KR20060113697A - 신규 아세토아세틸-ＣｏＡ 환원 효소 및 광학 활성알코올의 제조 방법 - Google Patents

신규 아세토아세틸-ＣｏＡ 환원 효소 및 광학 활성알코올의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, (R)-3-히드록시펜탄니트릴, 광학 활성 3-히드록시부탄산에스테르 및 광학 활성 1-페닐에탄올 유도체의 광학 활성 알코올의 간편한 제조 방법의 제공, 및 상기 광학 활성 알코올, 특히 (R)-3-히드록시펜탄니트릴의 제조에 유용한 신규 효소의 제공을 목적으로 한다. 본 발명은, 3-케토펜탄니트릴을 비대칭적으로 환원시켜, 광학 순도 99％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성할 수 있는 신규 아세토아세틸-CoA 환원 효소; 3-케토펜탄니트릴, 아세토아세트산에스테르 및 1-페닐에타논 유도체 각각에, 상기 신규 효소 또는 기지의 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 작용시켜, 대응하는 광학 활성 알코올을 제조하는 방법이다.
아세토아세틸-CoA 환원효소, 3-케토펜탄니트릴, (R)-3-히드록시펜탄니트릴, 광학 활성 3-히드록시부탄산에스테르, 광학 활성 1-페닐에탄올 유도체

Description

신규 아세토아세틸-ＣｏＡ 환원 효소 및 광학 활성 알코올의 제조 방법 {NOVEL ACETOACETYL-CoA REDUCTASE AND PROCESS FOR PRODUCING OPTICALLY ACTIVE ALCOHOL}
본 발명은 유용한 신규 아세토아세틸-CoA 환원 효소에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 효소 또는 기지의 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 사용한, 광학 활성 알코올류, 특히 (R)-3-히드록시펜탄니트릴, 광학 활성 3-히드록시부탄산에스테르 및 광학 활성 1-페닐에탄올 유도체의 제조 방법에 관한 것이다. (R)-3-히드록시펜탄니트릴, 광학 활성 3-히드록시부탄산에스테르 및 광학 활성 1-페닐에탄올 유도체 등의 광학 활성 알코올은 각종 의약품·농약 등의 합성 원료 또는 중간체로서 유용한 화합물이다.
광학 활성 3-히드록시펜탄니트릴, 특히 (R)-3-히드록시펜탄니트릴은 다양한 의약품이나 농약 등의 제조 원료나 합성 중간체로서 매우 유용하다. 그 때문에, 높은 광학 순도의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 고수율로 제조할 수 있으며 또한 공업적으로 실시할 수 있는 제조 방법의 개발이 강하게 요구되어 왔다.
종래, (R)-3-히드록시펜탄니트릴의 제조 방법으로서는, 라세미체 3-아세톡시펜탄니트릴을 슈도모나스 세파시아 리파아제(Pseudomonas cepacia lipase)를 사용 하여 비대칭적으로 가수분해하여 (R)-3-히드록시펜탄니트릴과 (S)-3-아세톡시펜탄니트릴로 광학 분할하는 방법이 알려져 있다(비특허 문헌 1을 참조). 이 방법의 경우, 광학 순도 90％ e.e.의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴이 얻어지지만, 효소의 사용량은 기질의 2분의 1 중량으로 많고, 또한 수율도 29％로 낮아서, 경제적인 제조 방법이라고 말할 수는 없다.
또한, 상기 비특허 문헌 1에는, 상기 비대칭적 가수분해 반응에 있어서, 티오크라운에테르(1,4,8,11-테트라티아시클로테트라데칸)을 첨가함으로써 광학 순도 99％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴이 수율 49％로 얻어진다고 기재되어 있다. 그러나, 반응에 필요한 티오크라운에테르의 양이 기질의 10 분의 1 중량으로 매우 많기 때문에, 비용면 및 안전면에서 공업적인 실시에는 적합하지 않다. 또한, 이 비특허 문헌 1의 기술에서는, 반응 생성물인 (R)-3-히드록시펜탄니트릴과 (S)-3-아세톡시펜탄니트릴의 분리를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에서 행하고 있지만, 이 분리법도 번잡하여 실용적이지 않고, 공업적으로 채용하는 데에는 유리한 방법이 아니다.
상기와 같은 상황하에, 본 발명자들은 3-케토펜탄니트릴을 효소로 비대칭적으로 환원시켜 광학 활성 3-히드록시펜탄니트릴을 제조하는 방법을 발명하고, 먼저 출원하였다(특허 문헌 1을 참조). 이 방법에서는, 매우 간편한 방법으로 높은 광학 순도(94.8％ e.e.)의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 얻을 수 있지만, 더욱 높은 광학 순도의 목적물을 얻기 위해서는, 개량의 여지가 남겨져 있었다.
또한, 광학 활성 3-히드록시부탄산에스테르, 특히 (R)-3-히드록시부탄산에스 테르도 각종 의약품이나 농약 등의 제조 원료나 합성 중간체로서 매우 유용하다. (R)-3-히드록시부탄산에스테르의 제조 방법의 하나로, 아세토아세트산에스테르를 생체 촉매로 비대칭적으로 환원시켜 제조하는 방법이 있다. 예를 들면, 빵 효모를 사용한 방법(비특허 문헌 2를 참조), 게오트리컴 칸디덤(Geotrichum candidum)이나 아스페르길러스 니거(Aspergillus niger) 등의 미생물을 사용한 방법(비특허 문헌 3을 참조), 게오트리컴 칸디덤 유래의 글리세롤 데히드로게나제를 사용한 방법(비특허 문헌 4를 참조) 등이 알려져 있다. 그러나, 이들 방법은 모두, 그의 기질 투입 농도 및 기질로부터 생성물로의 전환율이 실용상 충분하지 않아, 보다 효율이 양호한 합성법이 기대되었다.
또한, 광학 활성 1-페닐에탄올 유도체도 다양한 의약품이나 농약 등의 제조 원료나 합성 중간체로서 매우 유용하다.
광학 활성 1-페닐에탄올 유도체를 효소적 비대칭 환원에 의해서 제조하는 방법으로서는, 2-할로-1-(치환 페닐)에타논에, 아시비아(Ashbya)속이나 오가타에아(Ogataea)속 등에 속하는 미생물 또는 그의 처리물을 작용시켜 광학 활성 2-할로-1-(치환 페닐)에탄올을 얻는 방법(특허 문헌 2, 3, 4를 참조)이 개시되어 있다. 또한, 코리네박테리움 종(Corynebacterium sp.) ST-10 유래의 페닐아세트알데히드 환원 효소의 유전자를 도입한 재조합 대장균을 사용하는 동일한 방법(비특허 문헌 5를 참조)이 개시되어 있다. 그러나, 이들 방법은 모두, 그의 기질의 투입 농도 및 기질로부터 생성물로의 전환율이 낮아서, 보다 효율이 양호한 제조 방법이 요망되었다.
한편, NADH 또는 NADPH를 보효소로 하여 아세토아세틸-CoA를 환원시키는 효소(아세토아세틸-CoA 환원 효소)는 다양한 미생물로부터 단리되고, 그의 성질이 보고되어 있지만(비특허 문헌 6, 7을 참조), 3-케토펜탄니트릴, 아세토아세트산에스테르 또는 1-페닐에타논 유도체에 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 작용시켜, 대응하는 광학 활성 알코올을 제조하는 것은 보고되어 있지 않다.
특허 문헌 1: WO03/031636
특허 문헌 2: WO92/01804
특허 문헌 3: 일본 특허 공개 (평)11-215995
특허 문헌 4: WO03/00911
비특허 문헌 1: Journal of 0 rganic Chemistry, 62, 9165(1997)
비특허 문헌 2: Enzyme and Microbial Technology, 31, 656(2002)
비특허 문헌 3: Journal of the Chemical Society , Chemical Communication, 7, 461(1984)
비특허 문헌 4: Tetrahedron Lett., 29, 2453(1988)
비특허 문헌 5: Eur . J. Biochem ., 269, 2394(2002)
비특허 문헌 6: FEMS Microbiol . Lett ., 52, 259-264(1988)
비특허 문헌 7: J. Microbiol . Biotechnol ., 6, 425-431(1996)
도 1은 RAX를 코딩하는 유전자의 염기 서열 및 RAX의 추정 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.
도 2는 재조합 벡터 pNTAX, pNTAXG, pSTVG의 구축을 나타내는 도면이다.
도 3은 재조합 벡터 pNTRE의 구축을 나타내는 도면이다.
본 발명의 목적은, 광학 활성 알코올, 특히 (R)-3-히드록시펜탄니트릴의 제조에 매우 유용한 신규 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은, 광학 활성 알코올, 특히 (R)-3-히드록시펜탄니트릴, (R)-3-히드록시부탄산에스테르 및 광학 활성 1-페닐에탄올 유도체의 효율적인 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 예의 검토한 결과, 의외로 아세토아세틸-CoA 환원 효소가 3-케토펜탄니트릴, 아세토아세트산에스테르, 1-페닐에타논 유도체를 각각 비대칭 환원시켜 (R)-3-히드록시펜탄니트릴, (R)-3-히드록시부탄산에스테르, 광학 활성 1-페닐에탄올 유도체를 생성할 수 있는 것을 발견하였다.
또한, 3-케토펜탄니트릴을 비대칭적으로 환원시켜 광학 순도 99％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 활성을 갖는, 지금까지의 보고예가 없는 신규 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 발견하고, 단리하는 것에 성공하였다. 또한, 이 효소를 코딩하는 DNA를 단리하고, 재조합 벡터 및 상기 효소를 대량 발현하는 형질 전환체를 창제하는 것에도 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, NADPH 또는 NADH를 보효소로 하여, 3-케토펜탄니트릴에 작용하여 광학 순도 99％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 신규 아세토아세틸-CoA 환원 효소에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 함유하는 재조합 벡터, 및 상기 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 많이 생산하는 형질 전환체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 형질 전환체를 사용한, 광학 순도 99％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴의 실용적인 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 사용한, (R)-3-히드록시펜탄니트릴, (R)-3-히드록시부탄산에스테르, 광학 활성 1-페닐에탄올 유도체라는 유용한 광학 활성 알코올의 실용적인 제조 방법에 관한 것이다.
이하, 상세히 본 발명을 설명한다.
본 발명에 있어서의 아세토아세틸-CoA 환원 효소란, 아세토아세틸-CoA를 환원시키는 능력(아세토아세틸-CoA 환원 활성)을 갖는 모든 효소를 포함한다.
아세토아세틸-CoA 환원 활성은, 예를 들면 이하의 방법에 의해 측정할 수 있다.
100 mM 인산 완충액(pH 6.5)중에 아세토아세틸-CoA 0.25 mM, NADPH 또는 NADH 0.25 mM 및 효소를 포함하는 반응액을 30℃에서 반응시키고, NADPH 또는 NADH의 소비에 따른 파장 340 nm의 흡광도 감소에 의해 측정할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 3-케토펜탄니트릴은, 예를 들면 WO94/21617에 기재된 방법으로 합성 가능하다. 또한, 3-케토펜탄니트릴로서, WO03/031636에 기재된 방법으로 얻어지는 하기 화학식 9로 표시되는 3-케토펜탄니트릴 알칼리 금속염, 예를 들면 3-케토펜탄니트릴 나트륨염 등도 사용할 수 있다.
Figure 112006031358011-PCT00001
(식 중, M은 알칼리 금속을 나타낸다.)
우선, 본 발명의 하나인 신규 아세토아세틸-CoA 환원 효소에 대하여 상술한다. 본 발명의 아세토아세틸-CoA 환원 효소로서는, 이하의 (1) 및 (2)의 이화학적 성질을 갖는 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 들 수 있다.
(1) 작용: NADPH 또는 NADH를 보효소로 하여, 하기 화학식 1로 표시되는 3-케토펜탄니트릴에 작용하여, 하기 화학식 2로 표시되는 광학 순도 99％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시킨다.
(2) 분자량: 겔 여과 분석법에 있어서 약 85500이고, SDS 폴리아크릴아미드 전기 영동 분석법에 있어서 약 26000이다.
Figure 112006031358011-PCT00002
Figure 112006031358011-PCT00003
상기 광학 순도, 겔 여과 분석법에 의한 분자량 및 SDS 폴리아크릴아미드 전 기 영동 분석법에 의한 분자량의 측정은 후술하는 실시예에 기재된 바와 같이 하여 행할 수 있다.
상기 아세토아세틸-CoA 환원 효소는, 또한 이하의 (3) 내지 (5)의 이화학적 성질을 갖는 것이 바람직하다.
(3) 최적 온도: 27 내지 33℃,
(4) 최적 pH: 5.5 내지 6.5, 및
(5) 저해제: p-클로로머큐리벤조산, 황산구리, 질산은 또는 염화수은.
또한, 본 발명의 아세토아세틸-CoA 환원 효소로서는, 예를 들면 (a) 서열 목록의 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 (b) 서열 목록의 서열 1에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 3-케토펜탄니트릴에 작용하여 광학 순도 99％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 활성을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다.
서열 목록의 서열 1에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, Inc., 1989년)] 등에 기재된 공지된 방법에 준하여 제조하는 것이 가능하고, 3-케토펜탄니트릴에 작용하여 광학 순도 99％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 활성을 갖는 한, 본 발명의 아세토아세틸-CoA 환원 효소에 포함된다. 또한, 아미노산의 변이는 자연계에서 일어나는 경우도 있으므로, 인공적으로 아미노산을 변이시 킨 폴리펩티드뿐 아니라, 자연계에서 아미노산이 변이된 폴리펩티드에 대해서도, 3-케토펜탄니트릴에 작용하여 광학 순도 99％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 활성을 갖는 한, 본 발명의 아세토아세틸-CoA 환원 효소에 포함된다.
여기서, 「3-케토펜탄니트릴에 작용하여 광학 순도 99％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 활성」은, 예를 들면 이하와 같은 반응 및 측정 조건에 의해서 확인할 수 있다.
미리 3-케토펜탄니트릴 5 mg, NADPH 50 mg 및 1 M 인산 완충액(pH 65) 50 ㎕를 넣은 시험관에, 효소 용액(또는 무세포 추출액) 450 ㎕를 첨가하고, 30℃에서 밤새 진탕한다. 반응액을 아세트산에틸 1 ㎖로 추출하여, 생성된 3-히드록시펜탄니트릴의 광학 순도를 모세관 기체 크로마토그래피에 의해 측정한다.
[모세관 기체 크로마토그래피 분석 조건]
칼럼: Chiradex G-TA(20 m×0.25 mm)(ASTEC사 제조), 검출: FID
칼럼 온도: 120℃
주입 온도: 200℃
검출 온도: 200℃
캐리어 기체: 헬륨(100 kPa)
분할 비: 100/1
용출 시간: (R)-3-히드록시펜탄니트릴 4.37 분, (S)-3-히드록시펜탄니트릴 5.17 분.
본 발명의 아세토아세틸-CoA 환원 효소는, 3-케토펜탄니트릴을 (R)-3-히드록시펜탄니트릴로 변환하는 능력을 갖는 미생물, 동물 또는 식물로부터 발견할 수 있다. 본 발명의 아세토아세틸-CoA 환원 효소의 탐색 방법으로서는, 예를 들면 WO03/031636에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
예를 들면, 효모로부터는 이하와 같이 탐색할 수 있다. 글루코스 40 g, 효모 엑기스 3 g, 인산수소이암모늄 6.5 g, 인산이수소칼륨 1 g, 황산마그네슘 7수화물 0.8 g, 황산아연 7수화물 60 mg, 황산철 7수화물 90 mg, 황산구리 5수화물 5 mg, 황산망간 4수화물 10 mg, 염화나트륨 100 mg(모두 1 L당)의 조성으로 이루어지는 액체 배지(pH 7) 5 ㎖를 시험관에 넣어 살균 후, 무균적으로 효모를 접종하여 30℃에서 2 내지 3 일간 진탕 배양한다. 그 후, 균체를 원심 분리에 의해 모으고, 글루코스 2 내지 10 중량％를 포함한 인산 완충액 1 내지 5 ㎖에 현탁시킨 후, 미리 3-케토펜탄니트릴을 2.5 내지 25 mg 넣은 시험관에 첨가하여 2 내지 3 일간 30℃에서 진탕한다. 이 반응시, 효모를 파쇄하고 나서 실시할 수도 있다. 또한, NAD+ 및(또는) NADP+와, 글루코스 탈수소 효소 및 글루코스, 또는 포름산 탈수소 효소 및 포름산을 첨가할 수도 있다. 변환 반응 후, 적당한 유기 용매로 추출을 행하여, 생성되는 3-히드록시펜탄니트릴을 모세관 기체 크로마토그래피 등으로 분석할 수 있다.
본 발명의 아세토아세틸-CoA 환원 효소의 유래로서는, 예를 들면 아크로모박터(Achromobacter)속 세균을 들 수 있고, 바람직하게는 아크로모박터 크실로속시단 스 아종 데니트리피칸스(Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans), 보다 바람직하게는 아크로모박터 크실로속시단스 아종 데니트리피칸스 IFO15125주이다.
이하에, 3-케토펜탄니트릴을 비대칭적으로 환원시켜 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 능력을 갖는 미생물로부터, 본 발명의 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 취득하는 방법을 기재하지만, 본 발명은 이것으로 한정되지 않는다.
미생물을 적절한 배지에서 배양하여, 배양액으로부터 균체를 원심 분리한 후, 균체를 적당한 완충액 중에 현탁시킨다. 상기 균체를 유리 비드 등의 물리적 수법, 효소 등의 생화학적 수법 등을 사용하여 파쇄 또는 용해시키고, 또한 원심 분리 등에 의해 상기 용액 중의 고형물을 제거함으로써, 본 발명의 효소를 포함하는 용액을 얻을 수 있다. 또는, 배양액으로부터 균체를 분리하지 않고, 직접 상기와 동일한 방법으로 효소 용액을 얻을 수도 있다.
또한, 당업자가 통상 사용하는 효소의 정제 수법, 예를 들면 황산암모늄 침전, 투석, 크로마토그래피를 단독으로 또는 조합하여 실시할 수도 있다. 크로마토그래피로서는, 예를 들면 소수(疏水) 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등을 들 수 있다. 이에 의해, 불필요한 단백질을 포함하지 않는, 보다 순도가 높은 효소 용액을 얻을 수 있다.
본 발명의 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 코딩하는 DNA는, 상술한 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 코딩하는 DNA라면 어떤 것도 포함된다. 예를 들면, 서열 목록의 서열 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA를 들 수 있다.
이하에, 본 발명의 효소를 코딩하는 DNA를 취득하는 방법의 예를 기재하지 만, 본 발명은 이것으로 한정되지 않는다.
우선, 정제한 효소를 적당한 엔도펩티다아제에 의해 소화하여, 역상 HPLC에 의해 절단된 단편을 정제한 후, 프로테인 시퀀서(sequencer)에 의해 부분 아미노산 서열의 일부를 결정한다. 또한, 얻어진 부분 아미노산 서열을 바탕으로 하여, PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄 반응) 프라이머를 합성한다. 다음에, 상기 DNA의 기원이 되는 미생물로부터 통상의 DNA 단리법, 예를 들면 Hereford법[Cell, 18, 1261(1979)]에 의해 상기 미생물의 염색체 DNA를 제조한다. 이 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상술한 PCR 프라이머를 사용하여 PCR을 행하며, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 일부를 증폭(코어 서열)시켜 염기 서열 결정을 행한다. 염기 서열 결정은 디데옥시 체인 터미네이션법 등에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면, ABI 373A DNA 시퀀서(Applied Biosystems사 제조) 등을 사용하여 행해질 수 있다.
다음에, 코어 서열의 주변 영역의 염기 서열을 밝히기 위해서, 상기 미생물의 염색체 DNA를, 코어 서열 중에 그의 인식 서열이 존재하지 않는 제한 효소에 의해 소화하고, 생성된 DNA 단편을 T4 리가제에 의해 자체 환화(環化)시킴으로써 역 PCR(Inverse PCR)[Nuclcic Acids Rcs. 16, 8186(1988)]용 주형 DNA를 제조한다. 다음에, 코어 서열을 바탕으로, 코어 서열의 외측을 향하는 DNA 합성의 개시점이 되는 프라이머를 합성하고, 역 PCR에 의해 코어 서열의 주변 영역을 증폭시킨다. 이렇게 하여 얻어진 DNA의 염기 서열을 명확하게 함으로써, 목적하는 아세토아세틸-CoA 환원 효소의 전체 코딩 영역의 DNA 서열을 명확하게 할 수 있다.
본 발명의 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 코딩하는 DNA를 숙주 미생물 내에 도입하고, 그것을 그 도입된 숙주 미생물 내에서 발현시키기 위해서 사용되는 벡터로서는, 적절한 숙주 미생물 내에서 상기 폴리펩티드 유전자를 발현할 수 있는 것이면 어떤 것도 사용될 수 있다. 이러한 벡터로서는, 예를 들면 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 코스미드 벡터 등을 들 수 있다. 또한, 다른 숙주주 사이에서의 유전자 교환이 가능한 서틀(shuttle) 벡터도 사용될 수 있다.
이러한 벡터는, 작동 가능하게 연결된 프로모터(lacUV5 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, lpp 프로모터, tufB 프로모터, recA 프로모터, pL 프로모터) 등의 제어 인자를 포함하고, 본 발명의 DNA와 작동 가능하게 연결된 발현 단위를 포함하는 발현 벡터로서 바람직하게 사용될 수 있다. 예를 들면, pUCNT(WO94/03613) 등이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 「제어 인자」는 기능적 프로모터, 및 임의의 관련된 전사 요소(예를 들면 인핸서(enhancer), CCAAT 박스, TATA 박스, SPI 부위 등)을 갖는 염기 서열을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 「작동 가능하게 연결」은, 유전자가 발현하 도록, DNA가 그의 발현을 조절하는 프로모터, 인핸서 등의 다양한 조절 엘리멘트(element)가 숙주 세포 내에서 작동할 수 있는 상태로 연결되는 것을 말한다. 제어 인자의 유형 및 종류가, 숙주에 따라서 변할 수 있는 것은, 당업자에게 주지된 사항이다.
본 발명의 DNA를 갖는 벡터를 도입하는 숙주 세포로서는, 세균, 효모, 사상 균, 식물 세포, 동물 세포 등을 들 수 있으며, 도입 용이성이나 발현 효율의 관점에서는 세균이 바람직하고, 대장균이 특히 바람직하다.
본 발명의 DNA는 통상법에 의해 숙주 세포에 도입할 수 있다. 숙주 세포로서 대장균을 사용한 경우, 예를 들면 염화칼슘법에 의해 본 발명의 DNA를 도입할 수 있다.
본 발명의 아세토아세틸-CoA 환원 효소 또는 상기 환원 효소의 생산능을 갖는 형질 전환체를 사용하고, 3-케토펜탄니트릴을 비대칭적으로 환원시켜 광학 순도 99％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 합성하는 경우, 보효소로서 NADPH 또는 NADH가 필요해진다. 반응계에 NADPH 또는 NADH를 필요한 양만 첨가하여도 실시할 수 있지만, 산화된 상기 보효소(NADP+ 또는 NAD+)를 환원형(NADPH 또는 NADH)으로 변환하는 능력(이후, 보효소 재생 능력이라고 함)을 갖는 효소를 그의 기질과 함께, 즉 보효소 재생계를 본 발명의 효소와 조합하여 반응을 행함으로써, 고가의 보효소의 사용량을 대폭 삭감할 수 있다.
보효소 재생 능력을 갖는 효소로서는, 히드로게나제, 포름산 탈수소 효소, 알코올 탈수소 효소, 글루코스-6-인산 탈수소 효소 및 글루코스 탈수소 효소 등을 사용할 수 있다. 적합하게는, 글루코스 탈수소 효소, 포름산 탈수소 효소가 사용되고, 특히 글루코스 탈수소 효소가 바람직하다.
이러한 반응은, 보효소 재생계를 비대칭적 환원 반응계 내에 첨가함으로써도 행해질 수 있지만, 본 발명의 효소를 코딩하는 DNA 및 글루코스 탈수소 효소를 코 딩하는 DNA의 양자에 의해 형질 전환된 형질 전환체를 촉매로 한 경우에는, 보효소 재생능을 갖는 효소를 별도로 제조하여 반응계 내에 첨가하지 않아도 효율적으로 반응을 행할 수 있다.
이러한 형질 전환체는, 본 발명의 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 코딩하는 DNA 및 글루코스 탈수소 효소를 코딩하는 DNA를 동일 벡터에 조립하고, 이것을 숙주 세포에 도입함으로써 얻어질 뿐 아니라, 이들 2종의 DNA를 불화합성(不和合性) 그룹의 다른 2종의 벡터에 각각 조립하여, 이들을 동일 숙주 세포에 도입함으로써도 얻을 수 있다.
또한, 상술한 바와 같이, 본 발명의 재조합 벡터는, 상기 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 코딩하는 DNA, 또는 서열 목록의 서열 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA를 함유하는 것이다. 바람직하게는, 후술하는 도 2에 있어서 pNTAX로 표시되는 재조합 벡터 등을 들 수 있다.
또한, 상기 재조합 벡터로서는, 상기 글루코스 탈수소 효소를 코딩하는 DNA를 더 함유하는 것도 들 수 있다. 또한, 상기 글루코스 탈수소 효소가, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 것이 바람직하다.
본 발명의 형질 전환체는 상기 재조합 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질 전환하여 얻어진 것이다.
또한, 상기 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 코딩하는 DNA, 또는 서열 목록의 서열 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA를 함유하는 제1의 재조합 벡터, 및 글루코스 탈수소 효소를 코딩하는 DNA를 함유하는 제2의 재조합 벡터를 사용하여, 숙주 세포를 형질 전환하여 얻어지는 형질 전환체가 바람직하다.
보다 바람직한 형질 전환체로서는, 제1의 재조합 벡터가 상기 pNTAX이고, 상기 글루코스 탈수소 효소가 바실러스 메가테리움 유래의 것인 형질 전환체; 제1의 재조합 벡터가 상기 pNTAX이고, 제2의 재조합 벡터가 후술하는 도 2에 있어서 pSTVG로 표시되는 재조합 벡터인 형질 전환체 등을 들 수 있다.
또한, 숙주 세포로서는, 대장균이 바람직하다.
또한, 본 발명의 형질 전환체로서, 구체적으로는
재조합 대장균 E. coli HB101(pNTAX)(FERM BP-10126, 원기탁일 평성 15년 10월 23일의 국내 기탁을 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁에 이관),
재조합 대장균 E. coli HB101(pNTAX, pSTVG)(FERM P-19567, 기탁일 평성 15년 10월 23일)
등을 들 수 있으며, 각각 일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반치 1 주오 다이 6에 있는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁되어 있다.
다음에, 3-케토펜탄니트릴을 아세토아세틸-CoA 환원 효소로 비대칭적으로 환원시켜 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 제조하는 방법에 대하여 상술한다.
본 방법에 사용되는 아세토아세틸-CoA 환원 효소는 그의 기원을 막론하고 사용할 수 있다. 미생물 유래의 것뿐 아니라 동물 또는 식물 유래의 것일 수도 있다.
예를 들면, 아시네토박터 종(Acinetobacter sp.) RA3849 유래의 아세토아세 틸-CoA 환원 효소[J. Bacteriol ., 177, 4501 내지 4507(1995)], 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[FEMS Microbiol. Lett ., 52, 259 내지 264(1988)], 알칼리게네스 락터스(Alcaligenes latus) 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[J. Microbiol . Biotechnol ., 6, 425 내지 431(1996)], 아조스피릴럼 브라실렌스(Azospirillum brasilense) 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[J. Gen . Microbiol ., 136, 1191 내지 1196(1990); Mol . Gen. Genet ., 231, 375 내지 384(1992)], 아조토박터 바이제린키(Azotobacter beijerinckii) 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[Biochem . J., 134, 225 내지 238(1973)], 바실러스 메가테리움 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[Can . J. Microbiol., 41(Suppl. 1), 77 내지 79(1995)], 크로마튬 비노섬(Chromatium vinosum) D주 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[Eur . J. Biochem., 209, 135 내지 150(1992)], 엑토티오로도스피라 샤포슈니코비(Ectothiorhodospira shaposhnikovii) 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[Appl . Microbiol. Biotechnol., 40, 292 내지 300(1993)], 루피너스 루테우스(Lupinus luteus) 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[Plant Soil, 56, 379 내지 390(1980)], 메틸로박테리움 엑스토켄스(Methylobacterium extorquens) 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[FEMS Microbiol Lett ., 156, 275 내지 279(1997)], 메틸로박테리움 로데시아넘(Methylobacterium rhodesianum) MB126 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[Arch . Microbiol ., 161, 277 내지 280(1994)], 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans) 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[FEMS Microbiol. Rev ., 103, 257 내지 264(1992); FEMS Microbiol . Lett ., 133, 85 내지 90(1995)], 리조븀 루피니(Rhizobium lupini) 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[Fizio 1. Rast. (Moscow), 27, 544 내지 550(1980)], 리조븀 멜리로티(Rhizobium meliloti) 41 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[Microbiology, 141, 2553-2559(1995)], 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber) NCIMB40126 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[FEMS Microbiol . Rev ., 103, 93 내지 101(1992)], 시네코커스 종(Synechococcus sp.) 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소(일본 특허 공개 (평)08-187085호 공보), 신트로포모나스 울페이 아종 울페이(Syntrophomonas wolfei subsp. wolfei) 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[Arch . Microbiol., 159, 16 내지 20(1993)], 티오캅사 페니기(Thiocansa pfennigii) 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[Appl . Microbiol . Biotechnol ., 40, 292 내지 300(1993)], 주글로에아 라미게라(Zoogloe ramigera) I-16-M 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소[Arch . Microbiol., 114, 211 내지 217(1977); J. Biol . Chem. 262, 97 내지 102(1987)] 등, 기지의 아세토아세틸-CoA 환원 효소 등을 들 수 있다.
또한, 앞서 상술한 본 발명의 신규 아세토아세틸-CoA 환원 효소일 수도 있고, 예를 들면 서열 목록의 서열 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다.
또한, 본 방법에 사용되는 아세토아세틸-CoA 환원 효소로서, 이하의 (c) 내지 (e) 중 어느 것의 폴리펩티드를 들 수 있다.
(c) 서열 목록의 서열 3에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
(d) 서열 목록의 서열 3에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아 미노산이 부가, 결실 또는 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 3-케토펜탄니트릴을 비대칭적으로 환원시켜 광학 순도 95％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 활성을 갖는 폴리펩티드, 및
(e) 서열 목록의 서열 4에 나타낸 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA에 의해 코딩되고, 또한 3-케토펜탄니트릴을 비대칭적으로 환원시켜 광학 순도 95％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 활성을 갖는 폴리펩티드.
본 폴리펩티드의 유래로서는, 랄스토니아속에 속하는 미생물이 바람직하고, 특히 바람직하게는 랄스토니아 유트로파이다.
서열 목록의 서열 4에 나타낸 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA란, 서열 목록의 서열 4에 나타낸 전체 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA를 프로브(probe)로 하여, 콜로니 혼성화법, 플라크 혼성화법 또는 서던 혼성화법 등을 사용함으로써 얻어지는 DNA를 의미한다. 구체적으로는, 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA를 고정화한 필터를 사용하고, 0.7 내지 1.0 M의 NaCl 존재하에 65℃에서 혼성화를 행한 후, 0.1 내지 2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은 150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산나트륨을 포함함)을 사용하여, 65℃의 조건하에서 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA를 들 수 있다.
혼성화는 문헌[Molecular Cloning, A laboratory manual, second edition(Cold Spring Harbar Laboratory Press, 1989년)] 등에 기재되어 있는 방법 에 준하여 행할 수 있다.
혼성화 가능한 DNA로서 구체적으로는, 서열 목록의 서열 4에 나타낸 염기 서열과, 서열 동일성이 60％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 이상인 DNA를 들 수 있고, 코딩되는 폴리펩티드가 3-케토펜탄니트릴을 비대칭적으로 환원시켜 광학 순도 95％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 활성을 갖는 한, 본 발명에 사용할 수 있다.
여기서, 「서열의 동일성(％)」이란, 대비되는 2개의 DNA를 최적으로 정렬시켜, 핵산 염기(예를 들면, A, T, C, G, U 또는 I)가 양쪽 서열에서 일치한 위치의 수를 비교 염기 총수로 나누고, 또한 이 결과에 100을 곱한 수치로 표시된다.
상기 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 3-케토펜탄니트릴에 작용시킴으로써 광학 순도 95％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜타니트릴을 얻을 수 있다. 특히, 상술한 신규 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 사용한 경우에는, 광학 순도 99％ e.e. 이상의 매우 광학 순도가 높은 (R)-3-히드록시펜타니트릴을 얻을 수 있다.
또한, 상기 아세토아세틸-CoA 환원 효소의 아미노산 서열 또는 상기 효소를 코딩하는 DNA의 염기 서열이 이미 분명한 경우에는, 먼저 상술한 본 발명의 신규 아세토아세틸-CoA 환원 효소의 경우와 동일하게 조작함으로써, 상기 효소를 대량 발현하는 형질 전환체를 제조하고, 이 형질 전환체 또는 그의 배양물을 사용하여 환원 반응을 행할 수도 있다.
여기서, 상술한 재조합 벡터 이외에, 서열 목록의 서열 4로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA를 함유하고, 후술하는 도 3에 있어서 pNTRE로서 표시되는 재 조합 벡터 등도 사용할 수 있다.
또한, 상술한 형질 전환체 이외에, 이하의 형질 전환체 등도 사용할 수 있다.
재조합 대장균 E. coli HB101(pNTRE)(수탁 번호 FERM P-19566, 기탁일 평성 15년 10월 23일),
재조합 대장균 E. coli HB101(pNTRE, pSTVG)(수탁 번호 FERM BP-10125, 원기탁일 평성 15년 10월 23일의 국내 기탁을 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁에 이관).
이들은 각각, 일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반치 1 주오 다이 6에 있는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁되어 있다.
아세토아세틸-CoA 환원 효소를 발현시키는 형질 전환체를 사용하여, 3-케토펜탄니트릴을 환원시켜 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 제조하는 경우, 이하와 같이 실시될 수 있다. 단, 이하의 방법으로 한정되는 것은 아니다.
우선 최초에, 적당한 용매 중에 기질 3-케토펜탄니트릴 또는 3-케토펜탄니트릴 알칼리 금속염(예를 들면 3-케토펜탄니트릴의 나트륨염 등)을 첨가하고, NADP+ 등의 보효소 및 상기 형질 전환체의 배양물을 첨가하여, pH 조정하에 교반하여 반응시킨다. 이 반응은 5 내지 80℃, 바람직하게는 10 내지 60℃, 보다 바람직하게는 20 내지 40℃의 온도에서 행해지고, 반응 중 반응액의 pH는 3 내지 10, 바람직 하게는 4 내지 9, 보다 바람직하게는 5 내지 8로 유지한다. 반응은 회분식 또는 연속식으로 행해질 수 있다.
회분식의 경우에는, 반응 기질은 0.01 내지 70％(w/v), 바람직하게는 0.1 내지 50％, 보다 바람직하게는 0.5 내지 30％의 투입 농도로 첨가될 수 있다. 반응 도중에서 기질인 3-케토펜탄니트릴을 첨가하는 경우에는, 3-케토펜탄니트릴을 그대로 첨가할 수도 있고, 또한 3-케토펜탄니트릴 알칼리 금속염(예를 들면 3-케토펜탄니트릴의 나트륨염 등)을 첨가할 수도 있다.
또한, 형질 전환체의 배양은, 그 미생물이 증식하는 한, 통상의 탄소원, 질소원, 무기 염류, 유기 영양소 등을 포함하는 액체 영양 배지를 사용하여 행할 수 있다. 또한, 배양 온도는 바람직하게는 4 내지 50℃이다.
여기서 형질 전환체의 배양물이란, 배양액, 균체는 물론이고 동결 건조 균체, 아세톤 건조 균체 또는 그들의 마쇄물, 조효소액, 정제 효소일 수도 있으며, 또한 공지된 수단으로 고정화된 고정화 효소 또는 고정화 균체일 수도 있다.
또한, 본 반응을 행할 때, 형질 전환체로서 아세토아세틸-CoA 환원 효소와 글루코스 탈수소 효소를 둘다 모두 생산하는 것을 사용하는 경우, 반응계에 글루코스를 더 첨가함으로써 보효소의 사용량을 대폭 감소시키는 것이 가능해진다.
반응액으로부터의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴의 채취 방법은 특별히 한정되지 않지만, 반응액으로부터 직접 또는 균체 등을 분리 후, 아세트산에틸, 톨루엔, t-부틸메틸에테르, 헥산, 염화메틸렌 등의 용제로 추출하고, 탈수한 후에, 증류 또는 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 등에 의해 정제하면, 고순도의 (R)-3-히드록시펜탄 니트릴이 용이하게 얻어진다.
또한, 하기 화학식 3으로 표시되는 아세토아세트산에스테르에 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 작용시킴으로써, 하기 화학식 4로 표시되는 (R)-3-히드록시부탄산에스테르를 효율적으로 제조할 수 있다.
Figure 112006031358011-PCT00004
(식 중, R은 치환되어 있을 수도 있고, 분지되어 있을 수도 있는 저급 알킬기를 나타낸다.)
Figure 112006031358011-PCT00005
(식 중, R은 상기와 동일하다.)
R의 저급 알킬기로서는, 분지되어 있을 수도 있는 탄소수 1 내지 5의 알킬기가 바람직하고, 보다 바람직하게는 메틸기, 에틸기이다. 또한, 상기 저급 알킬기는 치환되어 있을 수도 있고, 치환기로서는, 예를 들면 할로겐 원자, 수산기, 알콕시기, 니트로기, 아미노기 등을 들 수 있다.
본 반응에 사용되는 아세토아세틸-CoA 환원 효소는, 아세토아세트산에스테르를 (R)-3-히드록시부탄산에스테르로 환원시키는 것이라면, 그의 기원을 막론하고 사용할 수 있으며, 본 발명의 신규 아세토아세틸-CoA 환원 효소나 상기 기지의 아 세토아세틸-CoA 환원 효소를 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 이들 효소를 대량 발현시킨 형질 전환체를 앞서 서술한 방법과 동일하게 육종하여, 이것을 사용할 수도 있다. 본 반응은, 앞서 서술한 3-케토펜탄니트릴의 환원 반응과 동일하게 실시할 수 있다.
또한, 하기 화학식 5로 표시되는 1-페닐에타논 유도체에 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 작용시킴으로써, 하기 화학식 6으로 표시되는 광학 활성 1-페닐에탄올 유도체를 효율적으로 제조할 수 있다.
Figure 112006031358011-PCT00006
(식 중, R1 및 R2는 수소 원자, 할로겐 원자, 알콕시기 또는 니트로기를 나타내고, 각각 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, R3은 수소 원자, 할로겐 원자, 수산기, 또는 치환될 수도 있는 알킬기를 나타낸다.)
Figure 112006031358011-PCT00007
(식 중, R1, R2 및 R3은 상기와 동일하다.)
특히, 하기 화학식 7로 표시되는 2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에타논에 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 작용시킴으로써, 하기 화학식 8로 표시되는 (R)-2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에탄올을 효율적으로 제조할 수 있다.
Figure 112006031358011-PCT00008
Figure 112006031358011-PCT00009
R1, R2 및 R3에서의 할로겐 원자로서는, 예를 들면 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 또는 요오드 원자를 들 수 있다.
R1 및 R2에서의 알콕시기로서는, 탄소수 1 내지 3의 알콕시기를 들 수 있고, 예를 들면 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기 등을 들 수 있다. 바람직하게는 메톡시기이다.
R3에서의 알킬기로서는, 탄소수 1 내지 8의 알킬기를 들 수 있고, 예를 들면 메틸기, 에틸기, 프로필기, 헥실기, 옥틸기 등을 들 수 있다. 바람직하게는 탄소수 1 내지 2의 알킬기이다. 또한, 상기 알킬기는 치환기를 가질 수도 있고, 치환 기로서는, 예를 들면 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자, 수산기, 아미노기 등을 들 수 있다.
본 반응에 사용되는 아세토아세틸-CoA 환원 효소는, 1-페닐에타논 유도체를 광학 활성 1-페닐에탄올 유도체로 환원시키는 활성, 특히 2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에타논을 (R)-2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에탄올로 환원시키는 활성을 갖는 것이면, 그의 기원을 막론하고 사용할 수 있다. 본 발명의 신규 아세토아세틸-CoA 환원 효소나 상기 기지의 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 이들 효소를 대량 발현시킨 형질 전환체를 앞서 서술한 방법과 동일하게 육종하여, 이것을 사용할 수도 있다. 본 반응은 앞서 서술한 3-케토펜탄니트릴의 환원 반응과 동일하게 실시할 수 있다.
<발명의 효과>
본 발명에 따르면, 높은 광학 순도의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴, (R)-3-히드록시부탄산에스테르, 광학 활성 1-페닐에탄올 유도체라는 유용한 광학 활성 알코올을 간편한 방법으로 제조할 수 있다. 특히, (R)-3-히드록시펜탄니트릴에 대해서는, 95％ e.e. 이상, 본 발명의 신규 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 사용하면 99％ e.e. 이상의, 종래에 없었던 매우 높은 광학 순도의 제품을 얻는 것이 가능하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 조금도 한정되지 않는다. 또한, 이하의 기재에 있어서, 「％」는 특별히 언급하지 않는 한, 「중량％」를 의미한다.
또한, 생성된 3-히드록시펜탄니트릴의 양 및 광학 순도에 대해서는, 하기 모세관 기체 크로마토그래피 조건에서 분석하여 구하였다.
[모세관 기체 크로마토그래피 분석 조건]
칼럼: Chiradex G-TA(20 m×0.25 mm)(ASTEC사 제조), 검출: FID
칼럼 온도: 120℃
주입 온도: 200℃
검출 온도: 200℃
캐리어 기체: 헬륨(100 kPa)
분할 비: 100/1
용출 시간: (R)-3-히드록시펜탄니트릴 4.37 분, (S)-3-히드록시펜탄니트릴 5.17 분
( 실시예 1) 아크로모박터 크실로속시단스 아종 데니트리피칸스 IFO15125주로부터의 신규 아세토아세틸 - CoA 환원 효소의 정제
3-케토펜탄니트릴로부터 3-히드록시펜탄니트릴로의 환원 활성은 이하와 같이 측정하였다. 3-케토펜탄니트릴 5 mg 및 NADPH 30 mg을 넣은 시험관에 1 M 인산 완충액(pH 6.5) 0.05 ㎖ 및 폴리펩티드(효소) 용액 0.45 ㎖를 첨가하고, 30℃에서 1 시간 진탕하였다. 이것에 아세트산에틸 1 ㎖를 첨가하여 충분히 교반 후, 원심 분리하였다. 유기층에 대하여 상기 모세관 기체 크로마토그래피 조건에서 분석하여, 생성된 3-히드록시펜탄니트릴량을 구하였다. 이 조건에 있어서, 1 분간에 1 ㎛ol의 3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 환원 활성을 1 유닛(unit)이라 정의하였다. 또한, 3-히드록시펜탄니트릴의 광학 순도에 대해서도, 상기 모세관 기체 크로마토그래피 조건에서 분석하여 구하였다.
고기 엑기스 10 g, 펩톤 10 g, 효모 엑기스 5 g, 염화나트륨 3 g(모두 1 L당)의 조성으로 이루어지는 액체 배지(pH 7) 100 ㎖를 판구(坂口) 플라스크에 분주하고, 120℃에서 20 분간 증기 살균을 행하였다. 이 액체 배지를 10개 준비하고, 이것에 아크로모박터 크실로속시단스 아종 데니트리피칸스 IFO15125주를 무균적으로 1백금이로 접종하여 30℃에서 40 시간 진탕 배양하였다. 얻어진 배양액 500 ㎖에 대하여, 원심 분리에 의해 균체를 모으고, 10 mM 인산 완충액(pH 7.0) 200 ㎖로 세정하고, 습균체를 1 mM이 되도록 β-머캅토에탄올을 첨가한 10 mM 인산 완충액(pH 7.0) 30 ㎖에 현탁시켰다. 또한, 균체를 초음파 파쇄기(브론슨사 제조)에서 파쇄하고, 원심 분리로써 균체 잔사를 제거하여 무세포 추출액 25 ㎖를 취득하였다. 이것을 1 mM의 β-머캅토에탄올을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 미리 평형화한 TOYOPEARL DEAE-650M(도소사 제조) 칼럼(10 ㎖)에 사용하여, 효소를 흡착시킨 후, 염화나트륨 농도(0 mM에서 500 mM까지)를 단계적으로 높혀 용출을 행하고, 3-케토펜탄니트릴의 환원 활성을 갖는 분획을 취득하였다. 활성 분획을 모아, 1 mM의 β-머캅토에탄올을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 미리 평형화한 HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade(아마샴 파마시아 바이오테크사 제조) 칼럼에 사용하였다. 활성 분획에 대하여, 또한 1 mM의 머캅토에탄올을 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 미리 평형화한 2'5' ADP Sepharose 4B(아마샴 파마시아 바이오테크사 제조) 칼럼(18 ㎖)에 사용하여, 효소를 흡착시킨 후, 염화나트 륨 농도(0 mM에서 1.0 M까지)의 선형 농도 구배에 의해 활성 분획을 용출시켰다. 이상의 정제 조작에 의해, 전기 영동적으로 거의 단일한 정제 폴리펩티드 표품(標品)을 얻었다. SDS 폴리아크릴아미드 전기 영동 분석법에 있어서의 밴드의 분자량은, 아마샴 바이오사이언스(Amcrsham Bioscience)사 제조의 LMW Calibration Kit For SDS-Electrophoresis의 프로토콜에 따라서 결정하였다. 그 결과, 상기 분자량은 약 26000이었다. 본 정제 효소를 NADPH 존재하에서 3-케토펜탄니트릴에 작용시키면, 광학 순도 99.2％ e.e.의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴이 생성되었다. 이후, 본 발명의 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 RAX라 부르기로 한다.
( 실시예 2) 효소의 성질 측정
얻어진 RAX의 효소 화학적 성질에 대하여 조사하였다.
(1) 작용
NADPH를 보효소로 하여, 3-케토펜탄니트릴에 작용하여 광학 순도 99.2％ e.e.의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴로 환원시켰다. NADPH 대신에 NADH를 보효소로 하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 3-케토펜탄니트릴 환원 활성을 측정한 결과, NADPH를 보효소로 한 경우의 약 15％의 활성을 나타내었다.
또한, 아세토아세틸-CoA 및 4-클로로아세토아세트산에틸에 대한 환원 활성을 조사하였다. 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 아세토아세틸-CoA 0.25 mM 또는 4-클로로아세토아세트산에틸 10 mM, NADPH 0.25 mM 및 효소를 포함하는 반응액을 30℃에서 반응시켜, NADPH의 소비에 따른 파장 340 nm의 흡광도 감소를 측정함으로써 각각의 기질에 대한 환원 활성을 구하였다. 이 반응 조건에 있어서, 1 분간에 1 ㎛ol의 NADPH를 NADP+로 산화하는 효소 활성을 1 유닛이라 정의하였다. 그 결과, 아세토아세틸-CoA, 4-클로로아세토아세트산에틸의 두 화합물에 대하여 환원 활성을 가지고, 실시예 1에 기재된 방법으로 구한 3-케토펜탄니트릴에 대한 환원 활성의 각각 약 7.6배, 약 3.2배의 값을 나타내었다.
(2) 작용 최적 온도
RAX의 작용 최적 온도를 조사하기 위해서, 10 내지 50℃에서의 4-클로로아세토아세트산에틸 환원 활성을 측정하였다. 활성 측정은, 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에 기질 4-클로로아세토아세트산에틸 10 mM, 보효소 NADPH 0.25 mM 및 효소를 첨가하고, 10 내지 50℃에서 3 분간 반응시켜, 파장 340 mM의 흡광도 감소를 측정함으로써 행하였다. 그 결과, 최적 온도는 27 내지 33℃였다.
(3) 작용 최적 pH
RAX의 작용 최적 pH를 조사하기 위해서, pH 4 내지 9에 있어서의 4-클로로아세토아세트산에틸 환원 활성을 측정하였다. 효소 활성은, 완충액에 기질 4-클로로아세토아세트산에틸 10 mM, 보효소 NADPH 0.25 mM 및 효소를 첨가하고, 30℃에서 3 분간 반응시켜, 파장 340 mM의 흡광도 감소를 측정함으로써 행하였다. 완충액으로서 100 mM 인산 완충액, 100 mM 아세트산 완충액 또는 100 mM 트리스염산 완충액을 사용하고, pH 4 내지 9의 범위에서 활성을 측정하였다. 그 결과, 최적 pH는 5.5 내지 6.5였다.
(4) 저해제
4-클로로아세토아세트산에틸에 대한 환원 활성을 각종 화합물 및 금속염을 첨가한 조건에서 측정하였다. 활성 측정은, 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에 기질 4-클로로아세토아세트산에틸 10 mM, 보효소 NADPH 0.25 mM, 효소 및 저해제를 첨가하고, 30℃에서 3 분간 반응시켜, 파장 340 mM의 흡광도 감소를 측정함으로써 행하였다. 저해제를 첨가하지 않았을 때의 활성을 100％로 하여, 저해제 첨가시의 활성을 상대 활성으로 표 1에 통합하였다.
Figure 112006031358011-PCT00010
그 결과, 효소 활성은 p-클로로머큐리벤조산, 황산구리, 질산은, 염화수은에 의해 저해되었다.
(5) 분자량
용출액으로서 150 mM의 염화나트륨을 포함하는 50 mM 인산 완충액(pH 7.0)을 사용하고, Superdex 200 HR 10/30(파마시아 바이오텍사 제조)에 의한 정제 효소의 겔 여과 크로마토그래피 분석을 행한 결과, 표준 단백질과의 상대 유지 시간으로부터 산출한 본 효소의 분자량은 약 85500이었다.
( 실시예 3) RAX 유전자의 클로닝
실시예 1에서 얻어진 정제 효소를 8 M 요소 존재하에서 변성시킨 후, 아크로모박터 유래의 리실 엔도펩티다아제(와코 쥰야쿠 고교사 제조)로 소화하고, 얻어진 펩티드 단편의 아미노산 서열을 에드만법에 의해 결정하였다.
상기 아미노산 서열로부터 예상되는 DNA 서열을 고려하여, 프라이머 1(5'-CARGGNTAYACNTTYTAYG-3': 서열 5) 및 프라이머 2(5'-GCDATYTCYTCNGGNGTYCC-3': 서열 6)을 합성하였다. 프라이머 2종(프라이머 1 및 프라이머 2) 각 100 pmol, 아크로모박터 크실로속시단스 아종 데니트리피칸스 IFO15125주의 염색체 DNA 866 ng, dNTP(데옥시뉴클레오티드삼인산) 각 10 nmol, ExTaq(다까라 슈조사 제조) 2.5 U를 포함하는 ExTaq용 완충액 100 ㎕를 제조하여, 열 변성(96℃, 1 분), 어닐링(50℃, 1 분), 신장 반응(72℃, 1 분)을 30 사이클 행하고, 4℃까지 냉각 후, 아가로스 겔 전기 영동에 의해 증폭 DNA를 확인하였다.
본 반응에 사용한 아크로모박터 크실로속시단스 아종 데니트리피칸스 IFO15125주의 염색체 DNA의 제조는, 분자 생물학 실험 프로토콜 1(마루젠) P.36에 기재되어 있는 세균 게놈 DNA의 소량 제조법에 의해 행하였다. 증폭 DNA를 pT7 Blue Vector(Novagen사 제조)에 서브클로닝하여 그의 염기 서열을 결정하였다. 그 결과, 증폭 DNA는 프라이머 서열을 포함하여 503 염기를 포함하였다. 그의 서열은, 도 1에 나타낸 DNA 서열에 있어서, 이중 하선을 뺀 DNA 서열 부분이다. 이 후 이 서열을 「코어 서열」이라 기재한다.
코어 서열의 5'-측에 가까운 부분의 염기 서열을 바탕으로, 그의 상보 서열이 되는 프라이머 3(5'-CGTCGGCGCTCATCTTGCGGAACAG-3': 서열 7)을 제조하고, 또한 3'-측에 가까운 부분의 염기 서열을 바탕으로, 프라이머 4(5'-AGGGCATCACGGTCAACACGGTGTC-3': 서열 8)을 제조하였다. 역 PCR의 주형으로서, 우선 아크로모박터 크실로속시단스 아종 데니트리피칸스 IFO15125주의 염색체 DNA를 제한 효소 SphI에 의해 소화하여, 소화물을 T4 DNA 리가제를 사용하여 자체 폐환하였다. 이 자체 폐환물 300 ng, 프라이머 2종(프라이머 3 및 프라이머 4) 각 50 pmol, dNTP 각 10 nmol, ExTaq(다까라 슈조사 제조) 2.5 U를 포함하는 ExTaq용 완충액 50 ㎕를 제조하여, 열 변성(97℃, 0.5 분), 어닐링(68℃, 1 분), 신장 반응(72℃ , 5 분)을 30 사이클 행하고, 4℃까지 냉각 후, 아가로스 겔 전기 영동에 의해 증폭 DNA를 확인하였다.
증폭 DNA를 pT7 Blue Vector(Novagen사 제조)에 서브클로닝하여, 그의 염기 서열을 결정하였다. 이 결과와 코어 서열의 결과로부터, RAX를 코딩하는 유전자의 전체 염기 서열을 결정하였다. 전체 염기 서열을 서열 목록의 서열 15에 나타내었다. 또한, 전체 염기 서열 및 상기 유전자가 코딩하는 추정 아미노산 서열을 도 1에 통합하였다. 도 1 중 한겹 하선은, 정제 RAX를 리실 엔도펩티다아제로 소화하여 생성된 펩티드 단편에 있어서, 에드만법에 의해 결정한 아미노산 서열을 나타낸다.
( 실시예 4) RAX 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조
대장균에 있어서 RAX를 발현시키기 위해서, 형질 전환에 사용되는 재조합 벡터를 제조하였다. 우선, RAX 유전자의 개시 코돈 부분에 NdeI 부위를 부가하고, 또한 종결 코돈의 직후에 새로운 종결 코돈과 EcoRI 부위를 부가한 이본쇄 DNA를 이하의 방법에 의해 취득하였다.
실시예 3에서 결정한 염기 서열에 기초하여, RAX 유전자의 개시 코돈 부분에 NdeI 부위를 부가한 프라이머 5(5'-GTACATATGAGCGGAAAACTGGCTTACG-3': 서열 9), 및 RAX 유전자의 종결 코돈의 직후에 새로운 종결 코돈과 EcoRI 부위를 부가하고, 또한 NdeI 부위를 파괴하기 위해서 1 염기 치환한 프라이머 6(5'-G TAGAATTCTTATCAGCCCATGTGCAGGCCGCCG-3': 서열 10)을 합성하였다. 프라이머 2종(프라이머 5 및 프라이머 6) 각 100 pmol, 아크로모박터 크실로속시단스 아종 데니트리피칸스 IFO15125주의 염색체 DNA 132 ng, dNTP 각 20 nmol, ExTaq(다까라 슈조사 제조) 2.5 U를 포함하는 ExTaq용 완충액 100 ㎕를 제조하여 열 변성(97℃, 0.5 분), 어닐링(65℃, 1 분), 신장 반응(72℃, 1 분)을 30 사이클 행하고, 4℃까지 냉각 후, 아가로스 겔 전기 영동에 의해 증폭 DNA를 확인하였다. 이 증폭 단편을 NdeI 및 EcoRI로 소화하여, 플라스미드 pUCNT(WO94/03613)의 lac 프로모터 하류의 NdeI, EcoRI 부위에 삽입함으로써 재조합 벡터 pNTAX를 얻었다. pNTAX의 제조법 및 구조를 도 2에 나타내었다.
( 실시예 5) RAX 유전자 및 글루코스 탈수소 효소 유전자의 양자를 동시에 포함하는 재조합 벡터의 제조
바실러스 메가테리움 IAM1030주 유래의 글루코스 탈수소 효소(이후 GDH라 기재함)의 유전자의 개시 코돈으로부터 5 염기 상류에 대장균의 샤인-댈가노(Shine-Dalgarno) 서열(9 뉴클레오티드)를, 또한 그의 직전에 EcoRI 절단점을, 또한 종결 코돈의 직후에 SalI 절단점을 부가한 이본쇄 DNA를 이하의 방법에 의해 취득하였다.
GDH 유전자의 염기 서열 정보를 기초로, GDH의 구조 유전자의 개시 코돈으로부터 5 염기 상류에 대장균의 샤인-댈가노 서열(9 뉴클레오티드)를, 또한 그의 직전에 EcoRI 절단점을 부가한 프라이머 7(5'-GCCGAATTCTAAGGAGGTTAACAATGTATAAAGATTTAGAAGG-3': 서열 11)과, 종결 코돈의 직후에 SalI 부위를 부가한 프라이머 8(5'-GCGGTCGACTTATCCGCGTCCTGCTTGG-3': 서열 12)를 통상법에 따라서 합성하였다. 이들 2개의 프라이머를 사용하고, 플라스미드 pGDK1[Eur. J. Biochem ., 186, 389(1989)]을 주형으로 하여 PCR에 의한 이본쇄 DNA를 합성하였다. 얻어진 DNA 단편을 EcoRI 및 SalI로 소화하여, 실시예 4에 있어서 구축한 pNTAX의 EcoRI-SalI 부위에 삽입한 재조합 벡터 pNTAXG를 얻었다. pNTAXG의 제조법 및 구조를 도 2에 나타내었다.
( 실시예 6) RAX 를 생산하는 재조합 대장균의 제조
실시예 4에서 얻은 재조합 벡터 pNTAX 및 실시예 5에서 얻은 재조합 벡터 pNTAXG를 사용하여 대장균 HB101(다까라 슈조사 제조)를 형질 전환하고, 각각으로부터 재조합 대장균 HB101(pNTAX) 및 HB101(pNTAXG)를 얻었다. 재조합 대장균 HB101(pNTAX)(수탁 번호 FERM BP-10126, 원기탁일 평성 15년 10월 23일의 국내 기탁을 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁에 이관)는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁되어 있다.
또한, 실시예 5에서 제조한 재조합 벡터 pNTAXG를 EcoRI 및 PstI로 이중 소화하여 얻어지는 GDH 유전자를 포함하는 약 0.8 kb의 DNA 단편을, 플라스미드 pSTV28(다까라 슈조사 제조)의 EcoRI-PstI 부위에 삽입하여 재조합 벡터 pSTVG를 구축하였다. pSTVG의 제조법 및 구조를 도 2에 나타내었다. 이 pSTVG로, 미리 염화칼슘법으로 컨피턴트화해 둔 재조합 대장균 HB101(pNTAX)을 형질 전환하여 재조합 대장균 HB101(pNTAX, pSTVG)를 얻었다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체인 재조합 대장균 HB101(pNTAX, pSTVG)(수탁 번호 FERM P-19567, 기탁일 평성 15년 10월 23일)는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁되어 있다.
( 실시예 7) 재조합 대장균에 있어서의 RAX 및 GDH 의 발현
박토 트립톤 1.6％(w/v), 박토 이스트 엑기스 1.0％(w/v), NaCl 0.5％(w/v)의 조성으로 이루어지는 2×YT 배지(pH 7) 50 ㎖를 500 ㎖ 용량 판구 플라스크에 분주하고, 120℃에서 20 분간 증기 살균을 행하였다. 실시예 6에서 얻은 재조합 대장균 HB101(pNTAX), HB101(pNTAXG), HB101(pNTAX, pSTVG) 및 벡터 플라스미드만의 형질 전환체인 재조합 대장균 HB101(pUCNT)의 각각을 동일 배지에 파종 후, 37℃에서 18 시간 진탕 배양하였다. 단, HB101(pNTAX), HB101(pNTAXG), HB101(pUCNT)의 배양시에는 120 ㎍/㎖가 되도록 암피실린을 부가하고, 또한 HB101(pNTAX, pSTVG)의 배양시에는 각각 120 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖가 되도록 암피실린, 클로람페니콜을 첨가하였다. 집균 후, 10 mM 인산 완충액(pH 7)에 현탁시켜, 초음파 파쇄를 행함으로써 무세포 추출액을 얻었다. 각 재조합 대장균의 무세포 추출액에 대하여, 3-케토펜탄니트릴 환원 비활성 및 GDH 비활성을 측정하였다. GDH 비활성의 측정은, 1 M 트리스염산 완충액(pH 8.0)에 기질 글루코스 0.1 M, 보효소 NADP+ 2 mM 및 효소를 첨가하고, 25℃에서 파장 340 mM의 흡광도 증가를 측정함으로써 행하였다. 이 반응 조건에 있어서, 1 분간에 1 ㎛ol의 NADP+를 NADPH로 환원시키는 효소 활성을 1 유닛이라 정의하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure 112006031358011-PCT00011
재조합 대장균 HB101(pNTAX)에서는, 벡터 플라스미드만의 형질 전환체인 재조합 대장균 HB101(pUCNT)와 비교하여, 분명한 3-케토펜탄니트릴 환원 비활성의 증가를 볼 수 있었다. 또한, 재조합 대장균 HB101(pNTAXG) 및 재조합 대장균 HB101(pNTAX, pSTVG)에서는, 벡터 플라스미드만의 형질 전환체인 재조합 대장균 HB101(pUCNT)와 비교하여, 분명한 3-케토펜탄니트릴 환원 비활성 및 GDH 비활성의 증가를 볼 수 있었다.
( 실시예 8) 재조합 대장균 HB101 ( pNTAX )를 사용한 3- 케토펜탄니트릴로부터의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴의 합성
재조합 대장균 HB101(pNTAX)를 실시예 7과 동일하게 배양, 균체 파쇄를 행하여 무세포 추출액을 제조하였다. 미리 3-케토펜탄니트릴 5 mg, NADPH 50 mg 및 1 M 인산 완충액(pH 6.5) 50 ㎕를 넣은 시험관에, 앞의 무세포 추출액 450 ㎕를 첨가하여 30℃에서 밤새 진탕하였다. 아세트산에틸 1 ㎖로 2회 추출을 행하고, 생성물인 3-히드록시펜탄니트릴의 생성량과 광학 순도를 측정한 결과, 생성량 3.7 mg, 광학 순도(R) 99.2％ e.e.였다.
( 실시예 9) 재조합 대장균 HB101 ( pNTAXG )를 사용한 3- 케토펜탄니트릴로부터의 (R)-3- 히드록시펜탄니트릴의 합성
재조합 대장균 HB101(pNTAXG)를 실시예 7과 동일하게 배양 후, 균체 파쇄를 행하여 무세포 추출액을 제조하였다. 무세포 추출액 450 ㎕에 1 M 인산 완충액(pH 6.5) 50 ㎕, 글루코스 13.9 mg, NADP+ 1 mg, 3-케토펜탄니트릴 5 mg을 첨가하여 30℃에서 밤새 교반하였다. 반응 후, 생성물인 3-히드록시펜탄니트릴의 생성량과 광학 순도를 측정한 결과, 생성량 4.5 mg, 광학 순도 99.2％ e.e.였다.
( 실시예 10) 재조합 대장균 HB101 ( pNTAX , pSTVG )를 사용한 3- 케토펜탄니트릴로부터의 (R)-3- 히드록시펜탄니트릴의 합성
재조합 대장균 HB101(pNTAX, pSTVG)를 실시예 7과 동일하게 배양하였다. 얻어진 배양액 20 ㎖에 글루코스 5.0 g, NADP+ 3 mg, 3-케토펜탄니트릴의 나트륨염 0.2 g을 첨가하고, 5 N의 수산화나트륨 수용액을 적하함으로써 pH 6.5로 조정하면서 30℃에서 교반하였다. 반응 후 1.5 시간째, 3 시간째, 4.8 시간째, 5.7 시간째, 7 시간째 및 9 시간째에 각 0.2 g의 3-케토펜탄니트릴의 나트륨염을 각각 첨가하였다. 또한, 반응 9.4 시간째에 배양액 4 ㎖와 NADP+ 3 mg을 첨가하였다. 반응 후 24 시간째에 생성물인 3-히드록시펜탄니트릴의 생성량과 광학 순도를 측정한 결과, 생성량 1.1 g, 광학 순도 99.2％ e.e.였다.
( 실시예 11) 재조합 대장균 HB101 ( pNTAX , pSTVG )를 사용한 3-케토펜탄니트릴로부터의 (R)-3- 히드록시펜탄니트릴의 합성
재조합 대장균 HB101(pNTAX, pSTVG)를 실시예 7과 동일하게 배양하였다. 1 L의 세퍼러블 플라스크에, 얻어진 배양액 400 ㎖, 글루코스 36.3 g, NADP+ 50 mg, 3-케토펜탄니트릴의 나트륨염 3.5 g을 넣고, pH를 6.5로 조정 후, 30℃에서 교반하였다. 3-케토펜탄니트릴의 나트륨염 18.5 g을 이온 교환수 37 ㎖에 용해시킨 3-케토펜탄니트릴 수용액을 별도로 제조하고, 이 용액을 첨가함으로써 반응액의 pH를 6.5로 유지하였다. 3-케토펜탄니트릴 수용액을 전량 첨가한 후에는, 30％ 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 반응액을 pH 6.5로 유지하였다. 반응 종료 후, 반응액을 아세트산에틸로 추출하고, 수상을 아세트산에틸로 더욱 추출하였다. 유기상을 합하여 감압하에서 용매를 증류 제거 후, 증류에 의해 정제를 행하였다. 따라서, 광학 순도 99.2％ e.e.의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴 13.5 g을 취득하였다.
( 실시예 12) 랄스토니아 유트로파 ATCC17699 주 유래 아세토아세틸 - CoA 환원 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조
랄스토니아 유트로파 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소(이후 RRE라 기재함)를 대장균에서 발현시키기 위해서, 형질 전환에 사용되는 재조합 벡터를 제조하였다. RRE 유전자를 취득하는 데 있어서, 문헌[J. Biol . Chem., 264, 15293(1989)]에 보고되어 있는 RRE 유전자의 염기 서열 정보를 참고로 하였다. 우선 RRE 유전자의 개시 코돈 부분에 NdeI 부위를 부가하고, 또한 종결 코돈의 직후에 새로운 종결 코돈과 EcoRI 부위를 부가한 이본쇄 DNA를 이하의 방법에 의해 취득하였다.
RRE의 구조 유전자의 개시 코돈 부분에 NdeI 부위를 부가한 프라이머 9(5'-AAGGAGTGCATATGACTCAGCGCATTGCGTATGTG-3': 서열 13), 및 종결 코돈의 직후에 새로운 종결 코돈과 EcoRI 부위를 부가하고, 또한 NdeI 부위를 파괴하기 위해서 1 염기 치환한 프라이머 10(5'-GTAGAATTCTTATCAGCCCATGTGCAGGCCGCCG-3': 서열 14)를 합성하였다. 프라이머 2종(프라이머 9 및 프라이머 10) 각 100 pmol, 랄스토니아 유트로파 ATCC17699주의 염색체 DNA 132 ng, dNTP 각 20 nmol, ExTaq(다까라 슈조사 제조) 2.5 U를 포함하는 ExTaq용 완충액 100 ㎕를 제조하여 열 변성(97℃, 0.5 분), 어닐링(65℃, 1 분), 신장 반응(72℃, 1 분)을 30 사이클 행하고, 4℃까지 냉각 후, 아가로스 겔 전기 영동에 의해 증폭 DNA를 확인하였다. PCR에 사용한 랄스토니아 유트로파 ATCC17699주의 염색체 DNA의 제조는, 실시예 3에서 기재한 아크로모박터 크실로속시단스 아종 데니트리피칸스 IFO15125주의 염색체 DNA의 제조와 동일하게 행하였다.
상기 증폭 단편을 NdeI 및 EcoRI로 소화하여, 플라스미드 pUCNT(WO94/03613) 의 lac 프로모터 하류의 NdcI-EcoRI 부위에 삽입함으로써 재조합 벡터 pNTRE를 얻다. pNTRE의 제조법 및 구조를 도 3에 나타내었다.
( 실시예 13) RRE 를 생산하는 재조합 대장균의 제조
실시예 12에서 얻은 재조합 벡터 pNTRE를 사용하여 대장균 HB101(다까라 슈조사 제조)를 형질 전환하여 재조합 대장균 HB101(pNTRE)를 얻었다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체인 재조합 대장균 HB101(pNTRE)(수탁 번호 FERM P-19566, 기탁일 평성 15년 10월 23일)는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁되어 있다.
또한, 실시예 6에서 얻어진 재조합 벡터 pSTVG로, 미리 염화칼슘법으로 컨피턴트화해 둔 재조합 대장균 HB101(pNTRE)를 형질 전환하여 재조합 대장균 HB101(pNTRE, pSTVG)를 얻었다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체인 재조합 대장균 HB101(pNTRE, pSTVG)(수탁 번호 FERM BP-10125, 원기탁일 평성 15년 10월 23일의 국내 기탁을 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁에 이관)는 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터에 기탁되어 있다.
( 실시예 14) 재조합 대장균에서의 RRE 및 GDH 의 발현
실시예 13에서 얻은 재조합 대장균 HB101(pNTRE), HB101(pNTRE, pSJVG), 및 벡터 플라스미드만의 형질 전환체인 재조합 대장균 HB101(pUCNT)를 실시예 7과 동일하게 배양 후, 무세포 추출액을 제조하였다. 각 재조합 대장균의 무세포 추출액에 대하여, 3-케토펜탄니트릴 환원 비활성 및 GDH 비활성을 측정하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.
Figure 112006031358011-PCT00012
재조합 대장균 HB101(pNTRE)에서는, 벡터 플라스미드만의 형질 전환체인 재조합 대장균 HB101(pUCNT)와 비교하여, 분명한 3-케토펜탄니트릴 환원 비활성의 증가를 볼 수 있었다. 또한, 재조합 대장균 HB101(pNTRE, pSTVG)에서는, 벡터 플라스미드만의 형질 전환체인 재조합 대장균 HB101(pUCNT)와 비교하여, 분명한 3-케토펜탄니트릴 환원 비활성 및 GDH 비활성의 증가를 볼 수 있었다.
( 실시예 15) 재조합 대장균 HB101 ( pNTRE )를 사용한 3- 케토펜탄니트릴로부터의 (R)-3- 히드록시펜탄니트릴의 합성
재조합 대장균 HB101(pNTRE)를 실시예 7과 동일하게 배양, 균체 파쇄를 행하여 무세포 추출액을 제조하였다. 미리 3-케토펜탄니트릴 5.0 mg, NADPH 50 mg 및 1 M 인산 완충액(pH 6.5) 50 ㎕를 넣은 시험관에, 앞의 무세포 추출액 450 ㎕를 첨가하여 30℃에서 밤새 진탕하였다. 아세트산에틸 1 ㎖로 2회 추출을 행하고, 생성물인 3-히드록시펜탄니트릴의 생성량과 광학 순도를 측정한 결과, 생성량 2.5 mg , 광학 순도(R) 98.4％ e.e.였다.
( 실시예 16) 재조합 대장균 HB101 ( pNTRE , pSTVG )를 사용한 3- 케토펜탄니트릴로부터의 (R)-3- 히드록시펜탄니트릴의 합성
재조합 대장균 HB101(pNTRE, pSTVG)를 실시예 7과 동일하게 배양하여 배양액을 취득하였다. 배양액 20 ㎖에 글루코스 5.0 g, NADP+ 3 mg, 3-케토펜탄니트릴의 나트륨염 0.2 g을 첨가하고, 5 N의 수산화나트륨 수용액을 적하함으로써 pH 6.5로 조정하면서 30℃에서 교반하였다. 반응 후 2 시간째, 3 시간째, 5 시간째, 7 시간째, 8 시간째, 및 9 시간째에 각 0.2 g의 3-케토펜탄니트릴의 나트륨염을 각각 첨가하였다. 또한, 반응 10 시간째에 배양액 4 ㎖와 NADP+ 3 mg을 첨가하였다. 반응 후 24 시간째에 생성물인 3-히드록시펜탄니트릴의 생성량과 광학 순도를 측정한 결과, 생성량 1.0 g, 광학 순도 98.3％ e.e.였다.
( 실시예 17) 재조합 대장균 HB101 ( pNTAX , pSTVG )를 사용한 아세토아세트산메 틸로부터의 (R)-3- 히드록시부탄산메틸의 합성
재조합 대장균 HB101(pNTAX, pSTVG)를 실시예 7과 동일하게 배양하였다. 얻어진 배양액 20 ㎖에 글루코스 5.0 g, NADP+ 3 mg, 아세토아세트산메틸 0.4 g을 첨가하고, 5 N의 수산화나트륨 수용액을 적하함으로써 pH 6.5로 조정하면서 30℃에서 교반하였다. 반응 후 1.5 시간째, 3 시간째, 4.5 시간째, 5.5 시간째, 7 시간째에 각 0.4 g의 아세토아세트산메틸을 각각 첨가하였다. 반응 후 24 시간째에 생성물인 3-히드록시부탄산메틸의 생성량을 모세관 기체 크로마토그래피로 분석하였다.
[분석 조건]
칼럼: TC-WAX(15 m×0.25 mm)(GL 사이언스사 제조), 검출: FID, 칼럼 온도: 85℃, 주입 온도: 200℃, 검출 온도: 200℃, 캐리어 기체: 헬륨(70 kPa), 분할 비: 100/1, 용출 시간: 아세토아세트산메틸 2.9 분, 3-히드록시부탄산메틸 3.8 분.
또한, 생성된 3-히드록시부탄산메틸의 광학 순도는 디니트로벤조일화 후, HPLC 분석함으로써 측정하였다. 3-히드록시부탄산메틸의 디니트로벤조일화는, 반응액으로부터 3-히드록시부탄산메틸을 아세트산에틸로 추출 후, 피리딘 및 3,5-디니트로염화벤조일을 3-히드록시부탄산메틸의 1.2 당량 첨가 후, 실온에서 2 시간 교반함으로써 행하였다. 1 규정 염산으로 세정 후, 분취용 박층 크로마토그래피에 의해 정제 취득하고, 이것을 에탄올에 용해 후, 하기 HPLC 조건으로 분석하였다.
[분석 조건]
칼럼: Chiralpak AD-H(다이셀 가가꾸사 제조), 검출 파장: 230 nm, 칼럼 온도: 20℃, 용출액: n-헥산/에탄올=3/7, 유속: 0.7 ㎖/분, 용출 시간: S체 21.7 분, R체 29.8 분.
그 결과, 3-히드록시부탄산메틸의 생성량은 1.9 g, 광학 순도 97.2％ e.e.였다.
( 실시예 18) 재조합 대장균 HB101 ( pNTRE , pSTVG )를 사용한 아세토아세트산메틸로부터의 (R)-3- 히드록시부탄산메틸의 합성
재조합 대장균 HB101(pNTAX, pSTVG) 대신에 재조합 대장균 HB101(pNTRE, pSTVG)를 사용한 것 이외에는, 실시예 17과 동일하게 반응을 행하여 반응 후 24 시간째에 생성된 3-히드록시부탄산메틸의 생성량과 광학 순도를 측정하였다. 그 결과, 3-히드록시부탄산메틸의 생성량은 1.9 g, 광학 순도 98.3％ e.e.였다.
( 실시예 19) 재조합 대장균 HB101 ( pNTAX , pSTVG )를 사용한 2- 클로로 -1-(3'-클로로페닐)에타논으로부터의 (R)-2- 클로로 -1-(3'- 클로로페닐 )에탄올의 합성
재조합 대장균 HB101(pNTAX, pSTVG)를 실시예 7과 동일하게 배양하였다. 얻어진 배양액 20 ㎖에 글루코스 5.0 g, NADP+ 3 mg, 2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에타논 0.4 g을 첨가하고, 5 N의 수산화나트륨 수용액을 적하함으로써 pH 6.5로 조정하면서 30℃에서 교반하였다. 반응 후 2 시간째, 4 시간째, 6 시간째, 8 시간째에 각 0.4 g의 2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에타논을 각각 첨가하였다. 반응 후 24 시간째에 생성물인 2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에탄올의 생성량 및 광학 순도를 하기 조건에서 분석하여 구하였다.
[분석 조건]
칼럼: Chiralpak OJ(다이셀 가가꾸사 제조), 검출 파장: 210 nm, 칼럼 온도: 20℃, 용출액: n-헥산/이소프로판올= 39/1, 유속: 1.0 ㎖/분, 용출 시간: 2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에타논 25.3 분, (R)-2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에탄올 38.4 분, (S)-2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에탄올 44.0 분.
그 결과, 2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에탄올의 생성량은 1.9 g, 광학 순도 99.0％ e.e.였다.
( 실시예 20) 재조합 대장균 HB101 ( pNTRE , pSTVG )를 사용한 2- 클로로 -1-(3'-클로로페닐)에타논으로부터의 (R)-2- 클로로 -1-(3'- 클로로페닐 )에탄올의 합성
재조합 대장균 HB101(pNTAX, pSTVG) 대신에 재조합 대장균 HB101(pNTRE, pSTVG)를 사용한 것 이외에는, 실시예 19와 동일하게 반응을 행하여 반응 후 24 시간째에 생성된 2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에탄올의 생성량과 광학 순도를 측정하였다. 그 결과, 2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에탄올의 생성량은 1.9 g, 광학 순도 99.9％ e.e.였다.
본 발명에 따르면, 높은 광학 순도의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴, (R)-3-히드록시부탄산에스테르, 광학 활성 1-페닐에탄올 유도체라는 유용한 광학 활성 알코올을 간편한 방법으로 제조할 수 있다. 특히, (R)-3-히드록시펜탄니트릴에 대해서는, 95％ e.e. 이상, 본 발명의 신규 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 사용하면, 99％ e.e. 이상의 종래에 없었던 매우 높은 광학 순도의 제품을 얻는 것이 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> KANEKA CORPORATION <120> NOVEL ACETOACETYL-CoA REDUCTASE AND PROCESS FOR PRODUCING OPTICALLY ACTIVE ALCOHOL <130> BO30435WO01 <150> JP2003-380987 <151> 2003-11-11 <160> 15 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 245 <212> PRT <213> Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans <400> 1 Met Ser Gly Lys Leu Ala Tyr Val Thr Gly Gly Met Gly Gly Ile Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ile Cys Gln Arg Leu Ala Lys Asp Gly Phe Arg Val Val Ala 20 25 30 Gly Cys Gly Pro Ser Arg Asn Tyr Gln Gln Trp Leu Asp Glu Gln Ala 35 40 45 Ala Gln Gly Tyr Thr Phe Tyr Ala Ser Val Gly Asn Val Ser Asp Trp 50 55 60 Glu Ser Thr Val Glu Ala Phe Glu Arg Val Lys Arg Asp Met Gly Pro 65 70 75 80 Val Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Gly Leu Phe 85 90 95 Arg Lys Met Ser Ala Asp Asp Trp Arg Ala Val Ile Asp Thr Asn Leu 100 105 110 Asn Ser Leu Phe Asn Val Thr Lys Gln Val Ile Asp Asp Met Val Glu 115 120 125 Arg Gln Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asn Gly Gln Lys 130 135 140 Gly Gln Phe Gly Gln Thr Asn Tyr Ser Thr Ala Lys Ala Gly Ile His 145 150 155 160 Gly Phe Thr Met Ala Leu Ala Gln Glu Val Ala Ser Lys Gly Ile Thr 165 170 175 Val Asn Thr Val Ser Pro Gly Tyr Ile Gly Thr Asp Met Val Arg Ala 180 185 190 Ile Arg Pro Asp Val Leu Glu Lys Ile Val Ala Thr Ile Pro Val Arg 195 200 205 Arg Leu Gly Thr Pro Glu Glu Ile Ala Ser Ile Thr Ser Trp Leu Ala 210 215 220 Ser Asp Glu Ser Gly Phe Ser Thr Gly Ala Asp Phe Ser Leu Asn Gly 225 230 235 240 Gly Leu His Met Gly 245 <210> 2 <211> 738 <212> DNA <213> Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans <220> <221> CDS <222> (1)..(738) <223> <400> 2 atg agc gga aaa ctg gct tac gtt aca ggc ggg atg ggc ggt atc ggc 48 Met Ser Gly Lys Leu Ala Tyr Val Thr Gly Gly Met Gly Gly Ile Gly 1 5 10 15 acc tca att tgc cag cgc ctg gcc aaa gat ggc ttt cgc gtg gtg gca 96 Thr Ser Ile Cys Gln Arg Leu Ala Lys Asp Gly Phe Arg Val Val Ala 20 25 30 ggc tgc ggc ccc agc cgc aat tac cag caa tgg ctg gat gaa cag gcg 144 Gly Cys Gly Pro Ser Arg Asn Tyr Gln Gln Trp Leu Asp Glu Gln Ala 35 40 45 gcg cag ggc tat acg ttc tac gcg tca gtg ggc aac gtg tcc gat tgg 192 Ala Gln Gly Tyr Thr Phe Tyr Ala Ser Val Gly Asn Val Ser Asp Trp 50 55 60 gag tcc acg gta gaa gca ttc gag cgc gtc aag cgg gac atg ggc ccg 240 Glu Ser Thr Val Glu Ala Phe Glu Arg Val Lys Arg Asp Met Gly Pro 65 70 75 80 gtc gat gtg ctg gtc aac aac gcg ggc atc acc cgc gac ggc ctg ttc 288 Val Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Gly Leu Phe 85 90 95 cgc aag atg agc gcc gac gac tgg cgc gcg gtc atc gac acc aac ctg 336 Arg Lys Met Ser Ala Asp Asp Trp Arg Ala Val Ile Asp Thr Asn Leu 100 105 110 aac agc ctc ttc aac gtg acc aag cag gtg atc gac gac atg gtc gag 384 Asn Ser Leu Phe Asn Val Thr Lys Gln Val Ile Asp Asp Met Val Glu 115 120 125 cgc cag tgg ggc cgc atc gtc aac atc agc tcg gtg aac ggg cag aag 432 Arg Gln Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asn Gly Gln Lys 130 135 140 ggg cag ttc ggc cag acg aac tat tcc acg gcg aag gcg ggc atc cat 480 Gly Gln Phe Gly Gln Thr Asn Tyr Ser Thr Ala Lys Ala Gly Ile His 145 150 155 160 ggc ttc acc atg gcg ctg gcg cag gaa gtg gcc agc aag ggc atc acg 528 Gly Phe Thr Met Ala Leu Ala Gln Glu Val Ala Ser Lys Gly Ile Thr 165 170 175 gtc aac acg gtg tcg ccg ggc tac atc ggc acg gac atg gtt cgc gcc 576 Val Asn Thr Val Ser Pro Gly Tyr Ile Gly Thr Asp Met Val Arg Ala 180 185 190 atc cgt ccg gac gtg ctg gaa aag atc gtc gcc acc att ccg gtg cgc 624 Ile Arg Pro Asp Val Leu Glu Lys Ile Val Ala Thr Ile Pro Val Arg 195 200 205 cgc ctg ggc acg ccg gag gaa atc gcg tcc atc acg tcg tgg ctg gcc 672 Arg Leu Gly Thr Pro Glu Glu Ile Ala Ser Ile Thr Ser Trp Leu Ala 210 215 220 tcg gat gag tct ggg ttt tcg acg ggc gcg gac ttc tcg ctc aac ggc 720 Ser Asp Glu Ser Gly Phe Ser Thr Gly Ala Asp Phe Ser Leu Asn Gly 225 230 235 240 ggc ctg cat atg ggc tga 738 Gly Leu His Met Gly 245 <210> 3 <211> 246 <212> PRT <213> Ralstonia eutropha <400> 3 Met Thr Gln Arg Ile Ala Tyr Val Thr Gly Gly Met Gly Gly Ile Gly 1 5 10 15 Thr Ala Ile Cys Gln Arg Leu Ala Lys Asp Gly Phe Arg Val Val Ala 20 25 30 Gly Cys Gly Pro Asn Ser Pro Arg Arg Glu Lys Trp Leu Glu Gln Gln 35 40 45 Lys Ala Leu Gly Phe Asp Phe Ile Ala Ser Glu Gly Asn Val Ala Asp 50 55 60 Trp Asp Ser Thr Lys Thr Ala Phe Asp Lys Val Lys Ser Glu Val Gly 65 70 75 80 Glu Val Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Val Val 85 90 95 Phe Arg Lys Met Thr Arg Ala Asp Trp Asp Ala Val Ile Asp Thr Asn 100 105 110 Leu Thr Ser Leu Phe Asn Val Thr Lys Gln Val Ile Asp Gly Met Ala 115 120 125 Asp Arg Gly Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asn Gly Gln 130 135 140 Lys Gly Gln Phe Gly Gln Thr Asn Tyr Ser Thr Ala Lys Ala Gly Leu 145 150 155 160 His Gly Phe Thr Met Ala Leu Ala Gln Glu Val Ala Thr Lys Gly Val 165 170 175 Thr Val Asn Thr Val Ser Pro Gly Tyr Ile Ala Thr Asp Met Val Lys 180 185 190 Ala Ile Arg Gln Asp Val Leu Asp Lys Ile Val Ala Thr Ile Pro Val 195 200 205 Lys Arg Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Ala Ser Ile Cys Ala Trp Leu 210 215 220 Ser Ser Glu Glu Ser Gly Phe Ser Thr Gly Ala Asp Phe Ser Leu Asn 225 230 235 240 Gly Gly Leu His Met Gly 245 <210> 4 <211> 741 <212> DNA <213> Ralstonia eutropha <220> <221> CDS <222> (1)..(741) <223> <400> 4 atg act cag cgc att gcg tat gtg acc ggc ggc atg ggt ggt atc gga 48 Met Thr Gln Arg Ile Ala Tyr Val Thr Gly Gly Met Gly Gly Ile Gly 1 5 10 15 acc gcc att tgc cag cgg ctg gcc aag gat ggc ttt cgt gtg gtg gcc 96 Thr Ala Ile Cys Gln Arg Leu Ala Lys Asp Gly Phe Arg Val Val Ala 20 25 30 ggt tgc ggc ccc aac tcg ccg cgc cgc gaa aag tgg ctg gag cag cag 144 Gly Cys Gly Pro Asn Ser Pro Arg Arg Glu Lys Trp Leu Glu Gln Gln 35 40 45 aag gcc ctg ggc ttc gat ttc att gcc tcg gaa ggc aat gtg gct gac 192 Lys Ala Leu Gly Phe Asp Phe Ile Ala Ser Glu Gly Asn Val Ala Asp 50 55 60 tgg gac tcg acc aag acc gca ttc gac aag gtc aag tcc gag gtc ggc 240 Trp Asp Ser Thr Lys Thr Ala Phe Asp Lys Val Lys Ser Glu Val Gly 65 70 75 80 gag gtt gat gtg ctg atc aac aac gcc ggt atc acc cgc gac gtg gtg 288 Glu Val Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Val Val 85 90 95 ttc cgc aag atg acc cgc gcc gac tgg gat gcg gtg atc gac acc aac 336 Phe Arg Lys Met Thr Arg Ala Asp Trp Asp Ala Val Ile Asp Thr Asn 100 105 110 ctg acc tcg ctg ttc aac gtc acc aag cag gtg atc gac ggc atg gcc 384 Leu Thr Ser Leu Phe Asn Val Thr Lys Gln Val Ile Asp Gly Met Ala 115 120 125 gac cgt ggc tgg ggc cgc atc gtc aac atc tcg tcg gtg aac ggg cag 432 Asp Arg Gly Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asn Gly Gln 130 135 140 aag ggc cag ttc ggc cag acc aac tac tcc acc gcc aag gcc ggc ctg 480 Lys Gly Gln Phe Gly Gln Thr Asn Tyr Ser Thr Ala Lys Ala Gly Leu 145 150 155 160 cat ggc ttc acc atg gca ctg gcg cag gaa gtg gcg acc aag ggc gtg 528 His Gly Phe Thr Met Ala Leu Ala Gln Glu Val Ala Thr Lys Gly Val 165 170 175 acc gtc aac acg gtc tct ccg ggc tat atc gcc acc gac atg gtc aag 576 Thr Val Asn Thr Val Ser Pro Gly Tyr Ile Ala Thr Asp Met Val Lys 180 185 190 gcg atc cgc cag gac gtg ctc gac aag atc gtc gcg acg atc ccg gtc 624 Ala Ile Arg Gln Asp Val Leu Asp Lys Ile Val Ala Thr Ile Pro Val 195 200 205 aag cgc ctg ggc ctg ccg gaa gag atc gcc tcg atc tgc gcc tgg ttg 672 Lys Arg Leu Gly Leu Pro Glu Glu Ile Ala Ser Ile Cys Ala Trp Leu 210 215 220 tcg tcg gag gag tcc ggt ttc tcg acc ggc gcc gac ttc tcg ctc aac 720 Ser Ser Glu Glu Ser Gly Phe Ser Thr Gly Ala Asp Phe Ser Leu Asn 225 230 235 240 ggc ggc ctg cat atg ggc tga 741 Gly Gly Leu His Met Gly 245 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n represents a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n represents a, t, g or c <400> 5 carggntaya cnttytayg 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n represents a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n represents a, t, g or c <400> 6 gcdatytcyt cnggngtycc 20 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 <400> 7 cgtcggcgct catcttgcgg aacag 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 <400> 8 agggcatcac ggtcaacacg gtgtc 25 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5 <400> 9 gtacatatga gcggaaaact ggcttacg 28 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6 <400> 10 gtagaattct tatcagccca tgtgcaggcc gccg 34 <210> 11 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 7 <400> 11 gccgaattct aaggaggtta acaatgtata aagatttaga agg 43 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 8 <400> 12 gcggtcgact tatccgcgtc ctgcttgg 28 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 9 <400> 13 aaggagtgca tatgactcag cgcattgcgt atgtg 35 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 10 <400> 14 gtagaattct tatcagccca tgtgcaggcc gccg 34 <210> 15 <211> 900 <212> DNA <213> Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans <220> <221> CDS <222> (40)..(778) <223> <400> 15 tcaatcaacg aggcgtccgt cgcacacagg aggaaatcca atgagcggaa aactggctta 60 cgttacaggc gggatgggcg gtatcggcac ctcaatttgc cagcgcctgg ccaaagatgg 120 ctttcgcgtg gtggcaggct gcggccccag ccgcaattac cagcaatggc tggatgaaca 180 ggcggcgcag ggctatacgt tctacgcgtc agtgggcaac gtgtccgatt gggagtccac 240 ggtagaagca ttcgagcgcg tcaagcggga catgggcccg gtcgatgtgc tggtcaacaa 300 cgcgggcatc acccgcgacg gcctgttccg caagatgagc gccgacgact ggcgcgcggt 360 catcgacacc aacctgaaca gcctcttcaa cgtgaccaag caggtgatcg acgacatggt 420 cgagcgccag tggggccgca tcgtcaacat cagctcggtg aacgggcaga aggggcagtt 480 cggccagacg aactattcca cggcgaaggc gggcatccat ggcttcacca tggcgctggc 540 gcaggaagtg gccagcaagg gcatcacggt caacacggtg tcgccgggct acatcggcac 600 ggacatggtt cgcgccatcc gtccggacgt gctggaaaag atcgtcgcca ccattccggt 660 gcgccgcctg ggcacgccgg aggaaatcgc gtccatcacg tcgtggctgg cctcggatga 720 gtctgggttt tcgacgggcg cggacttctc gctcaacggc ggcctgcata tgggctgaag 780 catcgcgggc cgccacgagc ggcccgccgg cgccgggcgg cctcggggag agggccgtcc 840 ggcattacac ttacccttat ccgaagtctt agagatcgcc cgatccgggg acaaccatga 900

Claims (35)

  1. (1) NADPH 또는 NADH를 보효소로 하여, 하기 화학식 1로 표시되는 3-케토펜탄니트릴에 작용하여, 하기 화학식 2로 표시되는 광학 순도 99％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 작용, 및
    (2) 겔 여과 분석법으로 측정시 약 85500의 분자량 및 SDS 폴리아크릴아미드 전기 영동 분석법으로 측정시 약 26000의 분자량
    의 이화학적 성질을 갖는 아세토아세틸-CoA 환원 효소.
    <화학식 1>
    Figure 112006031358011-PCT00013
    <화학식 2>
    Figure 112006031358011-PCT00014
  2. 제1항에 있어서,
    (3) 27 내지 33℃의 최적 온도,
    (4) 5.5 내지 6.5의 최적 pH, 및
    (5) 저해제로서 p-클로로머큐리벤조산, 황산구리, 질산은 또는 염화수은에 의해 저해되는 성질
    의 이화학적 성질을 추가로 갖는 아세토아세틸-CoA 환원 효소.
  3. (a) 서열 목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
    (b) 서열 목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 3-케토펜탄니트릴에 작용하여 광학 순도 99％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 활성을 갖는 폴리펩티드
    인 아세토아세틸-CoA 환원 효소.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아크로모박터(Achromobacter)속에 속하는 미생물 유래인 아세토아세틸-CoA 환원 효소.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아크로모박터 크실로속시단스 아종 데니트리피칸스(Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans)에 속하는 미생물 유래인 아세토아세틸-CoA 환원 효소.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아크로모박터 크실로속시단스 아종 데니트리피칸스 IFO15125주 유래인 아세토아세틸-CoA 환원 효소.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 코딩하는 DNA.
  8. 서열 목록의 서열 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA.
  9. 제7항 또는 제8항에 기재된 DNA를 함유하는 재조합 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 도 2에서 pNTAX로 표시되는 재조합 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 글루코스 탈수소 효소를 코딩하는 DNA를 추가로 함유하는 재조합 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 글루코스 탈수소 효소가 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 것인 재조합 벡터.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질 전환하여 얻어지는 형질 전환체.
  14. 제7항 또는 제8항에 기재된 DNA를 함유하는 제1의 재조합 벡터, 및 글루코스 탈수소 효소를 코딩하는 DNA를 함유하는 제2의 재조합 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질 전환하여 얻어지는 형질 전환체.
  15. 제14항에 있어서, 제1의 재조합 벡터가 pNTAX이고, 글루코스 탈수소 효소가 바실러스 메가테리움 유래의 것인 형질 전환체.
  16. 제14항에 있어서, 제1의 재조합 벡터가 pNTAX이고, 제2의 재조합 벡터가 도 2에 있어서 pSTVG로 표시되는 재조합 벡터인 형질 전환체.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 대장균인 형질 전환체.
  18. 제17항에 있어서, 대장균(E. coli) HB101(pNTAX)(FERM BP-10126)인 형질 전환체.
  19. 제17항에 있어서, E. coli HB101(pNTAX, pSTVG)(FERM P-19567)인 형질 전환체.
  20. 하기 화학식 1로 표시되는 3-케토펜탄니트릴에 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는, 하기 화학식 2로 표시되는 (R)-3-히드록시펜탄 니트릴의 제조 방법.
    <화학식 1>
    Figure 112006031358011-PCT00015
    <화학식 2>
    Figure 112006031358011-PCT00016
  21. 제20항에 있어서, 생성되는 (R)-3-히드록시펜탄니트릴의 광학 순도가 95％ e.e. 이상인 제조 방법.
  22. 하기 화학식 3으로 표시되는 아세토아세트산에스테르에 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는, 하기 화학식 4로 표시되는 (R)-3-히드록시부탄산에스테르의 제조 방법.
    <화학식 3>
    Figure 112006031358011-PCT00017
    <화학식 4>
    Figure 112006031358011-PCT00018
    상기 식들 중, R은 치환되거나 분지될 수 있는 저급 알킬기를 나타낸다.
  23. 하기 화학식 5로 표시되는 1-페닐에타논 유도체에 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 작용시키는 것을 특징으로 하는, 하기 화학식 6으로 표시되는 광학 활성 1-페닐에탄올 유도체의 제조 방법.
    <화학식 5>
    Figure 112006031358011-PCT00019
    <화학식 6>
    Figure 112006031358011-PCT00020
    상기 식들 중, R1 및 R2는 수소 원자, 할로겐 원자, 알콕시기 또는 니트로기를 나타내고, 각각 동일하거나 상이할 수 있으며,
    R3은 수소 원자, 할로겐 원자, 수산기 또는 치환될 수 있는 알킬기를 나타낸 다.
  24. 제23항에 있어서, 하기 화학식 7로 표시되는 2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에타논에 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 작용시켜, 하기 화학식 8로 표시되는 (R)-2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에탄올을 제조하는 것인 제조 방법.
    <화학식 7>
    Figure 112006031358011-PCT00021
    <화학식 8>
    Figure 112006031358011-PCT00022
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 아크로모박터, 아시네토박터(Acinetobacter), 랄스토니아(Ralstonia), 알칼리게네스(Alcaligenes), 아조스피릴럼(Azospirillum), 아조토박터(Azotobacter), 바실러스(Bacillus), 크로마튬(Chromatium), 엑토티오로도스피라(Ectothiorhodospira), 루피너스(Lupinus), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 파라코커스(Paracoccus), 리조븀(Rhizobium), 로도코커스(Rhodococcus), 시네코커스(Synechococcus), 신트로포모나스 (Syntrophomonas), 티오캅사(Thiocapsa) 또는 주글로에아(Zoogloea)에 속하는 미생물 유래의 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 사용하는 것인 제조 방법.
  26. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 아세토아세틸-CoA 환원 효소를 사용하는 것인 제조 방법.
  27. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 아세토아세틸-CoA 환원 효소로서 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환체의 배양물을 사용하는 것인 제조 방법.
  28. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    (c) 서열 목록의 서열 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드,
    (d) 서열 목록의 서열 3에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 3-케토펜탄니트릴을 비대칭적으로 환원시켜, 광학 순도 95％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 활성을 갖는 폴리펩티드, 또는
    (e) 서열 목록의 서열 4에 기재된 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA에 의해 코딩되고, 3-케토펜탄니트릴을 비대칭적으로 환원시켜, 광학 순도 95％ e.e. 이상의 (R)-3-히드록시펜탄니트릴을 생성시키는 활성을 갖는 폴리펩티드
    를 아세토아세틸-CoA 환원 효소로서 사용하는 것인 제조 방법.
  29. 제28항에 있어서, 아세토아세틸-CoA 환원 효소가 랄스토니아속에 속하는 미생물 유래인 제조 방법.
  30. 제28항에 있어서, 아세토아세틸-CoA 환원 효소가 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)에 속하는 미생물 유래인 제조 방법.
  31. 제20 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에서 사용된 아세토아세틸-CoA 환원 효소에 추가하여, 글루코스 탈수소 효소를 발현시키는 형질 전환체를 사용하는 것인 제조 방법.
  32. 서열 목록의 서열 4로 표시되는 염기 서열을 포함하는 DNA를 함유하고, 도 3에 있어서 pNTRE로서 표시되는 재조합 벡터.
  33. 재조합 대장균 E. coli HB101(pNTRE)(FERM P-19566)인 형질 전환체
  34. 재조합 대장균 E. coli HB101(pNTRE, pSTVG)(FERM BP-10125)인 형질 전환체.
  35. 제20 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 아세토아세틸-CoA 환원 효소로서 제33항 또는 제34항에 기재된 형질 전환체의 배양물을 사용하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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