CN103555739A

CN103555739A - 一种重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因及其制备方法

Info

Publication number: CN103555739A
Application number: CN201310504755.0A
Authority: CN
Inventors: 胡春霞
Original assignee: Shaoxing University Yuanpei College
Current assignee: Shaoxing University Yuanpei College
Priority date: 2013-10-23
Filing date: 2013-10-23
Publication date: 2014-02-05

Abstract

本发明涉及一种芽孢杆菌的重组微生物谷氨酰胺转氨酶酶基因及其表达，属于食品工业生物技术领域。将来自芽孢杆菌的谷氨酰胺转氨酶基因克隆分离后，构建了含有该基因的乳酸乳球菌重组表达载体spNZ8048-Tgase，并在乳酸乳球菌N9800菌株中获得了表达，将该重组乳酸乳球菌命名为L.lactis；表达产物经过分离纯化后，得到纯度为90%左右的重组谷氨酰胺转氨酶，活性达到2.2U/mL，高于原始菌株2倍以上。本发明利用乳酸乳球菌生产谷氨酰胺转氨酶，具有操作简单，产酶活性较高，生产成本低，安全性好，表达的酶易于分离纯化等优点，为谷氨酰胺转氨酶的生产提供一条切实可行的途径。

Description

一种重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域及蛋白质表达领域，尤其涉及谷氨酰胺转胺酶酶原基因在乳酸菌表达系统中的可溶性表达，具体为一种重组芽孢杆菌的微生物谷氨酰胺转氨酶的制备方法。

背景技术

畜产品加工业是联结畜牧生产与人民生活需要的重要产业。一方面，随畜牧业的快速发展，我国畜产品呈现出供需平衡并有剩余的特点，但畜产品加工率只有5%左右，远低于发达国家的60%～70%，畜产品加工业的严重滞后，制约了畜牧业的快速、高效发展。另一方面，随人们经济收入的增加、生活水平的提高、膳食结构的优化及生活节奏的加快，对工业化食品特别是肉类、乳类等畜产品加工制品（多样化、方便化、营养化、安全化、个性化）的需求量不断增加。另外，畜产品加工业作为畜牧业面向消费市场的后续加工产业，为增加产品附加值、农民就业机会及农民收入提供了途径。因此，大力发展畜产品加工业对保障畜牧业的可持续发展、人们生活质量的提高及带动农业增效、农民致富具有重要意义。

为提高加工畜产品的风味、口感、质地及营养价值，添加多种食品增味剂是畜产品加工过程中必不可少的环节。目前，我国批准许可使用的食品增味剂主要有Ｌ-谷氨酸钠、5'-鸟苷酸二钠、5'-肌苷酸二钠、5'-呈味核苷酸二钠、琥珀酸二钠和L-丙氨酸、甘氨酸以及植物水解蛋白、动物水解蛋白、酵母抽提物等化学增味剂。这些化学增味剂虽然能够有效改善食品风味，但其中的不少增味剂是采用化学方法进行生产的，这往往会给产品品质带来一些不好的影响，如利用酸水解法制取水解植物蛋白时，会产生1-氯丙二醇、1，3-二氯丙醇等致癌物，这严重影响了食品安全和消费者身体健康。随着生物技术等相关学科的飞速发展，利用生物技术如植物组织培养法、微生物发酵法、酶转化法等方法生产增味剂是获得天然风味物质的有效途径，因而生物技术在增味剂的生产中将会得到越来越广泛的应用。随之而来的开发安全、经济、高效的增味剂用于动物加工产品的问题是迫切需要解决的。

谷氨酰胺转胺酶（transglutaminase简称TGase），又称转谷氨酰胺酶，能催化酰基反应，从而导致蛋白质分子内和分子间或蛋白质分子与氨基酸分子间发生共价交联，生成网络状的超大蛋白质分子，进而发生凝胶，以此改善食品的品质、口味，提高食品的强度和稳定性。与传统的化学增味剂相比，新型增味剂谷氨酰胺转胺酶具有以下优点：（1）提高蛋白质营养价值，生产出满足人们需求的新型蛋白食品；（2）本身是一种蛋白质，可被人体内的酶降解和消化，具有安全性和营养性；（3）采用酶法修饰对食品进行处理，具有安全、快速、专一性强、对食品营养无破坏，而且对食品的色、香、味以及口感不产生副作用；（4）可以广泛的用于面制品、乳制品、肉制品、水产品等各个领域，可替代有致癌作用的强筋剂溴酸钾，可部分替代硝酸盐、亚硝酸盐等稳定剂，延长保质期；（5）由食品级微生物产生，可以直接将发酵液添加到食品中或是提纯后添加，应用较为方便。

1989年，Ando和Motoki等人首先报道了微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的研究情况。1993年日本味之素公司和天野公司已成功利用微生物发酵生产该酶制剂，投入市场获得了巨大的经济效益，2000年日本谷氨酰胺转胺酶相关的食品销售额达2000亿日元。肉类加工等行业方面，谷氨酰胺转胺酶在国外应用较多，而国内相对应用较少，其加工以传统方式为主，这不但影响产品的美观，还影响到产品的质量。随着我国经济的迅速发展，人民生活水平的不断提高，人们对新型食品有更高的要求，而作为安全、健康的新型、高效食品添加剂和酶制剂产品，谷氨酰胺转胺酶可以在食品加工等多个领域发挥积极的作用，并产生巨大的经济效益。

现代分子生物学技术的迅速发展，为从微观分子水平改造基因序列，生产出高效、安全、低成本的天然食品增味剂提供了可能，利用基因工程技术构建基因工程菌来生产TGase是新的研究领域。目前，编码TGase的完整基因和TGase蛋白质氨基酸顺序已经被克隆和测序，他们得到的TGase酶活水平很低，远不能达到工业化的水平；微生物来源的谷氨酰胺转氨酶，因其生产不受季节和原料限制，是谷氨酰胺转氨酶家族中最有可能进行大规模生产应用的一种，尽管有多种微生物自然状态下能产谷氨酰胺转氨酶，但大多数的产酶量不高；而通过常规诱变育种技术进行育种，耗时费力，又很难筛选到产谷氨酰胺转氨酶高产菌株，这就造成了实际生产成本较高，限制了该酶的大规模工业化生产。

发明内容

本发明解决上述问题是运用分子生物学技术和基因工程技术，将微生物谷氨酰胺转氨酶基因克隆至大肠杆菌，然后通过诱导基因高效率表达谷氨酰胺转氨酶，从而提高该酶的产量和降低该酶的生产成本。具体的技术方案如下：

1.首先提供一种产谷氨酰胺转氨酶细菌的分离和谷氨酰胺转氨酶基因的克隆的方法：提取芽孢杆菌基因组DNA后，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增出谷氨酰胺转氨酶全长基因；

2.提供一种谷氨酰胺转氨酶基因乳酸乳球菌表达载体构建的方法：主要是利用乳酸乳球菌表达载体spNZ8048进行谷氨酰胺转氨酶基因的表达；

3.提供重组谷氨酰胺转氨酶分离纯化的方法，主要是利用乙醇沉淀和阳离子交换柱的方法获得高纯度的谷氨酰胺转氨酶，进而进行谷氨酰胺转氨酶在乳酸乳球菌中的表达。

上述技术方案的进一步设置如下：

所述的谷氨酰胺转氨酶基因的获取步骤为：（1）提取芽孢杆菌基因组DNA；（2）谷氨酰胺转氨酶基因的PCR扩增；（3）PCR产物的回收纯化；（4）谷氨酰胺转氨酶基因的T/A克隆；（5）谷氨酰胺转氨酶基因双脱氧终止法双向测序。

所述的微生物谷氨酰胺转氨酶基因在乳酸乳球菌中表达的具体步骤为：（1）构建表达载体；（2）重组谷氨酰胺转氨酶的分离纯化，分离纯化方法为：加入终浓度约为10ng/mL的nisin诱导表达2～3h后，收集发酵液于4℃冷冻离心，上清液采用乙醇沉淀法进行分离纯化，得到的沉淀蛋白通过阳离子交换柱，利用buffer A（含0～1mol/L NaCl）进行梯度洗脱，再通过测定酶活性确认纯化结果。

本发明所获得的重组芽孢杆菌的谷氨酰胺转氨酶原基因的长度是738bp，用DNAtools5.1分析，该基因编码为246个氨基酸组成的成熟肽，理论分子量为28.5kDa，谷氨酰胺转氨酶全长基因序列及编码氨基酸序列如下：

本发明有益效果：

重组后的谷氨酰胺转氨酶酶活性达到2.2U/ml，高于原始菌株2～3倍，且利用乳酸乳球菌摇瓶发酵生产该酶的工艺流程少，原料简单且价格低廉。而在一些对酶纯度要求不高的行业，诸如皮革制品、纺织品工业、饲料加工等行业，也可直接使用未经纯化的粗酶，这将大大降低这些行业的生产成本。譬如：若利用未经纯化的重组谷氨酰胺转氨酶对酪蛋白进行改性研究发现，粗酶也可很好的交联酪蛋白，使之溶液粘度增加，乳化能力提高，发泡性下降；另外，通过重组的谷氨酰胺转氨酶粘和小体型虾，获得了体积增大且经煎煮后也不易分离的重叠虾，大幅度提高了小体型虾的商品价值。总之，通过这一方法生产的重组谷氨酰胺转氨酶同非重组谷氨酰胺转氨酶一样可以广泛应用于化妆品行业、食品加工业等领域中。

附图说明

图1谷氨酰胺转氨酶基因的PCR扩增电泳图谱（本图中，M：3000DNAMarker；1：PCR产物）；

图2为用于生产重组谷氨酰胺转氨酶的表达载体；

图3为重组质粒spNZ8048-Tgase双酶切鉴定结果（本图中，1：BamH I；M：Xba I酶切产物）；

图4重组谷氨酰胺转氨酶的蛋白电泳分析和纯化（本图中，M：蛋白marker；1：L.lactis[spNZ8048-Tgase]；2：谷氨酰胺转氨酶的纯化条带）。

具体实施方式

1.微生物谷氨酰胺转氨酶基因的分离克隆：从产谷氨酰胺转氨酶的芽孢杆菌提取基因组DNA为模板，具体DNA提取方法参照Promega说明书，根据Genbank中报道的枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶基因序列（登录号为：E13095）设计并合成引物如下：上游引物TgP1：

5′-AGGGGATCCGATTATTGTATCAGGACAATTGCTCCGT-3′，

TgP2：5′-GATTCTAGA TCATTAGCGGACGATGCGGAAAAG-3′；在其5端分别加入BamHⅠ和XbaI酶切位点和相应的保护碱基，进行谷氨酰胺转氨酶基因全长的扩增，PCR扩增条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，59℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃后延伸反应10min；制备0.8%TBE琼脂糖凝胶，取PCR扩增产物5μL与6×凝胶电泳上样缓冲液1μL混匀后电泳，电压120V，电流100mA，电泳完毕后，将凝胶置于ImageMaster VDS成像系统（pharmacia公司）中成相并拍照，结果见图1；利用PCR割胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，与克隆pUCm-T Vector载体（上海生工生物工程公司）进行连接；10μL连接反应体系为：pUCm-T载体1.0μL，PCR产物7.0μL，10×T₄DNA连接酶缓冲液1.0μL，T4DNA连接酶1.0μL，4℃连接过夜，连接产物转化感受态E.coli Top10细胞，并在含有X-gal、IPTG及Amp的LB平板上进行重组子的筛选，挑选白色菌落，抽提质粒DNA进行酶切和PCR鉴定出阳性重组子并命名为pUCm-T-Tgase，并将含Tgase的重组克隆菌送上海英骏生物工程公司进行序列测定，测序最终结果如下：

将所获得的上述基因序列同GenBank中已登录的其它Tgase基因序列进行BLAST搜索比较，发现核苷酸序列的同源性达到了95%～99%。

2.重组表达载体spNZ8048-Tgase的构建：将重组载体pUCm-T-Tgase和表达载体spNZ8048（见图2）分别用BamH I和Xba I双酶切，得到Tgase目的片段和酶切完全的spNZ8048载体，割胶回收目的片段，连接转化中间宿主菌E.coliMC1061感受态细胞后，涂布LB平板（含有100μg/mL链霉素和10μg/mL氯霉素），37℃培养过夜；从平板上挑斑于LB液体培养基（含有100μg/mL链霉素和10μg/mL氯霉素）中过夜培养，提取质粒，用BamHI和XbaI对初步筛选到的阳性质粒进行双酶切鉴定；酶切鉴定结果可得到大小为750bp左右的目的片段，表明Tgase基因已经成功构建到表达载体spNZ8048中；提取重组质粒，并命名为spNZ8048-Tgase；双酶切产物电泳检测结果见图3。将重组表达质粒spNZ8048-Tgase电击转化乳酸乳球菌L.lactis NZ9800感受态细胞，产物涂布含10.0μg/mL氯霉素的GM17平板，培养后，在平板上挑取单菌落，在含10.0μg/mL氯霉素的GM17培养基中培养，提取质粒，清洗后，酶切鉴定为阳性的菌株命名为L.lactis[spNZ8048-Tgase]。

3.重组谷氨酰胺转氨酶的提取：将重组乳酸乳球菌L.lactis NZ9800[spNZ8048-Tgase]转接到5mL含氯霉素（终浓度为10μg/mL）的GM17液体培养基中，在30℃，180r/min培养过夜后；按1:25的比例稀释至10mL新鲜培养基中，30℃培养至OD600约为0.4，然后按1:1000的比例稀释加入过夜培养的L.lactis NZ9700菌液上清（含nisin，终浓度约为10ng/mL）诱导表达2～3h，收集发酵液于4℃冷冻离心，上清液加入终浓度为70%（V/V）的乙醇，得到沉淀蛋白迅速溶解在50mmol/L pH5.0醋酸钠缓冲液（buffer A）中，然后以1mL/min流速通过阳离子交换柱（25mL Fractogel EMD SO₃ ^-column，Merk，Darmstadt，Germany），利用含有0～1mol/L NaCl的buffer A梯度洗脱。TGase在NaCl浓度为0.25～0.35mol/L之间洗脱下来。纯化得到的谷氨酰胺转氨酶测定酶活进行确认。经过SDS-PAGE结果证明电泳的条带为一条，分子量30KD左右，且表达量较高，见图4。谷氨酰胺转氨酶酶活单位定义为：pH6.0，7℃时，每分钟催化底物生成1mol CBZ-Glu（Gly）γ-单氧肟酸产物所需的酶量。重组后的谷氨酰胺转氨酶酶活性达到2.2U/mL，高于原始菌株2～3倍，且利用乳酸乳球菌摇瓶发酵生产该酶的工艺流程少，原料简单且价格低廉。

Claims

1.一种重组微生物谷氨酰胺转氨酶原基因，其特征在于，该基因长度是738bp，该基因编码为246个氨基酸组成的成熟肽，理论分子量为28.5kDa，谷氨酰胺转氨酶全长基因序列及编码氨基酸序列如下：

。

2.根据权利要求1所述一种重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

A、产谷氨酰胺转氨酶细菌的分离和谷氨酰胺转氨酶基因的克隆；

B、谷氨酰胺转氨酶基因乳酸乳球菌表达载体构建；

C、谷氨酰胺转氨酶在乳酸乳球菌中的表达。

3.根据权利要求2所述的一种重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因的制备方法，其特征在于，所述的谷氨酰胺转氨酶基因的获取步骤为：（1）提取芽孢杆菌基因组DNA；（2）谷氨酰胺转氨酶基因的PCR扩增；（3）PCR产物的回收纯化；（4）谷氨酰胺转氨酶基因的T/A克隆；（5）谷氨酰胺转氨酶基因双脱氧终止法双向测序。

4.根据权利要求2或3所述的一种重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因的制备方法，其特征在于，所述的微生物谷氨酰胺转氨酶基因在乳酸乳球菌中表达的具体步骤为：（1）构建表达载体；（2）重组谷氨酰胺转氨酶的分离纯化。

5.根据权利要求4所述的一种重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因的制备方法，其特征在于，所述的重组谷氨酰胺转氨酶的分离纯化方法为：加入终浓度约为10ng/mL的nisin诱导表达2～3h后，收集发酵液于4℃冷冻离心，上清液采用乙醇沉淀法进行分离纯化，得到的沉淀蛋白通过阳离子交换柱，利用buffer A进行梯度洗脱，再通过测定酶活性确认纯化结果。

6.根据权利要求5所述的一种重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因的制备方法，其特征在于：所述的buffer A含0～1mol/L NaCl。