Leu Lys Gly Lys Ala Ala Ile Val Thr Gly Gly Ala Ser Gly 1 5 10 15 Ile Gly Arg Ala Thr Ala Ile Arg Phe Ala Glu Glu Gly Ala Lys Val 20 25 30 Ala Val Ser 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Gly Glu Pro Ile Gly Arg Leu Gly Ser Pro Glu Glu Val 210 215 220 Ala Asn Ala Val Ile Trp Leu Cys Ser Asp Lys Ala Ser Phe Val Thr 225 230 235 240 Gly Ala Thr Leu Ala Val Asp Gly Gly Arg Leu Ala 245 250 <210> 12 <211> 759 <212> DNA <213> Chloroflexus aurantiacus DSM 635 <400> 12 atggagccac ctttcattgg gaaggttgcg ctggtcaccg gcgcagcagc cggtattggt 60 cgtgcttcag cactggcgtt tgcccgtgag ggtgccaagg ttgtcgttgc tgatgtgaat 120 gtcgagggcg gggaagagac gattgcgctg tgtcgggctt tgaataccga tgcaatgttc 180 gtgcgttgtg atgtttcgca acgcgatgaa gtggagcgat taattgctct ggcagttgac 240 acgttcggtc ggatcgactt tgcgcacaac aacgccggga ttgaaggcgt gcaggcaatg 300 ctggccgatt atcccgaaga ggtctgggat cgggtgatcg agatcaacct caaaggggtc 360 tggttgtgta tgaagtacga aatccggcac atgctcaagc agggtggcgg tgcgattgtg 420 aatacctcat cggtcgccgg tctggccgga tcacgtggcg tttcggcgta tgtagccagc 480 aagcacggta ttgttggtat taccaaagcg gcagcccttg agtatgcgcg taacggtatt 540 cgtgtcaacg caatctgtcc aggtacgatt catactgcga tgatcgaccg ctttacccag 600 ggtgatcccc aactgcttgc ccagttcgct gagggtgaac cgattggtcg gctcggctcg 660 cctgaagagg tcgccaatgc ggtgatctgg ctctgctcag ataaggcttc gtttgtgacc 720 ggagcgacac tggcggttga tggtggccgc ctggcgtaa 759 <210> 13 <211> 756 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 13 atggagcccc catttatcgg gaaagttgcg ttagttacgg gggcagcggc agggatcggc 60 agggcgagtg ccctggcgtt tgctagagaa ggggccaagg tcgttgtggc agacgttaac 120 gtagagggtg gcgaagagac aattgcttta tgcagagctc tcaacactga tgccatgttc 180 gtccgctgtg atgtgtcaca gcgagacgaa gtcgaaaggc taatcgccct agcggtagac 240 acattcggcc gtattgactt tgctcataat aacgcgggca tagagggagt acaagcaatg 300 ttggctgact atcctgagga agtatgggat cgagtaattg aaatcaatct caagggggtt 360 tggctgtgta tgaagtacga aataaggcac atgctcaagc aaggtggcgg agcgatcgta 420 aacactagct ctgtcgccgg tctagcagga tctcgggggg tttccgcata cgtcgcctcg 480 aaacacggca ttgtagggat taccaaagct gcagcccttg agtatgcccg aaatggaata 540 agagtgaatg ctatctgccc aggcacaata catactgcaa tgatagatcg gtttacgcag 600 ggtgatccgc aacttttggc gcagttcgcc gaaggtgagc ctataggtcg ccttggtagc 660 ccggaagagg tcgctaatgc ggtgatttgg ttgtgttcag acaaagcaag tttcgtgacg 720 ggagctaccc tggcagtgga tggaggacgt ttagct 756 <210> 14 <211> 243 <212> PRT <213> Candida magnoliae CBS 6396 <400> 14 Met Ser Ala Thr Ser Asn Ala Leu Ile Thr Gly Ala Ser Arg Gly Met 1 5 10 15 Gly Glu Ala Thr Ala Ile Lys Leu Ala Leu Glu Gly Tyr Ser Val Thr 20 25 30 Leu Ala Ser Arg Gly Ile Glu Gln Leu Asn Ala Ile Lys Glu Lys Leu 35 40 45 Pro Ile Val Lys Lys Gly Gln Gln His Tyr Val Trp Gln Leu Asp Leu 50 55 60 Ser Asp Ile Glu Ala Ala Ser Thr Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala 65 70 75 80 Ser Ser Tyr Asp Val Phe Phe Ser Asn Ala Gly Val Val Asp Phe Ala 85 90 95 Pro Phe Ala Asp Gln Ser Glu Thr Ala Gln Lys Asp Leu Phe Thr Val 100 105 110 Asn Leu Leu Ser Pro Val Ala Leu Thr Lys Thr Ile Val Lys Ala Ile 115 120 125 Ala Asp Lys Pro Arg Glu Thr Pro Ala His Ile Ile Phe Thr Ser Ser 130 135 140 Ile Val Gly Ile Arg Gly Val Pro Asn Val Ala Val Tyr Ser Ala Thr 145 150 155 160 Lys Gly Ala Ile Asp Ser Phe Ala Arg Ser Leu Ala Arg Glu Phe Gly 165 170 175 Pro Lys Asn Ile His Val Asn Cys Val Asn Pro Gly Thr Thr Arg Thr 180 185 190 Glu Met Thr Lys Gly Val Asp Leu Ala Ala Phe Gly Asp Val Pro Ile 195 200 205 Lys Gly Trp Ile Glu Val Asp Ala Ile Ala Asp Ala Val Leu Phe Leu 210 215 220 Ile Lys Ser Lys Asn Ile Thr Gly Gln Ser Leu Val Val Asp Asn Gly 225 230 235 240 Phe Gly Val <210> 15 <211> 732 <212> DNA <213> Candida magnoliae CBS 6396 <400> 15 atgtctgcta cttcgaacgc tcttatcact ggtgccagcc gcggaatggg cgaggccaca 60 gctattaagc ttgcccttga ggggtacagc gtcacccttg catcacgcgg tattgagcag 120 ctcaatgcca tcaaggaaaa actacccatc gtgaagaagg gccagcagca ctacgtttgg 180 cagctcgatc ttagtgacat cgaggcggct tccaccttca agggggctcc tctgcctgcc 240 agcagctacg acgtgttctt cagcaacgcc ggtgtggtgg actttgctcc gttcgcagac 300 caaagcgaga ctgcgcaaaa ggacctgttc acggttaacc tgctgtcgcc tgttgcgttg 360 accaagacca ttgttaaggc catcgccgac aagccccgcg agacgcctgc tcacattatc 420 ttcacctcgt ccattgtcgg aattcgcggt gttcccaacg tggcggtcta cagcgccacc 480 aagggcgcga ttgacagctt tgcgcgctcg cttgctcgtg agttcggtcc caagaacatc 540 cacgttaact gcgtgaaccc gggcacgacg cgcaccgaga tgacaaaggg cgttgatctc 600 gcggctttcg gcgatgttcc tatcaagggc tggatcgagg tcgatgcgat tgccgacgct 660 gtgctgtttt tgatcaagtc caagaacatc actggccagt cgctcgttgt tgacaacgga 720 ttcggtgttt aa 732

Claims

일반식 (Ⅰ)의 하이드록시케톤의, 일반식 (Ⅱ)의 키랄 디올로의 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법으로서,

여기서 R₁ = C₁-C₆ 알킬 및 R₂ = -Cl, -CN, -OH, -H 또는 C₁-C₆ 알킬이고,

여기서 R₁ 및 R₂는 식 (Ⅰ)에서와 동일한 의미를 갖고,

상기 하이드록시케톤은 NADH 또는 NADPH의 존재 하에 산화환원효소로 환원되며,

상기 산화환원효소가,

a) 아미노산 서열인 서열식별번호:1, 서열식별번호:8, 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:14의 아미노산을 갖는 것,

b) 핵산 서열인 서열식별번호:2, 서열식별번호:3, 서열식별번호:9, 서열식별번호:10, 서열식별번호:12, 서열식별번호:13 또는 서열식별번호:15에 의해 코딩되는 것, 또는

c) 엄격한 조건(stringent condition) 하에서 서열식별번호:2, 서열식별번호:3, 서열식별번호:9, 서열식별번호:10, 서열식별번호:12, 서열식별번호:13 또는 서열식별번호:15에 하이브리드하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것임을 특징으로 하는 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 엄격한 조건은 60℃에서 0.7-1 M NaCl 용액 중에서 하이브리드화하고, 65℃에서 0.1 내지 2배 SSC 용액(1배 SSC 용액은 150 mM NaCl 및 15 mM 구연산나트륨으로 구성된 혼합물)으로 세척되는 것인 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법.
일반식 (Ⅰ)의 하이드록시케톤의, 일반식 (Ⅱ)의 키랄 디올로의 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법으로서,

여기서 R₁ = C₁-C₆ 알킬 및 R₂ = -Cl, -CN, -OH, -H 또는 C₁-C₆ 알킬이고,

여기서 R₁ 및 R₂는 식 (Ⅰ)에서와 동일한 의미를 갖고,

상기 하이드록시케톤은 NADH 또는 NADPH의 존재 하에 산화환원효소로 환원되며,

상기 산화환원효소가,

a) 아미노산 서열인 서열식별번호:1, 서열식별번호:8, 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:14의 아미노산을 갖는 것, 또는

b) 핵산 서열인 서열식별번호:2, 서열식별번호:3, 서열식별번호:9, 서열식별번호:10, 서열식별번호:12, 서열식별번호:13 또는 서열식별번호:15에 의해 코딩되는 것

임을 특징으로 하는 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NADH 또는 NADPH가 공동기질(cosubstrate)에 의해 지속적으로 환원되는 것을 특징으로 하는 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 2-프로판올, 2-부탄올, 2-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-헵탄올 또는 2-옥탄올이 각각, 공동기질로서 또는 2차 알콜로서 사용되는 것을 특징으로 하는 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드록시케톤은 전체 반응 부피를 기준으로, 5 내지 50 중량%의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드록시케톤은 전체 반응 부피를 기준으로, 8 - 40 중량%의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하이드록시케톤은 전체 반응 부피를 기준으로, 10 - 25 중량%의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, tert-부틸 (5R)-6-시아노-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트, tert-부틸 (5S)-6-클로로-5-하이드록시-3-옥소헥사노에이트 또는 tert-부틸 (5S)-5,6-디하이드록시-3-옥소헥사노에이트가 일반식 (I)의 하이드록시케톤으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, TTN(전체 전환수(total turn over number) = 환원된 하이드록시케톤의 몰/사용된 보조인자의 몰)이 ≥10³인 것을 특징으로 하는 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 수성 유기 2상 시스템에서 수행되는 것을 특징으로 하는 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 추가로, 디에틸 에테르, 3차 부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 헵탄, 헥산 또는 사이클로헥산과 같은 유기 용매가 사용되는 것을 특징으로 하는 거울상이성질체선택성 효소적 환원 방법.