CN106995807B - 一种重组转氨酶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种重组转氨酶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组转氨酶及其制备方法与应用。一种高活性的重组转氨酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因如SEQ ID NO.1所示。一种制备所述的重组转氨酶的方法，包括发酵培养含有上述编码基因的基因工程菌，以及收集和制备重组转氨酶。本发明所述的重组转氨酶应用于不对称合成手性胺类化合物，特别是用于合成西他列汀及其中间体(R)‑3‑氨基‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)‑丁酸甲酯。本发明所涉及的酶具有优良的立体选择性、区域选择性和催化活力，且其催化的反应温和，反应转化率和产物的产量高，具有较好的应用前景。

Description

一种重组转氨酶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组转氨酶及其制备方法和应用。
背景技术
转氨酶(transaminase)是不对称合成光学纯手性胺的关键酶，为辅酶磷酸吡哆醛(PLP)依赖型，在动、植物和微生物中分布广泛。其中ω-转氨酶是从前手性酮出发制备光学纯胺类化合物的高效催化剂，因其优良的催化活性和对映体选择性成为了不对称合成手性胺类化合物的重要选择之一。
2006年10月，美国食品药品管理局(FDA)批准磷酸西他列汀单水合物(Sitagliptin，商品名Januvia)用于治疗Ⅱ型糖尿病。西他列汀可抑制胰高血糖素的分泌和胰岛β细胞增殖及提高葡萄糖耐受水平，其降糖作用较为适中，不引起患者水肿及体重增加，导致低血糖的风险较小，并且无增加体重、恶心、呕吐等副作用。西他列汀单独使用或与其他降糖药合用，均可达到降糖的目的。
目前西他列汀及其中间体的合成方法有多种，其中化学合成方法存在反应路线长、需要使用有毒原料、产物收率和光学纯度低、反应条件苛刻等缺点；而酶催化合成西他列汀及其中间体具有反应条件温和、对映体选择性强、产物的收率、产物容易分离纯化、能耗低、催化剂无毒且可降解等绿色合成过程的优点，具有很好的应用前景。本发明开发了一种具有优良的催化活性和对映选择性，且底物及溶剂耐受性好的重组转氨酶，可用于大规模催化合成手性胺化合物，特别是催化合成西他列汀及其中间体(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对目前西他列汀及其中间体合成路线长、需要使用有毒原料、产物收率和手性纯度低、反应条件苛刻等缺点，提供一种催化活性高、对映选择性好、底物耐受性好的重组转氨酶，该转氨酶的编码基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其制备方法，以及该重组转氨酶突变体在催化制备手性胺化合物中的应用。特别的，将该重组转氨酶用于西他列汀及其中间体(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的制备。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种高活性的重组转氨酶突变体，以SEQ ID NO.3所示的基因编码的烟曲霉(Aspergillus fumigatus Af293)野生型转氨酶为出发酶；所述的重组转氨酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
本发明中SEQ ID NO.3所示的核酸来源于烟曲霉(Aspergillus fumigatusAf293)。本发明所述SEQ ID NO.3所示的核酸可以从烟曲霉(Aspergillus fumigatusAf293)的基因组中分离获得，也可以从含有SEQ ID NO.3所示核酸的重组表达载体或者重组转化体中分离获得，也可以人工合成获得。
一种编码本发明所述的重组转氨酶突变体的基因，其核苷酸序列选自SEQ IDNO.1。
一种包含本发明所述的重组转氨酶突变体编码基因的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的重组转氨酶基因的核酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、噬菌体或病毒载体等等，优选质粒pET21a。
一种包含本发明的重组转氨酶突变体编码基因或其重组表达载体的重组表达转化体，本发明优选大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。将前述重组表达质粒转化至大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，即可得到本发明优选的基因工程菌。
一种制备所述的重组转氨酶的方法，包括发酵培养该基因工程菌，以及收集和制备重组转氨酶。
所述方法包括在一定生产罐发酵条件下，进行工业化制备所述重组转氨酶的步骤；所述的生产罐发酵条件优选：DO 35％以上，空气流量1:1.5vvm。
本发明所述的重组转氨酶应用于不对称合成手性胺类化合物，特别是用于合成西他列汀及其中间体(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯。
本发明重组转氨酶催化反应如下：
优选：在pH 6.5～7.5的反应液中，在磷酸吡哆醛存在下，在本发明所述的重组转氨酶突变体作用下，以化合物A为底物不对称酶催化还原制备光学手性胺化合物
其中，R选自
(1)—OCnH2n+1，其中n选自1～8的整数
(2)
R'1选自H，甲氧基，羟基
(3)
R'2选自H，—CN，—CnH2n+1，—CnH2n+1-mXm，X为卤素原子。其中n选自1～8的整数，m选自1～4的整数；
最佳的，R为—OCH3，—OCH2CH3、—CH2CH3或
有益效果：
本发明开发到一种具有优良的对映体选择性和催化活性的重组转氨酶突变体，可用于催化合成手性胺化合物。本发明的重组转氨酶的辅酶为磷酸吡哆醛PLP。
本发明所涉及的酶具有优良的对映体选择性和催化活力，且其催化的反应温和、对映体选择性强、反应转化率和产物的浓度高、产物容易分离纯化且能耗低，易于大规模制备，具有较好的应用前景。
具体实施方式
实施例1基因工程菌的建立
根据Genbank收录的烟曲霉(Aspergillus fumigatus Af293)转氨酶的基因序列(NCBI登录号：XM_743728.1)，人工合成该基因片段，通过PCR扩增扩展该片段(片段两侧加NdeⅠ和BamHⅠ内切酶基因片段)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。并利用NdeⅠ和BamHⅠ内切酶位点将基因插入pET21a质粒中，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立转氨酶基因工程菌。其中PCR扩增转氨酶基因的引物为：正向引物F1：GGCCACATATGTGGACAAAGTCTTTTCGGGA(SEQ ID NO.4)，反向引物R1：GGCTGGGATCCTAGCCACTGCCATAGTCAA CA(SEQ ID NO.5)。
实施例2转氨酶突变体基因的获得
本研究利用易错PCR方法，对转氨酶进行了蛋白质工程改造。易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。本研究采用保真度较低的聚合酶在特定措施下很容易向扩增产物中掺入随机突变的原理，同时利用Mn2+替代天然辅助因子Mg2+增加易错概率。
50μl PCR反应体系为：10×扩增缓冲液5μl，4种dNTP混合物(2.5mmol/L)各4μl，引物各50pmol，模板DNA 1.5μg，Taq DNA聚合酶0.5μL，Mg2+2mmol/L，加双蒸水至50μl。
PCR扩增程序为：98℃预变性4min，98℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，进行30个循环；于72℃下继续延伸10min，冷却至4℃。扩增的基因片段经检测后用1％琼脂糖凝胶电泳回收，并纯化扩增产物，去除多余的引物。
实验流程
按照实施例1的方法PCR扩增转氨酶基因并利用NdeⅠ和BamHⅠ内切酶位点将基因插入至pET21a质粒中，作为基因突变模板；
易错PCR扩增转氨酶的基因，扩增后基因片段链接至pET21a载体，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立转氨酶基因突变体库；利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET21a质粒为载体，表达扩展转氨酶，高通量筛选高活性突变株；突变后对高活性转氨酶基因进行鉴定。筛选出的高活性转氨酶突变体基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
转氨酶基因引物为：正向引物F1：GGCCACATATGTGGACAAAGTCTTTTCGGGA(SEQ IDNO.4)，反向引物R1：GGCTGGGATCCTAGCCACTGCCATAGTCAACA(SEQ ID NO.5)。
按实施例1所述方法构建表达该转氨酶突变体的基因工程菌。
在获得突变体序列后,也可以通过化学合成方式合成该基因序列后利用NdeⅠ和BamHⅠ内切酶位点将基因插入至pET21a质粒中，再转化大肠杆菌构建基因工程菌。
实施例3转氨酶的摇瓶制备
将实施例1、实施例2构建所得的重组大肠杆菌分别接种至50mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.2)中，于37℃，180rpm的摇床中振荡培养15小时以上。转接2mL菌体培养液于50mL含氯霉素(或氨苄青霉素)的LB培养基中，置于同样条件下振荡培养，定时测量菌液在600nm下的吸光值以监测菌体生长密度。当菌液的OD 600值在0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2mmol/L，30℃诱导表达12小时以上。表达后通过离心(8000rpm，15min，4℃)收集菌体，并用磷酸缓冲液(pH7.2，50mM)清洗两次，分散于同样预冷的缓冲液中，于冰水浴中进行超声破碎。离心(8000rpm，30min，4℃)收集上清液，浓缩、冷冻干燥得到重组转氨酶或重组转氨酶突变体的粗品粉末。实施例4重组转氨酶活力的测定
以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯为底物，HPLC检测实施例3制备的重组转氨酶活性，从而筛选出能够表达具有最高转氨酶酶活的基因工程菌。使用岛津LC-20AT高效液相色谱仪，配备C18柱(150mm×4.6mm,5um)，流动相0.1％三氟乙酸水溶液-甲醇(40:60)，检测波长254nm，柱温30℃，流速1.0mL/min。
检测条件为：反应体系总体积2mL，其中包含0.5-50μmol/L底物，200μL 1mol/L异丙胺盐酸盐，100μmol 5-磷酸吡哆醛，5％-25％(v/v)DMSO，500μL酶液，45℃反应30min，测定底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的消耗量和产物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的生成量。
酶活力单位(U)的定义为：在上述反应条件下，毎分钟催化生成1μmol(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯所需的酶量或每分钟消耗1μmol底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯所需的酶量。
测得重组转氨酶突变体的比酶活为765U/g，比野生型的酶活提高了3倍以上。
实施例5重组转氨酶的发酵制备
发酵培养基成分为：磷酸氢二钾10.8g/L，磷酸二氢钾4.8g/L，硫酸铵0.49g/L，NaCl 9.5g/L，酵母提取物10.2g/L，蛋白胨6.2g/L，甘油15.2g/L，钼酸铵四水合物0.01g/L。发酵液通过加入氨水维持pH 7.0，罐温32℃，搅拌转速300-1300rpm，发酵过程中控制DO35％以上，空气流量1:1.5vvm。接入种子液的OD600为0.68，接入量为发酵液体积的10-15％，发酵液OD600达0.8时加入IPTG至终浓度1mmol/L以诱导转氨酶的表达，此后继续发酵18小时，罐温25℃。发酵过程中通过加入含甘油412g/L、酵母提取物136g/L，氯化铵10.7g/L、钼酸铵四水合物0.03mg/L的溶液维持培养物的生长。发酵结束后将培养物冷却至4℃保存。
将发酵液经离心(10000rpm，15min)、细胞破碎、冷冻干燥等常规处理，制备得到转氨酶多肽冻干粉并于-80℃保存。
实施例6重组转氨酶催化合成(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯
向2000L反应釜中加入34.2kg底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，138.6kg异丙胺盐酸盐，0.58kg 5-磷酸吡哆醛(PLP)，578L DMSO，随后向釜内投加按照实施例5方法制备的重组转氨酶冻干粉1.16kg，在氮气保护下，升温至45℃，并加入4mol/L异丙胺水溶液调节反应液的pH为8.5。反应过程中通过加入4mol/L异丙胺水溶液控制反应液的pH为8.5-9.0，搅拌反应至底物含量降至1％以下时终止反应。
反应终止后经离心、萃取、脱色等操作，得到产物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯：1H NMR(CDCl3)d7.08(m,1H),6.94(m,1H),3.85(s,2H),3.77(s,3H),3.55(s,2H)；13C NMR(CDCl3)d 197.9,167.1,156.9,154.5,150.4,147.9,145.5,119.4,117.0,105.5,52.4,48.3,41.9。经HPLC分析，确定底物转化率98.2％，产物ee 99％。
产物ee值的具体分析条件为：Chiralpak AD-H色谱柱(150mm×4.6mm,5um)，流动相正己烷-异丙醇(80:20，v/v)；检测波长254nm，流速1mL/min，柱温30℃。
<110> 宿迁阿尔法科技有限公司
<120> 一种重组转氨酶及其制备方法与应用
<160> 5
<210> 1
<211> 972
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组转氨酶突变体的编码基因
<400> 1
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agcgacaatc ctttctctaa gggcattgct tatgtggaag gaaagctcgt ctttcctagt 120
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atatgggatg gctattggga gatgcactac aatccggcgt atagttttcc tgttgactat 960
ggcagtggct aa 972
<210> 2
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组转氨酶突变体氨基酸序列
<400> 2
Met Ala Ser Met Asp Lys Val Phe Ser Gly Tyr Tyr Ala Arg Gln Lys
5 10 15
Let Let Glt Arg Ser Asp Asn Pro Phe Ser Lys Gly Ile Ala Tyr Val
20 25 30
Glt Gly Lys Let Val Thr Pro Ser Asp Ala Arg Ile Pro Let Let Asp
35 40 45
Glt Gly Phe Met His Ser Asp Let Thr Tyr Asp Val Ile Ser Val Trp
50 55 60
Asp Gly Arg Phe Phe Arg Let Asp Asp His Let Gln Arg Ile Let Glt
65 70 75 80
Ser Cys Asp Lys Met Arg Let Lys Phe Pro Let Ala Let Ser Phe Val
85 90 95
Glt Asn Ile Let Ala Glt Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Arg Asp Ala
100 105 110
Phe Val Glt Val Ile Val Thr Arg Gly Let Thr Gly Val Arg Gly Ser
115 120 125
Lys Pro Glt Asp Let Tyr Asn Asn Asn Ile Tyr Let Let Val Let Pro
130 135 140
Tyr Ile Trp Val Met Ala Pro Glt Asn Gln Let His Gly Gly Glt Ala
145 150 155 160
Ile Ile Thr Arg Thr Val Arg Arg Thr Pro Pro Gly Ala Phe Asp Pro
165 170 175
Thr Ile Lys Asn Let Gln Trp Gly Asp Let Thr Lys Gly Let Phe Glt
180 185 190
Ala Met Asp Arg Gly Ala Thr Tyr Pro Phe Let Thr Asp Gly Asp Thr
195 200 205
Asn Let Thr Glt Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Let Val Lys Asn Gly
210 215 220
Ile Ile Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Let Arg Gly Ile Thr Arg Lys
225 230 235 240
Ser Val Ile Asp Val Ala Arg Ala Asn Ser Ile Asp Ile Arg Let Glt
245 250 255
Val Val Pro Val Glt Gln Ala Tyr His Ser Asp Glt Ile Phe Met Cys
260 265 270
Thr Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Let Let Asp Gly Gln Pro
275 280 285
Val Asn Asp Gly Gln Val Gly Pro Ile Thr Lys Lys Ile Trp Asp Gly
290 295 300
Tyr Trp Glt Met His Tyr Asn Pro Ala Tyr Ser Phe Pro Val Asp Tyr
305 310 315 320
Gly Ser Gly
<210> 3
<211> 972
<212> DNA
<213> 烟曲霉（Aspergillus fumigatus Af293）
<220>
<223> 烟曲霉（Aspergillus fumigatus Af293）转氨酶的基因序列
<400> 3
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agcgacaatc ctttctctaa gggcattgct tatgtggaag gaaagctcgt cttacctagt 120
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cttgttcttc catacatttg ggttatggcg cctgagaacc agctccatgg tggcgaggct 480
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ccatttctca ctgatggaga caccaacctt actgaaggat ctggtttcaa cattgttttg 660
gtgaagaacg gtattatcta tacccctgat cgaggtgtct tgcgagggat cacacgtaaa 720
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atatgggatg gctattggga gatgcactac aatccggcgt atagttttcc tgttgactat 960
ggcagtggct aa 972
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物F1
<400> 4
ggccacatat gtggacaaag tcttttcggg a 31
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物R1
<400> 5
ggctgggatc ctag cactg ccatagtcaa ca 32

Claims (10)

1.一种磷酸吡哆醛依赖的重组转氨酶突变体，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的重组转氨酶突变体的基因，其特征在于核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
3.一种含有权利要求2所述的基因的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于表达载体系统为pET21a。
5.一种用于生产权利要求1所述的重组转氨酶突变体的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌中含有权利要求2所述的基因。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌的宿主细胞为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21(DE3)。
7.一种权利要求1所述的重组转氨酶突变体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：培养权利要求5中所述的基因工程菌，获得重组表达的重组转氨酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法包括在生产罐发酵条件下，进行工业化制备所述重组转氨酶突变体的步骤；所述的生产罐发酵条件为：DO 35%以上，空气流量1:1.5 vvm。
9.权利要求1所述的重组转氨酶作为催化剂在制备西他列汀或其中间体中的应用；所述的中间体为(R)-3-氨基-4-(2, 4, 5-三氟苯基)-丁酸甲酯。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于在pH 6.5~7.5的反应液中，在5-磷酸吡哆醛存在下，在权利要求1所述的重组转氨酶突变体作用下，以3-羰基- 4-(2, 4, 5-三氟苯基)-丁酸甲酯为底物不对称酶催化还原制备光学手性胺化合物(R)-3-氨基-4-(2, 4, 5-三氟苯基)-丁酸甲酯。
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