KR20070050461A

KR20070050461A - 신규 카르보닐 환원 효소, 그의 유전자 및 그의 이용 방법

Info

Publication number: KR20070050461A
Application number: KR1020077005277A
Authority: KR
Inventors: 노리유끼 기자끼; 미호 야노; 마사히로 후나끼; 데루아끼 다께스에; 요시히꼬 야소하라; 소우이치 모리까와; 다까히사 나까이; 미치히로 가따오까; 사까유 시미즈
Original assignee: 가부시키가이샤 가네카
Priority date: 2004-08-06
Filing date: 2005-08-01
Publication date: 2007-05-15
Also published as: EP1792986B1; JP4746548B2; JPWO2006013801A1; US7915022B2; US7794993B2; EP1792986A1; US20080261281A1; EP1792986A4; ATE419340T1; US20100317075A1; WO2006013801A1; CN1993464A; DE602005012127D1; ES2317277T3; CN1993464B; ZA200701856B

Abstract

본 발명은 오가타에아(Ogatea)속에 속하는 미생물로부터 단리된 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 비대칭적으로 환원하여 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 상기 폴리펩티드를 생산하는 형질 전환체, 및 상기 폴리펩티드 또는 상기 형질 전환체를 이용하여 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 형질 전환체를 이용함으로써 (2R,3 S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올 등의 광학 활성 알코올을 효율적으로 제조할 수 있다.

오가타에아, 폴리펩티드, 형질 전환체, 광학 활성 알코올

Description

신규 카르보닐 환원 효소, 그의 유전자 및 그의 이용 방법{NOVEL CARBONYL REDUCTASE, GENE THEREOF AND METHOD OF USING THE SAME}

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 비대칭적으로 환원하여 하기 화학식 2로 표시되는 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 생성하는 활성을 갖는 미생물로부터 단리된, 상기 활성을 갖는 폴리펩티드(카르보닐 환원 효소), 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 함유하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질 전환된 형질 전환체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 폴리펩티드 또는 상기 형질 전환체를 이용한 광학 활성 알코올, 특히 상기 화학식 2로 표시되는 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올의 제조 방법에 관한 것이다.

(2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올은 의약 등의 합성 출발 물질로서 유용한 화합물이다.

(2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올의 제조 방법으로서는, 아미노기가 보호된 (3S)-1-할로-3-아미노-4-페닐-2-부타논 유도체를 수소화붕소나트륨 등의 환원제로 화학적으로 환원하는 것을 포함한 방법이 알려져 있다(특허 문헌 1, 비특허 문헌 1). 그러나, 이 방법은 비교적 고가의 환원제를 이용할 필요가 있고, 그의 입체 선택성도 실용상 충분하다고 할 수 없었다.

또한, 미생물을 이용하는 방법으로서, (3S)-1-할로-3-아미노-4-페닐-2-부타논 유도체에 칸디다(Candida)속 등에 속하는 미생물을 작용시켜 (2R,3S)-1-할로-3-아미노-4-페닐-2-부탄올 유도체를 제조하는 것을 포함한 방법(특허 문헌 2), 및 (3S)-1-할로-2- 옥소-3-보호 아미노-4-치환 부탄에 로도코커스(Rhodococcus)속 등 에 속하는 미생물을 접촉시켜 (2R,3S)-1-할로-2-히드록시-3-보호아미노-4-치환 부탄을 제조하는 것을 포함한 방법(특허 문헌 3, 비특허 문헌 2)이 알려져 있다. 그러나, 이들 방법에서는 반응액 중에 축적시킬 수 있는 생성물의 농도가 실용상 충분하다고 할 수 없었다.

특허 문헌 1: 일본 특허 공개 (평)2-42048호 공보

특허 문헌 2: 일본 특허 공개 (평)9-285호 공보

특허 문헌 3: WO2002/014528호 공보

비특허 문헌 1: Tetrahedron, 50, 6333(1994)

비특허 문헌 2: Tetrahedron: Asymmetry, 14, 3105(2003)

<발명의 개시>

<발명이 해결하고자 하는 과제>

상기를 감안하여, 본 발명은 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올의 제조에 유용한 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 함유하는 벡터, 및 상기 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 제공하는 것을 과제로 한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드 또는 상기 형질 전환체를 이용한 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 비롯한 다양한 광학 활성 알코올의 효율적인 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

<과제를 해결하기 위한 수단>

본 발명자들은 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 비대칭적으로 환원하여, (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 상기 활성을 갖는 미생물로부터 단리하였다. 또한, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 염기 서열을 밝히고, 그 서열을 이용하여 상기 폴리펩티드를 다량 생산하는 형질 전환체를 생성하는 데 성공하였다. 또한, 상기 폴리펩티드 또는 상기 형질 전환체를 이용함으로써 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 비롯한 각종 유용한 광학 활성 알코올을 효율적으로 제조할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 비대칭적으로 환원하여 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드이다.

또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 DNA를 함유하는 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 벡터를 함유하는 형질 전환체를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드 또는 상기 형질 전환체를 이용한 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 비롯한 광학 활성 알코올의 제조 방법을 제공한다.

<발명의 효과>

본 발명에 의해 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 비롯한, 유용한 광학 활성 알코올의 실용적인 제조 방법이 제공될 수 있다.

도 1은 재조합 벡터 pNTOM4G1의 제조 방법 및 구조를 나타낸다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 기술되어 있는 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논은, 예를 들면 일본 특허 공개 (소)62-126158호 공보 또는 일본 특허 공개 (평)2-42048호 공보에 개시된 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 기술되어 있는 DNA의 단리, 벡터의 제조, 형질 전환 등의 유전자 조작은 특별히 명기하지 않는 한 문헌[Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)] 등에 기재되어 있는 방법에 의해 실시할 수 있다. 또한, 본 명세서의 기술에 사용되는 ％는 특별히 언급이 없는 한, ％(w/v)를 의미한다.

본 발명의 폴리펩티드는 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 비대칭적으로 환원하여 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 이러한 폴리펩티드는 상기 활성을 갖는 미생물로부터 단리할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 기원이 되는 미생물은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 오가타에아(Ogataea)속에 속하는 효모를 사용할 수 있다. 특히 바람직한 것은 오가타에아ㆍ미누타. 바. 미누타(Ogataea minuta var. minuta) NBRC0975주이 다. 상기 미생물은 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 생물 공학 본부 생물 유전자원 부문(NBRC: 우편 번호 292-0818 일본 시바껭 기사라즈시 가즈사카마타리 2-5-8)로부터 입수할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 기원이 되는 미생물을 배양하기 위한 배지로서는, 그 미생물이 증식하는 한, 통상적인 탄소원, 질소원, 무기염류, 유기 영양소 등을 포함하는 액체 영양 배지를 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 기원이 되는 미생물로부터 통상적으로 공지된 단백질 정제법을 적당하게 조합하여 단리할 수 있다. 예를 들면, 단리는 이하와 같이 실시할 수 있다.

우선, 상기 미생물을 적당한 배지에서 배양하고, 배양액으로부터 원심 분리 또는 여과에 의해 균체를 모은다. 얻어진 균체를 초음파 파쇄기 또는 유리 비드 등을 이용한 물리적 수법으로 파쇄한 후, 원심 분리로써 균체 잔여물을 제거하여, 무세포 추출액을 얻는다. 그 뒤, 염석(황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(아세톤 또는 에탄올 등에 의한 단백질 분획 침전법), 투석, 겔 투과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 한외 여과 등의 수법을 단독으로 또는 조합하여, 상기 무세포 추출액으로부터 본 발명의 폴리펩티드를 단리한다.

(3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 환원하는 활성은, 예를 들면 0.33 ％(v/v)의 디메틸술폭시드를 함유하는 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에 0.2 mM의 기질 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐- 2-부타논, 0.25 mM의 보효소 NADPH 및 조효소를 첨가하고, 혼합물을 30 ℃에서 1 분간 반응시켰을 때의 파장 340 nm에서의 흡광도의 감소 속도로부터 산출할 수 있다.

또한, 상기 반응에서 생성된 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올의 절대 배치의 결정 및 디아스테레오머 과잉률의 측정은 고속 액체 크로마토그래피(칼럼: COSMOSIL 5C8-MS(φ4.6 mm×250 mm; 나카라이 테스크사 제조), 용리액: 10 mM 인산 수용액/아세토니트릴=1/1(v/v), 유속: 1 ml/분, 검출: 210 nm)를 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 DNA는 상술한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA이고, 후술하는 방법에 따라서 전환된 숙주 세포내에서 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 것이라면 어떠한 것이어도 좋고, 임의의 비번역 영역을 포함할 수도 있다. 상기 폴리펩티드를 취득할 수 있다면, 당업자라면 공지된 방법으로 상기 폴리펩티드의 기원이 되는 미생물로부터 이러한 DNA를 취득할 수 있다. 예를 들면 이하에 나타낸 방법으로 취득할 수 있다.

우선, 단리된 본 발명의 폴리펩티드를 적당한 엔도펩티다제를 이용하여 소화하고, 생성된 펩티드 단편을 역상 HPLC에 의해 분취(分取)한다. 또한, 예를 들면 ABI492형 단백질 시퀀서(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사 제조)에 의해 이들 펩티드 단편의 아미노산 배열의 일부 또는 전부를 결정한다.

이와 같이 하여 얻어진 아미노산 배열 정보를 바탕으로 하여, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 일부를 증폭하기 위한 PCR(Polymerase Chain Reaction) 프라 이머를 합성한다. 다음에, 통상적인 DNA 단리법, 예를 들면 비써(Visser) 등의 방법(문헌[Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415(2000)])에 의해 상기 폴리펩티드의 기원이 되는 미생물의 염색체 DNA를 제조한다. 이 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상술한 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 행하며, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 일부를 증폭시켜 그의 염기 배열을 결정한다. 염기 서열은, 예를 들면 ABI373A형 DNA 시퀀서(어플라이드 바이오시스템즈사 제조) 등을 이용하여 결정할 수 있다.

상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 일부의 염기 서열이 밝혀지면, 예를 들면 i-PCR법(문헌[Nucl. Acids Res., 16, 8186(1988)])에 의해 그의 전장 서열을 결정할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 DNA의 예로서는, 서열 목록의 서열 1에 나타내는 염기 서열을 함유하는 DNA 및 서열 목록의 서열 2에 나타내는 염기 서열을 함유하는 DNA를 들 수 있다. 또한, 서열 목록의 서열 1 또는 서열 2에 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하며, 또한 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 비대칭적으로 환원하여 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA도 본 발명의 DNA에 포함된다.

서열 목록의 서열 1 또는 서열 2에 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA란, 콜로니 혼성화법, 플 라크 혼성화법 또는 서던 혼성화법 등을 실시하였을 때, 서열 목록의 서열 1 또는 서열 2에 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA와 특이적으로 혼성화를 형성하는 DNA를 말한다.

여기서, 엄격한 조건이란, 예를 들면 75 mM 시트르산 삼나트륨, 750 mM 염화나트륨, 0.5 ％ 도데실황산나트륨, 0.1 ％ 소혈청 알부민, 0.1 ％ 폴리비닐피롤리든 및 0.1 ％ 피콜(Ficoll) 400(아마샴 바이오사이언스사 제조) 조성의 수용액 중, 65 ℃에서 혼성화를 행한 후에 15 mM 시트르산 삼나트륨, 150 mM 염화나트륨 및 0.1 ％ 도데실황산나트륨 조성의 수용액을 이용하여 60 ℃에서 세정이 행해지는 조건을 말한다. 바람직하게는 상기 조건에서 혼성화를 행한 후에, 15 mM 시트르산 삼나트륨, 150 mM 염화나트륨 및 0.1 ％ 도데실황산나트륨 조성의 수용액을 이용하여 65 ℃에서 세정이 행해지는 조건을 말한다. 보다 바람직하게는 상기와 같이 혼성화를 행한 후에, 1.5 mM 시트르산 삼나트륨, 15 mM 염화나트륨 및 0.1 ％ 도데실황산나트륨 조성의 수용액을 이용하여 65 ℃에서 세정이 행해지는 조건을 말한다.

본 발명의 폴리펩티드의 예로서는, 서열 목록의 서열 1에 나타내는 염기 서열에 의해서 코딩되는, 서열 목록의 서열 3에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 서열 목록의 서열 2에 나타내는 염기 서열에 의해서 코딩되는, 서열 목록의 서열 4에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다.

또한, 이들 2종의 폴리펩티드 중 어느 것과 일정 수준 이상의 상동성을 가지면서, 또한 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 비대칭 적으로 환원하여 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드는 이들 2종의 폴리펩티드와 기능적으로 동등하고, 본 발명에 포함된다.

본원에서 사용되는 서열의 상동성은, 예를 들면 상동성 검색 프로그램 FASTA(문헌[W. R. Pearson & D. J. Lipman; Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448(1988)])를 이용하여 2개의 아미노산 서열을 비교 해석한 경우에, 서열 전체에 대한 아이덴티티(Identity)의 값으로 표시된다. 서열 목록의 서열 3 또는 서열 4에 나타내는 폴리펩티드와 동등한 폴리펩티드의 예로는, 이들 2종의 폴리펩티드 중 어느 것과의 상동성이 78 ％ 이상(서열 3의 폴리펩티드와 서열 4의 폴리펩티드의 상동성이 78 ％임), 바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 85 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상인 폴리펩티드를 들 수 있다.

이러한 폴리펩티드는, 예를 들면 상술한 서열 목록의 서열 1 또는 서열 2에 나타내는 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화할 수 있는 DNA를 적당한 벡터에 연결한 후, 적당한 숙주 세포에 도입하여 발현시킴으로써 얻어진다. 또한, 예를 들면 문헌[Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, Inc.,1989)] 등에 기재된 공지된 방법에 따라서, 서열 목록의 서열 3 또는 서열 4에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 아미노산의 치환, 삽입, 결실 또는 부가를 발생시킴으로써도 취득할 수 있다.

후자의 수법에 의해 취득한 폴리펩티드의 예로서는, 서열 목록의 서열 4에 나타내는 아미노산 서열에 있어서 42번째의 알라닌을 글리신으로, 43번째의 글루탐 산을 알라닌으로, 46번째의 리신을 글루탐산으로 및/또는 49번째의 아스파라긴을 리신으로 치환하여 얻어지는 폴리펩티드를 들 수 있다. 이들 4개의 변이 모두를 갖는 폴리펩티드(변이 폴리펩티드 1)를 서열 목록의 서열 16에, 이 폴리펩티드를 코딩하는 DNA(변이 DNA 1)를 서열 목록의 서열 15에 나타내었다.

본 발명의 DNA를 숙주 미생물내에 도입하고, 도입된 숙주 미생물내에서 발현시키기 위해서 이용되는 벡터는, 적당한 숙주 미생물내에서 상기 DNA가 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 벡터로서는, 예를 들면 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 코스미드 벡터 등을 들 수 있다. 또한 다른 숙주주와의 사이에서의 유전자 교환이 가능한 서틀 벡터도 사용할 수 있다.

이러한 벡터는 통상적으로 lacUV5 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, lpp 프로모터, tufB 프로모터, recA 프로모터, pL 프로모터 등의 제어 인자를 포함하고, 본 발명의 DNA와 작동 가능하게 연결된 발현 단위를 함유하는 발현 벡터로서 바람직하게 사용할 수 있다. 예를 들면, pUCNT(WO94/03613 공보)를 바람직하게 사용할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어「제어 인자」는 기능적 프로모터 및 임의의 관련된 전사 요소(예를 들면 인헨서, CCAAT 박스, TATA 박스, SPI 부위 등)를 갖는 염기 서열을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 용어「작동 가능하게 연결」은 유전자의 발현을 조절하는 프로모터, 인헨서 등의 각종 조절 성분과 유전자가 숙주 세포 중에서 작동할 수 있는 상태로 연결되는 것을 말한다. 제어 인자의 유형 및 종류가 숙주에 따 라서 변할 수 있는 것은 당업자에게 주지된 사항이다.

본 발명의 발현 벡터로서는, 후술하는 pUCNT에 서열 1에 나타내는 DNA를 도입한 pNTOM3, pUCNT에 서열 2에 나타내는 DNA를 도입한 pNTOM4, pUCNT에 서열 15에 나타내는 DNA를 도입한 pNTOM5 등을 들 수 있다.

본 발명의 DNA를 함유하는 벡터를 도입하는 숙주 세포로서는, 세균, 효모, 사상균, 식물 세포, 동물 세포 등을 들 수 있다. 도입 및/또는 배양 용이성 때문에 세균이 바람직하고, 대장균이 특히 바람직하다. 본 발명의 DNA를 함유하는 벡터는 공지된 방법에 의해 숙주 세포에 도입할 수 있다. 숙주 세포로서 대장균을 이용하는 경우, 예를 들면 시판되는 E. coli HB101 컴피턴트 셀(competent cell)(다카라 바이오사 제조)을 이용함으로써 상기 벡터를 숙주 세포에 도입할 수 있다.

본 발명의 형질 전환체로서는, 후술하듯이, E. coli HB101에 상기 pNTMO3을 도입한 E. coli HB101(pNTMO3) FERM BP-10368, 상기 pNTMO4를 도입한 E. coli HB101(pNTOM4) FERM BP-10369, 상기 pNTMO5를 도입한 E. coli HB101(pNTOM5) FERM BP-10370 등을 들 수 있다. 이들 형질 전환체는 각각 상기 수탁 번호로써 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(IPOD: 우편 번호 305-8566 일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1-1-1 주오 다이 6)에 기탁되어 있다(원기탁일 2004년 6월 3일의 국내 기탁주를 부다페이스 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관(2005년 7월 6일)).

본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 카르보닐기를 갖는 화합물을 비대칭적으로 환원하여 광학 활성 알코올을 생산하는 경우, NADH, NADPH 등의 보효소가 필요해진다. 그러나, 산화된 상기 보효소를 환원형으로 변환할 수 있는(이 후, 보효소 재생능이라 함) 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 기질이 되는 화합물을 본 발명의 폴리펩티드와 공존시켜 반응을 행함으로써 고가의 보효소의 사용량을 대폭 삭감할 수 있다.

보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드로서는, 예를 들면 히드로게나제, 포름산 탈수소 효소, 알코올 탈수소 효소, 알데히드 탈수소 효소, 글루코스-6-인산 탈수소 및 글루코스 탈수소 효소 등을 사용할 수 있다. 적합하게는 글루코스 탈수소 효소가 사용된다.

본 발명의 폴리펩티드를 이용한 광학 활성 알코올의 제조는 이하와 같이 실시할 수 있다. 우선, 적당한 용매 중에, 기질이 되는 카르보닐기를 갖는 화합물, NADPH 등의 보효소 및 상기 폴리펩티드를 첨가하고, 혼합물을 pH 조정하에 교반하여 반응을 행한다. 본 발명의 폴리펩티드와 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 조합하여 반응을 행하는 경우에는, 상기 반응 조성물에 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드(예를 들면 글루코스 탈수소 효소)와 그의 기질이 되는 화합물(예를 들면 글루코스)를 더 첨가한다.

반응에는 수계 용매를 이용할 수도 있고, 수계와 유기계의 용매를 혼합하여 이용할 수도 있다. 유기계 용매로서는, 예를 들면 톨루엔, 아세트산에틸, 아세트산 n-부틸, 헥산, 이소프로판올, 디이소프로필에테르, 메탄올, 아세톤, 디메틸술폭시드 등을 들 수 있다. 반응은 10 ℃ 내지 70 ℃의 온도에서 행해지고, 반응액의 pH는 4 내지 10로 유지한다. 반응은 배치(batch) 방식 또는 연속 방식으로 실시할 수 있다. 배치 방식의 경우, 반응 기질은 0.1 ％ 내지 70 ％(w/v)의 투입 농도로 첨가된다. 기질이 되는 카르보닐기를 갖는 화합물로서는, 예를 들면 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 들 수 있다. 하지만, 상술한 반응 조건에서 환원되어 광학 활성 알코올로 변환될 수 있는 것이라면, 특별히 한정되지 않는다.

본 발명의 폴리펩티드 대신에 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 형질 전환체 또는 그의 처리물을 사용하여도 유사하게 반응을 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 양자(兩者)를 함유하는 형질 전환체 또는 그의 처리물을 사용하여도 유사하게 반응을 행할 수 있다. 「형질 전환체의 처리물」이란, 예를 들면 계면활성제나 유기 용매로 처리한 세포, 건조 세포, 파쇄 처리한 세포, 세포의 조추출액 등 외, 공지된 수단으로 이들을 고정화한 것을 의미한다.

그 중에서도, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 양자를 함유하는 형질 전환체 또는 그의 처리물을 사용한 경우에는, 보효소를 재생하기 위한 효소를 별도로 제조ㆍ첨가할 필요가 없어 광학 활성 알코올의 제조를 효율적으로 행할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 양자를 함유하는 형질 전환체는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 양자를 동일 벡터에 조립하고, 이것을 숙주 세포에 도입함으로써 얻어질 뿐 아니라, 이들 2종의 DNA를 불화합성 그룹에 속하는 다른 2종의 벡터에 각각 조립하여 이들 2종의 벡터를 동일한 숙주 세포에 도입함으로써도 얻어진다.

본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 양자가 조립된 벡터로서는, 상기 발현 벡터 pNTOM3, pNTOM4 및 pNTOM5의 각각에 바실러스ㆍ메가테리움 유래의 글루코스 탈수소 효소 유전자를 도입한 pNTOM3G1, pNTOM4G1, pNTOM5G1 등을 들 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 양자를 함유하는 형질 전환체로서는, E. coli HB101을 이들 벡터로 형질 전환한 E. coli HB101(pNTOM3G1), E. coli HB101(pNTOM4G1), E. coli HB101(pNTOM5G1) 등을 들 수 있다.

형질 전환체내의 보효소 재생능을 갖는 폴리펩티드의 활성은 통상법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들면, 글루코스 탈수소 효소의 활성은 1 M의 트리스 염산 완충액(pH 8.0)에 100 mM의 글루코스, 2 mM의 보효소 NADP 또는 NAD, 및 효소를 첨가하고, 25 ℃에서 1 분간 반응시켰을 때의 파장 340 nm에서의 흡광도의 증가 속도로부터 산출할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유하는 형질 전환체는 그것이 증식하는 한, 통상적인 탄소원, 질소원, 무기 염류, 유기 영양소 등을 포함하는 액체 영양 배지를 이용하여 배양할 수 있다.

반응으로 생성된 광학 활성 알코올은 통상법에 의해 정제할 수 있다. 예를 들면, 반응으로 생성된 광학 활성 알코올이 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올인 경우, 반응액을 아세트산에틸, 톨루엔 등의 유기 용매로 추출하고, 유기 용매를 감압하에서 제거한다. 또한, 결정 석출 또는 크로마토그래피 등의 처리를 행함으로써 정제할 수 있다.

(3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논과 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올의 정량 및 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올의 디아스테레오머 과잉률의 측정은 고속 액체 크로마토그래피(칼럼: COSMOSIL 5C8-MS(φ4.6 mm×250 mm; 나카라이 테스크사 제조), 용리액: 10 mM 인산 수용액/아세토니트릴=1/1, 유속: 1 ml/분, 검출: 210 nm)를 이용하여 행할 수 있다.

이상과 같이, 본 발명에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드의 효율적 생산이 가능하고, 그것을 이용함으로써 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 비롯한 각종 유용한 광학 활성 알코올의 우수한 제조 방법이 제공될 수 있다.

이하, 실시예에서 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들에 의해 한정되지 않는다. 또한, 이하의 실시예에서 이용한 재조합 DNA 기술에 관한 상세한 조작 방법 등은 문헌 ([Molecular Cloning 2nd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], [Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience])에 기재되어 있다.

(실시예 1) 폴리펩티드의 정제

이하의 방법에 따라서 오가타에아ㆍ미누타ㆍ바ㆍ미누타(Ogataea minuta var minuta) NBRC0975주로부터 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 비대칭적으로 환원하여 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 단일로 정제하였다. 특별히 언급이 없는 한, 정제 조작은 4 ℃에서 행하였다.

(3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논에 대한 환원 활성은, 0.33 ％(v/v)의 디메틸술폭시드를 함유하는 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에 기질 [(3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논]을 종료 농도 0.2 mM, 보효소 NADPH를 종료 농도 0.25 mM이 되도록 용해시키고, 또한 조효소액을 첨가하여 30 ℃에서 1 분간 반응을 행하였을 때, 상기 반응액의 파장 340 nm에서의 흡광도의 감소 속도로부터 산출하였다. 본 반응 조건에서 1 분간에 1 μmol의 NADPH를 NADP로 산화하는 활성을 1 유닛(unit)이라 정의하였다.

(미생물의 배양)

30 L 단지 발효기(비. 이. 마루비시사 제조)에 글루코스 5 ％, 폴리펩톤 0.5 ％, 이스트 엑기스 0.1 ％, 인산수소이칼륨 0.1 ％, 인산이수소칼륨 0.2 ％, 황산마그네슘ㆍ7수화물 0.02 ％(pH 6.5)를 함유하는 액체 배지 18 L를 제조하고, 120 ℃에서 20 분간 증기 살균을 행하였다.

이 배지에, 미리 동일한 배지에서 전배양해 둔 오가타에아ㆍ미누타ㆍ바ㆍ미누타(Ogataea minuta var. minuta) NBRC0975주의 배양액을 180 ml 접종하고, 교반 회전수 250 rpm, 통기량 5.0 NL/ml, 28 ℃의 조건에서 48 시간 배양하였다.

(무세포 추출액의 제조)

상기 배양액으로부터 원심 분리에 의해 균체를 모으고, 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5) 2000 ml를 이용하여 균체를 세정하여, 상기 균주의 균체 907 g을 얻었다. 이 균체를 0.1 mM의 디티오트레이톨(DTT)을 함유하는 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5) 1800 ml에 현탁시키고, UH-600형 초음파 분산기(SMT사 제조)를 이용하여 균체를 파쇄하였다. 이 파쇄물로부터 원심 분리로써 균체 잔사를 제거하여 무세포 추출액을 얻었다.

(황산암모늄 분획)

상기에서 얻은 무세포 추출액의 pH를 암모니아수를 이용하여 7.5로 조정한 후, 동일한 pH를 유지하면서 40 ％ 포화가 되도록 황산암모늄을 첨가, 용해시키고, 생성된 침전을 원심 분리에 의해 제거하였다. 앞과 동일한 pH 7.5를 유지하면서, 이 원심 상청에 60 ％ 포화가 되도록 황산암모늄을 더 첨가, 용해시키고, 생성된 침전을 원심 분리에 의해 모았다. 이 침전을 0.1 mM의 DTT를 함유하는 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5)에 용해시킨 후, 동일한 완충액으로 하룻밤 투석하여 활성 분획을 얻었다.

(DEAE-세파셀(Sephacel) 칼럼 크로마토그래피)

황산암모늄 분획에 의해 얻어진 활성 분획을, 0.1 mM의 DTT를 함유하는 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5)으로 미리 평형화한 DEAE-세파셀(아마샴 바이오사이언스사 제조) 칼럼(φ29×290 mm)에 적용하여 활성 분획을 흡착시켰다. 동일한 완 충액으로 칼럼을 세정한 후, 염화나트륨의 선형 구배(0 M에서 1 M까지)에 의해 활성 분획을 용출시켰다. 활성 분획을 모으고, 동일한 완충액으로 밤새 투석을 행하였다.

(MonoQ HR 칼럼 크로마토그래피)

DEAE-세파셀 칼럼 크로마토그래피에 의해 얻어진 활성 분획을 0.1 mM의 DTT를 함유하는 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5)으로 미리 평형화한 MonoQ HR10/10 칼럼(아마샴 바이오사이언스사 제조)에 적용하여 활성 분획을 흡착시켰다. 동일한 완충액으로 칼럼을 세정한 후, 염화나트륨의 선형 구배(0 M에서 1 M까지)에 의해 활성 분획을 용출시켰다. 활성 분획을 모으고, 동일한 완충액으로 하룻밤 투석을 행하였다.

(페닐-수퍼로스(Phenyl-Superose) 칼럼 크로마토그래피)

MonoQ HR 칼럼 크로마토그래피에 의해 얻어진 활성 분획에, 종료 농도가 4 M가 되도록 염화나트륨을 용해시키고, 4 M의 염화나트륨과 0.1 mM의 DTT를 함유하는 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5)으로 미리 평형화한 페닐-수퍼로스 HR 10/10 칼럼(아마샴 바이오사이언스사 제조)에 적용하여 활성 분획을 흡착시켰다. 동일한 완충액으로 칼럼을 세정한 후, 염화나트륨의 선형 구배(4 M에서 0 M까지)에 의해 활성 분획을 용출시켰다. 활성 분획을 모으고, 0.1 mM의 DTT를 함유하는 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5)으로써 밤새 투석을 행하였다.

(MonoQ HR 칼럼 크로마토그래피)

페닐-수퍼로스 칼럼 크로마토그래피에 의해 얻어진 활성 분획을, 0.1 mM의 DTT를 함유하는 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5)으로 미리 평형화한 MonoQ HR 5/5 칼럼(아마샴 바이오사이언스사 제조)에 적용하여 활성 분획을 흡착시켰다. 동일한 완충액으로 칼럼을 세정한 후, 염화나트륨의 선형 구배(0 M에서 1 M까지)에 의해 활성 분획을 용출시켰다. 활성 분획을 모으고, 센트리콘(Centricon) YM-10(밀리포어사 제조)을 이용하여 농축하였다.

(겔 여과 크로마토그래피)

상술한 MonoQ HR 칼럼 크로마토그래피에 의해 얻어진 활성 분획을, 0.2 M의 염화나트륨과 0.1 mM의 DTT를 함유하는 10 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5)으로 미리 평형화한 수퍼덱스(Superdex) 200 HR 10/30 칼럼(아마샴 바이오사이언스사 제조)에 적용하고, 동일한 완충액을 이용하여 0.5 ml/분의 유속으로 활성 분획을 용출시켰다. 활성 분획을 모으고, 센트리콘(Centricon) YM-10(밀리포어사 제조)을 이용하여 농축하였다. 이것을, 동일한 완충액으로 미리 평형화한 수퍼덱스 200 HR 10/30 칼럼(아마샴 바이오사이언스사 제조)에 적용하고, 동일한 완충액을 이용하여 0.5 ml/분의 유속으로 활성 분획을 용출시켰다. 활성 분획을 모아 폴리펩티드의 정제 표준 시료로 사용하였다.

(실시예 2) 유전자의 클로닝

(PCR 프라이머의 제조)

실시예 1에서 얻어진 정제 폴리펩티드를 8 M 요소 존재하에서 변성시킨 후, 아크로모박터 유래의 리실 엔도펩티다제(와코 퓨어 케미칼 인더스트리즈(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 제조)로 소화하고, 얻어진 펩티드 단편의 아미노산 서 열을 ABI492형 단백질 시퀀서(퍼킨 엘머사 제조)에 의해 결정하였다. 이 아미노산 서열로부터 예상되는 DNA 서열에 기초하여, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 일부를 PCR에 의해 증폭시키기 위한 프라이머 1: 5'-acngtntayttyathgcngg-3'(서열 목록의 서열 5) 및 프라이머 2: 5'-atnggdatrtcraaytgrtc-3'(서열 목록의 서열 6)을 합성하였다.

(PCR에 의한 유전자의 증폭)

실시예 1과 동일하게 배양한 오가타에아ㆍ미누타ㆍ바ㆍ미누타(Ogataea minuta var minuta) NBRC0975주의 균체로부터 비써(Visser) 등의 방법(문헌[Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415(2000)])에 따라서 염색체 DNA를 추출하였다. 상기에서 제조한 DNA 프라이머 1 및 2를 이용하고, 얻어진 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 행하였다. 그 결과, 목적 유전자의 일부라고 생각되는 약 700 bp의 DNA 단편이 증폭되었다. PCR은 DNA 폴리메라제로서 TaKaRa Ex Taq(다카라 바이오사 제조)를 이용하여 행하고, 반응 조건은 그의 취급 설명서에 따랐다. 이 DNA 단편을 플라스미드 pT7Blue T-벡터(노바겐(Novagen)사 제조)에 클로닝하고, ABI PRISM 다이 터미네이터사이클 시퀀싱 레디 리액션 키트(Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, 퍼킨 엘머사 제조) 및 ABI 373A DNA 시퀀서(퍼킨 엘머사 제조)를 이용하여 그의 염기 서열을 해석하였다. 그 결과, 본 PCR에 의해, 염기 서열이 다른 2종의 DNA 단편이 증폭된 것이 판명되었다. 이들의 염기 서열을 서열 목록의 서열 7 및 서열 8에 나타내었다.

(i-PCR법에 의한 목적 유전자의 전장 서열의 결정)

상기에서 제조한 오가타에아ㆍ미누타ㆍ바ㆍ미누타(Ogataea minuta var. min uta) NBRC0975주의 염색체 DNA를 제한 효소 XbaI로 완전 소화하고, 얻어진 DNA 단편의 혼합물을 T4 리가제에 의해 분자내 환화시켰다. 이것을 주형으로서 이용하고, i-PCR법(문헌[Nucl. Acids Res., 16, 8186(1988)])에 의해, 상술한 서열 7에 나타내는 염기 서열을 함유하는 유전자의 전장 염기 서열을 결정하였다. 그 결과를 서열 목록의 서열 1에 나타내었다. i-PCR은 DNA 폴리메라제로서 TaKaRa LA Taq(다카라 바이오사 제조)를 이용하여 행하고, 반응 조건은 그의 취급 설명서에 따랐다. 상술한 서열 8에 나타내는 염기 서열을 포함하는 유전자의 전장 염기 서열도 유사한 조작으로 결정하고, 그 결과를 서열 목록의 서열 2에 나타내었다. 또한, 서열 1에 나타낸 염기 서열이 코딩하는 아미노산 서열을 서열 3에, 서열 2에 나타낸 염기 서열이 코딩하는 아미노산 서열을 서열 4에 각각 나타내었다.

(실시예 3) 발현 벡터의 구축

프라이머 3: 5'-gtgcatatgaccaagactgtttatttca-3'(서열 목록의 서열 9)와 프라이머 4: 5'-gtcgaattcttattaaaatggaatgtcgaa-3'(서열 목록의 서열 10)을 이용하고, 실시예 2에서 얻은 오가타에아ㆍ미누타ㆍ바ㆍ미누타(Ogataea minuta var. minuta) NBRC0975주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 행하였다. 그 결과, 서열 목록의 서열 2에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 유전자의 개시 코돈 부분에 NdeI 인식 부위가 부가되고, 또한 시종 코돈의 직후에 EcoRI 인식 부위가 부가된 이본쇄 DNA를 얻었다. PCR은 DNA 폴리메라제로서 TaKaRa LA Taq(다카라 바이오사 제조)를 이용하여 행하고, 반응 조건은 그의 취급 설명서에 따랐다. 이 DNA를 NdeI 및 EcoRI로 소화하고, 플라스미드 pUCNT(WO94/03613)의 lac 프로모터 하류의 NdeI 인식 부위와 EcoRI 인식 부위 사이에 삽입하여 재조합 벡터 pNTOM4를 구축하였다.

유사하게, 프라이머 5: 5'-gtgcatatggctaagactgtctatttca-3'(서열 목록의 서열 11)과 프라이머 6: 5'-gtcgaattcttactagaatggaatgtcaaa-3'(서열 목록의 서열 12)를 이용하고, 서열 목록의 서열 1에 나타내는 염기 서열을 갖는 유전자의 개시 코돈 부분에 NdeI 인식 부위가 부가되며, 또한 시종 코돈의 직후에 EcoRI 인식 부위가 부가된 이본쇄 DNA를 얻었다. 이 DNA를 앞과 동일하게 플라스미드 pUCNT에 삽입하여 재조합 벡터 pNTOM3을 구축하였다.

(실시예 4) 변이 유전자의 제조

뮤탄-수퍼익스프레스(Mutan-SuperExpress) Km(다카라 바이오사 제조)를 이용하여 그의 취급 설명서에 기록된 조작 방법에 따라서, 서열 목록의 서열 2에 나타낸 염기 서열을 갖는 유전자 중의 125번째의 C를 G로, 128번째의 A를 C로, 136번째의 A를 G로, 또한 147번째의 C를 G로 치환한 변이 유전자를 제조하였다. 본 변이 유전자는 서열 목록의 서열 4에 나타낸 아미노산 서열 중의 42번째의 알라닌이 글리신으로 치환되고, 43번째의 글루탐산이 알라닌으로 치환되며, 46번째의 리신이 글루탐산으로 치환되고, 49번째의 아스파라긴이 리신으로 치환된 폴리펩티드를 코딩한다. 본 변이 유전자의 염기 서열을 서열 목록의 서열 15에, 상기 유전자에 코딩되는 변이 폴리펩티드의 아미노산 서열을 서열 목록의 서열 16에 나타낸다. 본 변이 유전자를 실시예 3과 동일하게 벡터 pUCNT에 삽입하여 재조합 벡터 pNTOM5를 구축하였다.

(실시예 5) 글루코스 탈수소 효소 유전자를 더 함유하는 발현 벡터의 구축

프라이머 7: 5'-gccgaattctaaggaggttaacaatgtataaa-3'(서열 목록의 서열 13)과 프라이머 8: 5'-gcggtcgacttatccgcgtcctgcttgg-3'(서열 목록의 서열 14)를 이용하여 플라스미드 pGDK1(문헌[Eur. J. Biochem., 186, 389(1989)])을 주형으로 하여 PCR을 행하여, 바실러스ㆍ메가테리움(Bacillus megaterium) IAM1030주 유래의 글루코스 탈수소 효소(이후, GDH라 함) 유전자의 개시 코돈으로부터 5 염기 상류에 대장균의 리보솜 결합 서열이, 또한 그 직전에 EcoRI 절단점이 부가되며, 또한 종지 코돈의 직후에 SalI 절단점이 부가된 이본쇄 DNA를 취득하였다.

얻어진 DNA 단편을 EcoRI 및 SalI로 소화하고, 실시예 3 및 4에 있어서 구축한 pNTOM3, pNTOM4 및 pNTOM5의 EcoRI, SalI 부위에 각각 삽입하여, 재조합 플라스미드 pNTOM3G1, pNTOM4G1 및 pNTOM5G1을 구축하였다. 예로서, pNTOM4G1의 제조 방법 및 구조를 도 1에 나타낸다.

(실시예 6) 형질 전환체의 제조

실시예 3 및 4에서 구축한 재조합 벡터 pNTOM3, pNTOM4 및 pNTOM5를 각각 이용하여, E. coli HB101 컴피턴트 셀(다카라 바이오사 제조)을 형질 전환하여 E. coli HB101(pNTOM3), E. coli HB101(pNTOM4) 및 E. coli HB101(pNTOM5)를 얻었다. 이들 형질 전환체는 각각 수탁 번호 FERM BP-10368, 수탁 번호 FERM BP-10369, 수탁 번호 FERM BP-10370로서 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(IPOD)에 기탁되어 있다.

유사하게, 실시예 5에서 구축한 재조합 벡터 pNTOM3G1, pNTOM4G1 및 pNTOM5G1을 각각 이용하여, E. coli HB101 컴피턴트 셀(다카라 바이오사 제조)을 형질 전환하여 E. coli HB101(pNTOM3G1), E. coli HB101(pNTOM4G1) 및 E. coli HB101(pNTOM5G1)을 얻었다.

(실시예 7) 형질 전환체에서의 유전자 발현

실시예 6에서 얻은 6종의 형질 전환체 및 벡터 플라스미드 pUCNT를 함유하는 형질 전환체인 E. coli HB101(pUCNT)를, 200 μg/ml의 암피실린을 함유하는 2×YT 배지(트립톤 1.6 ％, 이스트 엑기스 1.0 ％, NaCl 0.5 ％, pH 7.0) 50 ml에 접종하고, 37 ℃에서 24 시간 진탕 배양하였다. 원심 분리에 의해 균체를 모아 50 ml의 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에 현탁시켰다. 균체를 UH-50형 초음파 균질기(SMT사 제조)를 이용하여 파쇄한 후, 원심 분리에 의해 균체 잔사를 제거하여 무세포 추출액을 얻었다. 이 무세포 추출액의 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논 환원 활성 및 GDH 활성을 측정하고, 비활성(specific activity)을 표 1에 나타내었다. 실시예 6에서 얻어진 6종의 형질 전환체 중 어느 것도 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논환원 활성의 발현이 확인되었다. 또한, GDH 유전자를 포함하는 E. coli HB101(pNTOM3G1), E. coli HB101(pNTOM4G1) 및 E. coli HB101(pNTOM5G1)에서는, GDH 활성의 발현도 확인되었다. (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논 환원 활성은 실시예 1에 기재된 방법으로 측정하였다. GDH 활성은 1 M 트리스 염산 완충액(pH 8.0)에 글루코스 0.1 M, 보효소 NADP 2 mM 및 조효소액을 첨가하여 25 ℃에서 1 분 간 반응을 행하고, 파장 340 nm에서의 흡광도의 증가 속도로부터 산출하였다. 이 반응 조건에서 1 분간에 1 μmol의 NADP를 NADPH로 환원하는 효소 활성을 1 유닛(unit)이라 정의하였다. 또한, 무세포 추출액 중의 단백질 농도는 단백질 분석 키트(BIO-RAD사 제조)를 이용하여 측정하였다.

(실시예 8) 형질 전환체를 이용한 반응

실시예 7에서 제조한 E. coli HB101(pNTOM3)의 무세포 추출액 50 ml에 글루코스 탈수소 효소(아마노 엔자임사 제조) 2000 U, 글루코스 2 g, NADP 6 mg, (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논 2.5 g을 첨가하고, 혼합물을 5 M의 수산화나트륨의 적하에 의해 pH 6.5로 조정하면서 30 ℃에서 22 시간 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 톨루엔으로 추출하고, 탈용제한 후, 추출물을 분석하였다. 그 결과, 디아스테레오머 과잉률 96.4 ％d.e.의 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올이 수율 86.3 ％로 얻어졌다.

(3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논과 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올의 정량 및 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올의 디아스테레오머 과잉률의 측정은 고속 액체 크로마토그래피(칼럼: COSMOSIL 5C8-MS(φ4.6 mm×250 mm; 나칼라이 테스크사 제조), 용리액: 10 mM 인산 수용액/아세토니트릴=1/1, 유속: 1 ml/분, 검출: 210 nm)로 행하였다.

(실시예 9) 형질 전환체를 이용한 반응

실시예 7에서 제조한 E. coli HB101(pNTOM4)의 무세포 추출액 22.5 ml에 글루코스 탈수소 효소(아마노 엔자임사 제조) 1250 U, 글루코스 3 g, NADP 4 mg, (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논 0.25 g을 첨가하고, 혼합물을 5 M의 수산화나트륨의 적하에 의해 pH 6.5로 조정하면서 30 ℃에서 교반하였다. 반응 개시로부터 2 시간 후, 4 시간 후, 6 시간 후에 0.25 g, 8 시간 후에 1.25 g의 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 추가하고, 혼합물을 31 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액을 톨루엔으로 추출하고, 탈용제한 후, 추출물을 실시예 8과 동일하게 분석하였다. 그 결과, 디아스테레오머 과잉률 99.8 ％d.e.의 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올이 수율 99.0 ％로 얻어졌다.

(실시예 10) 형질 전환체를 이용한 반응

실시예 7에서 제조한 E. coli HB101(pNTOM4G1)의 배양액 25 ml에 글루코스 3 g, NADP 3 mg, 톨루엔 0.25 ml, (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논 2.5 g을 첨가하고, 혼합물을 5 M의 수산화나트륨의 적하에 의해 pH 6.5로 조정하면서 40 ℃에서 교반하였다. 반응 종료 후, 반응액을 톨루엔으로 추출하고, 탈용제한 후, 추출물을 실시예 8과 동일하게 분석하였다. 그 결과, 디아스테레오머 과잉률 99.8 ％d.e.의 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올이 수율 99.1 ％로 얻어졌다.

(실시예 11) 형질 전환체를 이용한 반응

실시예 7과 동일하게 배양한 E. coli HB101(pNTOM5G1)의 배양액 50 ml에 글루코스 6 g, NADP 1.4 mg, 톨루엔 0.25 ml, (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논 2.5 g을 첨가하고, 혼합물을 5 M의 수산화나트륨의 적하에 의해 pH 6.5로 조정하면서 30 ℃에서 교반하였다. 반응 개시로부터 1 시간 후에 2.5 g의(3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 추가하고, 혼합물을 20 시간 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액을 톨루엔으로 추출하고, 탈용제한 후, 추출물을 실시예 8과 동일하게 분석하였다. 그 결과, 디아스테레오머 과잉률 99.8 ％d.e.의 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올이 수율 99.6 ％로 얻어졌다.

(실시예 12) 폴리펩티드의 기질 특이성

0.33 ％(v/v)의 디메틸술폭시드를 함유하는 100 mM 인산 완충액(pH 6.5)에, 기질이 되는 카르보닐 화합물을 종료 농도 1 mM, 보효소 NADPH를 종료 농도 0.25 mM이 되도록 각각 용해시켰다. 이것에 실시예 7에서 제조한 E. coli HB101(pNTOM4) 또는 E. coli HB101(pNTOM3)의 무세포 추출액을 첨가하고, 혼합물을 30 ℃에서 1 분간 반응을 행하였다. 상기 반응액의 파장 340 nm에서의 흡광도의 감소 속도로부터 각 카르보닐 화합물에 대한 환원 활성을 산출하고, 이것을 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논에 대한 활성을 100 ％로 한 경우의 상대값으로서 표 2에 나타내었다. 상기 형질 전환체에 의해 생산된, 서열 목록의 서열 3 및 서열 4에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 모두 광범한 카르보닐 화합물에 대하여 환원 활성을 나타내었다.

형질 전환체가 생산하는 폴리펩티드의 기질 특이성
	비활성(%)
	E.coli HB101
기질 (카르보닐 화합물)	(pNTOM3)	(pNTOM4)
CBPB*	100	100
2-아세틸피리딘	29	0
3-아세틸페리딘	15	0
4-아세틸페리딘	98	0
아세틸피라진	185	0
아세토페논	215	0
3'-히드록시아세토페논	33	0
3'-니트로아세토페논	273	31
4'-클로로아세토페논	35	9
4'-플루오로아세토페논	28	1
3',4'-디메톡시아세토페논	51	4
4'-메틸아세토페논	41	1
2-히드록시아세토페논	32	1
2-클로로-1-(3'-클로로페닐)에타논	1301	33
1-페닐-2-부타논	285	2
프로피오페논	183	2
벤조인	4018	5
벤질아세톤	66	0
에틸 벤조일포르메이트	296	20
에틸 2-옥소-4-페닐부티레이트	127	106
아세톤	47	0
2-부타논	22	0
2-헥사논	11	0
2-헵타논	102	0
2-옥타논	808	3
클로로아세톤	100	1
히드록시아세톤	51	0
디아세틸	444	5
아세틸아세톤	23	0
시클로펜타논	8	0
7-메톡시-2-테토랄론	599	6
1-테토랄론	146	1
에틸 3-옥소시클로펜탄카르복실레이트	484	12
메틸 피루베이트	674	5
에틸 피루베이트	1067	23
메틸 아세토아세테이트	8	0
에틸 아세토아세테이트	137	0
tert-부틸 아세토아세테이트	1330	2
에틸 2-메틸아세토아세테이트	619	4
에틸 2-클로로아세토아세테이트	3309	40
에틸 2-에텐아세토아세테이트	2013	10
에틸 2-옥소데카노에이트	985	5
에틸 4-클로로아세토아세테이트	4547	22
n-옥틸 4-클로로아세토아세테이트	466	24
에틸 4-브로모아세토아세테이트	476	7
에틸 4-아지드아세토아세테이트	659	1
에틸 4-벤질옥시아세토아세테이트	1259	8
에틸 4-아세톡시아세토아세테이트	465	1
벤질 아세토아세테이트	883	4
에틸 벤조일아세테이트	1233	0
에틸 2-클로로-3-옥소-3-페닐프로피오네이트	716	5
벤즈알데히드	81	1
2-피리딘카르브알데히드	56	1
피리딘-4-알데히드	571	2
o-클로로벤즈알데히드	269	17
m-클로로벤즈알데히드	344	17
p-클로로벤즈알데히드	91	12
o-니트로벤즈알데히드	1621	89
m-니트로벤즈알데히드	851	29
p-니트로벤즈알데히드	1166	21
프로피온알데히드	99	0
n-부틸알데히드	168	0
n-헥실알데히드	265	3
2-페닐프로피온알데히드	479	3
3-페닐프로피온알데히드	2410	7
글루타르알데히드	80	1
CPBP*: (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논

SEQUENCE LISTING <110> Kaneka Corporation <120> NOVEL CARBONYL REDUCTASE, GENE THEREOF AND METHOD OF USING THE SAME <130> B040342WO01- <150> JP2004-231226 <151> 2004-08-06 <160> 16 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 756 <212> DNA <213> Ogataea minuta var. minuta <400> 1 atggctaaga ctgtctattt cattgccgga gcatcgagag ggattggcct cgagattgca 60 acccaattga gtgcaaaccc agagaaccat gtgattgcct cgtacagatc tgaaaagact 120 gctggtgcac tcctggaact tgccaagaag gacaacgtgg acactgttgt gttggatatt 180 gcaatccagg agtcgattga gggtttgtcc caacagattg tgaagctgac ggacggaatt 240 gatattgctc tgatcaatgc cggagttgga tactcaatgt actctctact cgaatgttcc 300 agagaagcat tcattgacca ctggactaca aattctctgg gtccaatcct ggtgtataag 360 gaaatccacc aattcatgct gaagagagaa actcgaaaag tgttcttcat gtctagcgga 420 gcagggtcta ttcagggcca cttgcctgtt tccgtgagtg catacggtat gtcgaaggca 480 gcactgaact acgcggcccg gaaactttct gacgaatgct acaaagacgg ctttactatt 540 gtggcgcttc acccaggtat ggttctgaca gacatgggta tggagagtat tgagattatg 600 gcaaacggag acgagcagct tgccgcgtcc atcaacagta ttgcaattag tacagacact 660 agtgccgcac aatgcattgg tgcaatgcag agtcttacaa agcagagcaa cggtagattc 720 attaatgttg cagaccagtt tgacattcca ttctag 756 <210> 2 <211> 756 <212> DNA <213> Ogataea minuta var. minuta <400> 2 atgaccaaga ctgtttattt cattgccgga gcttctagag gtattggcct tgaggttgcc 60 actcagctga gtgccaaccc agataattat gttattggtt cttacagaac ggagaaaact 120 gcagctgagc tgctcaaact ggccaacaaa gaaaatgtcg acactgttgt cctagacatt 180 ggtagccaag gttctattga agcgcttcca gcacaaatct caaagctgac ggacggaatc 240 gatattactc tgatcaatgc cggaattgcg tactcaatgt actctatttt cgagtgttcc 300 agagagacat ttattgatca ctggaccaca aattccttgg gtccaatcat gctctacaag 360 gagattcatc agttcatgct gaagagagaa actcgtaagg tgtttttcat gtctagtgga 420 ggaggctcta tccagtctct attgcctatt tcaaccagtg cttacggtat gtcgaaggct 480 gcactgaact atgcggtccg gaagctttct gatgaatgct acaaggacaa cttcaccatt 540 gtgatgttgc acccaggagt ggtggccacg gatatgggcc gggaaactac caagatcatg 600 gccaatggaa atgctcagat tatctcttat attgaatcca tatctttgcc gcccgctaca 660 agcgctgcac agactattgg tgcaatgcaa gctcttgaca agcagagcaa tggtaggttc 720 atcggagtcg cagaccagtt cgacattcca ttttaa 756 <210> 3 <211> 251 <212> PRT <213> Ogataea minuta var. minuta <400> 3 Met Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly 1 5 10 15 Leu Glu Ile Ala Thr Gln Leu Ser Ala Asn Pro Glu Asn His Val Ile 20 25 30 Ala Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Thr Ala Gly Ala Leu Leu Glu Leu Ala 35 40 45 Lys Lys Asp Asn Val Asp Thr Val Val Leu Asp Ile Ala Ile Gln Glu 50 55 60 Ser Ile Glu Gly Leu Ser Gln Gln Ile Val Lys Leu Thr Asp Gly Ile 65 70 75 80 Asp Ile Ala Leu Ile Asn Ala Gly Val Gly Tyr Ser Met Tyr Ser Leu 85 90 95 Leu Glu Cys Ser Arg Glu Ala Phe Ile Asp His Trp Thr Thr Asn Ser 100 105 110 Leu Gly Pro Ile Leu Val Tyr Lys Glu Ile His Gln Phe Met Leu Lys 115 120 125 Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Met Ser Ser Gly Ala Gly Ser Ile 130 135 140 Gln Gly His Leu Pro Val Ser Val Ser Ala Tyr Gly Met Ser Lys Ala 145 150 155 160 Ala Leu Asn Tyr Ala Ala Arg Lys Leu Ser Asp Glu Cys Tyr Lys Asp 165 170 175 Gly Phe Thr Ile Val Ala Leu His Pro Gly Met Val Leu Thr Asp Met 180 185 190 Gly Met Glu Ser Ile Glu Ile Met Ala Asn Gly Asp Glu Gln Leu Ala 195 200 205 Ala Ser Ile Asn Ser Ile Ala Ile Ser Thr Asp Thr Ser Ala Ala Gln 210 215 220 Cys Ile Gly Ala Met Gln Ser Leu Thr Lys Gln Ser Asn Gly Arg Phe 225 230 235 240 Ile Asn Val Ala Asp Gln Phe Asp Ile Pro Phe 245 250 <210> 4 <211> 251 <212> PRT <213> Ogataea minuta var. minuta <400> 4 Met Thr Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly 1 5 10 15 Leu Glu Val Ala Thr Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile 20 25 30 Gly Ser Tyr Arg Thr Glu Lys Thr Ala Ala Glu Leu Leu Lys Leu Ala 35 40 45 Asn Lys Glu Asn Val Asp Thr Val Val Leu Asp Ile Gly Ser Gln Gly 50 55 60 Ser Ile Glu Ala Leu Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile 65 70 75 80 Asp Ile Thr Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser Met Tyr Ser Ile 85 90 95 Phe Glu Cys Ser Arg Glu Thr Phe Ile Asp His Trp Thr Thr Asn Ser 100 105 110 Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Lys Glu Ile His Gln Phe Met Leu Lys 115 120 125 Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ile 130 135 140 Gln Ser Leu Leu Pro Ile Ser Thr Ser Ala Tyr Gly Met Ser Lys Ala 145 150 155 160 Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ser Asp Glu Cys Tyr Lys Asp 165 170 175 Asn Phe Thr Ile Val Met Leu His Pro Gly Val Val Ala Thr Asp Met 180 185 190 Gly Arg Glu Thr Thr Lys Ile Met Ala Asn Gly Asn Ala Gln Ile Ile 195 200 205 Ser Tyr Ile Glu Ser Ile Ser Leu Pro Pro Ala Thr Ser Ala Ala Gln 210 215 220 Thr Ile Gly Ala Met Gln Ala Leu Asp Lys Gln Ser Asn Gly Arg Phe 225 230 235 240 Ile Gly Val Ala Asp Gln Phe Asp Ile Pro Phe 245 250 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 1 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n represents a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n represents a, t, g or c <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n represents a, t, g or c <400> 5 acngtntayt tyathgcngg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 2 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n represents a, t, g or c <400> 6 atnggdatrt craaytgrtc 20 <210> 7 <211> 703 <212> DNA <213> Ogataea minuta var. minuta <400> 7 agcatcgaga gggattggcc tcgagattgc aacccaattg agtgcaaacc cagagaacca 60 tgtgattgcc tcgtacagat ctgaaaagac tgctggtgca ctcctggaac ttgccaagaa 120 ggacaacgtg gacactgttg tgttggatat tgcaatccag gagtcgattg agggtttgtc 180 ccaacagatt gtgaagctga cggacggaat tgatattgct ctgatcaatg ccggagttgg 240 atactcaatg tactctctac tcgaatgttc cagagaagca ttcattgacc actggactac 300 aaattctctg ggtccaatcc tggtgtataa ggaaatccac caattcatgc tgaagagaga 360 aactcgaaaa gtgttcttca tgtctagcgg agcagggtct attcagggcc acttgcctgt 420 ttccgtgagt gcatacggta tgtcgaaggc agcactgaac tacgcggccc ggaaactttc 480 tgacgaatgc tacaaagacg gctttactat tgtggcgctt cacccaggta tggttctgac 540 agacatgggt atggagagta ttgagattat ggcaaacgga gacgagcagc ttgccgcgtc 600 catcaacagt attgcaatta gtacagacac tagtgccgca caatgcattg gtgcaatgca 660 gagtcttaca aagcagagca acggtagatt cattaatgtt gca 703 <210> 8 <211> 703 <212> DNA <213> Ogataea minuta var. minuta <400> 8 agcttctaga ggtattggcc ttgaggttgc cactcagctg agtgccaacc cagataatta 60 tgttattggt tcttacagaa cggagaaaac tgcagctgag ctgctcaaac tggccaacaa 120 agaaaatgtc gacactgttg tcctagacat tggtagccaa ggttctattg aagcgcttcc 180 agcacaaatc tcaaagctga cggacggaat cgatattact ctgatcaatg ccggaattgc 240 gtactcaatg tactctattt tcgagtgttc cagagagaca tttattgatc actggaccac 300 aaattccttg ggtccaatca tgctctacaa ggagattcat cagttcatgc tgaagagaga 360 aactcgtaag gtgtttttca tgtctagtgg aggaggctct atccagtctc tattgcctat 420 ttcaaccagt gcttacggta tgtcgaaggc tgcactgaac tatgcggtcc ggaagctttc 480 tgatgaatgc tacaaggaca acttcaccat tgtgatgttg cacccaggag tggtggccac 540 ggatatgggc cgggaaacta ccaagatcat ggccaatgga aatgctcaga ttatctctta 600 tattgaatcc atatctttgc cgcccgctac aagcgctgca cagactattg gtgcaatgca 660 agctcttgac aagcagagca atggtaggtt catcggagtc gca 703 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 3 <400> 9 gtgcatatga ccaagactgt ttatttca 28 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ttattgatca ctggaccaca aattccttgg gtccaatcat gctctacaag 360 gagattcatc agttcatgct gaagagagaa actcgtaagg tgtttttcat gtctagtgga 420 ggaggctcta tccagtctct attgcctatt tcaaccagtg cttacggtat gtcgaaggct 480 gcactgaact atgcggtccg gaagctttct gatgaatgct acaaggacaa cttcaccatt 540 gtgatgttgc acccaggagt ggtggccacg gatatgggcc gggaaactac caagatcatg 600 gccaatggaa atgctcagat tatctcttat attgaatcca tatctttgcc gcccgctaca 660 agcgctgcac agactattgg tgcaatgcaa gctcttgaca agcagagcaa tggtaggttc 720 atcggagtcg cagaccagtt cgacattcca ttttaa 756 <210> 16 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant polypeptide 1 <400> 16 Met Thr Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly 1 5 10 15 Leu Glu Val Ala Thr Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile 20 25 30 Gly Ser Tyr Arg Thr Glu Lys Thr Ala Gly Ala Leu Leu Glu Leu Ala 35 40 45 Lys Lys Glu Asn Val Asp Thr Val Val Leu Asp Ile Gly Ser Gln Gly 50 55 60 Ser Ile Glu Ala Leu Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile 65 70 75 80 Asp Ile Thr Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser Met Tyr Ser Ile 85 90 95 Phe Glu Cys Ser Arg Glu Thr Phe Ile Asp His Trp Thr Thr Asn Ser 100 105 110 Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Lys Glu Ile His Gln Phe Met Leu Lys 115 120 125 Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ile 130 135 140 Gln Ser Leu Leu Pro Ile Ser Thr Ser Ala Tyr Gly Met Ser Lys Ala 145 150 155 160 Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ser Asp Glu Cys Tyr Lys Asp 165 170 175 Asn Phe Thr Ile Val Met Leu His Pro Gly Val Val Ala Thr Asp Met 180 185 190 Gly Arg Glu Thr Thr Lys Ile Met Ala Asn Gly Asn Ala Gln Ile Ile 195 200 205 Ser Tyr Ile Glu Ser Ile Ser Leu Pro Pro Ala Thr Ser Ala Ala Gln 210 215 220 Thr Ile Gly Ala Met Gln Ala Leu Asp Lys Gln Ser Asn Gly Arg Phe 225 230 235 240 Ile Gly Val Ala Asp Gln Phe Asp Ile Pro Phe 245 250

Claims

(a) 서열 목록의 서열 1에 도시된 염기 서열을 포함하는 DNA; 또는

(b) 서열 목록의 서열 1에 도시된 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, 또한 하기 화학식 1로 표시되는 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 비대칭적으로 환원하여 하기 화학식 2로 표시되는 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.

<화학식 1>

<화학식 2>
(a) 서열 목록의 서열 2에 도시된 염기 서열을 포함하는 DNA; 또는

(b) 서열 목록의 서열 2에 도시된 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화하고, 또한 상기 화학식 1로 표시되는 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 비대칭적으로 환원하여 상기 화학식 2로 표시되는 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
제1항 또는 제2항에 기재된 DNA로 코딩되고, 또한 상기 화학식 1로 표시되는 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 비대칭적으로 환원하여 상기 화학식 2로 표시되는 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
(a) 서열 목록의 서열 3에 도시된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드; 또는

(b) 서열 목록의 서열 3에 도시된 아미노산 서열과 78 ％ 이상의 상동성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 화학식 1로 표시되는 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 비대칭적으로 환원하여 상기 화학식 2로 표시되는 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
(a) 서열 목록의 서열 4에 도시된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드; 또는

(b) 서열 목록의 서열 4에 도시된 아미노산 서열과 78 ％ 이상의 상동성을 보이는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 화학식 1로 표시되는 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논을 비대칭적으로 환원하여 상기 화학식 2로 표시되는 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올을 생성하는 활성을 갖는 폴리펩티드.
1) 42번째의 알라닌이 글리신으로 치환된 것;

2) 43번째의 글루탐산이 알라닌으로 치환된 것;

3) 46번째의 리신이 글루탐산으로 치환된 것;

4) 49번째의 아스파라긴이 리신으로 치환된 것

상기 1) 내지 4) 중 1개 이상의 변이로부터 생성되는, 서열 목록의 서열 4에 도시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
제6항에 있어서, 상기 1) 내지 4)의 모든 변이를 포함하는 폴리펩티드.
제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
제1항, 제2항 또는 제8항 중 어느 한 항에 기재된 DNA를 포함하는 벡터.
제9항에 있어서, 플라스미드 pNTOM3인 벡터.
제9항에 있어서, 플라스미드 pNTOM4인 벡터.
제9항에 있어서, 플라스미드 pNTOM5인 벡터.
제9항에 있어서, 글루코스 탈수소 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 더 포함하는 벡터.
제13항에 있어서, 상기 글루코스 탈수소 효소 활성을 갖는 폴리펩티드가 바실러스ㆍ메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 글루코스 탈수소 효소인 벡터.
제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환하여 얻어지는 형질 전환체.
제15항에 있어서, 상기 숙주 세포가 대장균(Escherichia coli)인 형질 전환체.
제16항에 있어서, E. coli HB101(pNTOM3) FERM BP-10368인 형질 전환체.
제16항에 있어서, E. coli HB101(pNTOM4) FERM BP-10369인 형질 전환체.
제16항에 있어서, E. coli HB101(pNTOM5) FERM BP-10370인 형질 전환체.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드, 또는 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환체, 또는 그의 처리물을, 카르보닐기를 갖는 화합물과 반응시키는 것을 특징으로 하는 광학 활성 알코올의 제조 방법.
제20항에 있어서, 상기 카르보닐기를 갖는 화합물이 상기 화학식 1로 표시되는 (3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부타논이고, 상기 광학 활성 알코올이 상기 화학식 2로 표시되는 (2R,3S)-1-클로로-3-tert-부톡시카르보닐아미노-4-페닐-2-부탄올인 제조 방법.