CN108374017B - 一种新型苯乙烯环氧化酶及其功能 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种来源于海洋微生物Marinobacterium litorale DSM 23545的新型苯乙烯环氧化酶基因及其在催化不对称环氧化中的应用。该酶可以催化共轭和非共轭的苯乙烯类衍生物生成对应的环氧化物，尤其对共轭的苯乙烯、肉桂醇和4‑乙烯基‑2，3‑二氢苯并呋喃具有较高的催化活性。

Description

一种新型苯乙烯环氧化酶及其功能
技术领域
本发明涉及一种新型苯乙烯环氧化酶MlSMO基因及其催化功能，该环氧化酶来源于一株海洋微生物Marinobacterium litorale DSM 23545，可利用其对共轭和非共轭苯乙烯类衍生物进行环氧化生物催化反应，属于应用微生物及酶工程领域。
背景技术
手性环氧化合物是有机合成、制药工业、香料工业的重要中间体，具有广泛的应用。传统环氧化合物的生产采用化学催化法。通常化学催化法存在许多不足，其反应条件苛刻，选择性低，副产物多，分离纯化困难，还会造成环境污染。
随着生物催化技术的发展，以环氧化酶生物催化获得环氧化合物成为关注的热点。近二十多年来，有许多关于环氧化酶的筛选和生物转化的文献报道。目前报道的苯乙烯环氧化酶主要来自假单胞菌属，也包括极少的红球菌属和宏基因组等。其中催化苯乙烯生成环氧化物的环氧化酶的基因为styA和styB，分别编码苯乙烯单加氧酶(SMO)和还原酶(Reductase)。这些菌株中，特别是来源于假单胞菌属的苯乙烯环氧化酶基因之间具有极高的相似性，催化活性也不是很理想。因此，筛选新的高活性苯乙烯环氧化酶基因，进一步发展其在不对称环氧化催化中的应用，具有重要意义。
我们知道海洋微生物在生态系统中发挥着许多重要的作用，同时是许多生物活性物质和一些重要蛋白的来源菌株。但是到目前为止，未见有来源于海洋微生物的苯乙烯环氧化酶报道。另一方面，随着测序技术的不断发展，为研究者提供了大量的基因组数据信息，通过基因组数据库挖掘的方法是高效寻找新型酶源的有效途径。
发明内容
本发明目的是公开一种来源于海洋微生物Marinobacterium litorale DSM23545的苯乙烯环氧化酶MlSMO的基因，并提供了该基因构建的重组菌用于催化不对称环氧化反应的方法。
本发明中，术语“苯乙烯环氧化酶”、“SMO”、“苯乙烯单加氧酶”可以互换使用。
本发明的环氧化酶MlSMO，其基因序列包括styA、styB以及两者之间的连接序列。其中，styA(1248bp，见SEQ ID No.1)和styB(516bp，见SEQ ID No.3)，分别编码苯乙烯单加氧酶(SMO，见SEQ ID No.4)和还原酶(Reductase，见序列SEQ ID No.5)；连接styA与styB之间的碱基长度为60bp(见SEQ ID No.2)。
本发明的环氧化酶MlSMO的新颖性：
本发明涉及的蛋白StyA和StyB与NCBI数据库中已报道序列的相似性见下表，从表中可以看出环氧化酶MlSMO在蛋白质水平上的相似度<70％，具有新颖性。
Figure BDA0001557223290000021
本发明的环氧化酶MlSMO是这样获得的：
环氧化酶MlSMO的获得是通过基因组数据库挖掘的方法获得的。首先我们以已报道的来源于Pseudomona sp.LQ26的StyA蛋白序列为参考序列在NCBI 数据库中进行BLAST搜索，得到数量较为庞大的序列，排除已经研究过的序列，同时根据酶来源菌株及序列相似度，最终我们筛选到了该序列(该蛋白的NCBI 登录号为：WP_027855270(StyA)和WP_051299263(StyB))，并根据蛋白序列进行了核苷酸密码子偏好性的优化，优化后的序列见SEQ ID No.1、SEQ ID No.2 和SEQ ID No.3。而后将该酶的基因由上海生工生物工程有限公司直接合成，并连接至pET28a(+)载体，上游限制性内切酶位点为BamH I，下游限制性内切酶位点为SacⅠ，获得的质粒命名为pET28-MlSMO。接着将质粒pET28-MlSMO 转入大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组表达菌E.coli(pET28-MlSMO)。
根据现有公共知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此，MlSMO表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等，表达宿主可以为大肠杆菌，毕赤酵母，链霉菌等。
苯乙烯环氧化酶的表达：
挑取重组子E.coli(pET28-MlSMO)单菌落，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中于37℃、180rpm培养12h作为种子培养基，以1％接种量接种于 TB培养基中，37℃振荡培养3h，而后降温至20℃诱导styAB基因表达，诱导 18～21h后，4℃冷冻离心，收获菌体。该菌体作为生物催化剂用于后续生物催化反应。重组质粒pET28-MlSMO表达StyA、StyB蛋白电泳图见附图1。
本发明还提供了MlSMO全细胞催化体系及该体系在针对不同底物的生物转化中的应用。
全细胞催化是将上述获得的重组菌E.coli(pET28-MlSMO)的湿菌体(静息细胞)作为生物催化剂，进行生物催化反应。
生物催化反应体系：反应体系为5mL，包括0.1M磷酸钾缓冲液(pH 6.5～8.0)， 1g湿菌体，1～10mM底物。对于疏水性底物，如苯乙烯，在全细胞催化体系中加入10％(V/V)环己烷。
本发明与已有技术相比具有如下优势：
本发明涉及的苯乙烯环氧化酶MlSMO与之前报道的来源于假单胞菌属的环氧化酶(PsSMO，NCBI登录号GU593979.1))相比，具有较高的活力，尤其是对苯乙烯、肉桂醇和4-乙烯基-2,3-二氢苯并呋喃，ee值均大于99％。其中催化4- 乙烯基-2,3-二氢苯并呋喃生成的(S)-2,3-二氢-4-环氧丙基苯并呋喃是合成褪黑激素受体作用剂的重要中间体，目前该化合物主要是通过环氧水解酶的动力学拆分得到。在该拆分过程中其收率45％，这也就意味着55％的底物不能被利用，虽然可以通过二醇的消旋过程提高底物的利用率，但是也增加了反应过程增加生产成本，因此利用苯乙烯环氧化酶MlSMO全细胞催化制备该化合物具有明显的优势。
附图说明
附图1重组质粒pET28-MlSMO表达StyA、StyB蛋白电泳图。
具体实施方式
以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。
实施例1MlSMO异源表达
将质粒pET28-MlSMO转入大肠杆菌BL21感受态后，提取单克隆接种于含有 50μg/mL卡那霉素的LB培养基于37℃、180rpm培养12h作为种子液，以1％接种率转接至新鲜TB培养基中(500mL容量摇瓶装液200mL培养基)，于37℃振荡培养3h，随后于20℃诱导18h后，以4000rpm、4℃冷冻离心10min收获菌体，再用0.1M磷酸钾缓冲液(pH 6.5)重悬洗涤两次，得到湿菌体。该湿菌体用作生物催化剂用于后续生物催化。
另外，可将湿菌体重悬于上述相同缓冲液中，以超声波破碎机破碎菌体后， SDS-PAGE查看MlSMO的表达情况。
实施例2苯乙烯环氧化酶全细胞生物催化条件优化
最适反应温度优化：取实施例1中新鲜培养的湿菌体1g，重悬于5mL磷酸钾缓冲液(0.1M、pH 6.5)，加入10％环己烷和5mg苯乙烯。分别在20℃、25℃、 30℃、35℃、40℃和45℃，200rpm震荡反应4h。反应完成后，等体积乙酸乙酯终止反应并萃取，加入适量无水硫酸钠干燥，旋蒸去除溶剂，以GC和HPLC 检测分析。结果如表-2所示，30℃时环氧产率最高。
表-2 MlSMO最适反应温度优化
Figure BDA0001557223290000041
最适反应pH值优化：取实施例1中新鲜培养的湿菌体1g，分别重悬于5mL 不同pH的0.1M磷酸钾缓冲液为(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)和0.05M的Tris-HCl 缓冲液加(7.5、8.0、8.5、9.0)，加入10％环己烷和7.5mg苯乙烯。在30℃、200rpm 震荡反应1h。反应完成后，等体积乙酸乙酯终止反应并萃取，加入适量无水硫酸钠干燥，旋蒸去除溶剂，以GC和HPLC检测分析。结果如表-3所示，在pH＝8.0、 0.1M磷酸钾缓冲液中环氧产率最高。
表-3 MlSMO最适反应pH优化
Figure BDA0001557223290000042
Figure BDA0001557223290000051
综上所述，以30℃，pH＝8.0为全细胞生物转化条件。
实施例3大肠肝菌重组菌全细胞催化体系进行生物转化
取实施例1中新鲜培养的湿菌体1g作为生物催化剂，以磷酸钾缓冲液(0.1M， pH8.0)重悬菌体，并加入5mM底物(底物谱如表-4所示)，最终转化体系为5mL。对于底物1a，则在全细胞催化体系中加入10％环己烷。该转化体系在30℃，200 rpm的振荡反应器中反应1h后，加入等体积乙酸乙酯终止反应并萃取，再加入适量无水硫酸钠干燥，旋蒸去除溶剂，以GC和HPLC检测分析。同时，我们以来源于假单胞菌属的环氧化酶(PsSMO，NCBI登录号GU593979.1)进行转化能力的比较。从表-5可以看出，两者对底物3a的转化能力相当。本发明公开的环氧化酶 MlSMO对底物4a和5a的对映体选择性更高，而对于底物1a、2a和6a，该酶的转化能力远远高于已报道的PsSMO。
表-4 底物谱
Figure BDA0001557223290000052
Figure BDA0001557223290000061
HPLC检测所用仪器：Shimadzu Prominence LC-20AD系统-PDA检测器。
非手性柱(ZORBAX Rx-SIL，Φ4.6mm×5μm×250mm，Agilent Co.)用于检测生物转化的转化率，手性柱用于检测生物转化的ee值，具体使用型号及条件见表-5。
表-5 全细胞生物转化HPLC分析结果
Figure BDA0001557223290000062
SEQ ID No.1
ATGAGCAAGCACATCGGTATTGTTGGTGCGGGTGCGGCGGGTCTGCACCTGGGTCTGTACCT GCGTCAGCACGACATCGATGTGACCATTTACACCGACCGTCGTCCGGAGGCGTATCAAGATAT CCGTCTGCTGAACACCGTTGCGCACCACAGCGTGACCATTGCGCGTGAGAGCGACATGGATG TTAACAAGTGGCCGGTGAACGAACACGGTTACTATGGCCACTACTATCACGTTGGCACCCCGA CCCCGCTGAACTTCTACGGTGACCTGCACCAGCCGAGCCGTGCGGTGGATTACCGTATCTATC TGCCGGAACTGATGAACGCGTTTACCGACAACGGTGGCAAAATCGTTTATGAGCAAATTGCG GCGGAGGACATGGAACAGCTGAGCGAACAATACGATCTGGTGGTTGTGTGCGCGGGCAAGT ATGCGTTCGGCGAGATGTTTGACACCCGTGAAGATGCGAGCCCGTTCAAAACCCCGCAGCGT GCGCTGTGCGTTGGTCTGTTTAAGGGCATCAAAGAGAGCCCGATTCGTGCGGTGACCATGAG CTTCAGCCCGGGTGCGGGCGAGCTGATCGAAATTCCGACCCTGAGCTTTGACGGCATGTGCA CCGCGCTGGTTCTGGAAAACCACATTGGTGGCGAGCTGGAAGTGCTGAGCACCACCCGTTAC GACGATAACCCGCGTGCGTTCCTGGATCTGCTGCTGGAGAAGCTGCACAAACACCACCCGAC CGTTGCGGAACGTATCGACCCGGAGGAATTTGATCTGGTGCGTGACAGCAACGATATTCTGCA GGGTCGTGTTACCCCGGTGTATCGTAAGGGTAGCGCGCGTCTGAGCAACGGCAAAAGCGTTG TGGCGCTGGGTGACATGCTGGCGACCGTTGATCCGGTGCTGGGTCAAGGTGCGAACATGGC GAGCCACGGTGCGCGTGTTCTGGGCGAGGAAATCGTTAGCAACGACGTGTTCGACGATCGTT TTATTGAGCACGTGGAACGTCGTCGTGAGGATCGTACCATCTGCGCGACCCGTTGGACCAACT ACATGCTGAAAAACCTGCAGGAGCTGCCGCCGGAATTCCAGCAATTTATTGGCACCCTGAGC CAAAGCCGTGCGATGGCGGACGAGTTCACCGATAACTTTAACTACCCGGAAAAGCAGTGGG ACTATTTCAGCAGCCCGGAGCGTCTGCTGGAATGGTGCCAGAAATATGCGCAAGGTATCGCG GCGTAA
SEQ ID No.2
GTCTACTTGTGGCCGTCCAGTTACGGGCGGCCTCAATCTTTTGATTATGAGGAGTCAACT
SEQ ID No.3
ATGACCGCGCAGGAGCTGAGCGTGAGCAAGGCGATCGACGATCAGAGCTTCCGTCAAGCGG TTAGCCTGTTTGCGACCGGTATCGGCGTGGTTAGCGCGGAGGAACAAGACGGTACCATTCAC GGCATGACCGTGAACAGCTTCACCAGCATCAGCCTGGACCCGCCGACCATTATGGTTAGCCTG AAGCCGGGTAAAATGCACCAGCTGATCACCGCGGGTCGTAAGTTTGGCGTGAGCATTCTGGG CGAGAACCACAAGGAATACAGCGCGTATTTCAGCAAACGTAACCTGGACGGTGCGCCGGCG CCGGAGTTTACCAAACGTTGCGAACTGGCGACCCTGAGCGATGCGATCGCGTGGTTCGAGTG CGAAGTGGACCAAAACGTGGAAGTTAGCGATCACACCCTGTTTATTGCGAAAGTGACCGCGT GCGGTCGTGTTGGCGAGGAAAACCACGCGCCGCTGCTGTTCTTTGCGAGCAAGTACCACCAC AAACCGTGCCCGGTTATTTAA
SEQ ID No.4
MSKHIGIVGAGAAGLHLGLYLRQHDIDVTIYTDRRPEAYQDIRLLNTVAHHS VTIARESDMDVNKWPVNEHGYYGHYYHVGTPTPLNFYGDLHQPSRAVDYRI YLPELMNAFTDNGGKIVYEQIAAEDMEQLSEQYDLVVVCAGKYAFGEMFDT REDASPFKTPQRALCVGLFKGIKESPIRAVTMSFSPGAGELIEIPTLSFDGMCTA LVLENHIGGELEVLSTTRYDDNPRAFLDLLLEKLHKHHPTVAERIDPEEFDLV RDSNDILQGRVTPVYRKGSARLSNGKSVVALGDMLATVDPVLGQGANMAS HGARVLGEEIVSNDVFDDRFIEHVERRREDRTICATRWTNYMLKNLQELPPEFQQFIGTLSQSRAMADEFTDNFNYPEKQWDYFSSPERLLEWCQKYAQGIAA
SEQ ID No.5
MTAQELSVSKAIDDQSFRQAVSLFATGIGVVSAEEQDGTIHGMTVNSFTSISL DPPTIMVSLKPGKMHQLITAGRKFGVSILGENHKEYSAYFSKRNLDGAPAPEF TKRCELATLSDAIAWFECEVDQNVEVSDHTLFIAKVTACGRVGEENHAPLLF FASKYHHKPCPVI 。
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
中国科学院成都生物研究所
中国科学院成都生物研究所
中国科学院成都生物研究所
中国科学院成都生物研究所
<120> 一种新型苯乙烯环氧化酶及其功能
<130> 应用微生物及酶工程领域应用微生物及酶工程领域应用微生物及酶工程领域应用微生物及酶工程领域应用微生物及酶工程领域
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1248
<212> DNA
<213> Marinobacterium litorale
<400> 1
atgagcaagc acatcggtat tgttggtgcg ggtgcggcgg gtctgcacct gggtctgtac 60
ctgcgtcagc acgacatcga tgtgaccatt tacaccgacc gtcgtccgga ggcgtatcaa 120
gatatccgtc tgctgaacac cgttgcgcac cacagcgtga ccattgcgcg tgagagcgac 180
atggatgtta acaagtggcc ggtgaacgaa cacggttact atggccacta ctatcacgtt 240
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<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> Marinobacterium litorale
<400> 1
gtctacttgt ggccgtccag ttacgggcgg cctcaatctt ttgattatga ggagtcaact 60
<210> 1
<211> 516
<212> DNA
<213> Marinobacterium litorale
<400> 1
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<210> 1
<211> 415
<212> PRT
<213> Marinobacterium litorale
<400> 1
Met Ser Lys His Ile Gly Ile Val Gly Ala Gly Ala Ala Gly Leu His
1 5 10 15
Leu Gly Leu Tyr Leu Arg Gln His Asp Ile Asp Val Thr Ile Tyr Thr
20 25 30
Asp Arg Arg Pro Glu Ala Tyr Gln Asp Ile Arg Leu Leu Asn Thr Val
35 40 45
Ala His His Ser Val Thr Ile Ala Arg Glu Ser Asp Met Asp Val Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Thr Pro Thr Pro Leu Asn Phe Tyr Gly Asp Leu His Gln Pro Ser
85 90 95
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100 105 110
Thr Asp Asn Gly Gly Lys Ile Val Tyr Glu Gln Ile Ala Ala Glu Asp
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195 200 205
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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<210> 1
<211> 171
<212> PRT
<213> Marinobacterium litorale
<400> 1
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Asn Leu Asp Gly Ala Pro Ala Pro Glu Phe Thr Lys Arg Cys Glu Leu
100 105 110
Ala Thr Leu Ser Asp Ala Ile Ala Trp Phe Glu Cys Glu Val Asp Gln
115 120 125
Asn Val Glu Val Ser Asp His Thr Leu Phe Ile Ala Lys Val Thr Ala
130 135 140
Cys Gly Arg Val Gly Glu Glu Asn His Ala Pro Leu Leu Phe Phe Ala
145 150 155 160
Ser Lys Tyr His His Lys Pro Cys Pro Val Ile
165 170

Claims (2)

1.一种苯乙烯环氧化酶基因，其特征是：由styA、styB以及两者之间的连接序列组成，其中styA的核苷酸长度为1248bp，序列如SEQ ID No.1所示，编码的苯乙烯单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；连接序列长度为60bp，序列如SEQ ID No.2所示；styB的核苷酸长度为516bp，序列如SEQ ID No.3所示，编码的还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
2.权利要求1所述的苯乙烯环氧化酶基因在催化1a～6a底物生成环氧化合物中的应用，所述的1a～6a底物如下所示：
Figure FDA0002852528360000011
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CN110592110B (zh) * 2019-07-17 2022-09-06 中国科学院成都生物研究所 一种来自链霉菌的(r)-选择性苯乙烯单加氧酶
CN111662887B (zh) * 2020-06-03 2023-07-25 中国科学院成都生物研究所 一种来自根瘤菌的苯乙烯环氧化酶及其功能

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001036654A1 (en) * 1999-11-18 2001-05-25 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Biocatalytic epoxidation of vinylaromatic compounds
CN102816774A (zh) * 2010-03-10 2012-12-12 中国科学院成都生物研究所 一种苯乙烯环氧化酶基因及其用途
CN107164342A (zh) * 2017-06-21 2017-09-15 江南大学 一种菜豆来源的环氧化物水解酶及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001036654A1 (en) * 1999-11-18 2001-05-25 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Biocatalytic epoxidation of vinylaromatic compounds
CN102816774A (zh) * 2010-03-10 2012-12-12 中国科学院成都生物研究所 一种苯乙烯环氧化酶基因及其用途
CN107164342A (zh) * 2017-06-21 2017-09-15 江南大学 一种菜豆来源的环氧化物水解酶及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Chimeric Styrene Monooxygenase with Increased Efficiency in Asymmetric Biocatalytic Epoxidation;Maria L.Corrado等;《ChemBioChem》;20180129;第679-686页，参见全文 *
Catalytic and hydrodynamic properties of styrene monooxygenases from Rhodococcus opacus 1CP are modulated by cofactor binding;Anika Riedel等;《AMB Express》;20150604;第1-11页，参见全文 *
flavin reductase [Marinobacterium litorale];登录号：WP_051299263.1;《GenBank》;20180111;参见序列及相关信息 *
monooxygenase [Marinobacterium litorale];登录号：WP_027855270.1;《GenBank》;20140612;参见序列及相关信息 *

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