CN111349594A - 一株能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株。本发明提供了一株能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，将枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的基因AprE、中性蛋白酶的基因NprE以及sigF基因进行敲除，构建宿主菌株；将MTG酶原基因的表达框整合到宿主菌株中，得到能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株。利用本发明构建的工程菌株进行MTG发酵，MTG酶原在发酵过程中被宿主细胞的内源胞外蛋白酶激活，从而无需整合其他的外源蛋白酶进行后续的激活过程，可以在发酵上清中直接回收具有活性的MTG，简化提取工艺；且具有发酵时间短，过程中不需要添加抗生素等优点，极具有工业化价值。

Description

一株能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株及其在生产谷氨酰胺转氨酶中的应用。

背景技术

谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13,TGase)，是一类具有酰胺基转移催化功能的蛋白，能够催化肽链内谷氨酰胺残基转化为γ-羧基酰胺基的酰基转移反应，特别是与赖氨酸残基的ε-酰基在蛋白质分子内、及分子间形成ε-(γ-Gln)-Lys交联键。TGase特殊的催化功能，使其在众多领域得到广泛应用，尤其在食品加工领域，TGase作为安全的食品交联剂，被应用于面制品、焙烤制品、肉制品及豆类品等行业。此外，TGase酶在纺织与皮革加工、组织工程、定点蛋白交联等方面具有较广泛的应用范围，因此引起人们的高度重视。

与其它来源TGase相比，细菌来源的TGase(MTG)催化活性不依赖于钙离子，且作用底物广泛，是商品化TGase的最佳选择。日本Amano Enzyme公司于1989年首次在茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense S-8112)中发现微生物TGase(Ando H,Adachi M,Umeda K,etal.Purification and characteristics of a novel transglutaminasederived from microorganisms[J],Agric biol chem,1989,53(10):2613-2617.)，并成功将该菌株用于工业生产。但是由于茂原链轮丝菌属于放线菌类，此类菌株在一般会在生长发酵期间会伴随着抗生素的产生，因而一般不作为食品安全菌株使用，具有一定的危险性。

多年来，研究人员一直在寻找合适的菌株来作为宿主生产TGase。目前，研究人员利用大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母(Candida boidinii)、谷氨酸棒杆菌(Carorynebacterium glutamicum)等表达宿主中均已成功实现了链霉菌pro-TGase(TG酶原)或TGase基因的表达。比如，Marx CK等(Marx CK,Hertel TC&Pietzsch M.Purificationand activation of a recombinant histidine-tagged pro-transglutaminase aftersoluble expression in Escherichia coli and partial characterization of theactive enzyme[J],Enzyme Microb Technol,2008,42(7):568-575.)在大肠杆菌中实现了MTG的可溶性表达，但是MTG是以酶原的形式存在，且存在于胞内，需要破碎，酶原激活，同时大肠杆菌也不是一种食品安全菌株，因此在工业化应用上存在限制。日本的Kikuchi Y等(Kikuchi Y,Date M,Yokoyama K,et al.Secretion of active-formStreptoverticillium mobaraense transglutaminase by Corynebacteriumglutamicum:Processing of the pro-transglutaminase by a cosecreted subtilisin-like protease from Streptomyces albogriseolus[J],Appl Environ Microb,2003,69(1):358-366.)实现了MTG酶原在谷氨酸棒杆菌中的胞外表达，同时其在细菌内同时转入了一种枯草杆菌蛋白酶基因，对发酵中生产的酶原进了激活，获得了具有活性的MTG。但是由于发酵时间过长，产量低等原因，工业化还存在一定难度，需要进一步的改造。

枯草芽孢杆菌(B.subtilis)作为一种食品级安全菌株，同时由于其具有高效的蛋白分泌系统，作为蛋白的表达宿主被广泛的应用于食品工业生产。因此，利用枯草芽孢杆菌来表达、生产MTG成为此领域的研究热点。罗宁等(罗宁，杨慧林，沈徐凯，郑明英.转谷氨酰胺酶酶原在枯草芽孢杆菌WB800中的表达.现代食品科技.2011，7:734-737)成功在枯草芽孢杆菌表达了MTG酶原，但是需要蛋白纯化后再进一步利用胰蛋白酶进行激活才具有生物活性，不具备工业化价值。杨慧林等(一株重组的枯草芽孢杆菌及由其生产转谷氨酰胺酶的方法，CN102586167A)在枯草芽孢杆菌中同时导入subtilisin-like protease基因和MTG酶原基因，实现了MTG的可溶性表达。但是一方面，其发酵酶活产量低，发酵液只有2U/ml，限制了其工业化生产能力；另一方面，构建的枯草芽孢杆菌工程菌株在发酵过程中需要添加卡那霉素，这在食品发酵工业中是被禁止的，也极大的局限了其应用价值。综上，如何获得一个具有食品安全性的、生产水平较高的谷氨酰胺转氨酶菌株是目前谷氨酰胺转氨酶工业化生产中还需要进行继续研究的热点。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一株能够高水平生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，有利于该酶在工业化生产中的应用。

本发明的另一目的在于利用上述菌株在生产谷氨酰胺转氨酶中的应用。

为实现上述发明目的，本发明通过下述技术方案予以实现：

本发明提供了一株能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，将枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的基因AprE、中性蛋白酶的基因NprE以及sigF基因进行敲除，构建宿主菌株；将MTG酶原基因的表达框整合到宿主菌株中，得到能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株。

在本发明的一些具体实施方案中，所述MTG酶原基因的表达框整合到宿主菌株的amyE位点。

在本发明的一些实施方案中，所述MTG酶原基因的表达框包括启动子序列，核糖体结合位点序列，信号肽序列，proMTG编码序列以及终止子序列。

在本发明的又一些实施方案中，所述MTG酶原基因的表达框是通过构建MTG酶原的整合质粒整合到所述宿主菌株中。

在本发明的又一些实施方案中，所述MTG酶原整合质粒的构建方法为：将枯草芽孢杆菌基因组中的amyE部分基因片段及其两侧序列片段整合到质粒pksB上，构建质粒pksB-amyFR；将MTG酶原基因的表达框插入质粒pksB-amyFR中，得到MTG酶原的整合质粒。

在本发明的又一些实施方案中，所述MTG酶原基因的表达框序列插入质粒pksB-amyFR中的amyF和amyR之间。

在本发明的再一些实施方案中，所述的pksB质粒包括温度敏感型的复制起点和一个红霉素抗性基因。

在本发明的再一些实施方案中，所述的pksB质粒在30℃时，复制起点有活性。

在本发明的再一些实施方案中，所述的pksB质粒在37℃时，复制起点失活。

在本发明的另一些实施方案中，所述的的AprE基因序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明的另一些实施方案中，所述的的NprE基因序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的另一些实施方案中，所述的的sigF基因序列如SEQ ID NO:5所示。

在本发明的一些优选实施方案中，所述基因敲除采用连续性方式单交叉坎贝尔型机制对上述的3个基因进行敲除。

在本发明的一些实施方案中，所述MTG酶原表达框如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了上述能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株在生产谷氨酰胺转氨酶中的应用。

有益效果：

本发明首先通过对枯草芽孢杆菌进行基因工程改造，构建部分蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌，之后又将其孢子形成相关基因进行敲除，构建了一株适用于MTG表达的枯草芽孢杆菌宿主细胞；然后利用一个高效的基因表达框，达到高效分泌表达MTG的目的，水平达到10.6U/ml，远高于目前报的枯草芽孢杆菌宿主表达水平。利用本发明构建的工程菌株进行MTG发酵，MTG酶原在发酵过程中被宿主细胞的内源胞外蛋白酶激活，从而无需整合其他的外源蛋白酶进行后续的激活过程，可以在发酵上清中直接回收具有活性的MTG，简化提取工艺；且具有发酵时间短，过程中不需要添加抗生素等优点，极具有工业化价值。

术语“酶原”指有些酶在细胞内合成或初级释放时只是酶的无活性前体，必须在一定的条件下，这些酶的前体水解开一个或几个特定的肽键，致使构象发生改变，表现出酶的活性。这种无活性酶的前体称作酶原。

术语“酶原激活”指使酶原转变为有活性酶的作用称为酶原激活。

术语“基因工程”指使用生物技术直接操纵有机体基因组、用于改变细胞的遗传物质的技术。包括了同一物种和跨物种的基因转移以产生改良的或新的生物体；可以通过使用分子克隆技术分离和复制需要的遗传物质以产生DNA序列；可以通过合成DNA，然后插入宿主生物体，以此将新的遗传物质插入宿主基因组中；也可以使用核酸酶除去或“敲除”基因。

术语“基因敲除”指用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。

附图和附图说明

图1：pksB质粒图谱

图2：MTG酶原整合质粒(pksB-proMTG)质粒的图谱

图3：BS-MTG菌株的摇瓶发酵样品SDS-PAGE电泳图

具体实施方式

下面结合实例对本发明的构建过程做进一步阐释，下述说明中相关实例是说明性质的，不能限定本发明的保护范围。

实施例1:pksB质粒的构建

pksB(图1所示)是一个温敏型的E.coli/B.subtilis穿梭质粒。该质粒包括一个温度敏感型的复制起点(在30℃有活性)和一个红霉素抗性基因(ermC)，该抗性基因在E.coli中的抗性是300ug/ml，在B.subtilis中的抗性是5ug/ml。在37℃时，质粒上的复制起点失活，质粒被整合到宿主菌基因组的指定位点，用一定浓度的红霉素进行筛选。

pksb质粒的构建方法如下所示。将质粒pUC57-KS-erm(由Genscript公司合成，序列SEQ ID NO：1)用BglII双酶切，回收纯化3.8kbp的片段，用T4连接酶(购买自New EnglandBiolabs)自连，克隆好的质粒就是pksB。该质粒转入E.coli TOP10中进行繁殖，并且作为以下基因操作的骨架。

实施例2:蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌菌株的构建

采用连续性方式单交叉坎贝尔型机制对枯草杆菌蛋白酶E(AprE)、中性蛋白酶E(NprE)和sigF基因进行敲除。具体如下：利用BglII内切酶处理质粒pksB，酶切回收后利用CIP酶处理防止自连，获得载体的线性片段；通过PCR方法分别扩增需要敲除的每个基因的侧翼大约500bp的同源区域。以枯草芽孢杆菌单菌落作为模板，PCR反应引物由Genscript公司合成，其中pksb-apr_R1/pksb-apr_F2，pksb-npr_R1/pksb-npr_F2和pksb-sig_R1/pksb-sig_F2分别用于PCR反应扩增apr,npr和sigF基因的侧翼序列，引物序列如下：

扩增apr基因上游序列的引物为：

pksb-apr_czF1：GTATCGATAAGCTTCCTGCAGATCTCTCAGGAGCATTTAACCT)

pksb-apr_R1：GCACCTACTGCAATAGTAAGGAACAGATTGCGCAT

扩增apr基因下游序列的引物为：

pksb-apr_F2：ATGCGCAATCTGTTCCTTACTATTGCAGTAGGTGC

pksb-apr_czR2：ATATGGCGGCCGCGAATTCAGATCTCTAATGCTGTCTCGCGTT

扩增npr基因上游序列的引物为：

pksb-npr_czF1：GGTATCGATAAGCTTCCTGCAGATCTCATCTTCCCCTTGAT

pksb-npr_R1：CAGTCTTCTGTATCGTTACGCTTTTAATTCGGCT

扩增npr基因下游序列的引物为：

pksb-npr_F2：AGCCGAATTAAAAGCGTAACGATACAGAAGACTG

pksb-npr_czR2：TATGGCGGCCGCGAATTCAGATCTCCTGGCCAGGAGAATCT扩增sig基因上游序列的引物为：

pksb-sig_czF1：

GGTATCGATAAGCTTCCTGCAGGAACAATCTGAACAGCAGGCACTCpksb-sig_R1：

TTGTCAAACCATTTTTCTTCGCCCGATGCAGCCGATCTG

扩增sig基因下游序列的引物为：

pksb-sig_F2：

CAGATCGGCTGCATCGGGCGAAGAAAAATGGTTTGACAApksb-sig_czR2：

ATATGGCGGCCGCGAATTCAGATCTGTTCATGATGGCAAGACAC

反应液体系为50ul，反应条件如下：98℃预变性8min，随后反应25～30个循环(96℃for15s,58℃for 15s and 72℃for 30s)，最终72℃，2min结束反应。扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶检测并纯化。

利用重叠延伸PCR(SOE)的方法构建每个基因敲除载体，具体方法如下所示：经纯化的上游和下游基因片段(PCR反应得到)以摩尔比1:1混合后，作为拼接PCR的模板；分别利用引物pksb-apr_czF1/pksb-apr_czR2，pksb-npr_czF1/pksb-npr_czR2和pksb-sig_czF1/pksb-sig_czR2，以上述扩增的混合片段作为模板，进行基因叠加片段的扩增；然后利用Clone-EZ克隆试剂盒(购买自Genscript)，将扩增得到的片段被克隆到经BglII线性化的pksB载体上，转化子在E.coli TOP10中进行扩增，构建完成的敲除载体分别被命名为pksB-Apr,pksB-Npr,pksB-SigF。

相应的敲除质粒被顺次转入枯草芽孢杆菌(CICC 20632，中国微生物菌种库购得)感受态中，转化方法参考文献中进行(Young,F.E.and Spizizen，J·(1961),Physiological and GeneticFactors Affecting Transformation of Bacillussubtilis,J·Bacteriol·81:823-829.)。转化获得克隆涂布在红霉素抗性平板，通过30℃(质粒复制允许温度)过夜孵育进行筛选。筛选出来的具有红霉素抗性的质粒单克隆被转接到另外一个红霉素抗性平板上，在37℃(质粒复制不允许的温度)条件下进行孵育筛选，达到质粒片段被整合到宿主的基因组上的目的。最后为了得到在目的基因被敲除的菌株，将几个筛选出的单克隆接种到不含抗生素的2YT培养基中，30℃条件下连续传代培养5-7天，获得对红霉素不敏感的菌株，利用PCR对筛选获得的对红霉素不敏感的菌株进行验证，获得最终的基因敲除菌株。具体检测引物序列如下：

aprTestF：TTTTTTCATT CTATCCCTTT TCTGT

aprTestR：ACGACGCTGA ACAAACTTGA CGATTCA

nprTestF：TTGTCTGCTT AATATAAAAT AACGTTCGAA

nprTestR：CACAAAAAAT AAGATTCCCC TGGCCA

sigTestF：GCTCGGGGCT TGGCGTTATT

sigTestR：ACCTCCAGCG GGCTGGGCTC TTCAT

通过上述方法最终获得缺失aprE、nprE和sigF基因的枯草芽孢杆菌，作为后续基因操作的宿主菌株，命名为BSΔans。

实施例3:MTG生产菌株的构建

将amyE基因上下游各500bp的片段整合到质粒pksB上，构建质粒pksB-amyFR。具体方法如下：将质粒pksB(图1)用KpnI-EcoRI双酶切，回收纯化3711bp的片段pksB-KpnI-EcoRI；利用引物pksb-amyF-F/pksb-amyF-R和pksb-amyR-F/pksb-amyR-R分别PCR扩增插入位点amyE上下游同源臂序列amyF、amyR；然后利用重叠PCR技术，以上下游引物pksb-amyF-F/pksb-amyR-R扩增将片段连接起来获得基因片段amyFR；利用KpnI-EcoRI酶切amyFR片段，然后与线性化载体pksB-KpnI-EcoRI通过T4连接酶(购买自New England Biolabs)进行连接，克隆好的质粒就是pksB-amyFR。该质粒转入E.coli TOP10中进行繁殖，并且作为后续操作的骨架。

相关引物如下：

pksb-amyF-F：tgagaccagtctcggaagctcaaaggtctcAgtcaacaatgacctttatgccatattcttc

pksb-amyF-R：ccgcgaattcaaagcgagggaagcgttcacag

pksb-amyR-F：attgggtaccctcaatggggaagagaaccgcttaag

pksb-amyR-R：gagacctttgagcttccgagactggtctcacaagtgaacgatggtaaactgacaggc

反应液体系为50ul，反应条件如下：98℃预变性1min，随后反应25～35个循环(98℃for22s,57℃for 20s and 68℃for 30s)，最终68℃，5min结束反应。扩增产物经1％的琼脂糖凝胶检测并纯化。

然后，将MTG酶原基因的表达框插入质粒pksB-amyFR中的amyF和amyR之间，构建MTG酶原的整合质粒。本发明的MTG酶原基因表达框如SEQ ID NO：2所示，包括启动子序列，RBS位点序列，信号肽序列，proMTG编码序列以及终止子序列，此序列由Genscript公司合成。利用引物P102015-F/R，以proMTG为模板进行扩增，获得的片段与载体pksB-amyFR利用GoldenGate的方法进行连接(Engler C,Kandzia R,Marillonnet S.A one pot,one step,precision cloningmethod with high throughput capability.PLoS ONE,2008,3(11):e3647.)，最终构建MTG酶原的整合质粒pksB-proMTG(如图2所示)。

P102015-F:agtcggtctcacttgccttctttgtgcttggaagc

P102015-R:agtcggtctcttgacaaactggacacatggaaacacac

MTG酶原基因表达框的整合方法与上述的蛋白酶敲除操作方法一致。利用质粒pksB-proMTG转化菌株BSΔans，转化获得克隆涂布在红霉素抗性平板，通过30℃(质粒复制允许温度)过夜孵育进行筛选。筛选出来的具有红霉素抗性的质粒单克隆被转接到另外一个红霉素抗性平板上，在37℃(质粒复制不允许的温度)条件下进行孵育筛选，达到质粒片段被整合到宿主的基因组上的目的。最后为了得到MTG酶原表达序列整合到基因组上的的菌株，将几个筛选出的单克隆接种到不含抗生素的2YT培养基中，30℃条件下连续传代培养5-7天，获得对红霉素不敏感的菌株，利用引物TestF/R，通过PCR方法对筛选获得的对红霉素不敏感的菌株进行验证，获得最终的基因工程菌株。通过上述方法最终获得将MTG酶原表达框整合到基因组amyE位点的BSΔans菌株，命名为BS-MTG，作为最终的MTG生产菌株。

TestF：ccatcattgatggtttctttcggtaagtc

TestR：tgcttcggtatgtgattgtgaagctg

实施例4:BS-MTG菌株的摇瓶发酵

取4个活化的BS-MTG菌株单克隆，分别命名为BS-MTG1、BS-MTG2、BS-MTG3、BS-MTG4，接种到20ml培养基中(葡萄糖3％，玉米浆干粉1％，硫酸铵1％，磷酸二氢钾0.6％)，32℃条件下进行培养达到生长的对数期，作为种子液。分别取2ml种子液接种到30ml培养基中(含有蔗糖10％，豆饼粉10％和十二水磷酸氢二钠1％)，每个克隆三个平行，在旋转摇床中，30℃条件下，200rpm发酵培养48h。最终的发酵样品通过5000rpm离心1min，收集保存上清液，做SDS-PAGE分析，结果如图3所示。SDS-PAGE结果显示，BS-MTG菌株所表达的MTG酶原蛋白被菌株自身分泌的胞外蛋白激活为MTG蛋白。

实施例5:MTG活力测定

本发明中对发酵样品的TGase活力进行了测定，采用TGase酶活检测中常用的比色法测定酶活(Grossowicz N,Wainfan E,Borek E,et al.The enzymatic formation ofhydroxamic acidsfrom glutamine and asparagine[J],J Biol Chem,1950,187(1):111-125.)。利用a-N-CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-γ-单羟胺酸做标准曲线。TGase酶活定义为：37℃每分钟催化底物，形成1μmol L-谷氨酸-γ-单羟胺酸所需酶量(U/mL)为一个单位。酶活测定条件：37℃条件下反应10min。结果如表1所示，BS-MTG菌株在发酵周期48h内能够分泌表达出活力高达10.62U/ml的MTG酶，远高于目前文献、专利报道的水平，同时，由于MTG酶序列以整合的形式存在于枯草芽孢杆菌细胞基因组上，不存在遗传稳定性的问题，发酵过程中不需要添加抗生素来维持其稳定存在，因此，具有工业化生产的价值。

表1 BS-MTG菌株的摇瓶发酵结果

菌株	菌株OD	发酵液酶活U/ml
			BS-MTG1	72	10.62±0.37
BS-MTG2	73	9.92±0.82
			BS-MTG3	80	10.15±0.46
BS-MTG4	81	9.92±0.11

序列表

<110> 南京百斯杰生物工程有限公司

<120> 一株能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 6

<211> 3744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaagctgtca gtagtatacc taataattta tctacattcc ctttagtaac gtgtaacttt 60

ccaaatttac aaaagcgact catagaatta tttcctcccg ttaaataata gataactatt 120

aaaaatagac aatacttgct cataagtaac ggtacttaaa ttgtttactt tggcgtgttt 180

cattgcttga tgaaactgat ttttagtaaa cagttgacga tattctcgat tgacccattt 240

tgaaacaaag tacgtatata gcttccaata tttatctgga acatctgtgg tatggcgggt 300

aagttttatt aagacactgt ttacttttgg tttaggatga aagcattccg ctggcagctt 360

aagcaattgc tgaatcgaga cttgagtgtg caagagcaac cctagtgttc ggtgaatatc 420

caaggtacgc ttgtagaatc cttcttcaac aatcagatag atgtcagacg catggctttc 480

aaaaaccact tttttaataa tttgtgtgct taaatggtaa ggaatactcc caacaatttt 540

atacctctgt ttgttaggga attgaaactg tagaatatct tggtgaatta aagtgacacg 600

agtattcagt tttaattttt ctgacgataa gttgaataga tgactgtcta attcaataga 660

cgttacctgt ttacttattt tagccagttt cgtcgttaaa tgccctttac ctgttccaat 720

ttcgtaaacg gtatcggttt cttttaaatt caattgtttt attatttggt tgagtacttt 780

ttcactcgtt aaaaagtttt gagaatattt tatatttttg ttcatgtaat cactccttct 840

taattacaaa tttttagcat ctaatttaac ttcaattcct attatacaaa attttaagat 900

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atactgcaat cggatgcgat tattgaataa aagatatgag agatttatct aatttctttt 1200

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taacgactta attacgaagt aaataagtct agtgtgttag actttatgaa atctatatac 1320

gtttatatat atttattatc cgatttttta ttaaaacgtc tcaaaatcgt ttctgagacg 1380

ttttagcgtt tatttcgttt agttatcggc ataatcgtta aaacaggcgt tatcgtagcg 1440

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gccgatgact gaatgaaata ataagcgcag cgcccttcta tttcggttgg aggaggctca 1560

agggagtatg agggaatgaa attccctcat gggtttgatt ttaaaaattg cttgcaattt 1620

tgccgagcgg tagcgctgga aaatttttga aaaaaatttg gaatttggaa aaaaatgggg 1680

ggaaaggaag cgaattttgc ttccgtacta cgacccccca ttaagtgccg agtgccaatt 1740

tttgtgccaa aaacgctcta tcccaactgg ctcaagggtt taaggggttt ttcaatcgcc 1800

aacgaatcgc caacgttttc gccaacgttt tttataaatc tatatttaag tagctttatt 1860

gttgttttta tgattacaaa gtgatacact aactttataa aattatttga ttggagtttt 1920

ttaaatggtg atttcagaat cgaaaaaaag agttatgatt tctctgacaa aagagcaaga 1980

taaaaaatta acagatatgg cgaaacaaaa aggtttttca aaatctgcgg ttgcggcgtt 2040

agctatagaa gaatatgcaa gaaaggaatc agaacaaaaa aaataagcga aagctcgcgt 2100

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taaaaatact aaagctagaa attttggatt tttattatat cctgactcaa ttcctaatga 2220

ttggaaagaa aaattagaga gtttgggcgt atctatggct gtcagtcctt tacacgatat 2280

ggacgaaaaa aaagataaag atacatggaa taatagtaat attatacaaa atggaaagca 2340

ctataaaaaa ccacactatc acgttatata tattgcacga aatcctgtaa caatagaaag 2400

cgttaggaac aagattaagc gaaaattggg gaatagttca gttgctcatg ttgagatact 2460

tgattatatc aaaggttcat atgaatattt gactcatgaa tcaaaggacg ctattgctaa 2520

gaataaacat atatacgaca aaaaagatat tttgaacatt aatgattttg atattgaccg 2580

ctatataaca cttgatgaaa gccaaaaaag agaattgaag aatttacttt tagatatagt 2640

ggatgactat aatttggtaa atacaaaaga tttaatggct tttattcgcc ttaggggagc 2700

ggagtttgga attttaaata cgaatgatgt aaaagatatt gtttcaacaa actctagcgc 2760

ctttagatta tggtttgagg gcaattatca gtgtggatat agagcaagtt atgcaaaggt 2820

tcttgatgct gaaacggggg aaataaaatg acaaacaaag aaaaagagtt atttgctgaa 2880

aatgaggaat taaaaaaaga aattaaggac ttaaaagagc gtattgaaag atacagagaa 2940

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tctatccctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt 3540

ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgagcgc gcgtaatacg actcactata 3600

gggcgaattg ggtacctgag accagtctcg gaagctcaaa ggtctcagaa ttcgcggccg 3660

ccatatttcc agggagcagc cgcggccggt gctttgcagg attgggatcc tctagagtcc 3720

gctagggacc tctttagctc cttg 3744

<210> 2

<211> 2807

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccttctttgt gcttggaagc agagcccaat attatcccga aacgataaaa cggatgctga 60

aggaaggaaa cgaagtcggc aaccattcct gggaccatcc gttattgaca aggctgtcaa 120

acgaaaaagc gtatcaggag attaacgaca cgcaagaaat gatcgaaaaa atcagcggac 180

acctgcctgt acacttgcgt cctccatacg gcgggatcaa tgattccgtc cgctcgcttt 240

ccaatctgaa ggtttcattg tgggatgttg atccggaaga ttggaagtac aaaaataagc 300

aaaagattgt caatcatgtc atgagccatg cgggagacgg aaaaatcgtc ttaatgcacg 360

atatttatgc aacgtccgca gatgctgctg aagagattat taaaaagctg aaagcaaaag 420

gctatcaatt ggtaactgta tctcagcttg aagaagtgaa gaagcagaga ggctattgaa 480

taaatgagta gaaagcgcca tatcggcgct tttcttttgg aagaaaatat agggaaaatg 540

gtacttgtta aaaattcgga atatttatac aatatcatat gtatcacatt gaaaggaggg 600

gcctgctgtc cagactgtcc gctgtgtaaa aaaaaggaat aaaggggggt tgacattatt 660

ttactgatat gtataatata atttgtataa gaaaatggag gggccctcga aacgtaagat 720

gaaaccttag ataaaagtgc tttttttgtt gcaattgaag aattattaat gttaagctta 780

attaaagata atatctttga attgtaacgc ccctcaaaag taagaactac aaaaaaagaa 840

tacgttatat agaaatatgt ttgaaccttc ttcagattac aaatatattc ggacggactc 900

tacctcaaat gcttatctaa ctatagaatg acatacaagc acaaccttga aaatttgaaa 960

atataactac caatgaactt gttcatgtga attatcgctg tatttaattt tctcaattca 1020

atatataata tgccaataca ttgttacaag tagaaattaa gacacccttg atagccttac 1080

tatacctaac atgatgtagt attaaatgaa tatgtaaata tatttatgat aagaagcgac 1140

ttatttataa tcattacata tttttctatt ggaatgatta agattccaat agaatagtgt 1200

ataaattatt tatcttgaaa ggagggatgc ctaaaaacga agaacattaa aaacatatat 1260

ttgcaccgtc taatggatag aaaggaggtg atccagccgc accttatgaa aaatcatttt 1320

atcagtttga aaattatgta ttatggccac attgaaaggg gaggagaatc atgaaacaac 1380

aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc ttgctgcctc 1440

attctgcagc agcggcggac aatggcgcgg gggaagagac gaagtcctac gccgaaacct 1500

accgcctcac ggcggatgac gtcgcgaaca tcaacgcgct caacgaaagc gctccggccg 1560

cttcgagcgc cggcccgtcg ttccgggccc ccgactccga cgacagggtc acccctcccg 1620

ccgagccgct cgacaggatg cccgacccgt accgtccctc gtacggcagg gccgagacgg 1680

tcgtcaacaa ctacatacgc aagtggcagc aggtctacag ccaccgcgac ggcaggaagc 1740

agcagatgac cgaggagcag cgggagtggc tgtcctacgg ctgcgtcggt gtcacctggg 1800

tcaattcggg tcagtacccg acgaacagac tggccttcgc gtccttcgac gaggacaggt 1860

tcaagaacga gctgaagaac ggcaggcccc ggtccggcga gacgcgggcg gagttcgagg 1920

gccgcgtcgc gaaggagagc ttcgacgagg agaagggctt ccagcgggcg cgtgaggtgg 1980

cgtccgtcat gaacagggcc ctggagaacg cccacgacga gagcgcttac ctcgacaacc 2040

tcaagaagga actggcgaac ggcaacgacg ccctgcgcaa cgaggacgcc cgttccccgt 2100

tctactcggc gctgcggaac acgccgtcct tcaaggagcg gaacggaggc aatcacgacc 2160

cgtccaggat gaaggccgtc atctactcga agcacttctg gagcggccag gaccggtcga 2220

gttcggccga caagaggaag tacggcgacc cggacgcctt ccgccccgcc ccgggcaccg 2280

gcctggtcga catgtcgagg gacaggaaca ttccgcgcag ccccaccagc cccggtgagg 2340

gattcgtcaa tttcgactac ggctggttcg gcgcccagac ggaagcggac gccgacaaga 2400

ccgtctggac ccacggaaat cactatcacg cgcccaatgg cagcctgggt gccatgcatg 2460

tctacgagag caagttccgc aactggtccg agggttactc ggacttcgac cgcggagcct 2520

atgtgatcac cttcatcccc aagagctgga acaccgcccc cgacaaggta aagcagggct 2580

ggccgtgatc aataataata acgctgtgtg ctttaagcac acagcgtttt ttagtgtgta 2640

tgaatcgaga tcctgagcgc cggtcgctac cattaccagt tggtctggtg tcaaaaataa 2700

taataaccgg gcaggccatg tctgcccgta tttcgcgtaa ggaaatccat tatgtactat 2760

ttcgatcaga ccagttttta atttgtgtgt ttccatgtgt ccagttt 2807

<210> 3

<211> 503

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggatatt ttgcagggta gccgactgtg cttgtgcttc cggatgaacc ttcgtttccg 60

gctgcggcag caacgacgat accgctggaa acggctttgt caacgactgt tttcagcgct 120

gtagaaccag taggtccgcc aaggctcatg ttgataacat ccatattgtt ggaaatggcc 180

cactcaatgc cgttaataat ccagctatat tggccgcttc ctgttgaatc aagcactttt 240

actgcatata atgatgcgct tggcgctacg cccagaacac cgattgagtt attaagagcg 300

gcaatcgtac cggctacatg cgtaccgtga gaactgccgt cctggtatgg gtttgtttca 360

gaaggtacga agcttgctcc gcctctgacg tttaagtcag gatgagaaga gtcaattccg 420

ctgtcgataa cagctacttt tacgttagag cctgtgtagc cttgagagtg aagagccggc 480

gctttaattt gagaaatgcc ata 503

<210> 4

<211> 665

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atagaaacaa aagacggcag ctatcgtctt gcttacgacg tgacgattcg ctatgtcgag 60

cctgaacctg caaactggga agtcttagtt gacgccgaaa caggcagcat tttaaaacag 120

caaaataaag tagaacatgc cgccgccact ggaagcggaa caacgctaaa gggcgcaact 180

gttcctttga acatctctta tgaaggcgga aaatatgttc taagagatct ttcaaaacca 240

acaggcaccc aaatcatcac atatgatttg caaaacagac aaagccgcct tccgggcacg 300

cttgtctcaa gcacaacgaa aacatttaca tcttcatcac agcgggcagc cgttgacgca 360

cactataacc tcggtaaagt gtacgattat ttttattcaa actttaaacg aaacagctat 420

gataacaaag gcagtaaaat cgtttcttcc gttcactacg gcactcaata caataacgct 480

gcatggacag gagaccagat gatttacggt gatggcgacg gttcattctt ctctccgctt 540

tccggctcat tagatgtgac agcgcatgaa atgacacatg gcgtcaccca agaaacagcc 600

aacttgattt atgaaaatca gccaggtgca ttaaacgagt ctttctctga cgtattcggg 660

tattt 665

<210> 5

<211> 350

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgagttgtca gcgatttgat caagcagggt aatcggatct ccgtcatttt cataaacggt 60

ttcgtgaatc gaagatggag cccttaccgc ctcttgggcc agtacaacat cctcagcttc 120

aatctccaaa tggtcagcga tctcctgcac cgtcggcact ctgcccagtg ttttcgaaag 180

ctcatccttc gcgcgccgga ttttgtttcc aagctctttt aatgaccgtg atacctttac 240

ggttccgtca tcacggataa atcgttggat ttctccgata atcatcggca ctgcatacgt 300

tgaaaaacgc acatcatagg ttaaatcaaa tttgtcaaca gattttaaca 350

Claims (13)

1.一株能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，将枯草芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的基因AprE、中性蛋白酶的基因NprE以及sigF基因进行敲除，构建宿主菌株；然后将MTG酶原基因的表达框整合到宿主菌株中，得到能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株。

2.根据权利要求1所述的能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，所述MTG酶原基因的表达框整合到所述宿主菌株的amyE位点。

3.根据权利要求1或2所述的能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，所述MTG酶原基因的表达框包括启动子序列，核糖体结合位点序列，信号肽序列，proMTG编码序列以及终止子序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，所述MTG酶原基因的表达框是通过构建MTG酶原的整合质粒整合到所述宿主菌株中。

5.根据权利要求4所述的能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，所述MTG酶原整合质粒的构建方法为：将枯草芽孢杆菌基因组中的amyE部分基因片段及其两侧序列整合到质粒pksB上，构建质粒pksB-amyFR；将MTG酶原基因的表达框插入质粒pksB-amyFR中，得到MTG酶原的整合质粒。

6.根据权利要求5所述的能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，所述MTG酶原基因的表达框序列插入质粒pksB-amyFR中的amyF和amyR之间。

7.根据权利要求5所述的能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，所述的pksB质粒包括温度敏感型的复制起点和一个红霉素抗性基因。

8.根据权利要求1所述的能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，所述的的AprE基因序列如SEQ ID NO.3所示。

9.根据权利要求1所述的能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，所述的的NprE基因序列如SEQ ID NO.4所示。

10.根据权利要求1所述的能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，所述的的sigF基因序列如SEQ ID NO.5所示。

11.根据权利要求1所述的能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，采用连续性方式单交叉坎贝尔型机制对上述的3个基因进行敲除。

12.根据权利要求1所述的能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株，其特征在于，所述MTG酶原表达框如SEQ ID NO：2所示。

13.权利要求1-12中任一项所述的能够生产谷氨酰胺转氨酶的菌株在生产谷氨酰胺转氨酶中的应用。

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