CN105441403B - 用于生产l-2-氨基丁酸的转氨酶 - Google Patents

用于生产l-2-氨基丁酸的转氨酶 Download PDF

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Abstract

本发明通过基因工程构建了转氨酶，相比Ochrobactrum anthropi来源的野生型ω‑转氨酶，本发明的转氨酶的酶活力有显著提高，可用于工业化生产L‑2‑氨基丁酸。

Description

用于生产L-2-氨基丁酸的转氨酶
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体地说，涉及通过基因工程构建的用于生产L-2-氨基丁酸的转氨酶。
背景技术
L-2-氨基丁酸，英文名为L(+)-2-Aminobutyric acid，分子式为C4H9NO2,CAS No.为1492-24-6，是一种非天然的手性α-氨基酸。L-2-氨基丁酸是新型抗癫痫药--左乙拉西坦的主要生产原料，也是合成抑菌抗结核药乙胺丁醇、以及许多手性药物的关键手性前体，市场需求量正在大幅增加。
L-2-氨基丁酸的生产包括化学法和生物方法。化学法生产L-2-氨基丁酸的生产工艺可参见中国发明专利ZL200610030420.X和ZL201210034250.8，该工艺以2-溴丁酸或者丙醛和氰化钠为底物生产，但是生产需要大量使用有机溶剂，有毒的芳香醛，以及拆分剂等，生产成本较高，对环境的危害也比较严重。
生物法生产L-2-氨基丁酸的途径有氨基酸氧化酶法、转氨酶法、脱氢酶法和发酵法等。氨基酸氧化酶法以化学合成的混旋2-氨基丁酸为底物，使用D-氨基酸氧化酶在金属催化剂的作用下制备L-2-氨基丁酸，分离收率可达95％以上[Fotheringham I,et al.,Biochemical Society Transactions,2006,34(2):287-290]，但是由于化学合成混旋2-氨基丁酸的成本较高，特别是金属催化剂的成本高，所以该路线并不适合于工业化生产。转氨酶法生产L-2-氨基丁酸存在转化率低、生产浓度低、杂质干扰等问题[Fotheringham I,etal.,Bioorganic&medicinal chemistry,1999,7(10):2209-2213；Zhu L,Tao R,et al.,AppliedMicrobiology and Biotechnology,2011,90(3):903-910]。发酵法生产的产量和转化率也不高[Zhang K,Li H,et al.,Proceedings of the National Academy ofSciences of the UnitedStates of America,2010,107(14):6234-6239]，所以也没有实现工业化生产。脱氢酶法以丁酮酸为底物，在L-苏氨酸脱氨酶、L-亮氨酸脱氢酶作用下生成L-2-氨基丁酸，但反应需要NADH作为辅酶，所以在转化体系需耦合辅酶的再生体系，增加了生产的复杂性和成本[Tao R,Jiang Y,Zhu F,et al.,Biotechnology letters,2014,36(4):835-841]。
转氨酶法使用ω-转氨酶(ω-TA)，以胺和酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺。Ochrobactrum anthropi来源ω-转氨酶在异丙胺存在下可将底物丁酮酸转化为L-2-氨基丁酸。而丁酮酸以L-苏氨酸为原料通过L-苏氨酸脱氨酶转化获得，L-苏氨酸和异丙胺都比较廉价，而且整个催化过程可以达到较高的转化率，因此具有较好的应用前景。但是目前的转化浓度较低，只有0.1M，酶的活性也比较低[Park E S,Dong J Y,Shin J S.,Organic&biomolecular chemistry,2013,11(40):6929-6933]，因此酶的活性和转化浓度成为了生产L-2-氨基丁酸的限制性因素。
发明内容
为了克服现有L-2-氨基丁酸生产技术的上述缺陷，得到酶活性更高的转氨酶，本发明利用基因工程技术来对微生物来源的野生型转氨酶进行改造和筛选，构建高酶活性的转氨酶突变体，从而进行L-2-氨基丁酸的工业化生产。
为此，本发明通过大量筛选ω-转氨酶，并通过随机突变、半理性设计等蛋白工程技术对Ochrobactrum anthropi来源ω-转氨酶(OATA)、Brucella neotomae来源ω-转氨酶(BNTA)、Ochrobactrum intermedium来源ω-转氨酶(OITA)、以及比活力较高的其他来源ω-转氨酶进行改造，获得酶活和稳定性提高的转氨酶突变体，有效地降低转氨酶法生产L-2-氨基丁酸的生产成本。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于生产L-2-氨基丁酸的转氨酶。
本发明的第二个目的在于提供编码上述转氨酶的基因。
本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。
本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。
本发明的第五个目的在于提供上述转氨酶或微生物在生产L-2-氨基丁酸的用途。
为了达到上述目的，本发明提供如下用于生产L-2-氨基丁酸的转氨酶：
OATA(SEQ ID NO:1)的下述突变体：
OATA/S87K/V154A(SEQ ID NO:2)，其为SEQ ID NO:1第87位的S替换为K、第154位的V替换为A的突变体；
OATA/S87K/V154G(SEQ ID NO:3)，其为SEQ ID NO:1第87位的S替换为K、第154位的V替换为G的突变体；
OATA/V154G/G229C(SEQ ID NO:4)，其为SEQ ID NO:1第154位的V替换为G、第229位的G替换为C的突变体；
OATA/S87K/V154G/N166V(SEQ ID NO:5)，其为SEQ ID NO:1第87位的S替换为K、第154位的V替换为G、第166位的N替换为V的突变体；
或者
BNTA(SEQ ID NO:6)、及其下述突变体：
BNTA/V154G/Y15N(SEQ ID NO:7)，其为SEQ ID NO:6第154位的V替换为G、第15位的Y替换为N的突变体；
BNTA/V154G/K79E(SEQ ID NO:8)，其为SEQ ID NO:6第154位的V替换为G、第79位的K替换为E的突变体；
或者
OITA(SEQ ID NO:9)、及其下述突变体：
OITA/V154G/S7L(SEQ ID NO:10)，其为SEQ ID NO:9第154位的V替换为G、第7位的S替换为L的突变体；
OITA/V154G/T21A(SEQ ID NO:11)，其为SEQ ID NO:9第154位的V替换为G、第21位的T替换为A的突变体；
OITA/V154G/N166V(SEQ ID NO:12)，其为SEQ ID NO:9第154位的V替换为G、第166位的N替换为V的突变体；
OITA/V154G/L254M(SEQ ID NO:13)，其为SEQ ID NO:9第154位的V替换为G、第254位的L替换为M的突变体；
OITA/V154G/K279N(SEQ ID NO:14)，其为SEQ ID NO:9第154位的V替换为G、第279位的K替换为N的突变体；
OITA/V154G/T422A(SEQ ID NO:15)，其为SEQ ID NO:9第154位的V替换为G、第422位的T替换为A的突变体；
OITA/V154G/N448D(SEQ ID NO:16)，其为SEQ ID NO:9第154位的V替换为G、第448位的N替换为D的突变体。
其中，野生型Ochrobactrum anthropi来源ω-转氨酶OATA的氨基酸序列(SEQ IDNO:1)是：
MTAQPNSLEARDIRYHLHSYTDAVRLEAEGPLVIERGDGIYVEDVSGKRYIEAMSGLWSVGVGFSEPRLAEAAARQMKKLPFYHTFSYRSHGPVIDLAEKLVSMAPVPMSKAYFTNSGSEANDTVVKLIWYRSNALGEPERKKIISRKRGYHGVTIASASLTGLPNNHRSFDLPIDRILHTGCPHFYREGQAGESEEQFATRLADELEQLIIAEGPHTIAAFIGEPVMGAGGVVVPPKTYWEKVQAVLKRYDILLIADEVICGFGRTGNLFGSQTFDMKPDILVMSKQLSSSYLPISAFLINERVYAPIAEESHKIGTLGTGFTASGHPVAAAVALENLAIIEERDLVANARDRGTYMQKRLRELQDHPLVGEVRGVGLIAGVELVTDKQAKTGLEPTGALGAKANAVLQERGVISRAMGDTLAFCPPLIINDQQVDTMVSALEATLNDVQASLTR。
野生型Brucella neotomae来源ω-转氨酶BNTA的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)是：MTAQPNSLEARDIRYHLHSYTDAVRLEAEGPLVIERGDGIYVEDIAGKRYIEAMSGLWSVGVGFSEQRLAEAAARQMKKLPFYHTFSYRSHGPVIDLAEKLVAMAPVPMSKAYFTNSGSEANDTVVKLIWYRSNALGEPERKKIISRKRGYHGVTIASASLTGLPNNHRSFDLPIDRILHTGCPHHYHDALPGESEEQFTTRLANELEQLILAEGPHTIAAFIGEPVMGAGGVVVPPKTYWEKVQAVLGRYNILLVADEVICGFGRTGNLFGCQTFDIKPDILVMSKQLSSSYLPISAFLINERVYAPIAEESHKIGTLGTGFTASGHPVAAAVALENLAIIEERDLVANARERGARMQKRLRELQDHPLVGEVRGVGLIAGVELVIDKEAKTGLEQPGALGARANAALQERGVISRAMGDTLAFCPPLIINDQQVDTMVSALEAALNDVQASLGK。
野生型Ochrobactrum intermedium来源ω-转氨酶OITA的氨基酸序列(SEQ IDNO:9)是：
MTAQPNSLEARDIRYHLHSYTDAVRLEAEGPLVIERGDGIYVEDVTGKRYIEAMSGLWSVGVGFSEPRLAEAAARQMKKLPFYHTFSYRSHGPVIDLAEKLVSMAPVPMSKAYFTNSGSEANDTVIKLIWYRSNALGEPERKKIISRKRGYHGVTIASASLTGLPNNHRSFDLPIDRILHAGCPHHYREGQAGETEEQFATRLADELEQLILAEGPHTIAAFIGEPVMGAGGVVVPPRTYWEKVQAVLKRYDILLVADEVICGFGRTGNLFGSQTFDIKPDILVMSKQLSSSYLPISAFLINERVYAPIAEESHKIGTLGTGFTASGHPVAAAVALENLAIIEERQLVANARDRGAYMQKRLRDLKDHPLVGEVRGVGLIAGVELVTDKQAKTGLEQAGALGAQANAALQDRGVISRAMGDTLAFCPPLIINDQQIDTMVSALEAALNDVQASLAR。
当本发明的转氨酶用于生产L-2-氨基丁酸时，可以采用两种方式进行：1.以丁酮酸和异丙胺为底物；2.以苏氨酸和异丙胺为底物，其中反应体系中加入苏氨酸脱氨酶或者苏氨酸脱氨酶表达菌，苏氨酸脱氨酶的作用是将L-苏氨酸转化为丁酮酸。
本发明的转氨酶不仅可以直接以酶的形式用于酶催化反应，而且可以以表达该酶的微生物的形式用于催化反应。
采用本发明的转氨酶来生产L-2-氨基丁酸时，由于酶活性大大提高，可以有效地克服现有技术转氨酶法的转化率低、转化浓度低等不足，有利于实现转氨酶法生产L-2-氨基丁酸的工业化。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
为简要起见，本文中的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于下表中：
氨基酸中英文对照及缩写
丙氨酸 Alanine A或Ala 脂肪族类
精氨酸 Arginine R或Arg 碱性氨基酸类
天冬酰胺 Asparagine N或Asn 酰胺类
天冬氨酸 Aspartic acid D或Asp 酸性氨基酸类
半胱氨酸 Cysteine C或Cys 含硫类
谷氨酰胺 Glutamine Q或Gln 酰胺类
谷氨酸 Glutamic acid E或Glu 酸性氨基酸类
甘氨酸 Glycine G或Gly 脂肪族类
组氨酸 Histidine H或His 碱性氨基酸类
异亮氨酸 Isoleucine I或Ile 脂肪族类
亮氨酸 Leucine L或Leu 脂肪族类
赖氨酸 Lysine K或Lys 碱性氨基酸类
蛋氨酸 Methionine M或Met 含硫类
苯丙氨酸 Phenylalanine F或Phe 芳香族类
脯氨酸 Proline P或Pro 亚氨基酸
丝氨酸 Serine S或Ser 羟基类
苏氨酸 Threonine T或Thr 羟基类
色氨酸 Tryptophan W或Trp 芳香族类
酪氨酸 Tyrosine Y或Tyr 芳香族类
缬氨酸 Valine V或Val 脂肪族类
在本文中，术语“ω-转氨酶”和“转氨酶”表示相同的意义。
在本发明中，术语“转氨酶突变体”、“突变体转氨酶”、“基因工程转氨酶”表示相同的意义，都是指通过对野生型转氨酶进行氨基酸的替换、增加、缺失等修饰方式获得的转氨酶，尤其是指酶活性增强的转氨酶。
为表述方便起见，在本发明中，通常将转氨酶用英文缩写代替，比如，微生物Ochrobactrum anthropi来源的转氨酶简写为OATA；微生物Brucella neotomae来源的转氨酶简写为BNTA；微生物Ochrobactrum intermedium来源的转氨酶简写为OITA；以此类推。
相对应地，转氨酶突变体也可采用简写形式，比如：OATA/S87K代表OATA的第87位的S替换为K；BNTA/V154G/Y15N代表BNTA的第154位的V替换为G、同时第15位的Y替换为N；OATA/S87K/V154G/N166V代表OATA的第87位的S替换为K、第154位的V替换为G、同时第166位的N替换为V；以此类推。
微生物Brucella neotomae和微生物Ochrobactrum intermedium、以及它们的转氨酶未曾报道可用于L-2-氨基丁酸生产。
令人惊奇的是，OATA、BNTA和OITA这三种转氨酶之间具有高度的同源性，其中OATA和BNTA的同源性为93％；OATA和OITA的同源性为95％。
相对于野生型转氨酶，本发明转氨酶突变体都是在个别位点发生了1个、或2个、最多3个氨基酸的替换，并且这些位点具有高度的重合性。由于转氨酶包含456个氨基酸，替换的氨基酸数量极少，因此这些突变体与野生型转氨酶保持了99.3％以上的同源性。
本发明的转氨酶突变体的氨基酸数量只有456个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
上述转化体宿主可以使任何适合表达转氨酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是细菌，尤其优选大肠杆菌。
当作为生物催化剂用于生产L-2-氨基丁酸时，本发明的转氨酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。
本发明的转氨酶分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。
实施例
本文中的全基因合成、引物合成及测序委托南京金斯瑞公司完成。
实施例1
1.1表达多种来源ω-转氨酶(ω-TA)的重组大肠杆菌的构建
选取Ochrobactrum anthropi、Aquamicrobium defluvii、Bradyrhizobiumsp.Ec3.3、Brucella neotomae、Novosphingobium acidiphilum、Ochrobactrumintermedium、Pseudaminobacter salicylatoxidans、Brucella abortus、Paracoccusdenitrificans PD1222来源的ω-转氨酶，以其已经公布的基因序列为基础，全基因合成这些转氨酶基因序列，并在基因两端设计限制性内切酶位点NdeI和BamHI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒，转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到表达ω-转氨酶的重组大肠杆菌。
1.2不同来源ω-转氨酶催化生产L-2-氨基丁酸的能力比较
ω-转氨酶表达菌种的摇瓶发酵：配制液体培养基TB(pH 7.0-7.5)，含有12g/L蛋白胨、24g/L进口酵母抽提物、5g/L甘油、2.13g/L KH2PO4、16.43g/L K2HPO4·3H2O。培养基TB分装于500mL三角摇瓶，装液量100mL，然后在高压灭菌锅中于121℃加热灭菌20min。在ω-转氨酶表达菌种的平板上用接种环挑菌体接种于TB摇瓶中，接种前在TB培养基中加入100μg/mL卡那霉素，于37℃、220rpm摇床培养至OD600＝5-6，加入0.2mM IPTG于28℃诱导16h左右。
粗酶液的制备：取发酵液50mL置于离心管中，离心得菌体，按菌体浓度200g/L加纯化水重悬，然后超声波破碎：悬浮菌体用冰浴冷却，进行超声破碎(电压400W，超声时间3s，间隔时间5s，工作次数80次)。
称取3g苏氨酸置于摇瓶中，加入25mL水，调pH至8.0，加入5g/L苏氨酸脱氨酶表达菌种[Zhu et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2011,90:903–910]粗酶液于37℃反应1h后，分别加入5mL 6M异丙胺(盐酸调pH 8.0)、500μL的10mM PLP和5g/L转氨酶粗酶液，定容至50mL。37℃开始反应，控制pH为7.5，2h后取样，HPLC检测L-2-氨基丁酸含量，评估酶催化能力。
酶活计算方法：酶活＝氨基丁酸含量×106/(5g×120min×119)。结果列于表1中。
表1 多种来源ω-转氨酶的氨基酸序列同源性及催化能力比较
名称 来源 同源性 2h(g/L) 相对酶活
OATA Ochrobactrum anthropi 100％ 12.62 100.0％
ADTA Aquamicrobium defluvii 77％ 8.42 66.7％
BATA Brucella abortus 94％ 8.2 64.97％
BNTA Brucella neotomae 93％ 5.1 40.25％
BSTA Bradyrhizobium sp.Ec3.3 69％ 9.0 71.3％
NATA Novosphingobium acidiphilum 65.5％ 17.5 138.9％
OITA Ochrobactrum intermedium 95％ 25.8 204.4％
PDTA Paracoccus denitrificans PD1222 40.7％ 8.26 65.54％
PSTA Pseudaminobacter salicylatoxidans 73％ 5.85 46.35％
实施例2定点突变
2.1多种来源ω-转氨酶的定点突变
Park等(2014)通过X衍射技术对PDTA进行分子建模，得到了酶结构中活性位点和底物相关信息(PBD ID：4GRX)。他们发现PDTA的L pocket识别的底物类型是由V153位点调控S pocket的空间结构所决定的。随后在该位点进行定点突变得到了对特异底物酶活提高的突变体V153A，进一步证实了V153位点作为酶活性位点的关键作用。[Park E S,et al.,Advanced Synthesis&Catalysis,2014,356(1):212–220]
Park等(2012)的文献已报道OATA的V154位点对应为PDTA的V153位点[Park E S,Kim M,Shin J S.,Appl Microbiol Biotechnol,2012,93(6):2425–2435]。发明人对其它7种来源的ω-转氨酶氨基酸序列与PDTA、OATA进行蛋白质比对分析，找出相应的活性位点。在这些位点上制造V-A的定点突变，构建一系列突变库。
表2 多种来源ω-转氨酶定点突变位点及引物设计
名称 突变位点 突变引物 引物序列(5’-3’)
OATA V154A OATA-V154A-F cgcggctatcacggtGCTacgattgcctctgcc
ADTA V154A ADTA-V154A-F cgcggttatcatggcGCTaccattgcatcggct
BATA V154A BATA-V154A-F cgcggttatcatggcGCTaccattgccagcgca
BNTA V154A BNTA-V154A-F cgcggttatcatggcGCTaccattgccagcgca
BSTA V154A BSTA-V154A-F cgcgcctaccatggcGCTaccatcgccagcgca
NATA V158A NATA-V158A-F cgcgcatatcacggcGCTaccctggctgccgca
OITA V154A OITA-V154A-F cgcggttatcatggcGCTacgattgcatcggct
PDTA V153A PDTA-V153A-F aacgcatatcacggtGCTaccgcggtttcagcc
PSTA V154A PSTA-V154A-F cgcggctaccatggcGCTaccattgcttctgcg
OATAerr-F GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC
OATAerr-R GACGGAGCTCGAATTCGGAT
F：正向引物；R：反向引物；OATAerr-F/R：公共突变引物。其中大写GCT代表突变位点。
以OATA的编码基因为模板，用表2所示的正向引物OATA-V154A-F和公共反向引物OATAerr-R，用KOD DNA聚合酶进行PCR扩增(94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃45s；30个循环；68℃10min)，得到带有V154A突变位点的DNA片段。胶回收该DNA片段作为大引物做MegaPrimer PCR(94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃3min；25个循环；68℃10min)，DpnI消化实施例1.1中的重组质粒，电转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，涂布到含有卡那霉素的LB平板。随机挑选转化子培养后，测序鉴定是否得到正确的突变体OATA/V154A。
按同样的方法构建一系列突变体ADTA/V154A、BATA/V154A、BNTA/V154A、BSTA/V154A、NATA/V158A、OITA/V154A、PDTA/V153A、PSTA/V154A。
2.2突变体催化能力比较
方法同实施例1的步骤1.2。
表3 突变体催化能力比较
突变体 2h(g/L) 2h百分含量
OATA/V154A 13.9 100％
ADTA/V154A 25.9 186.3％
BNTA/V154A 21.8 156.8％
BSTA/V154A 27.8 200％
NATA/V158A 17.1 123％
OITA/V154A 25.5 183.45％
PDTA/V153A 12.74 91.7％
PSTA/V154A 25.3 182％
实施例3定点饱和突变
3.1定点饱和突变库的构建
定点突变后，对比相应的野生型，ADTA/V154A、BNTA/V154A、BSTA/V154A、OITA/V154A、PSTA/V154A的催化能力均有明显提高，证明V154位点是决定ω-转氨酶酶活力高低的关键活性位点。采用兼并引物在这些位点上制造定点饱和突变，构建得到突变库。
表4 多种来源ω-转氨酶定点饱和突变位点及引物设计
名称 突变位点 突变引物 引物序列(5’-3’)
OATA V154 OATA-V154-F cgcggctatcacggtNNKacgattgcctctgcc
ADTA V154 ADTA-V154-F cgcggttatcatggcNNKaccattgcatcggct
BATA V154 BATA-V154-F cgcggttatcatggcNNKaccattgccagcgca
BSTA V154 BSTA-V154-F cgcgcctaccatggcNNKaccatcgccagcgca
NATA V158 NATA-V158-F cgcgcatatcacggcNNKaccctggctgccgca
OITA V154 OITA-V154-F cgcggttatcatggcNNKacgattgcatcggct
PDTA V153 PDTA-V153-F aacgcatatcacggtNNKaccgcggtttcagcc
PSTA V153 PSTA-V154-F cgcggctaccatggcNNKaccattgcttctgcg
OATAerr-F GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC
OATAerr-R GACGGAGCTCGAATTCGGAT
兼并引物代码：M＝(A/C)，K＝(G/T)，N＝(A/C/G/T)
F：正向引物；R：反向引物；OATAerr-F/R：公共突变引物。其中大写NNK代表突变位点。
以OATA的编码基因为模板，用表3所示的正向引物OATA-V154-F和公共反向引物OATAerr-R，采用KOD DNA聚合酶进行PCR扩增(94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃45s；30个循环；68℃10min)，得到带有V154突变位点的DNA片段。胶回收该DNA片段作为大引物做MegaPrimer PCR(94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃3min；25个循环；68℃10min)，DpnI消化实施例1.1中的重组质粒，电转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，涂布到含有卡那霉素的LB平板，构建得到OATA/V154位点的饱和突变体库，库中包括一系列突变体。
按同样的方法构建一系列定点饱和突变体库(ADTA/V154、BATA/V154、BNTA/V154、BSTA/V154、NATA/V158、OITA/V154、PDTA/V153、PSTA/V154)，每个突变库包括一系列突变体。
3.2突变体库的高通量筛选
反应液的配制如下：1M丁酮酸44μL，6M异丙胺9.125μL，10mM PLP 2.2μL，双蒸水64.675μL。
选取突变体库中的转化子接种到含400μL LB培养基的96孔深孔培养板中，含100μg/mL卡那霉素和0.1mM IPTG，37℃培养6h后降温至30℃培养过夜。取100μL培养物转到96孔深孔培养板中，3500rpm离心3min，弃上清，加入100μL双蒸水重悬，置于-70℃冷冻2h，37℃融化30min，重复三次。加入120μL反应液，37℃反应12h，取上清进行液相测定。。
3.3筛选出的突变体用于生产L-2-氨基丁酸的能力比较
方法同实施例1的步骤1.2，筛得催化能力提高的突变体如下。
表5 定点饱和突变的突变体(除V154A外)催化生产L-2-氨基丁酸的能力比较
突变体 2h(g/L) 2h百分含量
OATA/V154G 20.0 100％
OATA/V154T 15.9 79.5％
BNTA/V154G 21.95 109.8％
BSTA/V154G 17.8 89％
OITA/V154G 28.3 141.5％
实施例4
OATA及酶活提高的突变体OATA/V154G、BNTA/V154G、OITA/V154G的定向进化
4.1随机突变体库的构建
分别以OATA、OATA/V154G、BNTA/V154G、OITA/V154G的编码基因为模板，应用易错PCR和大引物PCR技术构建随机突变体库。
100μL易错PCR反应体系包括：50ng质粒模板，各30pmol一对引物OATAerr-F和OATAerr-R(表2所示)，1X Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mMMgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，5个单位的Taq酶(fermentas)。PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1.5min；40个循环；72℃10min。胶回收1.4kb随机突变片段作为大引物，用KOD DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃2min，68℃10min；98℃10s，55℃30s，68℃3min；25个循环；68℃10min。DpnI消化质粒模板(其中OATA质粒模板为实施例1.1中的重组质粒；OATA/V154G、BNTA/V154G、OITA/V154G的质粒模板来源于实施例3)，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过104个克隆的随机突变库。
4.2突变体库的高通量筛选方法
方法同实施例3的步骤3.2。
4.3筛选出的突变体用于生产L-2-氨基丁酸的催化能力比较
方法同实施例1的步骤1.2，结果筛得以下催化能力提高的突变体。
表6 OATA突变体催化能力比较
突变体 2h(g/L) 2h百分含量
OATA 12.62 100.0％
OATA/S87K 18.7 148.2％
OATA/V154G 20.0 158.5％
OATA/N166V 17.1 135.5％
OATA/S87K/V154A 28.4 225％
OATA/S87K/V154G 32.7 259.1％
OATA/V154G/G229C 46.4 367.7％
OATA/S87K/V154G/N166V 28 221.9％
表7 BNTA突变体催化能力比较
突变体 2h(g/L) 2h百分含量
BNTA/V154G 21.95 100％
BNTA/V154G/Y15N 27.8 126.7％
BNTA/V154G/K79E 26.72 121.7％
表8 OITA突变体催化能力比较
突变体 2h(g/L) 2h百分含量
OITA 16.5 100％
OITA/V154G 20.4 123.6％
OITA/V154G/S7L 30.7 186％
OITA/V154G/T21A 31.2 189.1％
OITA/V154G/N166V 24.9 150.9％
OITA/V154G/L254M 28.5 172.7％
OITA/V154G/K279N 38.5 233.3％
OITA/V154G/T422A 32.1 194.5％
OITA/V154G/N448D 32.0 193.9％
综上所述，本发明所构建的转氨酶，相比Ochrobactrum anthropi来源的野生型ω-转氨酶，酶活力有显著提高，具有广阔的工业应用前景。

Claims (10)

1.一种转氨酶，其氨基酸序列为：
SEQ ID NO:2，其为SEQ ID NO:1第87位的S替换为K、第154位的V替换为A的突变体；
SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1第87位的S替换为K、第154位的V替换为G的突变体；
SEQ ID NO:4，其为SEQ ID NO:1第154位的V替换为G、第229位的G替换为C的突变体；或者
SEQ ID NO:5，其为SEQ ID NO:1第87位的S替换为K、第154位的V替换为G、第166位的N替换为V的突变体。
2.如权利要求1所述转氨酶，其特征在于，所述氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
3.编码如权利要求1或2所述转氨酶的基因。
4.包含如权利要求3所述基因的质粒。
5.转化了如权利要求4所述质粒的微生物。
6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌。
7.如权利要求1所述转氨酶或者如权利要求5所述微生物在生产L-2-氨基丁酸中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，以丁酮酸和异丙胺为原料生产L-2-氨基丁酸。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，以苏氨酸和异丙胺为原料生产L-2-氨基丁酸。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，反应体系中加入苏氨酸脱氨酶或者苏氨酸脱氨酶表达菌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106801043B (zh) * 2016-12-28 2019-08-06 江苏阿尔法药业有限公司 一种重组转氨酶及其制备方法和应用
CN106995808B (zh) * 2017-04-27 2019-06-04 宿迁阿尔法科技有限公司 一种重组转氨酶及其应用
CN106995807B (zh) * 2017-04-27 2019-11-08 宿迁阿尔法科技有限公司 一种重组转氨酶及其制备方法与应用
US11407982B2 (en) 2017-11-06 2022-08-09 Asymchem Life Science (Tianjin) Co., Ltd Transaminase mutant and use thereof
CN109182319B (zh) * 2018-08-20 2021-02-09 浙江大学 一种苏氨酸脱氨酶突变体及其制备方法和应用
CN109999016B (zh) * 2019-05-23 2021-09-21 浙江药苑生物科技有限公司 盐酸乙胺丁醇在治疗难治性癫痫中的应用
CN111826362B (zh) * 2020-07-13 2022-05-10 李元源 一种ω-转氨酶突变体、基因及应用
CN112680487B (zh) * 2021-02-03 2022-07-12 江南大学 催化长侧链芳香族胺与2-酮丁酸合成l-2-氨基丁酸的方法
CN114540441A (zh) * 2022-01-17 2022-05-27 湖北大学 一种提高l-2-氨基丁酸合成速率的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1986784A (zh) * 2006-12-18 2007-06-27 南京工业大学 天冬氨酸转氨酶突变酶及其制备方法和应用
CN101580815A (zh) * 2007-12-17 2009-11-18 赢创德固赛有限责任公司 产生ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或其内酰胺的重组细胞
CN102660515A (zh) * 2012-05-10 2012-09-12 江南大学 一种酶活性及热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶
CN102719411A (zh) * 2012-06-18 2012-10-10 华东师范大学 一种微生物谷氨酰胺转胺酶及其应用
CN103421753A (zh) * 2013-07-25 2013-12-04 江南大学 一种酶活和热稳定性提高的谷氨酰胺转胺酶突变体及其构建方法
CN103421756A (zh) * 2013-07-25 2013-12-04 江南大学 一种同时提高谷氨酰胺转胺酶比酶活和热稳定性的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1986784A (zh) * 2006-12-18 2007-06-27 南京工业大学 天冬氨酸转氨酶突变酶及其制备方法和应用
CN101580815A (zh) * 2007-12-17 2009-11-18 赢创德固赛有限责任公司 产生ω-氨基羧酸、ω-氨基羧酸酯或其内酰胺的重组细胞
CN102660515A (zh) * 2012-05-10 2012-09-12 江南大学 一种酶活性及热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶
CN102719411A (zh) * 2012-06-18 2012-10-10 华东师范大学 一种微生物谷氨酰胺转胺酶及其应用
CN103421753A (zh) * 2013-07-25 2013-12-04 江南大学 一种酶活和热稳定性提高的谷氨酰胺转胺酶突变体及其构建方法
CN103421756A (zh) * 2013-07-25 2013-12-04 江南大学 一种同时提高谷氨酰胺转胺酶比酶活和热稳定性的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
定点突变技术在转氨酶改造中的应用;许伟等;《盐城工学院学报 自然科学版》;20041231;第17卷(第4期);第55-58页 *
登录号：WP_004687895.1;佚名;《Genbank》;20130526;参见第1-456位 *
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