CN102174456A - 产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌及其构建方法，主要内容是从枯草芽孢杆菌中提取染色体DNA、设计引物、PCR获得目的基因、构建重组质粒、利用枯草芽孢杆菌表达系统DB104/pWB980，构建生产谷氨酰胺转氨酶的生产菌株，将谷氨酰胺转氨酶进行分泌表达。本发明以枯草芽孢杆菌为基础，运用基因工程重组技术构建基因工程菌株，工程菌发酵液酶活达2U/ml，符合当前生物药物领域发展趋势，不仅具有较强的基础理论研究价值，而且具有巨大的经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。

Description

产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及基因工程菌株及其构建方法，尤其是一种产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌及其构建方法。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶是一种可以催化转酰基反应，能够使蛋白质(或多肽)之间发生共价交联，交联后可使改变蛋白质具有一些特性，具体包括：1、使蛋白质改性，改性后的蛋白质其塑性、持水性、水溶性和功能性得到改善；2、保护食品中的赖氨酸免受各种化学反应的破坏；3、可用于包埋脂类或脂溶性物质；4、可以形成耐热、耐水性的膜；在形成凝胶过程中不需要热处理；5、通过将包含各种必需氨基酸的蛋白质之间交联，提高蛋白质的营养价值。目前，转谷氨酰胺酶已应用于肉制品、鱼肉制品、乳制品、植物蛋白制品、焙烤制品、固定化酶以及可食性包装中。

利用工程菌生产谷氨酰胺转氨酶是现在研究的热点，特别是用大肠杆菌和谷草芽孢杆菌这两个较为成熟的表达体系，但由于谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中大部分以包涵体的形式表达出来，后续的复性过程较为复杂且费用较高，对大规模工业化生产有一定的局限性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌及其构建方法，构建的工程菌株增加了谷氨酰胺转氨酶基因的拷贝数，有效提高酶的表达量。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌，宿主菌为枯草芽孢杆菌，包含重组质粒pWB980-tg。

而且，所述重组质粒pWB980-tg中的tg大小为谷氨酰胺转氨酶基因大小为738bp，其序列为序列3。

而且，所述重组质粒pWB980-tg中的tg的来源为枯草芽孢杆菌。

而且，所述重组质粒pWB980-tg具有表达该基因所需的控制元件，含有一个启动子和一个终止子，在启动子和终止子之间有一段多克隆位点，这些多克隆位点分别包含有若干单一酶切位点。

一种产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌的构建方法，构建方法包括如下步骤：

(1)根据GenBank中已报道的枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶基因为依据，设计引物，引物序列为序列1和序列2，利用PCR得到谷氨酰胺转氨酶基因tg；

(2)表达载体的构建：将步骤(1)得到的目的基因酶切后与表达载体pWB980连接，鉴定正确后，获得重组质粒为pWB980-tg；

(3)转化和表达：重组质粒pWB980-tg转化表达宿主枯草芽孢杆菌中，构建基因工程菌，鉴定正确后即为产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌。

而且，所述表达载体pWB980来源于携带质粒pWB980的枯草芽孢杆菌菌株。

而且，所述重组质粒pWB980-tg中的tg大小为谷氨酰胺转氨酶基因大小为738bp，其序列为序列3。

而且，所述表达载体pWB980-tg中的tg的来源为枯草芽孢杆菌。

本发明的积极效果：

1、本发明以工业化枯草芽孢杆菌为基础，采用基因工程重组技术构建DB104/pWB980基因工程菌株，构建的工程菌株增加了谷氨酰胺转氨酶基因的拷贝数，有效提高酶的表达量，达到谷氨酰胺转氨酶大量合成，工程菌发酵液酶活达2U/ml，为进一步批量生产谷氨酰胺转氨酶提供有效的途径，打破大量生产谷氨酰胺转氨酶纯化费用昂贵的瓶颈，符合当前生物药物领域发展趋势，不仅具有较强的基础理论研究价值，而且具有巨大的经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。

2、本发明运用发酵工程技术将DB104/pWB980基因工程菌株进行发酵，得到了一个基因工程菌的最适发酵条件，不仅得率高，还可以节约工业用料，具有明显社会效益。

附图说明：

图1为本发明的扩增电泳图，其中：1、PCR获得的谷氨酰胺转氨酶基因；2、1kb DNAMarker；

图2为本发明pWB980-tg的重组表达质粒的结构图；

图3为本发明表达蛋白的SDS-PAGE分析；

图4为本发明构建基因工程菌株及其利用该菌株发酵生产谷氨酰胺转氨酶的流程图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明的主要思想为：枯草芽孢杆菌本身存在谷氨酰胺转氨酶基因，故其有大量表达谷氨酰胺转氨酶的潜能，我们可通过基因工程的方法构建新的含谷氨酰胺转氨酶基因的表达载体，将其转入枯草芽孢杆菌中以实现该酶的大量表达，然后通过对产谷氨酰胺转氨酶的枯草芽孢杆菌的发酵条件进行优化，确定谷氨酰胺转氨酶的最适表达条件，进一步提高谷氨酰胺转氨酶的产量，最终实现谷氨酰胺转氨酶的工业化高表达。

本发明以大量生产谷氨酰胺转氨酶为目的，利用基因工程技术构建重组菌株，实现谷氨酰胺转氨酶的大量分泌表达，本发明所用的基因来源是枯草芽孢杆菌DB104，本发明中重组载体的宿主细胞也为枯草芽孢杆菌DB104。

谷氨酰胺转氨酶DNA序列的重组表达载体除包括编码谷氨酰胺转氨酶的DNA序列外，还具有表达该基因所需的控制元件，这些载体携带有完整的阅读框架，即含有一个启动子和一个终止子，在启动子和终止子之间有一段多克隆位点，这些多克隆位点分别包含有若干单一酶切位点，选用限制酶将载体切成线状，并用DNA连接酶将酶基因连接到所选载体上，从而构建成一个在启动子和终止子之间含有目的基因的重组载体。

一种产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌及其构建方法，方法的步骤如下：

1、谷氨酰胺转氨酶基因的扩增

提取枯草芽孢杆菌DB104的基因组，根据GenBank中已报道的枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶基因为依据，设计如下引物：

上游引物P1：5’-CCCAAGCTTGGATGATTATTGTATCAGGACAATTGCTCCGT-3’酶切位点为HindIII；

下游引物P2：5’-CGCGGATCCTTAGCGGACGATGCGGAAAAG-3’酶切位点为BamH I；

以枯草芽孢杆菌DB104染色体DNA为模板进行PCR扩增，按以下次序，在灭菌EP管内混合，

a.采用20μL的PCR扩增体系：

Buffer    2μL

dNTP      1.6μL

上游引物  1μL

下游引物  1μL  20μL

模板      2μL

聚合酶    0.2μL

无菌水    12.2μL

b.用于扩增目的基因的PCR条件：

95℃    30s

59℃    1min    30cycles

72℃    1min

72℃    10min

将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测到扩增产物，结果如图1所示，可以看到在约750bp处出现一条特异性条带，其大小与目的基因大小完全吻合，连接在pWB980载体上，得到pWB980-tg，将其测序可知(委托北京宝生物)扩增到得谷氨酰胺转氨酶基因的DNA序列如如序列1，本方法所得到并表达的谷氨酰胺转氨酶基因与已报道的该酶基因相似性98.78％，谷氨酰胺转氨酶基因大小为738bp，其中738的序列不包含酶切位点和保护碱基。

2、重组质粒的构建

(1)表达载体的制备

在卡纳霉素(50μg/mL)的LB培养基中接种携带质粒pWB980的枯草芽孢杆菌菌株，于37℃振荡培养过夜；将1.5mL菌液转入微量离心管中，12000r/min离心30s收集菌体，弃上清，控干残液；将沉淀重悬于100μL预冷的溶液1(50mmol蔗糖，25mmol Tris，10mmol EDTA，PH8.0)，混合均匀，加入10μL(10mg/ml)溶菌酶37℃反应30min；加入200μL新配置的溶液2(0.2mol NaOH，1％SDS)盖紧管口，轻轻摇匀，放置冰上1-2min至液体清亮；加入150μL预冷的溶液3(3mol乙酸甲，PH4.8)轻轻转动离心管，使溶液3在粘稠的细菌裂解液中混合均匀，冰浴3-5min，12000r/min，离心5min，将上清液转移到另一管中，12000r/min离心5min，再将上清移到另一离心管中；在上清中加入2-2.5倍体积的无水乙醇，混匀，冰浴(或-20℃)放置30min，12000r/min，离心5min，收集质粒DNA沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀2-3次，弃去残液，空气中干燥10-20min，用20μL的双蒸水溶解沉淀，所获得的质粒pWB980即可用作连接谷氨酰胺转氨酶基因的载体。

(2)谷氨酰胺转氨酶基因(tg)表达载体的构建

①对载体pWB980和PCR产物进行双酶切，然后电泳、切胶回收酶切后的质粒和PCR产物，均选用50μL酶切体系：

BamH I酶               1μL

缓冲液                 5μL    50μL 37℃20h

质粒pWB980和PCR产物    20μL

无菌水                 23μL

上述酶切片段采用DNA纯化试剂盒(TaKaBa公司)进行纯化，所获得的线性纯化pWB980和谷氨酰胺转氨酶基因(tg)即可用来构建重组质粒，pWB980分子量为3787bp，pWB980-tg大小为4539bp。

②载体和目的基因的连接

均选用10μL连接体系：

质粒pWB980    1μL    10μL 14℃ 15h

谷氨酰胺转氨酶基因(tg)4μL

所得连接混合物采用化学转化法转化枯草芽孢杆菌DB104。

3、基因工程菌株的构建

按下述方法制备枯草芽孢杆菌DB104的感受态细胞：挑取单菌落接种于2mlGM I培养基中，30℃慢摇过夜；按10％接种量转接于2mlGM I培养基中，37℃快摇3.5h；按10％接种量转接于2mlGM II培养基中，37℃快摇1.5h；4000r/min离心5min，取菌，菌体重悬于1/10体积的上清液中，即得感受态细胞。

使用时将感受态细胞与50ul感受态细胞需25ngDNA，质粒混匀，37℃水浴保温30min，于37℃下250r/min培养2h。按每个平板100μL涂布到含卡纳霉素(50μg/mL)的LA平板上，37℃倒置培养过夜(16-20h)。从平板上挑取单一菌落，接种于液体LB培养基中，于37℃培养12-18h，然后小量提取质粒DNA，用相应的限制性内切酶进行双酶切鉴定。重组质粒构建过程图见图2。

4、谷氨酰胺转氨酶的表达

对重组菌和对照菌枯草芽孢杆菌DB104于37℃培养过夜，按1％(v∶v)的接种量转接于50mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在37℃、180r/min条件下培养过夜，发酵液于12000r/min离心5min，取300μL上清，向其中加入900μL丙酮，室温沉淀1h，12000r/min离心5min，弃去上清，待丙酮挥发完全后向沉淀中加入30μL电泳上样缓冲液，沸水浴5min，12000r/min离心10min，取上清液进行SDS-PAGE分析，结果见图3。

5、谷氨酰胺转氨酶酶活的测定

(1)酶活定义

每分钟催化1nmol/L的丹磺尸胺(MDC)插入到N，N-二甲基酪蛋白所需的酶量定义为一个活力单位。

(2)反应条件

总体积2.4mL：N，N-二甲基酪蛋白1mg/mL，丹磺尸胺(MDC)15μmol/L，Tris·HCl(pH7.5)50mmol/L，DTT 3mmol/L，酶液200μL。反应体系于60℃反应30min，加入10mmol/L(NH4)₂SO₄终止反应，于激发波长350nm和发射波长480nm下检测荧光强度。

(3)酶活计算

$\frac{\mathrm{\ΔI}}{13\×I_0}$

MDC插入量(nmol)＝    ×[MDC]

其中ΔI为反应体系荧光强度的增加值，即ΔI＝I-I₀，I为产物的荧光强度，I₀为不加酶液时对照反应荧光强度，[MDC]为反应体系中MDC的浓度，即15μmol/L。

产物的荧光强度(I)为不加酶液时对照反应荧光强度(IO)的13倍，如果[MDC]全部被插入到N，N-二甲基酪蛋白中，则体系的荧光强度应为13×IO，测出反应体系荧光强度的增加值ΔI(＝I-IO)，可以求出MDC的插入量。经实验测定，工程菌株的酶活达到2U/ml，而对照菌株无法检测到酶活，具文献报道，谷氨酰胺转氨酶在野生型菌株中为非分泌型表达，故检测不到酶活。

Claims (8)

1.一种产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌，其特征在于：宿主菌为枯草芽孢杆菌，包含重组质粒pWB980-tg。

2.根据权利要求1所述的产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌，其特征在于：所述重组质粒pWB980-tg中的tg大小为谷氨酰胺转氨酶基因大小为738bp，其序列为序列3。

3.根据权利要求1所述的产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌，其特征在于：所述重组质粒pWB980-tg中的tg的来源为枯草芽孢杆菌。

4.根据权利要求1所述的产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌，其特征在于：所述重组质粒pWB980-tg具有表达该基因所需的控制元件，含有一个启动子和一个终止子，在启动子和终止子之间有一段多克隆位点，这些多克隆位点分别包含有若干单一酶切位点。

5.一种产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于：构建方法包括如下步骤：

(1)根据GenBank中已报道的枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶基因为依据，设计引物，引物序列为序列1和序列2，利用PCR得到谷氨酰胺转氨酶基因tg；

(2)表达载体的构建：将步骤(1)得到的目的基因酶切后与表达载体pWB980连接，鉴定正确后，获得重组质粒为pWB980-tg；

(3)转化和表达：重组质粒pWB980-tg转化表达宿主枯草芽孢杆菌中，构建基因工程菌，鉴定正确后即为产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述表达载体pWB980来源于携带质粒pWB980的枯草芽孢杆菌菌株。

7.根据权利要求5所述的产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述重组质粒pWB980-tg中的tg大小为谷氨酰胺转氨酶基因大小为738bp，其序列为序列3。

8.根据权利要求5所述的产谷氨酰胺转氨酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述表达载体pWB980-tg中的tg的来源为枯草芽孢杆菌。

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