CN108841851B

CN108841851B - 一种利用食源安全性宿主表达谷氨酰胺转氨酶的方法

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Publication number: CN108841851B
Application number: CN201810789194.6A
Authority: CN
Inventors: 王丽敏; 王玉; 付丽红; 于波
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2018-07-18
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2038-07-18
Also published as: CN108841851A

Abstract

本发明公开了一种利用食源安全性宿主表达谷氨酰胺转氨酶的方法。本发明提供了构建产谷氨酰胺转氨酶的工程菌的方法，包括：对枯草芽孢杆菌进行改造，使其表达达卡轮枝链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶，改造后的所述枯草芽孢杆菌即为工程菌。本发明与现有的以枯草芽孢杆菌为宿主的TG酶表达具有下述区别：①TG酶活力高，最终酶活达到130U/mg，满足工业生产需要；②基因整合到基因组上，性能稳定；③TG酶稳定性好，放置15天TG酶仍具有80％的活力；④非钙离子依赖性，钙离子稳定性好，存在25mM钙离子的条件下，TG酶具有更高的活性(113％)，应用范围更为广泛。本发明对于谷氨酰胺转氨酶的工业化生产具有重要意义。

Description

一种利用食源安全性宿主表达谷氨酰胺转氨酶的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用食源安全性宿主表达谷氨酰胺转氨酶的方法。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13，简称为TG酶)能够使蛋白质发生交联作用，可以改善肉制品的外观、口感、风味、营养特性，可以提升酸奶品质，提高植物蛋白的弹性和持水能力。TG酶在食品加工、包装等领域具有极其广泛的应用前景，此外，TG酶还可用于制备薄膜，替代用高分子合成材料制造的食品包装薄膜(赵华梅，王曼霞，牟志春，徐琴，蔡发(2008).食品工业中的谷氨酰胺转氨酶及其酶制剂.食品科技,9:137–141；Gabe J,Zohar B,Moran J,Ayelet F(2017)Constitutive expression of activemicrobial transglutaminase in Escherichia coli and comparativecharacterization to a known variant.BMC Biotechnol 17:23–33)。1998年美国食品与药品管理局(FDA)认定TG酶为公认安全的添加剂(GRAS)，我国已将TG酶作为新增补品种，列入食品添加剂行列。

TG酶商业化的生产方法主要有微生物发酵法和天然提取法。天然提取法是从凝血因子ⅩⅢ，或者豚鼠肝脏中提取，不仅成本昂贵，而且天然提取的产品会产生色素沉积，影响产品的外观，在食品工业中应用面临很多困难(Lin Y,Chao ML,Liu C,Chu W(2004)Cloning and expression of the transglutaminase gene from Streptoverticilliumladakanum in Streptomyces lividans.Process Biochem 39:591–598)。微生物来源TG酶属于胞外酶，近几年正在逐步取代动物来源的TG酶，成为商业生产上的主要方法。微生物来源的TG酶主要来自链霉菌属和芽孢杆菌属，而目前仅链霉菌属(S.mobaraensis)来源的TG酶实现了商业化(Liu S,Zhang D,Wang M,Cui W,Chen K,Liu Y,Du G,Chen Jian,Zhou Z(2011)The pro-region of Streptomyces hygroscopicus transglutaminase affectsits secretion by Escherichia coli.FEMS Microbiol Lett 324:98–105)。虽然链霉菌来源的TG酶是钙离子非依赖性，具有更为广阔的应用空间，但是由于链霉菌生长比缓慢，需要比较长的培养期，增加了TG酶的生产成本(中国发明专利CN96105596.0)。而且，由于链霉菌本身含有降解TG酶的蛋白酶，因此，随着时间的延长，链霉菌来源TG酶活力逐渐降低。为了克服上述缺陷，国内外研究者开展了大量基因工程菌株构建工作，将不同来源的TG酶在不同宿主中表达，包括Corynebacterium spp.，Escherichia coli，Candida boidinii以及Streptomyces spp.，但均未实现商业化(CN 1230529C；CN 104818291A；CN 103555739A；WO2016170447)。

枯草芽孢杆菌是美国食品药物管理局和中国农业部等部门批准为食品级安全菌株。已有大量在枯草芽孢杆菌中表达的报道，如蛋白酶、淀粉酶。中国专利CN201110034957.4报道了以枯草芽孢杆菌为宿主表达TG酶，酶活仅为2U/ml，无法满足工业生产需要。中国发明专利CN96105596.0报道了从枯草芽孢杆菌AJ12866和枯草芽孢杆菌AJ1307中纯化得到TG酶，虽然该酶是钙离子非依赖性，但是5mM的钙离子就抑制了20％的酶活。该专利尝试利用枯草芽孢杆菌为宿主构建重组酶，但是TG酶以包涵体形式存在。虽然枯草芽孢杆菌克隆体系已建立的较为完善，但是以食源安全性的枯草芽孢杆菌为宿主表达TG酶的专利鲜有报道。TG酶是非常有发展潜力的酶制剂，寻找更多途径实现其大规模工业化生产是未来的必然趋势。以枯草芽孢杆菌为宿主异源表达TG酶，不仅有助于缩短发酵周期，降低成本，而且可以用于食品行业，具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用食源安全性宿主表达谷氨酰胺转氨酶的方法。

第一方面，本发明要求保护一种构建产谷氨酰胺转氨酶的工程菌的方法。

本发明所提供的构建产谷氨酰胺转氨酶的工程菌的方法，包括如下步骤：对枯草芽孢杆菌进行改造，使所述枯草芽孢杆菌表达达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)来源的谷氨酰胺转氨酶，改造后的所述枯草芽孢杆菌即为工程菌。

进一步地，所述方法可包括如下步骤：将达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)来源的谷氨酰胺转氨酶的编码基因导入所述枯草芽孢杆菌得到产谷氨酰胺转氨酶的重组菌，即为所述工程菌。

在所述方法中，所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)来源的谷氨酰胺转氨酶的编码基因可通过DNA片段的形式导入所述枯草芽孢杆菌中；所述DNA片段自5’端到3’端依次含有编码信号肽的核酸序列、编码前导肽和谷氨酰胺转氨酶的活性区域的核酸序列；其中，所述前导肽和谷氨酰胺转氨酶的活性区域为来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的前导肽和活性区域或其突变体。

其中，所述信号肽包括N-端正电荷区，疏水核心区和C-端亲水信号肽酶识别区域。

进一步地，所述信号肽具体可为如下任一：SacB信号肽、AmyE信号肽、AmyQ信号肽、Epr信号肽、LytD信号肽、NucB信号肽、PenP信号肽、WapA信号肽、WprA信号肽、YhcR信号肽、YncM信号肽。

更进一步地，所述SacB信号肽的氨基酸序列具体如SEQ ID No.1所示；所述AmyE信号肽的氨基酸序列具体如SEQ ID No.2所示；所述AmyQ信号肽的氨基酸序列具体如SEQ IDNo.3所示；所述Epr信号肽的氨基酸序列具体如SEQ ID No.4所示；所述LytD信号肽的氨基酸序列具体如SEQ ID No.5所示；所述NucB信号肽的氨基酸序列具体如SEQ ID No.6所示；所述PenP信号肽的氨基酸序列具体如SEQ ID No.7所示；所述WapA信号肽的氨基酸序列具体如SEQ ID No.8所示；所述WprA信号肽的氨基酸序列具体如SEQ ID No.9所示；所述YhcR信号肽的氨基酸序列具体如SEQ ID No.10所示；所述YncM信号肽的氨基酸序列具体如SEQID No.11所示。

其中，来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的前导肽的氨基酸序列可如SEQ ID No.12所示。来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的活性区域的氨基酸序列可如SEQ ID No.13所示。

相应的，来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的前导肽和活性区域的突变体的突变位点可位于SEQ ID No.27(来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶从N-端信号肽到C-端活性区域的氨基酸序列)的如下位置中的部分或全部：第34-36位氨基酸、第74-75位氨基酸、第80-82位氨基酸、第83位氨基酸。

更进一步地，来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的前导肽和活性区域的突变体的突变位点处的氨基酸变化与SEQ ID No.27相比，为如下任一所示：将第74-75位的PS突变为AA并将第80-82位的DAD突变为AAA、将第74-75位的PS突变为AA、将第80-82位的DAD突变为AAA、缺失第74-75位的PS、缺失第80-82位的DAD、将第34-36位的SGS突变为AAA、将第83位的E突变为D。

对应于基因水平，编码所述SacB信号肽的核酸序列可如SEQ ID No.14所示；编码所述AmyE信号肽的核酸序列如SEQ ID No.15所示；编码所述AmyQ信号肽的核酸序列可如SEQ ID No.16所示；编码所述Epr信号肽的核酸序列如SEQ ID No.17所示；编码所述LytD信号肽的核酸序列可如SEQ ID No.18所示；编码所述NucB信号肽的核酸序列如SEQ ID No.19所示；编码所述PenP信号肽的核酸序列可如SEQ ID No.20所示；编码所述WapA信号肽的核酸序列如SEQ ID No.21所示；编码所述WprA信号肽的核酸序列可如SEQ ID No.22所示；编码所述YhcR信号肽的核酸序列如SEQ ID No.23所示；编码所述YncM信号肽的核酸序列可如SEQ ID No.24所示。

编码来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的前导肽的核酸序列可如SEQ ID No.25所示。

编码来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的活性区域的核酸序列可如SEQ ID No.26所示。

编码来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的前导肽和活性区域的突变体的突变位点处的核苷酸变化与SEQ ID No.28(编码来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶从N-端信号肽到C-端活性区域的核苷酸序列)相比，为如下任一所示：将第220-225位的ccgtcc突变为gcagca并将第238-246位的gactccgac突变为gcagcagca(对应“将第74-75位的PS突变为AA并将第80-82位的DAD突变为AAA”)、将第220-225位的ccgtcc突变为gcagca(对应“将第74-75位的PS突变为AA”)、将第238-246位的gactccgac突变为gcagcagca(对应“将第80-82位的DAD突变为AAA”)、缺失第220-225位的ccgtcc(对应“缺失第74-75位的PS”)、缺失第238-246位的gactccgac(对应“缺失第80-82位的DAD”)、将第100-108位的agtggcagc突变为gcagcagca(对应“将第34-36位的SGS突变为AAA”)、将第247-249位的gag突变为gac(对应“将第83位的E突变为D”)。

在本发明的具体实施方式中，所述重组载体具体为将所述编码前导肽和谷氨酰胺转氨酶的活性区域的核酸序列插入到pWB980载体的酶切位点XmaI和XbaI之间后得到的重组质粒。

在所述方法中，为了保证最终所得工程菌性能稳定，将所述DNA片段整合到了所述枯草芽孢杆菌的基因组的lacA位点处。

进一步地，所述DNA片段具体被整合到所述枯草芽孢杆菌的基因组中的SEQ IDNo.29和SEQ ID No.31之间。

在本发明的具体实施方式中，所述枯草芽孢杆菌具体为枯草芽孢杆菌菌株WB600。

第二方面，本发明要求保护如下任一生物材料：

(A1)利用前文所述方法制备得到的产谷氨酰胺转氨酶的工程菌。

(A2)蛋白质，自N端到C端依次为前文所述的信号肽、前文所述的前导肽和前文所述的谷氨酰胺转氨酶的活性区域。

特别的，所述蛋白质自N端到C端依次为SEQ ID No.3所示的AmyQ信号肽、来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的前导肽和活性区域的突变体。其中，来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的前导肽的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示；来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的活性区域的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示；来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的前导肽和活性区域的突变体的突变位点处的氨基酸变化与SEQ ID No.27(来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶从N-端信号肽到C-端活性区域的氨基酸序列)相比，为将第74-75位的PS突变为AA并将第80-82位的DAD突变为AAA。

(A3)编码(A2)所示蛋白质的核酸分子。

特别的，所述核酸分子自5’端到3’端依次为SEQ ID No.16所示的编码AmyQ信号肽的核酸序列、编码来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的前导肽和活性区域的突变体的核酸序列。其中，编码来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的前导肽的核酸序列如SEQ ID No.25所示；编码来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的活性区域的核酸序列如SEQ ID No.26所示；编码来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶的前导肽和活性区域的突变体的突变位点处的核苷酸变化与SEQ ID No.28(编码来源于所述达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)的谷氨酰胺转氨酶从N-端信号肽到C-端活性区域的核苷酸序列)相比，为将第220-225位的ccgtcc突变为gcagca并将第238-246位的gactccgac突变为gcagcagca(对应“将第74-75位的PS突变为AA并将第80-82位的DAD突变为AAA”)。该核酸分子对应实施例部分表1中的突变体“PS 74-75AA/DSD 80-82AAA”。

(A4)含有(A3)所示核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。

第三方面，本发明要求保护前文第二方面中所述的生物材料在制备谷氨酰胺转氨酶中的应用。

第四方面，本发明要求保护一种制备谷氨酰胺转氨酶的方法。

本发明所提供的制备谷氨酰胺转氨酶的方法，可包括如下步骤：培养前文所述的产谷氨酰胺转氨酶的工程菌，从培养产物中获得谷氨酰胺转氨酶。

在所述方法中，进行所述培养时，采用的培养基为LB培养基，条件为：37℃，200rpm培养48小时。

在所述方法中，可按照包括如下步骤的方法从所述培养产物中获得谷氨酰胺转氨酶：培养结束后，将整个培养体系进行离心(6000rpm，4℃，20分钟)，上清液过膜(截留分子量为30KDa)浓缩干燥，制成干粉，即为谷氨酰胺转氨酶的粗酶粉。

第五方面，本发明要求保护利用前文第四方面中所述的方法制备得到的谷氨酰胺转氨酶。

采用该方法制备得到的所述谷氨酰胺转氨酶具有如下特性：最适反应pH为6-7，最适反应温度为50℃，放置15天后所述谷氨酰胺转氨酶仍具有80％的活力，存在25mM钙离子的条件下，所述谷氨酰胺转氨酶的活性为无钙离子的条件下的113％。

本发明与现有的以枯草芽孢杆菌为宿主的TG酶表达具有下述区别：①TG酶活力高，最终酶活达到约130U/mg，满足工业生产需要；②基因整合到基因组上，性能稳定；③TG酶稳定性好，放置15天TG酶仍具有80％的活力；④非钙离子依赖性，钙离子稳定性好，存在25mM钙离子的条件下，TG酶具有更高的活性(113％)，应用范围更为广泛。本发明对于谷氨酰胺转氨酶的工业化生产具有重要意义。

附图说明

图1为重组表达载体pWB980-pro-tg和pWB980-pro-sacb-tg的质粒图谱。A为pWB980-pro-tg；B为pWB980-pro-sacb-tg。

图2为各重组芽孢杆菌的SDS-PAGE验证结果。1：蛋白Marker；2：PWB980-WB600；3：pro-sacb-tg-PWB980-WB600。箭头处为目标蛋白。

图3为菌株B.subtilis TG所产TG酶的最适反应pH和最适反应温度测定结果。A为最适反应pH；B为最适反应温度。

图4为菌株B.subtilis TG所产TG酶的钙离子依赖性测定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)：记载于“Cloning and expression of thetransglutaminase gene from Streptoverticillium ladakanum in Streptomyceslividans，《Process Biochemistry》,2004,39(5):591-598”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

pWB980载体：TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd.(Dalian,China)该载体的酶切位点XmaI上游有sacB信号肽编码序列，sacB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其对应的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。

枯草芽孢杆菌菌株WB600(简称B.subtilis WB600)：为上海今迈生物科技有限公司(中国，上海)产品。

分散酶：北京索莱宝科技有限公司产品，货号为Z8030。活力：≥50units/mg；活力定义：1g固体酶粉，在30℃，pH7.5条件下，1分钟水解酪素产生1μg酪氨酸为1个酶活力单位，以u/g表示；稳定pH：5.5～8.5；最适pH：6.8～7.0；最适温度：45～50℃。

实施例1、产谷氨酰胺转氨酶的重组枯草芽孢杆菌的构建及鉴定

一、达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)来源TG酶基因的克隆

达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)来源TG酶由信号肽，前导肽和活性区域三部分组成。链霉菌TG酶是以无活性的酶原进行合成和分泌，其N端前导肽被胞外活化蛋白酶切割后，才会使TG酶表现出催化活性。由于N端区域决定着TG酶的活性表达，因此，本发明采取两种表达策略，分别为信号肽替换和前导区重排。

针对第一种策略，用正向引物pro-TG-XmaI-F：5’-cggtacccggggccaccggcagtggcagtgg-3’；和反向引物pro-TG-R-XbaI：5’-ctctagaggatcgagcggccagccctgtgtcacct-3’，以达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)基因组为模板，扩增得到了含有TG酶自身前导肽编码序列和TG酶活性区域编码序列的DNA片段pro-TG。所述DNA片段pro-TG的序列为“5’-cggtacccggg+SEQ ID No.25+SEQ ID No.26的第1-993位+ctcgatcctctagag-3’”。其中，SEQ ID No.25为达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)来源的TG酶的自身前导肽编码核酸序列，编码SEQ ID No.12所示的S.ladakanum来源的TG酶自身前导肽；SEQ ID No.26为达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)来源的TG酶活性区域编码核酸序列，编码SEQ ID No.13所示的达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)来源的TG酶活性区域。

针对第二种策略，需要分别克隆TG酶的前导肽和活性区域，以及SacB序列。用PRO-F-XmaI：5’-cctcgagctcggtacccggggccaccggcagtggcagtggcagcg-3’和PRO-R：5’-cagccctcctggtaccgct atcactttagggggcccggaaggacggaccg-3’这对引物从达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)基因组扩增得到了谷氨酰胺转氨酶的前导肽的核酸序列pro(5’-cctcgagctcggtacccggg+SEQ ID No.25+agtgatagcggtaccaggagggctg-3’)。用TG-F：5’-aggaggcgcaactcaagcttttgccgatcctctagaggactccgacgagc-3’和TG-R-NheI：5’-aagctagcttgcatgcctgcagg tcgaggccagccctgtgtcaccttgtc-3’这对引物从达卡轮枝链霉菌(S.ladakanum)基因组扩增得到了TG酶活性区域的基因序列TG(5’-aggaggcgcaactcaagcttttgccgatcctctagag+SEQ ID No.26的第1-992位+tcgacctgcaggcatgcaagctagctt_-3’)。用sacB-F：5’-cggtccgtccttccgggccccctaaagtgatagcggtaccaggagggctg-3’和sacB-R：5’-gctcgtcggagtcctctagaggatcggcaaaagcttgagttgcgcctcct-3’为引物，以pWB980载体为模板，克隆得到sacB信号肽序列(5’-cggtccgtccttccgggccccctaaagtgatagcggtacca ggagggctggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacg+SEQ ID No.14+gatcctctag aggactccgacgagc-3’)。

二、表达载体的构建及在枯草芽孢杆菌中的表达

1、pWB980-pro-tg的构建

利用sacB信号肽替换链霉菌来源TG酶原有信号肽，以pWB980为表达载体，使用XmaI和XbaI分别酶切pWB980载体和步骤一中第一种策略所得的pro-TG。然后将酶切后的pro-TG片段和pWB980载体骨架大片段16℃过夜连接，化转B.subtilis WB600。PCR验证获得重组载体pWB980-pro-tg(图1中A)。

重组表达载体pWB980-pro-tg的结构描述为：将pWB980载体的酶切位点XmaI和XbaI之间的小片段替换为DNA片段pro-TG后得到的重组质粒(XmaI上游有SacB信号肽的核酸序列)。

将向B.subtilis WB600中转入重组表达载体pWB980-pro-tg后所得的重组枯草芽孢杆菌命名为pro-tg-PWB980-WB600。

2、pWB980-pro-sacb-tg的构建

将pro、sacB和TG这三个片段(步骤一中第二种策略所得)通过引物PRO-F-XmaI和TG-R-NheI(具体序列同上)overlap合在一起，得到长片段pro-sacB-TG。然后连在pMD19T上，转化E.coli TOP10，PCR验证选择正确的转化子pro-sacB-TG-19T。使用XmaI和NheI将长片段pro-sacB-TG从pro-sacB-TG-19T载体上切下来，并同时XmaI和NheI酶切pWB980载体。将得到的片段pro-sacB-TG和pWB980载体骨架大片段16℃过夜连接，转化B.subtilisWB600，PCR验证获得重组载体pWB980-pro-sacb-tg(图1中B)。

重组表达载体pWB980-pro-sacb-tg的结构描述为：将pWB980载体的酶切位点XmaI和NheI之间的小片段替换为DNA片段pro-sacB-TG后得到的重组质粒。pWB980-pro-sacb-tg中，DNA片段pro-sacB-TG连接到质粒pWB980sacB信号肽后面。

将向B.subtilis WB600中转入重组表达载体pWB980-pro-sacb-tg后所得的重组枯草芽孢杆菌命名为pro-sacb-tg-PWB980-WB600。

三、酶活检测

1、SDS-PAGE蛋白胶验证

取步骤二获得的各重组芽孢杆菌的培养上清1mL，加入130微升100％TCA冰上放置30min，离心收集沉淀，丙酮洗两次，挥发后沉淀溶解于20微升蒸馏水。加入蛋白Loading沸水浴5min。以带有pWB980空质粒的枯草芽孢杆菌(命名为PWB980-WB600)做对照，重组蛋白的大小和纯度检测使用SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE结果如图2。由图可见，在重组芽孢杆菌pro-tg-pWB980-WB600的培养上清中检测到目的单一的蛋白条带，条带大小约为44KDa，说明TG酶被成功表达。

2、酶活测定方法

用比色法测定酶活：通过测定CBZ-Gln-Gly与羟胺反应生成氧肟酸的量来计算。反应液A为0.2M Tris-HCl(pH＝6.0)、0.03M CBZ-Gln-Gly、0.01M还原型谷胱甘肽、0.1M盐酸羟胺。显色液B为3M盐酸、12％(w/v)(12g/100ml)三氯乙酸、5％(w/v)(5g/100ml)六水三氯化铁(溶解于0.1M盐酸中)三种试剂等体积混合。

将步骤二获得的各重组芽孢杆菌置于LB培养基中培养，37℃，200rpm培养48小时。培养结束后，按照如下方法测定重组芽孢杆菌胞外酶活：取500μl发酵上清，加入10μl浓度为2.4mg/ml的分散酶，37℃反应20min。取100μl分散酶处理的上清，加入200μl的反应液A，37℃反应60分钟，加入200μl的显色液B，在525nm下检测吸光值。根据吸光值计算氧肟酸含量。对照为100μl分散酶处理过的发酵上清液加入200μl显色液B终止反应，37℃处理60min之后，加入200μl反应液A。1单位TG酶活定义为：37℃每分钟催化底物，形成1μmol氧肟酸所需的酶量(U/mL)。采用Bradford方法计算蛋白浓度(mg/mL)，利用单位酶活除以蛋白浓度得到比酶活(U/mg)。

结果：48小时重组菌pro-tg-pWB980-WB600的胞外TG酶的比酶活达到31U/mg。重组菌pro-sacb-tg-PWB980-WB600未检测到胞外TG酶活。

3、突变体构建及酶活检测

根据步骤2的结果，利用重组表达载体pWB980-pro-tg和B.subtilis WB600构建重组菌pro-tg-pWB980-WB600的突变体。

利用定点突变技术，对来源于S.ladakanum的TG酶从N-端信号肽到C-端活性区域(SEQ ID No.27)做如下几种突变(突变位点主要集中在前导肽及前导肽与活性区的交界部分)：

(1)将SEQ ID No.27所示的来源于S.ladakanum的TG酶从N-端信号肽到C-端活性区域的氨基酸序列的第83位的E突变为D(对应的突变体记为E83D)。正向引物5’-ttccgggcccccgactccgacgaccgggtgactcct-3’，反向引物5’-aggagtcacccggtcgtcggagtcgggggcccggaa-3’。

(2)将SEQ ID No.27所示的来源于S.ladakanum的TG酶从N-端信号肽到C-端活性区域的氨基酸序列的第80-82位的DSD缺失(对应的突变体记为DSD缺失)。正向引物5’-gtccgtccttccgggcccccgagcgggtgactcctcccgc-3’，反向引物5’-gcgggaggagtcacccgctcgggggcccggaaggacggac-3’。

(3)将SEQ ID No.27所示的来源于S.ladakanum的TG酶从N-端信号肽到C-端活性区域的氨基酸序列的的第80-82位的DSD突变成AAA(对应的突变体记为DSD80-82AAA)。正向引物5’-gtccttccgggcccccgcagcagcagagcgggtgactcctcccgc-3’，反向引物5’-gcgggaggagtcacccg ctctgctgctgcgggggcccggaaggac-3’。

(4)将SEQ ID No.27所示的来源于S.ladakanum的TG酶从N-端信号肽到C-端活性区域的氨基酸序列的的第74-75位的PS缺失(对应的突变体记为PS缺失)。正向引物5’-gccgcttcgagcgccggtttccgggcccccgactcc-3’，反向引物5’-ggagtcgggggcccggaaa ccggcgctcgaagcggc-3’。

(5)将SEQ ID No.27所示的来源于S.ladakanum的TG酶从N-端信号肽到C-端活性区域的氨基酸序列的的第74-75位的PS突变为AA(对应的突变体记为PS 74-75AA)。正向引物5’-gcttcgagcgccggtgcagcattccgggcccccgac-3’，反向引物5’-gtcgggggcccggaatgctgcaccgg cgctcgaagc-3’。

(6)将SEQ ID No.27所示的来源于S.ladakanum的TG酶从N-端信号肽到C-端活性区域的氨基酸序列的第34-36位的SGS突变为AAA(对应的突变体记为SGS34-36AAA)。正向引物5’-gccaccggcagtggcgcagcagcaggcaccggggaagag-3’，反向引物5’-ctcttccccggtgcctgctgctgc gccactgccggtggc-3’。

(7)将SEQ ID No.27所示的来源于S.ladakanum的TG酶从N-端信号肽到C-端活性区域的氨基酸序列的第74-75位的PS突变为AA，同时将第80-82位的DSD突变成AAA(对应的突变体记为PS 74-75AA/DSD 80-82AAA)。在(1)的基础上(第80-82位的DSD突变成AAA)，正向引物5’-tcgagcgc cggtgcagcattccgggccccc-3’，反向引物5’-gggggcccggaatgctgcaccggcgctcga-3’进行第二个位点(第74-75位的PS突变为AA)的突变。

以重组表达载体pWB980-pro-tg为模板，以(1)-(7)中所示的各正向引物和相应的反应引物进行PCR扩增，得到构建各突变体所对应的重组突变表达载体。将各重组突变表达载体分别导入B.subtilis WB600中，得到对应于上述(1)-(7)的重组菌pro-tg-PWB980-WB600的各种突变体。

将获得重组菌pro-tg-PWB980-WB600的各种突变体以及重组菌pro-tg-PWB980-WB600(野生型)分别置于LB培养基中培养，37℃，200rpm培养48小时。培养结束后，按照上述步骤2中的方法测定各重组菌所得TG酶的比酶活(U/mg)。

结果如表1所示，由表可知：与原始菌相比，除了N-端第83位突变导致酶活降低，其余位点突变均得到较高的酶活和比酶活，其中N-端74-75位和80-82位双点突变酶活和比酶活最高，酶活达到26U/ml，比酶活达到128U/mg。

表1重组菌pro-tg-pWB980-WB600突变体的突变信息以及比酶活测定结果

注：蛋白取代/缺失的编号是从SEQ ID No.27所示氨基酸序列的N端为起始的；基因取代/缺失的编号是从SEQ ID No.27所示核苷酸序列的5’端为起始的。表中，对于氨基酸取代，使用下述命名法：原始氨基酸(野生型)，位置(即在SEQ ID No.27中的位置)，取代氨基酸。如，在SEQ ID No.27的第83位用天冬氨酸(D)取代原有的谷氨酸(E)命名为“E83D”；在SEQ ID No.27的第80-82位用三个丙氨酸(AAA)取代原有的“天冬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸”(DSD)命名为“DSD80-82AAA”。对于碱基取代，使用下述命名法：原始碱基(野生型)，位置(即在SEQ ID No.28中的位置)，取代碱基。如，在SEQ ID No.28的第247-249位用gac取代原有的gag命名为“gag 247-249gac”。对于氨基酸和碱基的缺失，均以符号△表示，如“蛋白：△80-82”表示缺失SEQ ID No.27的第80-82位氨基酸，“基因：△238-246”表示缺失SEQ IDNo.28的第238-246位核苷酸”。对于氨基酸和碱基的突变而言，均以“/”表示多重突变。

四、基因组整合与酶学性质分析

1、基因组整合

由于步骤三表1中的突变体PS74-75AA/DSD80-82AAA具有较高的酶活，因此将该重组菌中的TG突变体基因整合到B.subtilis WB600基因lacA位点，获得菌株B.subtilis TG。

具体操作如下：

使用引物LacA-up-F和LacA-up-R扩增WB600基因组LacA位点的5’端序列，扩增所得序列为：5’-gccagtcactatggcgtgctgctagc+SEQ ID No.29+atcgattttgctgaggtggcagagg-3’。其中，SEQ ID No.29为来源于B.subtilis WB600基因lacA位点的5’端的核苷酸序列。

LacA-up-F：5’-gccagtcactatggcgtgctgctagc gatcagaccctcatagaaatcacgct-3’；

LacA-up-R：5’-cctctgccacctcagcaaaatcgat atccatgcaaatgattgcccacggc-3’。

使用引物P43-F和TG-R扩增表达载体PS74-75AA/DSD80-82AAA-PWB980(表达突变体PS74-75AA/DSD80-82AAA的载体)的TG表达框，扩增所得序列为：5’-gccgtgggcaatcatttgcatggat+SEQ ID No.30+acagcagattcatgcccgggcgcttt-3’。其中，SEQID No.30为来源于S.ladakanum的双点突变(PS74-75AA/DSD80-82AAA)TG酶的核苷酸序列。

P43-F：5’-gccgtgggcaatcatttgcatggat atcgattttgctgaggtggcagagg-3’；

TG-R：5’-aaagcgcccgggcatgaatctgc tgtggttaatcgagcggccagccctgtgt-3’

使用引物LacA-Down-F和引物LacA-Down-R扩增WB600基因组的LacA的3’端序列，扩增所得序列为：5’-acacagggctggccgctcgattaacc+SEQ ID No.31+gagctcctaacttataggggtaacacttaa-3’。其中，SEQ ID No.31为来源于B.subtilis WB600基因lacA位点的3’端的核苷酸序列。

LacA-Down-F：5’-acacagggctggccgctcgattaacc acagcagattcatgcccgggcgcttt-3’；

LacA-Down-R：5’-ttaagtgttacccctataagttaggagctccagtataggcggccgggtcatattag-3’

将上述三片段overlap融合在一起。利用RMGE基因编辑方法(A Novel Tool forMicrobial Genome Editing Using the Restriction-Modification System.ACS SynthBiol.2018Jan 19；7(1):98-106.doi:10.1021/acssynbio.7b00254.Epub 2017Oct 12.)方法整合到B.subtilis WB600基因组上，并经测序验证正确后的菌株即为B.subtilis TG。

将菌株B.subtilis TG在LB培养基中，37℃，200rpm，培养48小时。培养结束后，收集整个培养体系，离心(6000rpm，4℃，20分钟)，上清液过膜浓缩干燥(截留分子量为30KDa)，制成干粉，即为TG酶的粗酶粉。

2、最适反应pH

将酶干粉(即步骤1获得的TG酶的粗酶粉)用水溶解，制成浓度为2.5g/L的酶液(以下测酶学性质所用浓度均是一样)，取500μl酶液，加入10μl浓度为2.4mg/ml的分散酶，37℃反应20min。加入200μl的反应液A(配方同上)。取100μl分散酶处理的上清，在pH为3，4，5(0.2mol/mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)，6，7，8，9(0.2mol/mL Tris-盐酸缓冲液)中，于37℃反应1个小时，加入200μl的显色液B(配方同上)，在525nm条件下检测酶活(U/mg)，以最高点酶活为100％，其余与之相比得相对酶活。结果见图3中A，最适反应pH为6-7。

3、最适反应温度

将500μl酶液，加入10μl浓度为2.4mg/ml的分散酶，37℃反应20min。加入200μl的反应液A(配方同上)。取100μl分散酶处理的上清，在0.2mol/mL Tris-盐酸缓冲液(pH 6)中，分别在20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃的条件下反应1个小时。加入200μl的显色液B(配方同上)，在525nm条件下检测酶活(U/mg)。设其中的最高点酶活为100％，其余与之相比得相对酶活。结果见图3中B，最适反应温度为50℃。

4、金属离子依赖性

向分散酶处理后的酶液(反应条件同步骤3)加入终浓度为5mM的金属离子(Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺)，反应条件同步骤3(温度为37℃)。测定添加不同金属离子后的酶活，以不加金属离子的酶活为100％，其他与之相比得相对酶活。结果如表2所示：铜离子和锌离子对B.subtilis TG来源TG酶具有较强的抑制作用，而钾离子，钠离子，钙离子等对B.subtilis TG来源TG酶没有抑制作用。

表2 B.subtilis TG来源TG酶对金属离子的依赖性测定结果

序号	金属离子	相对酶活/％
			1	对照	100.0±2
2	Na<sup>+</sup>	109.2±0.5
			3	K<sup>+</sup>	90.8±2.4
4	Ca<sup>2+</sup>	101.4±2.2
			5	Mg<sup>2+</sup>	102.4±0.1
6	Cu<sup>2+</sup>	59.7±0.9
			7	Zn<sup>2+</sup>	9.8±0.5
8	Mn<sup>2+</sup>	91.7±1.7

5、钙离子依赖性

向分散酶处理后的酶液(反应条件同步骤3)加入不同浓度的Ca²⁺(5mM，10mM，15mM，20mM，25mM，为在反应体系中的终浓度)，反应条件同步骤3(温度为37℃)。以不加Ca²⁺的酶液为对照，其酶活设为100％，其余与之相比得相对酶活。结果如图4所示，可见，B.subtilisTG来源TG酶是Ca²⁺非依赖性，但是Ca²⁺存在不仅没有抑制TG酶活，而且酶活有所增加。存在25mM钙离子的条件下，TG酶具有更高的活性(113％)。因此，与其它来源TG酶相比，B.subtilis TG来源TG酶具有更加广阔的利用空间。

五、信号肽优化

信号肽影响着蛋白的分泌，从而影响胞外TG酶含量。从枯草芽孢杆菌信号肽数据库中(SignalP 3.0)，选择不同强度的信号肽，替换酶活最高突变体(PS74-75AA/DSD80-82AAA)中的sacB信号肽，候选的10个信号肽如表3所示。利用上下游引物(上游引物中带有BamH I酶切位点，下游引物带有Xma I酶切位点)，以枯草芽孢杆菌WB600为模板，PCR得到信号肽片段，将重组信号肽表达载体导入B.subtilis WB600中，得到对应的重组菌。测定各菌株的比酶活，测定方法同上文。比酶活结果显示，不同信号肽对胞外酶活影响较小，其中与sacB相比，AmyQ为信号肽比酶活有略微提高。

表3 10个信号肽以及对应重组菌的比酶活测定结果

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种利用食源安全性宿主表达谷氨酰胺转氨酶的方法

<130> GNCLN181470

<160> 31

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Asn Ile Lys Lys Phe Ala Lys Gln Ala Thr Val Leu Thr Phe Thr

1 5 10 15

Thr Ala Leu Leu Ala Gly Gly Ala Thr Gln Ala Phe Ala

20 25

<210> 2

<211> 33

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Phe Ala Lys Arg Phe Lys Thr Ser Leu Leu Pro Leu Phe Ala Gly

1 5 10 15

Phe Leu Leu Leu Phe His Leu Val Leu Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ser

20 25 30

Ala

<210> 3

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met

1 5 10 15

Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala

20 25 30

<210> 4

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Met Lys Asn Met Ser Cys Lys Leu Val Val Ser Val Thr Leu Phe Phe

1 5 10 15

Ser Phe Leu Thr Ile Gly Pro Leu Ala His Ala

20 25

<210> 5

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Met Lys Lys Arg Leu Ile Ala Pro Met Leu Leu Ser Ala Ala Ser Leu

1 5 10 15

Ala Phe Phe Ala Met Ser Gly Ser Ala Gln Ala

20 25

<210> 6

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 6

Met Lys Lys Trp Met Ala Gly Leu Phe Leu Ala Ala Ala Val Leu Leu

1 5 10 15

Cys Leu Met Val Pro Gln Gln Ile Gln Gly Ala Ser Ser

20 25

<210> 7

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 7

Met Lys Leu Lys Thr Lys Ala Ser Ile Lys Phe Gly Ile Cys Val Gly

1 5 10 15

Leu Leu Cys Leu Ser Ile Thr Gly Phe Thr Pro Phe Phe Asn Ser Thr

20 25 30

His Ala Glu Ala

35

<210> 8

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 8

Met Lys Lys Arg Lys Arg Arg Asn Phe Lys Arg Phe Ile Ala Ala Phe

1 5 10 15

Leu Val Leu Ala Leu Met Ile Ser Leu Val Pro Ala Asp Val Leu Ala

20 25 30

<210> 9

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 9

Met Lys Arg Arg Lys Phe Ser Ser Val Val Ala Ala Val Leu Ile Phe

1 5 10 15

Ala Leu Ile Phe Ser Leu Phe Ser Pro Gly Thr Lys Ala Ala Ala

20 25 30

<210> 10

<211> 46

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 10

Met Leu Ser Val Glu Met Ile Ser Arg Gln Asn Arg Cys His Tyr Val

1 5 10 15

Tyr Lys Gly Gly Asn Met Met Arg Arg Ile Leu His Ile Val Leu Ile

20 25 30

Thr Ala Leu Met Phe Leu Asn Val Met Tyr Thr Phe Glu Ala

35 40 45

<210> 11

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 11

Met Ala Lys Pro Leu Ser Lys Gly Gly Ile Leu Val Lys Lys Val Leu

1 5 10 15

Ile Ala Gly Ala Val Gly Thr Ala Val Leu Phe Gly Thr Leu Ser Ser

20 25 30

Gly Ile Pro Gly Leu Pro Ala Ala Asp Ala

35 40

<210> 12

<211> 51

<212> PRT

<213> S. ladakanum

<400> 12

Ala Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Glu Glu Lys Arg Ser

1 5 10 15

Tyr Ala Glu Thr His Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Asp Asp Ile Asn

20 25 30

Ala Leu Asn Glu Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe

35 40 45

Arg Ala Pro

50

<210> 13

<211> 331

<212> PRT

<213> S. ladakanum

<400> 13

Asp Ser Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met

1 5 10 15

Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Ile Val Asn

20 25 30

Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg

35 40 45

Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys

50 55 60

Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu

65 70 75 80

Ala Phe Ala Phe Phe Asp Glu Asp Lys Tyr Lys Asn Glu Leu Lys Asn

85 90 95

Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val

100 105 110

Ala Lys Asp Ser Phe Asp Glu Ala Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Asp

115 120 125

Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Gly

130 135 140

Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala

145 150 155 160

Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn

165 170 175

Thr Pro Ser Phe Lys Asp Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Lys

180 185 190

Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg

195 200 205

Ser Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Glu Ala Phe Arg

210 215 220

Pro Asp Arg Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile

225 230 235 240

Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Ser Phe Val Asn Phe Asp Tyr

245 250 255

Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp

260 265 270

Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met

275 280 285

His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Asp Gly Tyr Ser Asp

290 295 300

Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Val Thr Phe Val Pro Lys Ser Trp Asn

305 310 315 320

Thr Ala Pro Asp Lys Val Thr Gln Gly Trp Pro

325 330

<210> 14

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg 60

gcaggaggcg caactcaagc ttttgcc 87

<210> 15

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

atgtttgcaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgctggatt tttattgctg 60

tttcatttgg ttctggcagg accggcggct gcgagtgcc 99

<210> 16

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacgctgtta 60

tttgtcagtt tgccgattac aaaaacatca gcc 93

<210> 17

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

atgaaaaaca tgtcttgcaa acttgttgta tcagtcactc tgtttttcag ttttctcacc 60

ataggccctc tcgctcatgc g 81

<210> 18

<211> 81

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

atgaaaaaga gactaatcgc acctatgctt ctatccgccg cgtcccttgc cttttttgcc 60

atgtctggtt ctgcccaggc c 81

<210> 19

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

atgaaaaaat ggatggcagg cctgtttctt gctgcagcag ttcttctttg tttaatggtt 60

ccgcaacaga tccaaggcgc atcttcg 87

<210> 20

<211> 108

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

atgaagttga aaactaaagc gtcaataaaa ttcggaatat gtgttgggct tttatgttta 60

agcattactg gtttcacacc ttttttcaac tcaacacatg ccgaagcc 108

<210> 21

<211> 96

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

atgaaaaaaa gaaagaggcg aaactttaaa aggttcattg cagcattttt agtgttggct 60

ttaatgattt cattagtgcc agccgatgta ctagcc 96

<210> 22

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

atgaaacgca gaaaattcag ctcggttgtg gcggcagtgc ttatttttgc actgattttc 60

agcctttttt ctccgggaac caaagctgca gcg 93

<210> 23

<211> 138

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

atgctgtctg tcgaaatgat aagcagacaa aatcgttgtc attatgtgta taagggagga 60

aatatgatga ggcgtattct gcatattgtg ttgatcacgg cattaatgtt cttaaatgta 120

atgtacacgt tcgaagct 138

<210> 24

<211> 126

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

atggcgaaac cactatcaaa agggggaatt ttggtgaaaa aagtattgat tgcaggtgca 60

gtaggaacag cagttctttt cggaaccctt tcatcaggta taccaggttt acccgcggca 120

gacgcc 126

<210> 25

<211> 153

<212> DNA

<213> S. ladakanum

<400> 25

gccaccggca gtggcagtgg cagcggcacc ggggaagaga agaggtccta cgccgaaacg 60

caccgcctga cggcggatga cgtcgacgac atcaacgcgc tgaacgaaag cgctccggcc 120

gcttcgagcg ccggtccgtc cttccgggcc ccc 153

<210> 26

<211> 996

<212> DNA

<213> S. ladakanum

<400> 26

gactccgacg agcgggtgac tcctcccgcc gagccgctcg accggatgcc cgacccgtac 60

cggccctcgt acggcagggc cgagacgatc gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag 120

gtctacagcc accgcgacgg caggaaacag cagatgaccg aggaacagcg ggagtggctg 180

tcctacggtt gcgtcggtgt cacctgggtc aactcgggcc agtatccgac gaacaggctg 240

gctttcgcgt tcttcgacga ggacaagtac aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg 300

tccggcgaaa cgcgggcgga gttcgagggg cgcgtcgcca aggacagctt cgacgaggcg 360

aaggggttcc agcgggcgcg tgacgtggcg tccgtcatga acaaggccct ggagaacgcc 420

cacgacgagg gggcgtacct cgacaacctc aagaaggagc tggcgaacgg caacgacgcc 480

ctgcggaacg aggatgcccg ctcgcccttc tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc 540

aaggaccgca acggcggcaa tcacgacccg tccaagatga aggccgtcat ctactcgaag 600

cacttctgga gcggccagga ccggtcgggc tcctccgaca agaggaagta cggcgacccg 660

gaggccttcc gccccgaccg cggcaccggc ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt 720

ccgcgcagcc ccaccagccc cggcgagagt ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcgga 780

gcgcagacgg aagcggacgc cgacaagacc gtatggaccc acggcaacca ctaccacgcg 840

cccaatggca gcctgggtgc catgcacgtg tacgagagca agttccgcaa ctggtccgac 900

ggttactcgg acttcgaccg cggagcctac gtggtcacgt tcgtccccaa gagctggaac 960

accgcccccg acaaggtgac acagggctgg ccgtga 996

<210> 27

<211> 410

<212> DNA

<213> S. ladakanum

<400> 27

Met Ser Gln Arg Gly Arg Thr Leu Val Phe Ala Ala Leu Gly Ala Val

1 5 10 15

Met Cys Thr Thr Ala Leu Met Pro Ser Ala Gly Ala Ala Thr Gly Ser

20 25 30

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Glu Glu Lys Arg Ser Tyr Ala Glu Thr

35 40 45

His Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Asp Asp Ile Asn Ala Leu Asn Glu

50 55 60

Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala Pro Asp

65 70 75 80

Ser Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro

85 90 95

Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Ile Val Asn Asn

100 105 110

Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys

115 120 125

Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys Val

130 135 140

Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu Ala

145 150 155 160

Phe Ala Phe Phe Asp Glu Asp Lys Tyr Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly

165 170 175

Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala

180 185 190

Lys Asp Ser Phe Asp Glu Ala Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Asp Val

195 200 205

Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Gly Ala

210 215 220

Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu

225 230 235 240

Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr

245 250 255

Pro Ser Phe Lys Asp Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Lys Met

260 265 270

Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser

275 280 285

Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Glu Ala Phe Arg Pro

290 295 300

Asp Arg Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro

305 310 315 320

Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Ser Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly

325 330 335

Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr

340 345 350

His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His

355 360 365

Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Asp Gly Tyr Ser Asp Phe

370 375 380

Asp Arg Gly Ala Tyr Val Val Thr Phe Val Pro Lys Ser Trp Asn Thr

385 390 395 400

Ala Pro Asp Lys Val Thr Gln Gly Trp Pro

405 410

<210> 28

<211> 1233

<212> DNA

<213> S. ladakanum

<400> 28

atgtcccaac gcgggagaac tctcgtcttc gccgctctcg gtgcggtcat gtgcaccacc 60

gcgttaatgc cgtccgcagg cgcggccacc ggcagtggca gtggcagcgg caccggggaa 120

gagaagaggt cctacgccga aacgcaccgc ctgacggcgg atgacgtcga cgacatcaac 180

gcgctgaacg aaagcgctcc ggccgcttcg agcgccggtc cgtccttccg ggcccccgac 240

tccgacgagc gggtgactcc tcccgccgag ccgctcgacc ggatgcccga cccgtaccgg 300

ccctcgtacg gcagggccga gacgatcgtc aacaactaca tacgcaagtg gcagcaggtc 360

tacagccacc gcgacggcag gaaacagcag atgaccgagg aacagcggga gtggctgtcc 420

tacggttgcg tcggtgtcac ctgggtcaac tcgggccagt atccgacgaa caggctggct 480

ttcgcgttct tcgacgagga caagtacaag aacgagctga agaacggcag gccccggtcc 540

ggcgaaacgc gggcggagtt cgaggggcgc gtcgccaagg acagcttcga cgaggcgaag 600

gggttccagc gggcgcgtga cgtggcgtcc gtcatgaaca aggccctgga gaacgcccac 660

gacgaggggg cgtacctcga caacctcaag aaggagctgg cgaacggcaa cgacgccctg 720

cggaacgagg atgcccgctc gcccttctac tcggcgctgc ggaacacgcc gtccttcaag 780

gaccgcaacg gcggcaatca cgacccgtcc aagatgaagg ccgtcatcta ctcgaagcac 840

ttctggagcg gccaggaccg gtcgggctcc tccgacaaga ggaagtacgg cgacccggag 900

gccttccgcc ccgaccgcgg caccggcctg gtcgacatgt cgagggacag gaacattccg 960

cgcagcccca ccagccccgg cgagagtttc gtcaatttcg actacggctg gttcggagcg 1020

cagacggaag cggacgccga caagaccgta tggacccacg gcaaccacta ccacgcgccc 1080

aatggcagcc tgggtgccat gcacgtgtac gagagcaagt tccgcaactg gtccgacggt 1140

tactcggact tcgaccgcgg agcctacgtg gtcacgttcg tccccaagag ctggaacacc 1200

gcccccgaca aggtgacaca gggctggccg tga 1233

<210> 29

<211> 799

<212> DNA

<213> B. subtilis

<400> 29

gatcagaccc tcatagaaat cacgctgaaa ttgatcctcc aaacgcgcgc cgataaaata 60

cgccttgccc tgctgatact catggcttgt gaccgctggc gtgcgcgcat aaaaatcttc 120

ttgatacacc gcttccactg aagctgtctt tacatcaatc acggttgcat aatccttcat 180

ttcatatatt tggctgcggt agctgacagc gtttcgatcc ttcggataca gggtgtccgt 240

ttcaagaggc tcaactccaa atatagcttg aagatccgga tgccatccgc ctgtgtatgt 300

taagtcatgc tcattcacaa ccccgctgat atacgtcatg actaaggtgc cgccgtcagc 360

cgtaaacgct tttaaacggg aaacggtgtc ctcgctgatt aaatacagca tcgggacgat 420

cagcagttta tatggtgaaa agtcttgttc tttcgtgatg acgtcgacag ggatatcgtg 480

ttcccagaat gtgcggtaat gctgctgaag cgtttgcgga taacgttttg tcgccttcgc 540

aaacccctga gcatcctcga gcgcccaatg attttcccag tcatataaaa tcgcggtttg 600

agccggcctc ttcgttccga caacttcgga cagccgttcc aatgtctcgc ctaccttggc 660

cacttcttga aagacgcggt tcttcgggct attgtcatga tccacaaccg ctccgtgtaa 720

tttttctgat gacccccgtg atttgcggta ttggaaatag agaacgctgt ccgagccgtg 780

ggcaatcatt tgcatggat 799

<210> 30

<211> 1734

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 30

atcgattttg ctgaggtggc agagggcagg tttttttgtt tcttttttct cgtaaaaaaa 60

agaaaggtct taaaggtttt atggttttgg tcggcactga attcgagctc agcattattg 120

agtggatgat tatattcctt ttgataggtg gtatgttttc gcttgaactt ttaaatacag 180

ccattgaaca tacggttgat ttaataactg acaaacatca ccctcttgct aaagcggcca 240

aggacgctgc cgccggggct gtttgcgttt ttgccgtgat ttcgtgtatc attggtttac 300

ttattttttt gccaaagctg taatggctga aaattcttac atttatttta catttttaga 360

aatgggcgtg aaaaaaagcg cgcgattatg taaaatataa agtgatagcg gtaccaggag 420

ggctggaaga agcagaccgc taacacagta cataaaaaag gagacatgaa cgatgaacat 480

caaaaagttt gcaaaacaag caacagtatt aacctttact accgcactgc tggcaggagg 540

cgcaactcaa gcttttgcct cgagctcggt acccggggcc accggcagtg gcagtggcag 600

cggcaccggg gaagagaaga ggtcctacgc cgaaacgcac cgcctgacgg cggatgacgt 660

cgacgacatc aacgcgctga acgaaagcgc tccggccgct tcgagcgccg gtccgtcctt 720

ccgggccccc gcagcagcag agcgggtgac tcctcccgcc gagccgctcg accggatgcc 780

cgacccgtac cggccctcgt acggcagggc cgagacgatc gtcaacaact acatacgcaa 840

gtggcagcag gtctacagcc accgcgacgg caggaaacag cagatgaccg aggaacagcg 900

ggagtggctg tcctacggtt gcgtcggtgt cacctgggtc aactcgggcc agtatccgac 960

gaacaggctg gctttcgcgt tcttcgacga ggacaagtac aagaacgagc tgaagaacgg 1020

caggccccgg tccggcgaaa cgcgggcgga gttcgagggg cgcgtcgcca aggacagctt 1080

cgacgaggcg aaggggttcc agcgggcgcg tgacgtggcg tccgtcatga acaaggccct 1140

ggagaacgcc cacgacgagg gggcgtacct cgacaacctc aagaaggagc tggcgaacgg 1200

caacgacgcc ctgcggaacg aggatgcccg ctcgcccttc tactcggcgc tgcggaacac 1260

gccgtccttc aaggaccgca acggcggcaa tcacgacccg tccaagatga aggccgtcat 1320

ctactcgaag cacttctgga gcggccagga ccggtcgggc tcctccgaca agaggaagta 1380

cggcgacccg gaggccttcc gccccgaccg cggcaccggc ctggtcgaca tgtcgaggga 1440

caggaacatt ccgcgcagcc ccaccagccc cggcgagagt ttcgtcaatt tcgactacgg 1500

ctggttcgga gcgcagacgg aagcggacgc cgacaagacc gtatggaccc acggcaacca 1560

ctaccacgcg cccaatggca gcctgggtgc catgcacgtg tacgagagca agttccgcaa 1620

ctggtccgac ggttactcgg acttcgaccg cggagcctac gtggtcacgt tcgtccccaa 1680

gagctggaac accgcccccg acaaggtgac acagggctgg ccgctcgatt aacc 1734

<210> 31

<211> 800

<212> DNA

<213> B. subtilis

<400> 31

acagcagatt catgcccggg cgctttgcct tgttgacgtt atgccaattg accgcgcttg 60

gcgtacactc cattaataag aagggctgct gcttcaagct tcggtacaga tcattgataa 120

agccgacctt catcgccaaa tcagctgtgc tttcccagtc attgtgccag acaggataag 180

cgtcccagct gatggcatcg acatgctttg caaatttgct gtagtcgagg ccctgatacg 240

ggatcaaatc cggtgtgtca gccataaaat tcgttgtgat agggatatca ggcgtcaatt 300

ctttcagcgg aatgatttca ttttcataaa acgaaatcgt ttgatcggtg acgaaccggc 360

gccaatctaa attcaggcca tgcaagccat tttcaccgat cggcgaaggg ctttcaattt 420

gtgaccagtc attgaacgta tggctccaaa aaggggtcca ccacgcatgg ttcaatgtct 480

tgaggctgtt gtcatatttc gatttcagcc actcccggaa agcatgctgg cataaatcac 540

agtggcaatc tcccccgtat tcgtttgaaa tgtgccacat taacagcgcc gggtgatgtc 600

cgtatcgttc tgctaataag cggttgatgt gccgtgtttt ttctcggtag actttagatg 660

tgaggcagtg gttgtgcctt ccgccgtgca gctgtttgac gcgggaggca ttgacgcgca 720

aaacttccgg ataggtttgc gacagccagg ccggacgggc tccgctcggc gttgctaata 780

tgacccggcc gcctatactg 800

Claims

1.一种构建产谷氨酰胺转氨酶的工程菌的方法，包括如下步骤：对枯草芽孢杆菌进行改造，使所述枯草芽孢杆菌表达达卡轮枝链霉菌（S. ladakanum）来源的谷氨酰胺转氨酶，改造后的所述枯草芽孢杆菌即为工程菌；

所述方法包括如下步骤：将达卡轮枝链霉菌（S. ladakanum）来源的谷氨酰胺转氨酶的编码基因导入所述枯草芽孢杆菌，得到产氨酰胺转氨酶的重组菌，即为所述工程菌；

所述达卡轮枝链霉菌（S. ladakanum）来源的谷氨酰胺转氨酶的编码基因是通过DNA片段的形式导入所述枯草芽孢杆菌中的；所述DNA片段自5’端到3’端依次含有编码信号肽的核酸序列、编码前导肽和谷氨酰胺转氨酶的活性区域的核酸序列；其中，所述前导肽和谷氨酰胺转氨酶的活性区域为来源于所述达卡轮枝链霉菌（S. ladakanum）的谷氨酰胺转氨酶的前导肽和活性区域的突变体；

来源于所述达卡轮枝链霉菌（S. ladakanum）的谷氨酰胺转氨酶的前导肽的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示；来源于所述达卡轮枝链霉菌（S. ladakanum）的谷氨酰胺转氨酶的活性区域的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示；来源于所述达卡轮枝链霉菌（S. ladakanum）的谷氨酰胺转氨酶从N-端信号肽到C-端活性区域的氨基酸序列如SEQ ID No.27所示；

来源于所述达卡轮枝链霉菌（S. ladakanum）的谷氨酰胺转氨酶的前导肽和活性区域的突变体的突变位点处的氨基酸变化与SEQ ID No.27相比，为如下任一所示：将第74-75位的PS突变为AA并将第80-82位的DSD突变为AAA、将第74-75位的PS突变为AA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述信号肽包括N-端正电荷区，疏水核心区和C-端亲水信号肽酶识别区域。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述信号肽为如下任一：SacB信号肽、AmyE信号肽、AmyQ信号肽、Epr信号肽、LytD信号肽、NucB信号肽、PenP信号肽、WapA信号肽、WprA信号肽、YhcR信号肽、YncM信号肽。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述SacB信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示；所述AmyE信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述AmyQ信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述Epr信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；所述LytD信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；所述NucB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述PenP信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；所述WapA信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.8所示；所述WprA信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；所述YhcR信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示；所述YncM信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：编码所述SacB信号肽的核酸序列如SEQID No.14所示；编码所述AmyE信号肽的核酸序列如SEQ ID No.15所示；编码所述AmyQ信号肽的核酸序列如SEQ ID No.16所示；编码所述Epr信号肽的核酸序列如SEQ ID No.17所示；编码所述LytD信号肽的核酸序列如SEQ ID No.18所示；编码所述NucB信号肽的核酸序列如SEQ ID No.19所示；编码所述PenP信号肽的核酸序列如SEQ ID No.20所示；编码所述WapA信号肽的核酸序列如SEQ ID No.21所示；编码所述WprA信号肽的核酸序列如SEQ ID No.22所示；编码所述YhcR信号肽的核酸序列如SEQ ID No.23所示；编码所述YncM信号肽的核酸序列如SEQ ID No.24所示。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：编码来源于所述达卡轮枝链霉菌（S.ladakanum）的谷氨酰胺转氨酶的前导肽和活性区域的突变体的突变位点处的核苷酸变化与SEQ ID No.28相比，为如下任一所示：将第220-225位的ccgtcc突变为gcagca并将第238-246位的gactccgac突变为gcagcagca、将第220-225位的ccgtcc突变为gcagca。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述DNA片段是通过重组载体的形式导入所述枯草芽孢杆菌中的。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述重组载体为将所述编码前导肽和谷氨酰胺转氨酶的活性区域的核酸序列插入到pWB980载体的酶切位点XmaI和XbaI之间后得到的重组质粒。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述DNA片段被整合到所述枯草芽孢杆菌的基因组的lacA位点处。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌菌株WB600。

11.利用权利要求1-10中任一所述方法制备得到的产谷氨酰胺转氨酶的工程菌。

12.蛋白质，自N端到C端依次为权利要求1-5任一中所述的信号肽、权利要求1-6任一中所述的来源于所述达卡轮枝链霉菌（S. ladakanum）的谷氨酰胺转氨酶的前导肽和活性区域的突变体。

13.编码权利要求12所述蛋白质的核酸分子。

14.含有权利要求13所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。

15.权利要求11所述工程菌或权利要求12所述蛋白质或权利要求13所述核酸分子或权利要求14所述表达盒、重组载体或重组菌在制备谷氨酰胺转氨酶中的应用。

16.一种制备谷氨酰胺转氨酶的方法，包括如下步骤：培养权利要求11中所述的产谷氨酰胺转氨酶的工程菌，从培养产物中获得谷氨酰胺转氨酶。

17.利用权利要求16所述方法制备得到的谷氨酰胺转氨酶。