CN105821013B - 羰基还原酶及其在制备手性n-保护-羟基氮杂环中的应用 - Google Patents

羰基还原酶及其在制备手性n-保护-羟基氮杂环中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种羰基还原酶，及所述羰基还原酶在催化N‑叔丁氧羰基‑羰基氮杂环化合物的不对称还原，生成高光学纯度的相应(S)‑构型的N‑叔丁氧羰基‑羟基氮杂环化合物中的应用。所述羰基还原酶为由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第90位、第92位、第94位、第99位、第138位或第174位氨基酸残基经过氨基酸替换后所形成的新氨基酸序列构成的N‑叔丁氧羰基‑羰基哌啶还原活性提高的羰基还原酶突变体。与现有技术相比，本发明的工程化羰基还原酶具有活性高、底物谱广的优势，在制备(S)‑N‑Boc‑羟基氮杂环中具有很好的工业应用前景。

Description

羰基还原酶及其在制备手性N-保护-羟基氮杂环中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种工程化羰基还原酶及其在制备手性N-保护羟基氮杂环及其衍生物中的应用。
背景技术
许多天然和非天然的药物中都含有羟基氮杂环结构，光学纯的羟基哌啶和羟基吡咯烷及其衍生物作为合成这些药物的重要前体，具有广泛的应用前景。其中，(S)-N-Boc-3-羟基哌啶(其中Boc是叔丁氧羰基的缩写)是合成抗癌新药BTK抑制剂依鲁替尼(Ibrutinib)的重要前体，利用(S)-N-Boc-3-羟基哌啶合成依鲁替尼的工艺如下所示：
目前手性N-Boc-3-羟基哌啶的制备方法主要有三种，分别是化学拆分法、化学不对称还原法以及生物转化法。化学拆分法中将外消旋的哌啶醇溶解于单一构型的手性酸中，特定构型的哌啶醇与手性酸形成盐而沉淀，从而达到与另一构型的哌啶醇分离的目的，该法存在操作繁琐、拆分效率低、成本高等缺点。化学不对称还原法使用金属催化剂，催化效率低，反应条件苛刻，并且存在比较严重的环境污染。生物催化合成方法由于立体选择性好、效率高、反应条件温和、环境友好、成本低等优势已经逐渐成为有机手性合成尤其是手性醇合成的重要方法。目前已经有多篇专利文献报道使用生物催化剂生产光学纯(S)-N-Boc-3-羟基哌啶，中国发明专利201310054684.9中，使用醇脱氢酶PAR催化N-Boc-3-羰基哌啶还原，底物浓度33.3g/L(0.17mol/L)，酶用量为2g/L，NADH添加量为3.3g/L，用异丙醇作为辅底物，浓度为267g/L，转化32h，产物收率90％，光学纯度>99％；中国发明专利201310173088.2中，使用酮还原酶KRED作为催化剂，进行了(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的公斤级规模制备，底物浓度为45g/L(0.226mol/L)，酶用量为2.25g/L，用异丙醇作为辅底物，NAD+的用量为0.225g/L，转化24h，转化率高于99％，产品收率80％，光学纯度99.5％；中国发明专利201310596266.2中，由3-羟基哌啶出发，制备N-Boc-3-羰基哌啶，进而使用酮还原酶KRED198作为催化剂，催化N-Boc-3-羰基哌啶还原，在500ml酶促还原反应体系中，加入由100ml的3-羟基-哌啶制备的N-Boc-3-羰基哌啶，10g还原酶KRED198和10g葡萄糖脱氢酶GDH105酶粉，NADP+的添加量为0.1g/L，以葡萄糖作为辅底物，反应24h，总产品收率为72％，光学纯度99.2％；此外，PCT专利WO2013/190341中，使用系列氧化还原酶催化N-Boc-3-羰基哌啶还原制备(S)-N-Boc-3-羟基哌啶，100ml反应体系中，底物浓度100g/L，加酶液5.7ml，以异丙醇作为辅底物，NAD+的添加量为0.1g/L，转化24h，转化率95％，产物光学纯度>99.8％。
总的来说，已报道的N-Boc-3-羰基哌啶还原酶催化剂的活性不高，已报道的专利文献中，所用的催化剂都是游离酶液或酶粉催化剂，催化剂制备过程步骤多，成本高，难以大规模应用于工业生产；由于使用酶制剂催化反应，因此反应过程中必须额外添加价格昂贵的辅酶，导致生产成本进一步提高。另外，已报道的N-Boc-3-羰基哌啶还原酶催化剂的底物谱比较狭窄，尽管专利201310054684.9中公开的醇脱氢酶PAR还能催化其他一些羰基底物的还原，但未见催化不同位点羰基取代的N-Boc-羰基哌啶及其结构类似物N-Boc-羰基吡咯的报道，从而限制了这类羰基还原酶的应用范围。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种广谱的、能高效催化N-Boc-羰基哌啶以及N-Boc-羰基吡咯不对称还原制备相应(S)-羟基产物的高活性的酶，在此基础上，直接使用表达该酶的重组菌株整细胞作为催化剂，催化N-Boc-羰基哌啶以及N-Boc-羰基吡咯的不对称还原，高效利用细胞自身的辅酶，少加甚至不额外添加价格昂贵的辅酶。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明采用的技术方案之一是：一种高活性的N-Boc-羰基哌啶还原酶。
以N-Boc-羰基哌啶作为底物，对实验室酶库进行筛选，其中，如序列表SEQ IDNo.2所示氨基酸序列的羰基还原酶CgKR1可以催化底物不对称还原生成(S)-N-Boc-羟基哌啶，比活力为：1.4U/mg；并且该酶还可以催化N-Boc-羰基吡咯的不对称还原，生成相应的(S)-N-Boc-羟基吡咯。
在此基础上，采用易错PCR策略对CgKR1进行突变改造，以提高该酶对N-Boc-羰基哌啶以及N-Boc-羰基吡咯的反应活性。结果表明，所有活性显著提高的突变体都含有90位丝氨酸残基的突变。因此，得出一种高活性的N-Boc-羰基哌啶还原酶为由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第90位氨基酸残基经过氨基酸替换后所形成的新氨基酸序列构成的N-叔丁氧羰基-羰基哌啶还原活性提高的羰基还原酶突变体。SEQ ID No.2所示氨基酸序列对应的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
在此基础上，将所获得的90位突变点与之前已公开的CgKR1的突变点F92L、F94V、I99Y、D138N以及G174A(在专利CN 102618513B、CN104099305A中有记载)进行组合，对获得的组合突变体进行活力筛选，获得两个活性显著提高的突变体CgKR1S90C/F92L/F94V/I99Y/G174A和CgKR1S90F/F92L/I99Y/D138N/G174A。
突变体CgKR1S90C/F92L/F94V/I99Y/G174A为由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第90位丝氨酸替换为半胱氨酸、第92位苯丙氨酸替换为亮氨酸、第94位苯丙氨酸替换为缬氨酸、第99位异亮氨酸替换为酪氨酸、第174位甘氨酸替换为丙氨酸后所形成的新氨基酸序列构成的羰基还原酶。
突变体CgKR1S90F/F92L/I99Y/D138N/G174A为由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第90位丝氨酸替换为苯丙氨酸、第92位苯丙氨酸替换为亮氨酸、第99位异亮氨酸替换为酪氨酸、第138位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第174位甘氨酸替换为丙氨酸后所形成的新氨基酸序列构成的羰基还原酶。
与母本相比，突变体CgKR1S90C/F92L/F94V/I99Y/G174A和CgKR1S90F/F92L/I99Y/D138N/G174A对N-Boc-羰基哌啶的反应活性分别提高了8.3倍和10.8倍。
本发明采用的技术方案之二是：一种分离的核酸，所述核酸是编码上述N-Boc-羰基哌啶还原酶的核酸分子。
本发明所述的核酸的制备方法较佳为：可以从含编码表达所述氨基酸序列的蛋白质的表达质粒或重组转化体中分离获得，也可以通过全基因序列人工合成获得。
如本领域技术人员所知：由于密码子的简并性，编码所述工程化羰基还原酶的碱基序列不仅限于一种，还可以适当引入替换来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换来制得。
本发明采取的技术方案之三是：一种包含本发明所述的核酸序列的重组表达质粒。
本发明所述的重组表达质粒可通过本领域常规方法制备，即将编码本发明所述的工程化羰基还原酶的核酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种质粒，优选质粒pET-28a(+)。
本发明采取的技术方案之四是：一种包含上述重组表达质粒的重组表达转化体。
本发明所述重组表达转化体可通过将上述重组表达质粒转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达质粒可稳定地自行复制，且所携带的本发明的基因可被有效表达即可。较佳地为大肠杆菌，更佳地为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。其中所述的转化方法为本领域常规方法，如热激法，电转法等，较佳地为热激法。
本发明采取的技术方案之五是：一种重组羰基还原酶的制备方法，其中包括如下步骤：培养本发明所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组羰基还原酶。
其中所述的制备方法可采用本领域常规的培养方法。对于重组大肠杆菌转化体，较佳地为：将上述重组表达转化体接种至蛋白胨、酵母膏以及氯化钠配制的培养基中，30～40℃，搅拌混合，通气培养，培养液的光密度OD600达到一定指标(较佳地为6～8)，加入0.05～1.0mM(较佳地为0.5mM)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为16～37℃(优选25℃)，诱导8～24小时即可得到高效表达的重组工程化羰基还原酶。
本发明采取的技术方案之六是：使用如上所述的重组羰基还原酶催化N-Boc-羰基氮杂环不对称还原制备(S)-N-Boc-羟基氮杂环的方法。
其中所述的N-Boc-羰基氮杂环的结构如下所示：
其中，I：N-Boc-3-羰基吡咯；II：N-Boc-2-羰基吡咯；III：N-Boc-3-羰基哌啶，其中Boc是叔丁氧羰基的缩写。
所述的不对称还原反应的条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，较佳的，所述的应用包括下述步骤：将表达重组羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌整细胞加入反应缓冲液中，加入羰基反应底物与葡萄糖，在一定温度下混合反应。所述工程化羰基还原酶与N-Boc-羰基氮杂环化合物的用量比较佳的为80kU/mol～240kU/mol底物，葡萄糖与N-Boc-羰基氮杂环化合物的用量比较佳的为200g/mol～300g/mol。反应缓冲液为实验室常规缓冲液，pH范围在5.5～7.0，优选为磷酸钾缓冲液，浓度较佳的为0.1～0.2mol/L。反应温度较佳的为25～35℃。反应过程以在搅拌条件下进行较佳。羰基还原酶以及葡萄糖脱氢酶是由重组基因工程大肠杆菌通过发酵表达得到，所述的催化剂是以含有酶的菌体整细胞形式加入，额外添加的NADP+的用量以0～0.1mmol/L较佳。在底物以及葡萄糖加入之前，可先在缓冲液中加入菌体，充分搅拌0.5h～1h。不对称还原反应的反应时间以产物浓度不再继续增长的时间为准。反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取(S)-N-Boc-羟基哌啶和(S)-N-Boc-羟基吡咯。
与现有技术相比，本发明的工程化羰基还原酶具有活性高、底物谱广的优势，在制备(S)-N-Boc-羟基氮杂环中具有很好的工业应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1高活性N-Boc-羰基哌啶还原酶突变体的筛选
采用易错PCR策略对如序列表SEQ ID No.2所示氨基酸序列的羰基还原酶CgKR1进行突变改造，以提高该酶对N-Boc-羰基哌啶以及N-Boc-羰基吡咯的反应活性，发现90位丝氨酸残基是影响CgKR1活性的关键位点。
在此基础上，将90位丝氨酸的不同突变体与已公开的F92L、F94V、I99Y、D138N以及G174A的突变进行组合，对获得的组合突变体进行活力筛选，获得两个活性显著提高的突变体CgKR1S90C/F92L/F94V/I99Y/G174A和CgKR1S90F/F92L/I99Y/D138N/G174A。
筛选获得的活性显著提高的突变体如表1所示。
表1 N-Boc-羰基哌啶还原活性提高的羰基还原酶突变体
上述S90C、S90F、F92L/F94V/I99Y/G174A、F92L/I99Y/D138N/G174A、S90C/F92L/F94V/I99Y/G174A、S90F/F92L/I99Y/D138N/G174A分别表示由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的相应位点发生改变后的突变体。
实施例2重组酶CgKR1S90C/F92L/F94V/I99Y/G174A的发酵生产
重组酶CgKR1S90C/F92L/F94V/I99Y/G174A为由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第90位丝氨酸替换为半胱氨酸、第92位苯丙氨酸替换为亮氨酸、第94位苯丙氨酸替换为缬氨酸、第99位异亮氨酸替换为酪氨酸、第174位甘氨酸替换为丙氨酸后所形成的新氨基酸序列构成的羰基还原酶。
重组酶CgKR1S90C/F92L/F94V/I99Y/G174A是由重组基因工程大肠杆菌通过发酵表达得到的。
在5L发酵罐中发酵产酶，发酵培养基采用2×LB配方，即20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉及10g/L NaCl。补料氮源采用60g/L蛋白胨及60g/L酵母粉的混合液，碳源采用50％(w/w)的甘油。发酵液的pH通过采用外源补加酸(质量分数20％的H2SO4)以及碱(浓氨水)来调节恒定于pH 7.0。发酵培养基灭菌前调节pH至7.2，于121℃灭菌20min。发酵初始，采用1.5％接种量接种OD600约1.0左右的新鲜种子液，待菌体生长至为OD600约6～8左右时加入IPTG至终浓度0.5mM，于25℃诱导表达至发酵活力不再继续增长，发酵过程中通过调节转速以及补料速度使溶氧维持在10～30％。发酵16h，结束发酵，离心(8000×g,10min)收集菌体，用生理盐水洗涤两次，备用。湿细胞比活力为4100U/g。
实施例3重组酶CgKR1S90F/F92L/I99Y/D138N/G174A的发酵生产
重组酶CgKR1S90F/F92L/I99Y/D138N/G174A为由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第90位丝氨酸替换为苯丙氨酸、第92位苯丙氨酸替换为亮氨酸、第99位异亮氨酸替换为酪氨酸、第138位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第174位甘氨酸替换为丙氨酸后所形成的新氨基酸序列构成的羰基还原酶。
重组酶CgKR1S90F/F92L/I99Y/D138N/G174A是由重组基因工程大肠杆菌通过发酵表达得到的。
在5L发酵罐中发酵产酶，发酵培养基采用2×LB配方，即20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉及10g/L NaCl。补料氮源采用60g/L蛋白胨及60g/L酵母粉，碳源采用50％(w/w)的甘油。发酵液的pH通过采用外源补加酸(质量分数20％的H2SO4)以及碱(浓氨水)来调节恒定于pH7.0。发酵培养基灭菌前调pH至7.2，于121℃灭菌20min。发酵初始，采用1.5％接种量接种OD600约1.0左右的新鲜种子液，待菌体生长至为OD600约6～8左右时加入IPTG至终浓度0.5mM，于25℃诱导表达至发酵活力不再继续增长，发酵过程中通过调节转速以及补料速度使溶氧维持在10～30％。发酵20h，结束发酵，离心(8000×g,10min)收集菌体，用生理盐水洗涤两次，备用。湿细胞比活力为4700U/g。
实施例4重组葡萄糖脱氢酶的发酵生产
以实验室保存的表达葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌作为菌种，在5L发酵罐中发酵产酶，发酵培养基采用2×LB配方，即20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉及10g/L NaCl。补料氮源采用60g/L蛋白胨及60g/L酵母粉，碳源采用50％(w/w)的甘油。发酵液的pH通过采用外源补加酸(质量分数20％的H2SO4)以及碱(浓氨水)来调节恒定于pH 7.0。发酵培养基灭菌前调pH至7.2，于121℃灭菌20min。发酵初始，采用1.5％接种量接种OD600约1.0左右的新鲜种子液，待菌体生长至为OD600约6～8左右时加入IPTG至终浓度0.5mM，于25℃诱导表达至发酵活力不再继续增长，发酵过程中通过调节转速以及补料速度使溶氧维持在10～30％。发酵18h，结束发酵，离心(8000×g,10min)收集菌体，用生理盐水洗涤两次，备用。湿细胞比活力为770U/g。
实施例5重组酶CgKR1S90C/F92L/F94V/I99Y/G174A催化N-Boc-3-羰基哌啶还原
取0.2g如实施例1制备的还原酶湿细胞(4100U/g)以及0.7g如实施例3制备的葡萄糖脱氢酶湿细胞(770U/g)加入20ml夹套反应容器中，加入9mL磷酸钾缓冲液(0.2mol/L，pH7.0)，加入0.1mM NADP+，磁力搅拌，充分搅拌1h。随后加入1g的N-Boc-3-羰基哌啶(0.005mol)以及1.5g葡萄糖，开始反应。反应过程中滴加1N NaOH，控制pH值为7.0。间歇取样，HPLC检测，反应6h后，转化率>99％，终止反应。反应液离心，上清液加入乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤两次，用无水硫酸钠干燥6小时，旋转蒸发浓缩得到黄色油状物。将获得的粗产品在正己烷中结晶，得到0.81g(S)-N-Boc-3-羟基哌啶，摩尔收率为80.1％，GC纯度为98.2％，ee值>99％。
实施例6重组酶CgKR1S90F/F92L/I99Y/D138N/G174A催化N-Boc-3-羰基哌啶还原
取0.2g如实施例2制备的还原酶湿细胞(4700U/g)以及0.7g如实施例3制备的葡萄糖脱氢酶湿细胞(770U/g)加入20ml夹套反应容器中，加入9mL磷酸钾缓冲液(0.2mol/L,pH7.0)，加入0.1mM NADP+，磁力搅拌，充分搅拌1h。随后加入1g(0.005mol)的N-Boc-3-羰基哌啶以及1.5g葡萄糖，开始反应。反应过程中滴加1N NaOH，控制pH值为7.0。间歇取样，HPLC检测，反应4h后，转化率>99％，终止反应。反应液离心，上清液加入乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤两次，用无水硫酸钠干燥6小时，旋转蒸发浓缩得到黄色油状物。将获得的粗产品在正己烷中结晶，得到0.80g(S)-N-Boc-3-羟基哌啶，摩尔收率为79.1％，GC纯度为98.5％，ee值>99％。
实施例7重组酶CgKR1S90F/F92L/I99Y/D138N/G174A催化N-Boc-2-羰基哌啶还原
取0.1g如实施例2制备的还原酶湿细胞(4700U/g)以及0.7g如实施例3制备的葡萄糖脱氢酶湿细胞(770U/g)加入20ml夹套反应容器中，加入9mL磷酸钾缓冲液(0.2mol/L,pH7.0)，加入0.1mM NADP+，磁力搅拌，充分搅拌1h。随后加入1g(0.005mol)的N-Boc-2-羰基哌啶以及1.5g葡萄糖，开始反应。反应过程中滴加1N NaOH，控制pH值为7.0。间歇取样，HPLC检测，反应4h后，转化率>99％，终止反应。反应液离心，上清液加入乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤两次，用无水硫酸钠干燥6小时，旋转蒸发浓缩得到黄色油状物。将获得的粗产品在正己烷中结晶，得到0.84g(S)-N-Boc-2-羟基哌啶，摩尔收率为83.1％，GC纯度为98.5％，ee值>99％。
实施例8(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的十克级规模制备
取2g如实施例2制备的还原酶湿细胞(4700U/g)以及7g如实施例3制备的葡萄糖脱氢酶湿细胞(770U/g)加入250ml三口烧瓶中，加入90mL磷酸钾缓冲液(0.2mol/L,pH 6.0)，机械搅拌，充分搅拌1h。随后加入10g(0.054mol)的N-Boc-3-羰基哌啶以及15g葡萄糖，开始反应。反应过程中滴加1N NaOH，控制pH值为6.0。间歇取样，HPLC检测，反应3h后，转化率>99％，终止反应。反应液离心，上清液中加入乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤两次，用无水硫酸钠干燥6小时，旋转蒸发浓缩得到黄色油状物。将获得的粗产品在正己烷中结晶，得到8.5g(S)-N-Boc-3-羟基哌啶，摩尔收率为84.1％，GC纯度为98.0％，ee值>99％。
实施例9(S)-N-Boc-3-羟基吡咯的十克级规模制备
取2g如实施例2制备的还原酶湿细胞(4700U/g)以及7g如实施例3制备的葡萄糖脱氢酶湿细胞(770U/g)加入250ml三口烧瓶中，加入90mL磷酸钾缓冲液(0.2mol/L,pH 6.0)，机械搅拌，充分搅拌1h。随后加入10g(0.05mol)的N-Boc-3-羰基吡咯以及15g葡萄糖，开始反应。反应过程中滴加1N NaOH，控制pH值为6.0。间歇取样，HPLC检测，反应24h后，转化率>99％，终止反应。反应液离心，上清液中加入乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤两次，用无水硫酸钠干燥6小时，旋转蒸发浓缩得到黄色油状物。将获得的粗产品在正己烷中结晶，得到8.6g(S)-N-Boc-3-羟基吡咯，摩尔收率为85.1％，GC纯度为98.3％，ee值>99％。
实施例10(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的百克级规模制备
取25g如实施例2制备的还原酶湿细胞(4700U/g)以及75g如实施例3制备的葡萄糖脱氢酶湿细胞(770U/g)加入2L夹套玻璃反应釜中，加入0.9L磷酸钾缓冲液(0.2mol/L,pH6.0)，机械搅拌，充分搅拌1h。随后加入100g的N-Boc-3-羰基哌啶以及150g葡萄糖，开始反应。反应过程中滴加1N NaOH，控制pH值为6.0。间歇取样，HPLC检测，反应2.5h后，转化率>99％，终止反应。反应液离心，上清液中加入乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤两次，用无水硫酸钠干燥6小时，旋转蒸发浓缩得到黄色油状物。将获得的粗产品在正己烷中结晶，得到89.3g(S)-N-Boc-3-羟基哌啶，摩尔收率为88.5％，GC纯度为98.5％，ee值>99％。
实施例11(S)-N-Boc-3-羟基吡咯的百克级规模制备
取25g如实施例2制备的还原酶湿细胞(4700U/g)以及75g如实施例3制备的葡萄糖脱氢酶湿细胞(770U/g)加入2L夹套玻璃反应釜中，加入0.9L磷酸钾缓冲液(0.2mol/L,pH6.0)，机械搅拌，充分搅拌1h。随后加入100g的N-Boc-3-羰基吡咯以及150g葡萄糖，开始反应。反应过程中滴加1N NaOH，控制pH值为6.0。间歇取样，HPLC检测，反应24h后，转化率>99％，终止反应。反应液离心，上清液中加入乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤两次，用无水硫酸钠干燥6小时，旋转蒸发浓缩得到黄色油状物。将获得的粗产品在正己烷中结晶，得到84.0g(S)-N-Boc-3-羟基吡咯，摩尔收率为83.1％，GC纯度为98.1％，ee值>99％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种羰基还原酶，其特征在于，为由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第90位丝氨酸替换为半胱氨酸、第92位苯丙氨酸替换为亮氨酸、第94位苯丙氨酸替换为缬氨酸、第99位异亮氨酸替换为酪氨酸、第174位甘氨酸替换为丙氨酸后所形成的新氨基酸序列构成的羰基还原酶，或，
为由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第90位丝氨酸替换为苯丙氨酸、第92位苯丙氨酸替换为亮氨酸、第99位异亮氨酸替换为酪氨酸、第138位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第174位甘氨酸替换为丙氨酸后所形成的新氨基酸序列构成的羰基还原酶。
2.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸是编码如权利要求1所述羰基还原酶的核酸分子。
3.一种包含如权利要求2所述核酸的重组表达质粒。
4.一种包含如权利要求3所述重组表达质粒的重组表达转化体。
5.一种如权利要求1所述羰基还原酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：培养如权利要求4所述的重组表达转化体，从培养物中获得羰基还原酶。
6.一种如权利要求1所述羰基还原酶在催化N-叔丁氧羰基-羰基氮杂环化合物的不对称还原，生成高光学纯度的相应(S)-构型的N-叔丁氧羰基-羟基氮杂环化合物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的N-叔丁氧羰基-羰基氮杂环化合物的结构如下所示：
其中，I：N-Boc-3-羰基吡咯；II：N-Boc-2-羰基吡咯；III：N-Boc-3-羰基哌啶，Boc是叔丁氧羰基的缩写。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，直接使用表达所述羰基还原酶的重组菌株整细胞作为催化剂，催化N-叔丁氧羰基-羰基氮杂环化合物的不对称还原，生成高光学纯度的相应(S)-构型的N-叔丁氧羰基-羟基氮杂环化合物。
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