CN111944774B

CN111944774B - 醇脱氢酶及其编码基因和在催化合成(r)-苯基乙二醇中的应用

Info

Publication number: CN111944774B
Application number: CN202010813435.3A
Authority: CN
Inventors: 李玮; 张红蕾; 杜洁; 张超; 韩孟楠; 王旭明; 傅双庆
Original assignee: Hebei University
Current assignee: Hebei University
Priority date: 2020-08-13
Filing date: 2020-08-13
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2040-08-13
Also published as: CN111944774A

Abstract

本发明提供了一种醇脱氢酶及其编码基因和在催化合成(R)‑苯基乙二醇中的应用，所述醇脱氢酶的氨基酸序列如序列表中的序列1所示，其基因序列如序列表中的序列2所示。醇脱氢酶基因mladh在催化合成(R)‑苯基乙二醇中的应用。将醇脱氢酶MLADH与甲酸脱氢酶FDH构建双酶偶联催化体系，在所述体系中，醇脱氢酶MLADH与甲酸脱氢酶FDH的酶活性比例为1∶5~10。本发明构建了醇脱氢酶MLADH与甲酸脱氢酶FDH的双酶耦合系统，实现了辅酶NADH的原位再生。本发明以磷酸缓冲盐为水相的体系中引入大豆油作为有机相，降低了底物和产物对催化反应的抑制，促进了催化转化的效率，转化率达到99%，e.e.值在99%以上。

Description

醇脱氢酶及其编码基因和在催化合成(R)-苯基乙二醇中的应用

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种醇脱氢酶及其编码基因和在催化合成(R)-苯基乙二醇中的应用。

背景技术

(R)-苯基乙二醇((R)-PED)是一种重要的手性模型化合物，可以用于合成β-内酰胺类抗生素、(R)-诺氟西汀、(R)-氟西汀、(R)-{N-1-[(3-甲巯基苯基)乙基]}-3-苯基-1-丙胺等等手性药物，用作治疗精神障碍、代谢紊乱和甲状旁腺功能亢进等疾病。另外，(R)-PED也可进一步制成(R)-扁桃酸，后者常被用于头孢菌素类抗生素羟苄四唑头孢菌素的侧链修饰剂。

(R)-PED的生产方法主要分为手性拆分法和不对称合成法。手性拆分法是指将外消旋体转化为单一对映体，拆分的方法较多，主要方法有：吸附拆分法，结晶拆分法，色谱分离拆分法，化学拆分法，萃取拆分法，动力学拆分法，膜技术拆分法。其中色谱分离拆分法采用手性色谱高效又快速地分析手性化合物，还可应用于对映体之间的纯度测定。但拆分法制备手性醇过程中，往往需要对羟基进行保护，难度大且易生成其他衍生物，生成光学纯的对映异构体的产率不会高于50％，因此，这种方法应用较少。不对称合成法是指将含有潜手性羰基化合物经过不对称加氢还原反应转化得到手性醇，主要分为化学合成法和生物催化法。其中，化学合成法是通过添加重金属手性催化剂来实现羰基化合物的还原。最初，日本的Noyori等人发现，手性Schiff碱与Cu²⁺络合后产物对于环丙烷有催化作用，对映选择性达到10％，自此后，越来越多的手性催化剂被人们挖掘利用。Letko等人以2-羟基苯乙酮(2-HAP)为反应原料，通过添加手性铱催化剂，得到了(R)-PED。但由于手性试剂的选择性低、成本高、三废排放等问题，因此手性试剂还原法不能称之为清洁生产工艺。相比之下，生物催化法具有显著优势，如：反应条件温和，环境友好；高立体选择性；反应速度快；反应集中成本较低等。因此，生物催化法已逐渐被国内外认可，成为合成手性醇的发展趋势，目前，也已经有许多成功的应用。Lee等人通过萘双氧化酶立体选择性氧化苯乙烯，成功制备出(R)-PED；Cui等用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)不对称催化2-HAP得到(R)-PED；Zhang等人以具有专一生成R型产物的羰基还原酶重组大肠杆菌为生物催化剂，成功得到了(R)-PED。

但是，应用生物酶催化的方式进行工业化生产还未见报道。生物催化法的底物转化率和产物的光学纯度仍具有较大的提升空间，其中寻找合适的生物催化剂就是一项重要因素。因此，筛选具有高底物转化率和高产物光学纯度的优良转化酶类对生物酶催化反应的进一步放大具有重要的实用价值和现实意义。

发明内容

本发明的目的就是提供一种醇脱氢酶及其编码基因和在催化合成(R)-苯基乙二醇中的应用，以解决现有化学合成法选择性低、成本高、三废排放以及现有生物催化法底物转化率和产物的光学纯度不理想的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种醇脱氢酶MLADH，其氨基酸序列如序列表中的序列1所示。

编码上述醇脱氢酶MLADH的基因mladh，其基因序列如序列表中的序列2所示。

所述的基因mladh在催化合成(R)-苯基乙二醇中的应用。

将醇脱氢酶基因mladh插入到载体pGEX4T-1中，并转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)/pGEX4T-1-mladh，利用重组大肠杆菌发酵表达重组蛋白MLADH，经纯化后得到目标醇脱氢酶MLADH，将醇脱氢酶MLADH应用于(R)-苯基乙二醇的催化合成。

将醇脱氢酶基因mladh编码得到的醇脱氢酶MLADH与甲酸脱氢酶FDH构建双酶偶联催化体系，在所述体系中，醇脱氢酶MLADH与甲酸脱氢酶FDH的酶活性比例为1∶5～10。

更进一步地，所述体系采用有机相/水相两相溶剂体系，其中，以大豆油或邻苯二甲酸二丁酯为有机相，以磷酸钾缓冲液为水相，有机相与水相的体积比为1∶1～4，在两相溶剂体系中，底物2-HAP的浓度为40～60g/L。

所述磷酸钾缓冲液的pH为7.0，磷酸钾缓冲液中含有0.5g/L甲酸钠和2mM NAD+。

更具体地，本发明的技术方案包括以下内容：

(1)利用基因组狩猎的策略寻找用于将羰基化合物还原为相应的手性醇所需的醇脱氢酶类。根据已报道的微杆菌菌株Microbacterium luticocti DSM 19459的基因组(GCF_000422405.1)注释的假定的脱氢酶/氧化还原酶类，进行了一系列引物的设计，并用引物对本实验保存的微杆菌基因组进行了同源扩增。扩增后，获得四种可能的醇脱氢酶基因片段并在大肠杆菌中表达。通过分析底物(α-羟基苯乙酮(2-HAP))的转化，发现其中一株具有转化底物活性的重组细菌。此外，对重组菌株的插入基因片段进行测序，并对测序获得的基因序列进行比对分析。

(2)将上述得到的醇脱氢酶基因插入到载体pGEX4T-1，并转化大肠杆菌细胞。筛选到阳性大肠杆菌BL21(DE3)/pGEX4T-1-mladh。该重组大肠杆菌发酵后，使用细胞分离和离心收获MLADH的粗酶。利用配备有GSTrap HP的亲和色谱系统进一步纯化粗酶。通过SDS-PAGE监测纯化的重组蛋白MLADH。并对纯酶的酶活及酶学性质进行研究，包括温度和pH对酶催化活性的影响。

(3)根据MLADH依赖于辅酶NADH的催化性质，研究并优化了双酶(MLADH和甲酸脱氢酶FDH)偶联催化体系。并对MLADH和FDH的比例进行了优化摸索，以提高催化体系的酶活性。

(4)此外，研究了双酶偶联的两相催化体系的建立。首先对两相体系中的有机相进行了选择。通过研究不同有机溶剂邻苯二甲酸二丁酯，癸酸乙酯，月桂酸乙酯，正庚烷，乙酸乙酯，正己醇，正己烷或大豆油对双酶系统催化活性的影响，确定最佳的有机相。其次，对有机相与水相的最佳比例分配进行了优化，以确定最佳的两相体系的有机相与水相比例。在优化好的两相体系下，又进一步对体系中底物2-HAP添加的初始浓度进行了选择。并在最佳双酶-两相催化转化条件下放大体系进行产物(R)-PED的生物转化和制备。

本发明的有益效果在于：从微杆菌的基因组中挖掘到新型的羰基还原酶基因mladh。将该基因与表达载体pGEX4T-1相连并转化大肠杆菌细胞，得到重组菌株E.coli/pGEX4T-1-mladh。利用GSTrap HP亲和层析柱，分离纯化重组蛋白MLADH。构建了醇脱氢酶MLADH与甲酸脱氢酶FDH的双酶耦合系统，实现了辅酶NADH的原位再生。对双酶耦合系统的催化体系进行了优化，结果显示在以磷酸缓冲盐为水相的体系中引入大豆油作为有机相，降低了底物和产物对催化反应的抑制，促进了催化转化的效率。该两相体系中，水和有机相最适体积比为3∶1，最适底物浓度为60g/L，转化率达到99％，e.e.值在99％以上。该两相体系显著地提高了不对称还原反应的效率。

附图说明

图1是纯化的MLADH的SDS-PAGE分析图。图中，M为marker，1为重组大肠杆菌E.coli/pGEX4T-1-mladh全细胞，无IPTG诱导，2为重组大肠杆菌E.coli/pGEX4T-1-mladh全细胞，由IPTG诱导，3为纯化后的MLADH。

图2是底物2-羟基苯乙酮转化的液相图。图中，a为2-HAP,(R)-PED,and(S)-PED的标准品，b为无MLADH的转化系统，c为含有MLADH的转化系统。

图3是温度和pH对纯酶MLADH的酶活性的影响结果图。

图4是MLADH-FDH双酶偶联催化体系中的MLADH与FDH的酶活性比例对转化率的影响结果图。

图5是两相体系中水相与有机相的体积比对转化率的影响结果图。

图6是两相体系中底物浓度对转化率的影响结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。本发明实施例中未提到的试验条件和操作均按本领域常规方法或制造商建议的条件进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1微杆菌醇脱氢酶的基因组挖掘及重组菌株的构建

使用Primer Premier软件(Premier5.5，Palo Alto，CA，USA)根据来自NCBI数据库中登录的微杆菌Microbacterium luticocti DSM 19459的基因组(GCF_000422405.1)推定的氧化还原酶序列进行引物设计(如表1所示)。

表1：引物序列

名称	序列(5′-3′)	名称	序列(5′-3′)
				F1	ATGACNMGNACNGCNYTNATHACNG	F7	ATGACNGGNGGNCARCCNCARTGGA
R1	NCKNCCNCKNGCNGCNGCNCKNACN	R7	NGCNARYTCNGCDATDATNGGRTGD
				F2	ATGGCNACNGAYWSNGCNYTNGAYG	F8	ATGACNMGNYTNGGNMGNWSNGAYY
R2	CCANSWNSWYTTNCKRTARTCYTTN	R8	RTCYTGNGCNGCRTCNSWNGCNCKN
				F3	ATGGCNGGNACNWSNGGNCAYGTNA	F9	ATGWSNMGNTTYACNGGNAARGTNG
R3	YTGNACNSWCCANCCNCCRTCNSWN	R9	RTGNGCNSWRTANCCNCCRTCNACN
				F4	ATGACNGAYGCNMGNAAYGAYGAYG	F10	ATGCCNTAYMGNGTNATHGTNACNG
R4	NGCNGGNGCRTCDATNCCDATNGTN	R10	RTGCATNACCATNCCNCCNGTNACR
				F5	ATGGCNATGMGNTGGACNGCNCCNG	F11	ATGCCNACNGCNYTNATHACNGGNG
R5	NGCNARNARNGCNACYTTNCCNCCN	R11	NCKNCCNCKNGCNGCNGCNCKNACN
				F6	ATGMGNGCNATGATHATGGAYGCNY	F12	ATGACNGCNGGNMGNGCNGCNATHG
R6	NGCNCKNCKNGGRTCDATCATNGTC	R12	RTANACDATNACNGGYTTNACNGTN

利用引物扩增推断的还原酶基因的DNA片段，然后纯化扩增的片段，并插入表达载体pGEX4T-1中。将得到的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞。利用构建的重组大肠杆菌的全细胞对底物2-羟基苯乙酮(2-HAP)进行转化，并选择有转化活性的还原酶。随后，通过DNA测序验证纯化的扩增产物和质粒。最后，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pGEX4T-1-mladh和编码醇脱氢酶MLADH的mladh基因。

利用配有GSTrap HP(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)的纯化器系统(

GE Healthcare)纯化重组蛋白MLADH。使用BCA蛋白质测定试剂盒(SangonBiotech(Shanghai)Co.，Ltd。)测定重组蛋白质的浓度。通过在酶标仪(Synergy HT；BioTek，Winooski，VT，USA)上测量340nm处NADH(NADPH)吸光度1min的变化来测定MLADH的活性。酶活检测的反应体系(0.1mL)包括0.1M KHPO 4缓冲液(pH 7.5)，2μMNADH(NADPH)，2μM 2-HAP和适当的酶。上述条件下，每分钟催化生成1μmmol的NADH的酶量计为1个酶活单位U。

另外，还研究了温度和pH对酶活性的影响。温度影响：将纯化后的还原酶放置于10-65℃的环境下恒温孵育1h，之后按照酶活测定的标准条件和体系进行剩余酶活测试。pH影响：将纯化后的还原酶放置于pH 4-pH 9的环境下保持24h，再按照酶活测定的标准条件和体系进行剩余酶活测试，结果如图3所示。

转化产物的液相色谱分析方法如下：

使用分析柱Agilent Extend C-18(4.6mm×250mm，5μm)和手性分离柱CHIRALOAKID(4.6mm×250mm，5μm)进行产物的分析。

分析柱液相条件：流动相A：含0.05％三氟乙酸水溶液，B：含0.05％三氟乙酸乙腈溶液，紫外检测波长215nm，进样量5μL，流速1mL/min，柱温25℃。梯度洗脱条件为0～10min(20％B)，10～11min(20％～90％B)，12％～16min(90％B)，17～18min(90％～35％B)，19～22min(35％B)。

手性分离柱液相条件：流动相A:含0.05％三氟乙酸水溶液，B：含0.05％三氟乙酸乙腈溶液，紫外检测波长210nm，进样量5uL，流速0.5mL/min，柱温25℃。梯度洗脱条件为0～11min(15％B)，11～13min(15％～40％B)，13％～23min(40％B)，23～24min(40％～90％B)，24～30min(90％B)，30～31min(90％～15％)。

结果表明：

成功发现具有转化底物功能的醇脱氢酶MLADH。对重组菌株的插入基因片段进行测序，获得了1089bp的基因片段，将其命名为mladh，基因序列如序列表的序列2所示。该基因含有编码363个氨基酸的开放阅读框，预测分子量为36.74kDa，氨基酸序列如序列表的序列1所示。在NCBI数据库中进行BLASTn比对，结果表明，目前还未有该相似序列的功能研究，因此，对该序列以及其编码酶类的研究具有一定的理论及应用价值。将上述得到的醇脱氢酶基因插入到载体pGEX4T-1中，并转化大肠杆菌细胞。通过GSTrap HP的亲和色谱系统进一步纯化得到纯酶(如图1所示)，图中显示MLADH是分子大小约为62kDa的单一条带，表现为其与GST标签(26kDa)相融合表达。酶活测定显示MLADH是辅酶(NADH)依赖型还原酶。当使用2-HAP作为底物时，它表现出180U mg^-1的酶性。转化产物(R)-PED的光学纯度为99.8％(如图2所示)。这是从微杆菌中分离的一种具有转化(R)-型产物的NADH依赖的醇脱氢酶。MLADH催化反应的最佳温度和pH分别为55℃和5.0(图3)，表明MLADH具有一定的耐热性和耐酸性。

实施例2双酶偶联催化体系的构建

来自近平滑念珠菌的重组蛋白FDH通过纯化系统(

GE Healthcare)纯化，亲和柱填充有预装的Ni Sepharose TM(HisTrap HP；GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)。通过测量340nm处吸光度的增加来测定甲酸脱氢酶FDH的活性。用于酶测定的反应混合物(0.1mL)包括0.1M甲酸钠，1mM NAD+，0.1M KHPO 4缓冲液(pH 7.5)和适当的酶。该酶的比活性为140U/mg。将纯化的MLADH和FDH(各100μL)加入到含有1.0g/L 2-HAP，1.0g/L甲酸钠和2mM NAD+的磷酸钾缓冲液反应系统(1mL)中。反应体系在37℃和200r/min下转化2h。反应完成后，将反应液离心，取100μL上清液溶解于900μL甲醇溶液中。最后，通过HPLC进行产物分析。

探索醇脱氢酶与甲酸脱氢酶的比例。在上述生物转化反应混合物中，加入纯化的MLADH和FDH，使酶活性比例为1∶0，1∶0.5，1∶1，1∶2，1∶5，1∶10和1∶20。基于双酶对2-HAP的不对称还原反应效率，确定醇脱氢酶与甲酸脱氢酶的最佳比例。

结果表明：

随着MLADH和FDH比例的增加，生物转化效率提高。当MLADH和FDH的比例达到1∶10时，生物转化率为98.2％(1.0g/L 2-HAP)(图4)。然而比例继续增加超过1∶10时，生物转化效率降低。因此，选择1∶10的MLADH与FDH的比例用于进一步的溶剂系统研究。

实施例3两相催化体系的优化

首先对双酶反应的两相催化系统进行了优化。反应混合物(10mL)由0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)组成，其中含有0.5g/L甲酸钠，2mM NAD+，两种酶(MLADH∶FDH＝1∶10)和有机溶剂(邻苯二甲酸二丁酯，癸酸乙酯，月桂酸乙酯，正庚烷，乙酸乙酯，正己醇，正己烷或大豆油)，2-HAP的浓度为5g/L，水相与有机相的比例为1∶1。将混合物在37℃下搅拌2h。分别对有机层取样100μL并溶解在900μL甲醇中。产物含量通过HPLC测定。另外，还使用不同的水相和有机相比例(1∶0，4∶1，3∶1，2.3∶1，1.5∶1和1∶1)分析双酶对2-HAP的生物转化。

其次对催化体系中底物2-HAP的最佳初始浓度进行了摸索。在上述水相/有机溶剂比例最优的条件下，在共催化反应体系中分别加入不同浓度的2-HAP(5.0g/L，10.0g/L，20g/L，40.0g/L，50.0g/L，60.0g/L和70.0g/L)作为底物，45℃、200r/min下进行转化，4h后取样于HPLC分析。

将上述优化的双酶偶联两相系统进行放大，用于大规模制备(R)-PED的摸索研究。将6g的2-HAP(44mmol)溶解在25mL的大豆油中。将该溶液加入到75mL的pH7.0的0.1M磷酸钾缓冲液中，该缓冲液由双酶(174mg MLADH，FDH 3g)和1g甲酸钠组成。将反应液在37℃下振荡培养2h。在反应完成后，将有机相作为样品用于HPLC分析，通过比较还原产物与相应的参考手性醇来确定底物的转化率，醇的产率和光学纯度。

结果表明：

通过选取一系列不同LogP值(标准水/正辛醇体系中的分配系数的对数值)的有机溶剂对底物2-HAP进行了不对称还原转化分析，转化情况结果如表2所示。

表2：催化体系中有机溶剂的选择

有机溶剂	LogP值	转化率(％)
			无	-	46.7±1.0
大豆油	>6	78.8±0.8
			邻苯二甲酸二丁酯	5.4	71.3±1.4
癸酸乙酯	4.9	45.9±1.3
			月桂酸乙酯	5.7	47.3±1.1
正庚烷	4.0	42.9±1.0
			乙酸乙酯	0.7	8.4±0.5
正己醇	1.8	39.6±0.7
			正己烷	3.9	46.3±1.2

从表中可以看出，当添加LogP＜2的有机溶剂作为有机相时转化率较低，易引起生物催化剂失活，不适于生物催化反应体系；LogP＞4的有机溶剂作为有机相时转化率较高，对生物催化剂影响较小。其中大豆油作为有机相时转化率达到78.8％，较其它有机溶剂都高，因此，本研究选择大豆油作为两相体系中最佳有机溶剂，用于下一步的研究。

在有机溶剂/水的两相体系中，由于底物在两相之间存在分配比而使其在水相中的浓度较低而影响了反应速率。因此，我们对水相/有机相的分配比例进行了研究，来改善反应的进行。当底物浓度为5.0g/L时，设置了水相/有机相的体积比从1∶0到1∶1的一系列比例，结果如图5所示。水相/有机相的不同体积比对反应转化率有显著影响，当随着有机相比例的增大，2-HAP的转化率也升高，水相/有机相体积比为3∶1时，达到最大转化率86.9％。水相/有机相体积比例继续减小，转化率又呈现出下降的趋势。最终，我们选择水相/有机相体积比为3∶1为最佳两相体系分配比例进行反应。

将双酶在上述优化所得的水相/大豆油的两相体系下的催化活性与现有报道的其它两相体系下的催化活性做了对比，结果如表3所示。

表3：与现有报道两相体系的对比情况

结果显示双酶在水相/大豆油比例为3∶1时较其它水相/有机相的两相体系的酶催化活性要高。并且鉴于大豆油是一种无毒，可生物降解和可再生的有机溶剂，将使未来的工业生产更加清洁化和绿色化。

最后，在上述最优两相体系下的底物浓度优化结果如下，当底物2-HAP的初始浓度为5.0g/L时，双酶系统的生物转化率为86.7％。随着底物浓度增加，生物转化增加。当底物浓度达到60.0g/L时，生物转化达到最大值99.0％(图6)。随着底物浓度进一步增加，转化率降低。底物浓度为70.0g/L时，生物转化率仅为61.6％。因此，对于(R)-PED生产，2-HAP的最佳初始浓度设定为60.0g/L。在上述确定的最佳催化条件的基础上，检测了(R)-PED放大体系的生物转化和制备。将生物转化按比例放大，并在系统(100mL)中转化6.0g的2-HAP，转化完毕，提取产物，经分析得到所需产物(R)-PED，产率为98.7％，e.e.值为99.8％。由此，建立的双酶偶联的两相催化体系可以在放大体系下完成2-HAP向(R)-PED的高效转化，为该工艺的产业化应用提供了理论基础。

序列表

<120> 醇脱氢酶及其编码基因和在催化合成(R)-苯基乙二醇中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 362

<212> PRT

<213> 微杆菌(Microbacterium luticocti)

<400> 1

Met Gly Thr Val Leu Ile Arg Pro Pro Gly His Arg Arg Asp Val Ala

1 5 10 15

Leu Arg Pro Ala Ala Thr Ala Met Val Trp Ile Gly Glu Gly His Pro

20 25 30

His Glu Thr Ile Ala Val Pro Gly Val Ala Leu Gly Asp Arg Asp Val

35 40 45

Leu Val Ala Val Glu Met Ser Thr Ile Cys Gly Ser Asp Val His Thr

50 55 60

Val Gln Gly Arg Arg Ser Ala Pro Ala Pro Leu Val Leu Gly His Glu

65 70 75 80

Ser Val Gly Arg Val Ile Ala Leu Gly Asp Asp Gly Ala Thr Ala Val

85 90 95

Asp Gly Thr Pro Leu Arg Ile Gly Asp Arg Val Val Trp Ser Val Thr

100 105 110

Val Ser Cys Gly Thr Cys Asp Arg Cys Arg Arg Gly Leu Thr Gln Lys

115 120 125

Cys Arg Asp Leu Gly Lys Tyr Gly His Asp Arg Val Gly Ala His Gly

130 135 140

Asp Leu Thr Gly Ala Phe Ala Ser His Val Gln Leu Arg Ala Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ile Val Arg Val Pro Glu Ala Leu Pro Ala Ala Val Leu Ala Pro

165 170 175

Ala Gly Cys Ala Thr Ala Thr Ala Trp Ala Ala Val Ala Arg Ala Ala

180 185 190

Arg Asp Ile Asp Leu Asp Gly Ala Ala Val Arg Ile His Gly Ala Gly

195 200 205

Leu Val Gly Ile Ser Ala Ala Ala Ile Ala Ala Glu His Gly Ala Val

210 215 220

Val Glu Val Arg Asp Pro Asp Asp Asp Arg Arg Ala Val Ala Ser Arg

225 230 235 240

Phe Gly Ala Thr Ala Leu Asp Arg Asp Pro Asp Val Val Ile Glu Ala

245 250 255

Ser Gly His Ala Val Gly Glu Ala Leu Ala Gly Val Ala Val Gly Gly

260 265 270

Thr Val Val Leu Val Gly Ser Val Phe Pro Ala Ala Pro Val Pro Leu

275 280 285

Asp Ala Glu Asp Leu Val Arg Arg Leu Val Thr Val Thr Gly Val His

290 295 300

Asn Tyr Gly Ala Asp Asp Leu Ala Ala Ala Val Ser Phe Leu Ala Gly

305 310 315 320

Arg Gly Arg Ala Tyr Pro Phe Ala Glu Ala Val Gly Ala Val Arg Pro

325 330 335

Leu Leu Asp Ile Asp Ala Ala Leu Thr Glu Ala Ala Ala Pro Gly Ala

340 345 350

Pro Leu Arg Val Gly Leu Val Pro Gly Arg

355 360

<210> 2

<211> 1089

<212> DNA

<213> 微杆菌(Microbacterium luticocti)

<400> 2

atgggtacgg tgctgatccg cccacccggt caccggaggg acgtcgcgct gcgccccgca 60

gccaccgcga tggtctggat cggcgaaggc cacccgcacg agaccatcgc cgtccccggc 120

gtcgcgctcg gtgaccggga cgtgctcgtc gccgtggaga tgtcgacgat ctgcggatcg 180

gacgtgcaca ccgtgcaggg gcgccggtcc gcgcccgcgc ctctcgtcct cgggcatgag 240

agcgtcggtc gggtcatcgc gctgggcgac gacggtgcga cggcggtgga cggcaccccg 300

ctgcgcatcg gcgaccgcgt ggtgtggtcg gtcacggtgt cgtgcggcac ctgcgaccga 360

tgtcggcggg gcctcacgca gaagtgccgg gatctcggca agtacggcca cgaccgcgtc 420

ggcgcccacg gcgacctgac cggggcgttc gccagtcacg tgcagctgcg ggcaggtacc 480

gccatcgtgc gcgtgccgga ggcgctgccg gccgcggtgc tggctcccgc aggctgtgct 540

acggcgaccg catgggccgc cgtggcgagg gccgcccgcg acatcgatct ggacggcgcc 600

gcggtgcgca tccacggcgc gggattggtg gggatcagcg ccgcggcgat cgcggccgag 660

cacggcgccg tcgtcgaggt ccgggacccg gacgacgacc gccgagccgt cgcctcccga 720

ttcggagcca ccgcgctcga ccgtgacccg gacgtggtca tcgaggcatc cgggcatgcg 780

gtgggggagg ccctcgccgg cgtcgccgtc ggcggcacgg tcgtcctcgt cgggagcgtg 840

ttcccggcgg cgcccgtccc gctggacgcg gaggatctcg tccgccggct ggtcacggtc 900

accggcgtcc acaactacgg cgccgacgac ctcgcggcag cggtgtcgtt cctcgcgggt 960

cgcgggcgcg cgtatccgtt cgccgaggcc gtaggcgccg tgcgaccgct gctcgacatc 1020

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Claims

1.编码醇脱氢酶MLADH的基因mladh在催化底物2-羟基苯乙酮（2-HAP）合成(R)-苯基乙二醇中的应用，所述醇脱氢酶MLADH的氨基酸序列如序列表中的序列1所示，所述基因mladh的序列如序列表中的序列2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，将醇脱氢酶基因mladh插入到载体pGEX4T-1中，并转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞，得到重组大肠杆菌BL21（DE3）/ pGEX4T-1-mladh，利用重组大肠杆菌发酵表达重组蛋白MLADH，经纯化后得到目标醇脱氢酶MLADH，将醇脱氢酶MLADH应用于(R)-苯基乙二醇的催化合成。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是，将醇脱氢酶基因mladh编码得到的醇脱氢酶MLADH与甲酸脱氢酶FDH构建双酶偶联催化体系，在所述体系中，醇脱氢酶MLADH与甲酸脱氢酶FDH的酶活性比例为1∶5~10。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述体系采用有机相/水相两相溶剂体系，其中，以大豆油或邻苯二甲酸二丁酯为有机相，以磷酸钾缓冲液为水相，有机相与水相的体积比为1∶1~4，在两相溶剂体系中，底物2-HAP的浓度为40~60g/L。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是，所述磷酸钾缓冲液的pH为7.0，磷酸钾缓冲液中含有0.5g / L甲酸钠和2mM NAD⁺。