CN113846069B - 一种苯丙胺脱氢酶突变体及在手性胺合成中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)来源的苯丙胺脱氢酶突变体及其编码基因和氨基酸序列，以及利用该酶催化大位阻羰基化合物与氨还原胺化制备相应手性胺的方法。本发明所开发的胺脱氢酶突变体，可以催化目前已报道的该类酶难以还原胺化的大位阻芳香酮、烷基酮、杂环酮及官能化酮等羰基化合物。本发明所开发的胺脱氢酶催化酮与氨不对称还原胺化合成手性胺的方法，与其它制备方法相比，所使用的氨基供体为廉价的氨水，替代了相对比较昂贵的有机胺，且反应中产生的副产物只有水，因此具有原子经济性高、产品光学纯度高、反应条件温和、环境友好、产品后处理简易等优势，在手性伯胺的合成中表现出良好的应用前景。

Description

一种苯丙胺脱氢酶突变体及在手性胺合成中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种苯丙胺脱氢酶突变体及在手性胺合成中的应用。
背景技术
手性胺广泛存在于天然活性分子中，也是许多药物、天然活性分子、精细化学品等的合成前体。特别在药物合成中，约40％的化药都含有一个或多个手性胺的结构砌块，这类手性药物涉及抗炎药、抗阿尔茨海默病药、抗抑郁剂、抗艾滋病药等，在医药领域占据着十分重要地位。由于手性胺结构在药物分子合成中的重要性和巨大价值，其合成技术的开发已成为新药研究的热点(Chem.Rev.2003,103,2985-3012)。
手性胺传统的化学合成方法主要为外消旋胺拆分法和不对称合成法。然而外消旋体拆分方法的产品理论得率仅为50％，存在产品收率低的缺陷。而酮不对称还原胺化、亚胺不对称氢化和不对称氢胺化等其它不对称化学合成方法普遍存在反应条件苛刻、重金属催化剂有毒有害、保护和脱保护过程复杂，产物光学纯度低等问题。
相比于化学法，生物催化法具有反应条件温和、立体选择性高和环境友好等优点，已广泛用于医药中间体、精细化学品等手性化学品的工业生产中。目前，多种生物催化剂已被成功应用于手性胺的合成，包括水解酶、转氨酶、胺氧化酶、亚胺还原酶、还原胺化酶、氨裂合酶、细胞色素P450和胺脱氢酶等。其中，胺脱氢酶催化的酮与氨不对称还原胺化合成手性胺的方法，不仅所使用的氨基供体为廉价的氨水，而且反应中只产生水作为副产物，因此具有原子经济性高、产品光学纯度高、反应条件温和、环境友好、产品后处理简易等优势，在各类手性胺的合成中表现出良好的应用前景。
2012年，美国佐治亚理工学院的Bommarius课题组首次通过蛋白质工程技术将天然存在的亮氨酸脱氢酶进化为人工胺脱氢酶(Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,3969-3972)。此后，胺脱氢酶的应用开发开始受到了工业界和学术界的广泛关注。近年来，许多研究者已经报道了各种来源的胺脱氢酶。例如，Bommarius和Li进行了底物谱拓展的改造，创制的胺脱氢酶底物谱可拓展至苄基丙酮，但其催化活力极低(Adv.Synth.Catal.2013,355，1780-1786；ACS Catal.2015,5,1119-1122)，无法满足实际应用的需求。Mutti后续探究了各种已报道胺脱氢酶的底物谱，对许多位阻较小的芳香和脂肪酮有较好的反应效率，转化率高达>99％，ee>99％(Green Chem.2017,19,453-463)。
Schell课题组通过开发铵盐缓冲液/乙酸异戊酯两相介质反应体系，解决了高浓度酮底物对胺脱氢酶抑制的问题，成功实现了400mM苯氧基丙酮到(R)-1-苯氧基-2-丙胺的高效转化，底物转化率高达96％，产物光学纯度>99％(ACS Catal.2017,7,3204-3209)。近期，Mutti也考察了已报道胺脱氢酶催化羰基与有机胺供体的还原胺化反应，但其催化底物的转化率与立体选择性均较低，不能用于手性仲胺的高效合成(ChemBioChem,2019,20,800-812)。近期，Carine Vergne-Vaxelaire课题组报道了一种新型天然胺脱氢酶，也可实现对许多天然酮或者酮酸化合物的还原胺化(Nat.Catal.2019,2,324)。
目前为止，虽然已报道了10余种天然和工程的胺脱氢酶，但都难以催化大位阻芳香族与脂肪族酮类化合物与氨分子的不对称还原胺化，限制了它们在大位阻手性胺合成中的应用。因此，仍需进一步开发针对大位阻酮类化合物具有高还原胺化活性的胺脱氢酶，来丰富手性胺医药中间体的种类。
发明内容
针对现有胺脱氢酶不能催化大位阻羰基底物的问题，本发明提供一种苯丙胺脱氢酶突变体及在手性胺合成中的应用。
本发明主要通过对酶结构的半理性设计，提供几种对大位阻底物催化性能明显提升的胺脱氢酶突变体，解决其应用范围较窄的问题，拓展其在大位阻医药手性胺中间体合成中的应用范围。
具体而言，本发明涉及一种嗜热地芽孢杆菌来源(Geobacillus kaustophilus)的苯丙胺脱氢酶突变体及其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组胺脱氢酶或重组表达转化体催化羰基化合物与氨分子不对称还原胺化制备手性胺的应用，该生物催化剂能够高效催化已报道胺脱氢酶所不能催化的大位阻羰基化合物，在大位阻手性胺的合成中显示出良好的应用前景。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案之一，获得对大位阻羰基化合物具有催化活性的胺脱氢酶突变体。
具体而言，苯丙胺脱氢酶GkAmDH的突变体，为：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸和第309位缬氨酸替换为甘氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸和第310位丙氨酸替换为甘氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸、第309位缬氨酸替换为丙氨酸和第310位丙氨酸替换为甘氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸、第309位缬氨酸替换为丙氨酸、第310位丙氨酸替换为甘氨酸、第156位丝氨酸替换为苏氨酸、第308位谷氨酰胺替换为丙氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸、第309位缬氨酸替换为丙氨酸、第310位丙氨酸替换为甘氨酸、第156位丝氨酸替换为苏氨酸、第308位谷氨酰胺替换为丙氨酸、第79位半胱氨酸替换为天冬酰胺和第86位苯丙氨酸替换为甲硫氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
较优的为：对Geobacillus kaustophilus来源的苯丙胺脱氢酶GkAmDH进行定点突变，将144位的缬氨酸变为丙氨酸，将309位的缬氨酸变为丙氨酸，将310位的丙氨酸变为甘氨酸，获得苯丙胺脱氢酶突变体，命名为GkAmDH M6，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.6所示，以及将苯丙胺脱氢酶GkAmDH如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸、第309位缬氨酸替换为丙氨酸、第310位丙氨酸替换为甘氨酸、第156位丝氨酸替换为苏氨酸、第308位谷氨酰胺替换为丙氨酸、第79位半胱氨酸替换为天冬酰胺和第86位苯丙氨酸替换为甲硫氨酸所形成的苯丙胺脱氢酶突变体，命名为GkAmDH M8，其新氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
本发明还提供编码上述胺脱氢酶突变体的核酸。
本发明还提供包含所述核酸序列的重组表达载体。
本发明还提供了包含本发明所述胺脱氢酶突变体基因或其重组表达载体的重组表达转化体。可通过将构建的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表达转化体。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白质即可。本发明首选大肠杆菌作为宿主细胞，优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)用于高效表达本发明所述的胺脱氢酶突变体。
本发明还提供所述胺脱氢酶突变体的制备方法，其步骤包括：培养所述重组表达转化体，分离表达的胺脱氢酶突变体。
具体地，本发明提供了一种胺脱氢酶突变体的制备方法，制备方法为以下任意一种：
(1)培养所述重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞；
(2)培养所述重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的粗酶液；
(3)培养所述重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的粗酶液，干燥所制备的粗酶粉或纯化所制备的纯酶。
本发明还提供重组胺脱氢酶突变体催化剂，所述的重组胺脱氢酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：
(1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞；
(2)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的粗酶液；
(3)将所述胺脱氢酶突变体的粗酶液冷冻干燥得到的粗酶粉；
(4)将所述胺脱氢酶突变体纯化得到的纯酶。
其中所述重组表达转化体的培养方法和条件为本领域常规的方法和条件。
例如提供了以下可行的技术方案，包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组胺脱氢酶。对于重组大肠杆菌，优选培养基为TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，KH2PO4 2.3g/L，K2HPO4 12.5g/L，pH 6.5-7.0。优选的培养方法为：将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素的培养基中，于37℃、180rpm振荡培养过夜。按1-2％(v/v)的接种量接入装有100mL TB培养基(含卡那霉素)的三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床中振荡培养，当培养液的OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16-25℃诱导16-24h后，将培养液离心，收集菌体，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获得含有所述胺脱氢酶突变体的冻干细胞。将收获的重组细胞悬浮于5-10倍体积(v/w)的缓冲液中，进行超声破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组胺脱氢酶突变体的粗酶液。收集的粗酶液放置在-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机冷冻干燥，即可得到冻干酶粉。将所获得的冻干酶粉保存在4℃冰箱内备用。
本发明中所述胺脱氢酶突变体的活力测定方法：将含10mmol/L苄基丙酮(或其他酮类化合物)和0.1mmol/L NADH的1mL氨水/氯化铵(5M，pH 9.0)反应体系预热至30℃，然后加入适量的胺脱氢酶突变体，30℃保温反应，使用分光光度计在340nm处测量NADH在1分钟内的吸光度变化。用下式计算酶活力：酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×l)。
式中，EW为1分钟内NADH在340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为mL；6220为NADH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。单位酶活力(U)定义为上述条件下每分钟催化氧化1μmol NADH所需的酶量。
本发明还提供了所述重组胺脱氢酶突变体或胺脱氢酶突变体催化剂催化羰基化合物不对称还原胺化制备相应手性胺的方法。
进一步地，所述重组胺脱氢酶突变体或胺脱氢酶突变体催化剂催化潜手性羰基化合物与氨分子(例如氨水)的不对称还原胺化，制备各种手性胺化合物，即相应的(R)-构型手性仲胺产物的方法。
进一步地，所述胺脱氢酶突变体催化羰基化合物不对称还原胺化反应在甲酸脱氢酶、辅底物和辅酶的存在下进行。
进一步地，所述辅底物是甲酸或甲酸铵，所述辅酶是NADH或NAD+。
进一步地，所述的潜手性羰基化合物包括但不限于如下化合物：
Figure BDA0003326377790000071
本发明中所述重组胺脱氢酶突变体或胺脱氢酶突变体催化剂催化潜手性羰基化合物为大位阻羰基化合物。因此，本发明解决了现有胺脱氢酶不能催化大位阻羰基底物的问题。
胺脱氢酶突变体催化剂可以催化酮化合物的不对称还原，生成相应的手性胺产物。在所述应用中，潜手性羰基化合物的浓度为10～500mmol/L，所述胺脱氢酶的用量可选用为0.5～50U/mmol潜手性羰基化合物。反应液中NADH或NAD+的用量为0.1～0.5mmol/L。反应过程中可利用甲酸盐作为辅底物，通过甲酸脱氢酶催化甲酸根离子的氧化反应实现反应体系中昂贵辅酶NADH的循环再生，所述甲酸脱氢酶的用量为1～200U/mmol潜手性羰基化合物，所述甲酸盐的用量为潜手性羰基化合物摩尔浓度的1～50倍。不对称还原过程中所需的氨水/甲酸铵缓冲液(但不限于氨水/甲酸铵缓冲液)为本领域常规缓冲液，其浓度为1-5mol/L。所述的不对称还原反应是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度为30～50℃，优选40℃。所述的不对称还原反应的时间以底物完全转化或反应自行终止的时间为准，优选反应时间小于24h。
还原胺化反应结束后，采用常规方法对反应液中的产物胺进行分离提取。优选分离提取过程是在反应液中加入强碱，如氢氧化钠将反应液pH调节至强碱性，然后用二氯甲烷进行萃取，保留有机相溶液，再加入强酸，如稀盐酸将反应液pH调节至强酸性，然后用二氯甲烷进行萃取，保留水相后继续加入强碱如氢氧化钠pH至12，继续用二氯甲烷萃取，对萃取液进行浓缩除去溶剂，获得胺产物粗产品。将胺的粗产品进行多次酸碱萃取，然后对最终含有产物的有机相进行干燥、浓缩，纯化即获得目标胺纯品。
与现有技术相比，本发明的创新和改进效果在于：
本发明提供了一种催化性能更好的胺脱氢酶突变体，可高效催化各类大位阻芳香酮、烷基酮、杂环酮及官能化酮化合物的不对称还原胺化，制备大于99％光学纯的手性胺类化合物。所述的胺类化合物由于可作为许多药物的手性合成砌块，在市场上具有广泛的应用价值。所述的胺脱氢酶能够催化浓度高达200mM苄基丙酮的底物转化，在甲酸脱氢酶进行辅酶循环的基础上，实现99％以上的转化率和99％以上的对映体过量值。综上，本发明所开发的胺脱氢酶突变体具有催化活性高、可耐受底物浓度高、产物光学纯度高、无其它副产物的优点，因此具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1为重组胺脱氢酶突变体或胺脱氢酶突变体催化剂催化潜手性羰基化合物与氨分子的不对称还原胺化制备各种手性胺化合物的原理示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照商品说明书。
下列实施例中的材料来源为：
重组GkAmDH质粒是由我们实验室前期构建的。E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Prime Star、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。限制性内切酶Nco I和Hind III均为Takara公司的市售产品。
实施例1苯丙胺脱氢酶GkAmDH突变体的构建
以重组质粒GkAmDH为母本，对拟突变位点分别设计引物，上下游引物序列如表格中所示。
苯丙胺脱氢酶GkAmDH的基因序列如SEQ ID No.1所示。
引物纯化方式为PAGE，引物结构为：上游引物：突变位点前15-20个碱基+突变碱基+突变位点后15-20个碱基；下游引物：整个上游引物的反向互补序列；引物置于-20℃长期保存。PCR体系包含10μL PrimeSTAR HS,各1μL的上下游引物(10ng/μL)，1μL重组质粒(100ng/μl)，0.5μL DMSO和6.5μLddH2O。PCR扩增程序如下：在98℃下预变性10秒，然后进行20次如下循环：98℃变性10秒，65℃退火10秒，72℃延伸7分钟；最后在72℃下再延伸7分钟。PCR产物消化：消化体系如下：扩增片段15μL，CutSmart 1μL，DpnI 1μL，混合均匀后置于37℃恒温培养箱消化2-4h，即得到苯丙胺脱氢酶GkAmDH突变体质粒。将目的片段GkAmDH和pET28a质粒进行酶切并用T4连接酶进行连接。
表1 GkAmDH突变体构建所使用的引物
Figure BDA0003326377790000091
Figure BDA0003326377790000101
Figure BDA0003326377790000111
通过突变体组合，获得系列苯丙胺脱氢酶GkAmDH的突变体，包括：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，命名为GkAmDH M3；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸和第309位缬氨酸替换为甘氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，命名为GkAmDH M4；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸和第310位丙氨酸替换为甘氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，命名为GkAmDH M5；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸、第309位缬氨酸替换为丙氨酸和第310位丙氨酸替换为甘氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，命名为GkAmDH M6；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸、第309位缬氨酸替换为丙氨酸、第310位丙氨酸替换为甘氨酸、第156位丝氨酸替换为苏氨酸、第308位谷氨酰胺替换为丙氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，命名为GkAmDH M7；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸、第309位缬氨酸替换为丙氨酸、第310位丙氨酸替换为甘氨酸、第156位丝氨酸替换为苏氨酸、第308位谷氨酰胺替换为丙氨酸、第79位半胱氨酸替换为天冬酰胺和第86位苯丙氨酸替换为甲硫氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，命名为GkAmDH M8。
实施例2苯丙胺脱氢酶GkAmDH突变重组表达转化体的构建
将实施例1中PCR扩增所得含苯丙胺脱氢酶突变体的目的片段的重组质粒连接液转化至E.coli BL21，挑取阳性克隆，即获得系列重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-GkAmDH M3～8，通过基因序列测定证实了目的基因的正确性。
实施例3苯丙胺脱氢酶GkAmDH突变体的制备
将实施例2中所得的重组表达转化体接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃摇床中培养12小时，然后以1％(v/v)的接种量接种至装有100mL TB培养基的摇瓶中，放入37℃和180rpm摇床中培养，当培养液的OD600达到0.6-0.8左右时，加入终浓度为0.2mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，于16℃下诱导培养24小时。培养结束后，将培养液在8000rpm转速下离心收集细胞。将收集的细胞用10mL的Tris-HCl缓冲液(100mM,pH8.0)重新悬浮，并在冰水浴中进行如下超声处理：400W功率，工作4s，间歇6s，99个循环。破碎液在4℃下和10,000rpm转速下离心20分钟去除细胞碎片，上清液通过冻干干燥制备出相应的突变体酶粉，用于羰基化合物的还原胺化反应。
实施例4-43GkAmDH突变体催化大位阻酮还原胺化制备手性胺
重组胺脱氢酶突变体或胺脱氢酶突变体催化剂催化潜手性羰基化合物与氨分子的不对称还原胺化制备各种手性胺化合物的原理示意图如图1所示。
在10mL反应体系中加入50mg的胺脱氢酶冻干酶粉，50mg甲酸脱氢酶冻干酶粉，0.5mmol的酮类底物，1mM NAD+和相应的氨水/甲酸铵缓冲液(5M,pH 9.0)。反应液置于40℃下搅拌反应12-72小时。反应结束后，用10M的NaOH终止反应，用等体积二氯甲烷萃取3次，萃取液用无水硫酸钠干燥，通过气相色谱分析，转化率均为99％。将产物乙酰化或Marfey试剂衍生化后，通过气相色谱和液相色谱分析，测得产物均为R-构型，光学纯度均大于99％ee，如表2所示。
表2 GkAmDH及其突变体催化的还原胺化反应结果
Figure BDA0003326377790000121
Figure BDA0003326377790000131
/>
Figure BDA0003326377790000141
/>
Figure BDA0003326377790000151
实施例44手性胺药物中间体的酶促规模制备
在100mL的反应体系中，加入1g胺脱氢酶GkAmDH M8冻干酶粉，0.5g甲酸脱氢酶冻干酶粉，20mmol酮底物S3，1mM NAD+和相应的氨水/甲酸铵缓冲液(5M,pH 9.0)，在40℃下反应12-72小时。通过气相色谱监测反应进程，当底物转化率为99％时，用10M的NaOH终止反应，用二氯甲烷(3×10mL)萃取反应液，其中乳化层可离心分离，将萃取液用0.2M盐酸溶液萃取产物形成铵盐溶液并分离水相，调节水溶液pH至12以上，再用二氯甲烷(3×10mL)萃取，将有机相用Na2SO4干燥后减压蒸馏得到相应的手性胺产物。2.5克的Dilevalol手性胺中间体P3以85％的得率被分离得到，产物的光学纯度高于99％以上。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 一种苯丙胺脱氢酶突变体及在手性胺合成中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> 嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)
<400> 1
atgaatgtca tgctatcgcc aaacatgtca caaagattgg atttgttttt ccaaatgcgt 60
gaacatgaac aggtggtgtt ttgtctcgat gaagcgaccg gcctaagggc gatcatcgcc 120
attcatagca cggctcttgg gccggcgctc ggcggctgtc ggatgcatcc gtatgccacg 180
acggaagagg cgctcgccga tgcgcttcgg ctgtcgaaag ggatgacgta tagctgcttg 240
gccgctgatg tcgattttgg cggcggcaag gcggtgatca tcggcgatcc gcgcaaagac 300
aaatcgccgg aattgtttcg cgctttcggc cagttcgtgg agtcattagg cggccggttt 360
tacacgggca cggatatggg gacgacgccg gacgattttg tgcacgcgct gaaagagacg 420
aattgcatcg tcggcgttcc ggaagcgtat ggcggaagcg gcgactcatc cgtgccgacc 480
gccgagggcg ttgtttacgg cattcaggcg acgaacgatg ttgtgtttgg cagcaagcat 540
ttgcatggca aaacgtatgc ggtgcaaggg ctcggaaaag tcggaaaaaa agtggcgctt 600
cgtttgcttg aagaaggggc ggatctgtat gtgtgcgatt tgaacgaagc ggcagtcaaa 660
gaggtcgtgg cgtacggcaa gcaaatcggg gcgtccgtca agccggtgaa cggaacggat 720
atttatcgcg tcgaagccga tgtgttcgtc ccgtgcgcat ttggcggcgt catcaacgat 780
gaaacgatcg ccgagctgcg agtgaaagcg gtcgtcggtt cggcgctgaa tcagctggct 840
gacaaacgcc acgcccgtat gttgaaagaa aagggcatca tgtatgcccc cgattatatc 900
gtcaacgccg gcggcctcat tcaagtggcc gatgaactgt acggagcgaa caaagagcgg 960
gtgctggcga aaacgaaagc gatttatgat acgctgctcg ccatttatgc gcgggctgaa 1020
tcggaaggaa taacgacgat cgaggcagcc gatcaatttt gcgaagagcg gatcgagaaa 1080
cgcaaacgcc gcaatcattt tttcacgcac caaaagcggc cgaagtggga tattcgacgt 1140
<210> 2
<211> 380
<212> PRT
<213> 嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)
<400> 2
Met Asn Val Met Leu Ser Pro Asn Met Ser Gln Arg Leu Asp Leu Phe
1 5 10 15
Phe Gln Met Arg Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Leu Asp Glu Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Ser Thr Ala Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met His Pro Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Ala
50 55 60
Leu Ala Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Ser Cys Leu
65 70 75 80
Ala Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp
85 90 95
Pro Arg Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe
100 105 110
Val Glu Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr
115 120 125
Thr Pro Asp Asp Phe Val His Ala Leu Lys Glu Thr Asn Cys Ile Val
130 135 140
Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser Ser Val Pro Thr
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Tyr Gly Ile Gln Ala Thr Asn Asp Val Val Phe
165 170 175
Gly Ser Lys His Leu His Gly Lys Thr Tyr Ala Val Gln Gly Leu Gly
180 185 190
Lys Val Gly Lys Lys Val Ala Leu Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ala Asp
195 200 205
Leu Tyr Val Cys Asp Leu Asn Glu Ala Ala Val Lys Glu Val Val Ala
210 215 220
Tyr Gly Lys Gln Ile Gly Ala Ser Val Lys Pro Val Asn Gly Thr Asp
225 230 235 240
Ile Tyr Arg Val Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly
245 250 255
Val Ile Asn Asp Glu Thr Ile Ala Glu Leu Arg Val Lys Ala Val Val
260 265 270
Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Ala Asp Lys Arg His Ala Arg Met Leu
275 280 285
Lys Glu Lys Gly Ile Met Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ala Gly
290 295 300
Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Arg
305 310 315 320
Val Leu Ala Lys Thr Lys Ala Ile Tyr Asp Thr Leu Leu Ala Ile Tyr
325 330 335
Ala Arg Ala Glu Ser Glu Gly Ile Thr Thr Ile Glu Ala Ala Asp Gln
340 345 350
Phe Cys Glu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Lys Arg Arg Asn His Phe Phe
355 360 365
Thr His Gln Lys Arg Pro Lys Trp Asp Ile Arg Arg
370 375 380
<210> 3
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asn Val Met Leu Ser Pro Asn Met Ser Gln Arg Leu Asp Leu Phe
1 5 10 15
Phe Gln Met Arg Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Leu Asp Glu Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Ser Thr Ala Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met His Pro Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Ala
50 55 60
Leu Ala Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Ser Cys Leu
65 70 75 80
Ala Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp
85 90 95
Pro Arg Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe
100 105 110
Val Glu Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr
115 120 125
Thr Pro Asp Asp Phe Val His Ala Leu Lys Glu Thr Asn Cys Ile Ala
130 135 140
Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser Ser Val Pro Thr
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Tyr Gly Ile Gln Ala Thr Asn Asp Val Val Phe
165 170 175
Gly Ser Lys His Leu His Gly Lys Thr Tyr Ala Val Gln Gly Leu Gly
180 185 190
Lys Val Gly Lys Lys Val Ala Leu Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ala Asp
195 200 205
Leu Tyr Val Cys Asp Leu Asn Glu Ala Ala Val Lys Glu Val Val Ala
210 215 220
Tyr Gly Lys Gln Ile Gly Ala Ser Val Lys Pro Val Asn Gly Thr Asp
225 230 235 240
Ile Tyr Arg Val Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly
245 250 255
Val Ile Asn Asp Glu Thr Ile Ala Glu Leu Arg Val Lys Ala Val Val
260 265 270
Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Ala Asp Lys Arg His Ala Arg Met Leu
275 280 285
Lys Glu Lys Gly Ile Met Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ala Gly
290 295 300
Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Arg
305 310 315 320
Val Leu Ala Lys Thr Lys Ala Ile Tyr Asp Thr Leu Leu Ala Ile Tyr
325 330 335
Ala Arg Ala Glu Ser Glu Gly Ile Thr Thr Ile Glu Ala Ala Asp Gln
340 345 350
Phe Cys Glu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Lys Arg Arg Asn His Phe Phe
355 360 365
Thr His Gln Lys Arg Pro Lys Trp Asp Ile Arg Arg
370 375 380
<210> 4
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asn Val Met Leu Ser Pro Asn Met Ser Gln Arg Leu Asp Leu Phe
1 5 10 15
Phe Gln Met Arg Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Leu Asp Glu Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Ser Thr Ala Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met His Pro Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Ala
50 55 60
Leu Ala Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Ser Cys Leu
65 70 75 80
Ala Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp
85 90 95
Pro Arg Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe
100 105 110
Val Glu Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr
115 120 125
Thr Pro Asp Asp Phe Val His Ala Leu Lys Glu Thr Asn Cys Ile Ala
130 135 140
Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser Ser Val Pro Thr
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Tyr Gly Ile Gln Ala Thr Asn Asp Val Val Phe
165 170 175
Gly Ser Lys His Leu His Gly Lys Thr Tyr Ala Val Gln Gly Leu Gly
180 185 190
Lys Val Gly Lys Lys Val Ala Leu Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ala Asp
195 200 205
Leu Tyr Val Cys Asp Leu Asn Glu Ala Ala Val Lys Glu Val Val Ala
210 215 220
Tyr Gly Lys Gln Ile Gly Ala Ser Val Lys Pro Val Asn Gly Thr Asp
225 230 235 240
Ile Tyr Arg Val Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly
245 250 255
Val Ile Asn Asp Glu Thr Ile Ala Glu Leu Arg Val Lys Ala Val Val
260 265 270
Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Ala Asp Lys Arg His Ala Arg Met Leu
275 280 285
Lys Glu Lys Gly Ile Met Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ala Gly
290 295 300
Gly Leu Ile Gln Ala Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Arg
305 310 315 320
Val Leu Ala Lys Thr Lys Ala Ile Tyr Asp Thr Leu Leu Ala Ile Tyr
325 330 335
Ala Arg Ala Glu Ser Glu Gly Ile Thr Thr Ile Glu Ala Ala Asp Gln
340 345 350
Phe Cys Glu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Lys Arg Arg Asn His Phe Phe
355 360 365
Thr His Gln Lys Arg Pro Lys Trp Asp Ile Arg Arg
370 375 380
<210> 5
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Asn Val Met Leu Ser Pro Asn Met Ser Gln Arg Leu Asp Leu Phe
1 5 10 15
Phe Gln Met Arg Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Leu Asp Glu Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Ser Thr Ala Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met His Pro Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Ala
50 55 60
Leu Ala Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Ser Cys Leu
65 70 75 80
Ala Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp
85 90 95
Pro Arg Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe
100 105 110
Val Glu Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr
115 120 125
Thr Pro Asp Asp Phe Val His Ala Leu Lys Glu Thr Asn Cys Ile Ala
130 135 140
Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser Ser Val Pro Thr
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Tyr Gly Ile Gln Ala Thr Asn Asp Val Val Phe
165 170 175
Gly Ser Lys His Leu His Gly Lys Thr Tyr Ala Val Gln Gly Leu Gly
180 185 190
Lys Val Gly Lys Lys Val Ala Leu Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ala Asp
195 200 205
Leu Tyr Val Cys Asp Leu Asn Glu Ala Ala Val Lys Glu Val Val Ala
210 215 220
Tyr Gly Lys Gln Ile Gly Ala Ser Val Lys Pro Val Asn Gly Thr Asp
225 230 235 240
Ile Tyr Arg Val Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly
245 250 255
Val Ile Asn Asp Glu Thr Ile Ala Glu Leu Arg Val Lys Ala Val Val
260 265 270
Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Ala Asp Lys Arg His Ala Arg Met Leu
275 280 285
Lys Glu Lys Gly Ile Met Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ala Gly
290 295 300
Gly Leu Ile Gln Val Gly Asp Glu Leu Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Arg
305 310 315 320
Val Leu Ala Lys Thr Lys Ala Ile Tyr Asp Thr Leu Leu Ala Ile Tyr
325 330 335
Ala Arg Ala Glu Ser Glu Gly Ile Thr Thr Ile Glu Ala Ala Asp Gln
340 345 350
Phe Cys Glu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Lys Arg Arg Asn His Phe Phe
355 360 365
Thr His Gln Lys Arg Pro Lys Trp Asp Ile Arg Arg
370 375 380
<210> 6
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Asn Val Met Leu Ser Pro Asn Met Ser Gln Arg Leu Asp Leu Phe
1 5 10 15
Phe Gln Met Arg Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Leu Asp Glu Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Ser Thr Ala Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met His Pro Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Ala
50 55 60
Leu Ala Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Ser Cys Leu
65 70 75 80
Ala Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp
85 90 95
Pro Arg Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe
100 105 110
Val Glu Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr
115 120 125
Thr Pro Asp Asp Phe Val His Ala Leu Lys Glu Thr Asn Cys Ile Ala
130 135 140
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145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Tyr Gly Ile Gln Ala Thr Asn Asp Val Val Phe
165 170 175
Gly Ser Lys His Leu His Gly Lys Thr Tyr Ala Val Gln Gly Leu Gly
180 185 190
Lys Val Gly Lys Lys Val Ala Leu Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ala Asp
195 200 205
Leu Tyr Val Cys Asp Leu Asn Glu Ala Ala Val Lys Glu Val Val Ala
210 215 220
Tyr Gly Lys Gln Ile Gly Ala Ser Val Lys Pro Val Asn Gly Thr Asp
225 230 235 240
Ile Tyr Arg Val Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly
245 250 255
Val Ile Asn Asp Glu Thr Ile Ala Glu Leu Arg Val Lys Ala Val Val
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Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Ala Asp Lys Arg His Ala Arg Met Leu
275 280 285
Lys Glu Lys Gly Ile Met Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ala Gly
290 295 300
Gly Leu Ile Gln Ala Gly Asp Glu Leu Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Arg
305 310 315 320
Val Leu Ala Lys Thr Lys Ala Ile Tyr Asp Thr Leu Leu Ala Ile Tyr
325 330 335
Ala Arg Ala Glu Ser Glu Gly Ile Thr Thr Ile Glu Ala Ala Asp Gln
340 345 350
Phe Cys Glu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Lys Arg Arg Asn His Phe Phe
355 360 365
Thr His Gln Lys Arg Pro Lys Trp Asp Ile Arg Arg
370 375 380
<210> 7
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Asn Val Met Leu Ser Pro Asn Met Ser Gln Arg Leu Asp Leu Phe
1 5 10 15
Phe Gln Met Arg Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Leu Asp Glu Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Ser Thr Ala Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met His Pro Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Ala
50 55 60
Leu Ala Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Ser Cys Leu
65 70 75 80
Ala Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp
85 90 95
Pro Arg Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe
100 105 110
Val Glu Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr
115 120 125
Thr Pro Asp Asp Phe Val His Ala Leu Lys Glu Thr Asn Cys Ile Ala
130 135 140
Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Thr Ser Val Pro Thr
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Tyr Gly Ile Gln Ala Thr Asn Asp Val Val Phe
165 170 175
Gly Ser Lys His Leu His Gly Lys Thr Tyr Ala Val Gln Gly Leu Gly
180 185 190
Lys Val Gly Lys Lys Val Ala Leu Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ala Asp
195 200 205
Leu Tyr Val Cys Asp Leu Asn Glu Ala Ala Val Lys Glu Val Val Ala
210 215 220
Tyr Gly Lys Gln Ile Gly Ala Ser Val Lys Pro Val Asn Gly Thr Asp
225 230 235 240
Ile Tyr Arg Val Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly
245 250 255
Val Ile Asn Asp Glu Thr Ile Ala Glu Leu Arg Val Lys Ala Val Val
260 265 270
Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Ala Asp Lys Arg His Ala Arg Met Leu
275 280 285
Lys Glu Lys Gly Ile Met Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ala Gly
290 295 300
Gly Leu Ile Ala Ala Gly Asp Glu Leu Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Arg
305 310 315 320
Val Leu Ala Lys Thr Lys Ala Ile Tyr Asp Thr Leu Leu Ala Ile Tyr
325 330 335
Ala Arg Ala Glu Ser Glu Gly Ile Thr Thr Ile Glu Ala Ala Asp Gln
340 345 350
Phe Cys Glu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Lys Arg Arg Asn His Phe Phe
355 360 365
Thr His Gln Lys Arg Pro Lys Trp Asp Ile Arg Arg
370 375 380
<210> 8
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Asn Val Met Leu Ser Pro Asn Met Ser Gln Arg Leu Asp Leu Phe
1 5 10 15
Phe Gln Met Arg Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Leu Asp Glu Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Ser Thr Ala Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met His Pro Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Ala
50 55 60
Leu Ala Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Ser Asn Leu
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Pro Arg Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe
100 105 110
Val Glu Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr
115 120 125
Thr Pro Asp Asp Phe Val His Ala Leu Lys Glu Thr Asn Cys Ile Ala
130 135 140
Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Thr Ser Val Pro Thr
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Tyr Gly Ile Gln Ala Thr Asn Asp Val Val Phe
165 170 175
Gly Ser Lys His Leu His Gly Lys Thr Tyr Ala Val Gln Gly Leu Gly
180 185 190
Lys Val Gly Lys Lys Val Ala Leu Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ala Asp
195 200 205
Leu Tyr Val Cys Asp Leu Asn Glu Ala Ala Val Lys Glu Val Val Ala
210 215 220
Tyr Gly Lys Gln Ile Gly Ala Ser Val Lys Pro Val Asn Gly Thr Asp
225 230 235 240
Ile Tyr Arg Val Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly
245 250 255
Val Ile Asn Asp Glu Thr Ile Ala Glu Leu Arg Val Lys Ala Val Val
260 265 270
Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Ala Asp Lys Arg His Ala Arg Met Leu
275 280 285
Lys Glu Lys Gly Ile Met Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ala Gly
290 295 300
Gly Leu Ile Ala Ala Gly Asp Glu Leu Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Arg
305 310 315 320
Val Leu Ala Lys Thr Lys Ala Ile Tyr Asp Thr Leu Leu Ala Ile Tyr
325 330 335
Ala Arg Ala Glu Ser Glu Gly Ile Thr Thr Ile Glu Ala Ala Asp Gln
340 345 350
Phe Cys Glu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Lys Arg Arg Asn His Phe Phe
355 360 365
Thr His Gln Lys Arg Pro Lys Trp Asp Ile Arg Arg
370 375 380

Claims (7)

1.胺脱氢酶突变体，其特征在于，为如下的蛋白质：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸和第309位缬氨酸替换为甘氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸和第310位丙氨酸替换为甘氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸、第309位缬氨酸替换为丙氨酸和第310位丙氨酸替换为甘氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQID No.6所示；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸、第309位缬氨酸替换为丙氨酸、第310位丙氨酸替换为甘氨酸、第156位丝氨酸替换为苏氨酸、第308位谷氨酰胺替换为丙氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；
(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第144位缬氨酸替换为丙氨酸、第309位缬氨酸替换为丙氨酸、第310位丙氨酸替换为甘氨酸、第156位丝氨酸替换为苏氨酸、第308位谷氨酰胺替换为丙氨酸、第79位半胱氨酸替换为天冬酰胺和第86位苯丙氨酸替换为甲硫氨酸所形成的衍生蛋白质，其新氨基酸序列如SEQ IDNo.8所示。
2.编码如权利要求1所述胺脱氢酶突变体的核酸。
3.包含如权利要求2所述核酸序列的重组表达载体。
4.包含如权利要求3所述重组表达载体的重组表达转化体。
5.重组胺脱氢酶突变体催化剂，其特征在于：所述的重组胺脱氢酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：
(1)培养如权利要求4所述重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞；
(2)培养如权利要求4所述重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的粗酶液；
(3)培养如权利要求4所述重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的粗酶液，干燥所制备的粗酶粉或纯化所制备的纯酶。
6.利用权利要求1所述胺脱氢酶突变体或权利要求5所述重组胺脱氢酶突变体催化剂催化羰基化合物不对称还原胺化制备相应手性胺的方法，其特征在于：使用权利要求1所述胺脱氢酶突变体或权利要求5所述重组胺脱氢酶突变体催化剂，催化潜手性羰基化合物与氨分子的不对称还原胺化，获得相应的(R)-构型手性仲胺产物；
所述的潜手性羰基化合物选择如下化合物：
Figure FDA0004236263970000031
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述胺脱氢酶突变体催化羰基化合物不对称还原胺化反应在甲酸脱氢酶、辅底物和辅酶的存在下进行；
所述辅底物是甲酸或甲酸铵，所述辅酶是NADH或NAD+。
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