CN116710471A - 具有减少的细胞运动的突变的宿主细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及突变的细菌宿主细胞，所述宿主细胞产生目的多肽并具有至少一个经破坏的鞭毛基因；并且涉及编码至少一种具有减少或消除的活性的鞭毛多肽的核酸构建体和载体；还涉及在所述宿主细胞中生产一种或多种目的多肽的方法。

Description

具有减少的细胞运动的突变的宿主细胞
序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及突变的细菌宿主细胞，所述宿主细胞产生一种或多种目的多肽并具有一个或多个经破坏的鞭毛基因；并且涉及编码至少一种具有减少或消除的活性的鞭毛多肽的核酸构建体和载体；还涉及在所述宿主细胞中生产一种或多种目的多肽的方法。
背景技术
在重组宿主细胞(如细菌宿主细胞)中表达重组基因是生产重组蛋白的常用方法。在原核系统中产生的重组蛋白是酶和其他有价值的蛋白质。在工业和商业目的中，所用细胞系统的生产率(即每个发酵单位的总蛋白质产量)是生产成本的重要因素。传统上，产率的增加是通过诱变和筛选产量增加的目的蛋白来实现的。然而，该方法主要仅可用于在含有目的酶的分离物中过量生产内源蛋白。因此，对于每种新的蛋白质或酶产品，都需要漫长的菌株和工艺开发计划来实现生产率的改善。
对于异源蛋白在原核系统中的过表达，生产工艺被认为是复杂的多阶段和多组分工艺。细胞生长和产物形成由多种参数决定，包括培养基的组成、发酵pH、发酵温度、溶解氧张力、剪应力和细菌形态。
在细菌中已经使用了各种方法来改善转录。对于异源基因的表达，密码子优化的合成基因可以改善转录速率(WO 9923211，诺维信公司(Novozymes A/S))。为了获得特定基因的高水平表达，一项成熟的程序是使重组基因构建体的多个拷贝靶向高表达内源基因的基因座。另外的增加蛋白质产率的策略是通过如WO 9629391(诺维信公司)中所述破坏天然蛋白酶来减少重组蛋白的蛋白水解降解。尽管提出了这些方法，但进一步改善细菌宿主细胞中的重组蛋白产量仍是持续令人感兴趣的。
本发明的目的是提供经修饰的真菌宿主菌株和具有增加的重组蛋白生产率或产率的蛋白质生产方法。
发明内容
本发明基于令人惊讶和创造性的发现，即，与具有天然鞭毛基因表达或未突变的鞭毛基因的宿主细胞中异源蛋白的表达相比，具有至少一个鞭毛(flagellum)(复数：鞭毛(flagella))基因的减少或消除的表达、或具有至少一个突变的鞭毛基因的宿主细胞导致相同异源蛋白的改善的表达、活性和/或产率。
鞭毛是长度均匀的长蛋白丝，其负责细胞运动。鞭毛由在螺旋的链中聚集的球状蛋白质(鞭毛蛋白)的分子组成。它们锚定在质膜中，并且每个细胞的鞭毛数目可以在一个至几百个的范围。鞭毛通过绕其轴旋转以螺旋运动来推动细胞，该运动通常是对化学浓度梯度的响应，从而指示了感觉反馈调节系统，该系统是细菌趋化性的基础。鞭毛旋转装置被认为是专为细菌行进而演化的。据信，多于40个基因参与了鞭毛的构建，并且为了高效构建，还有精细复杂的鞭毛蛋白质的特异性输出装置、支架蛋白和封端蛋白。
令人惊讶的是，通过减少或消除至少一个鞭毛基因的表达、或通过突变或缺失至少一个鞭毛基因，本发明导致重组蛋白的生产率和/或活性增加，这已显示于本文中淀粉酶、蛋白酶、纳豆激酶、木聚糖酶和黄原胶裂解酶分子的表达。如从下面的实例中可见，具有突变或缺失的鞭毛基因、或具有减少或消除的鞭毛基因表达的细菌宿主细胞提供了改善的重组蛋白产率，如重组淀粉酶活性增加2.76倍，纳豆激酶增加2.0倍，AprH蛋白酶增加1.11倍，木聚糖酶增加1.68倍，并且黄原胶裂解酶增加1.32倍。
令人惊讶的是，凭借靶向单个鞭毛基因的方法，不仅有效抑制了由一个或多个sgRNA靶向的一个或多个基因的表达，而且还有效抑制了操纵子中在sgRNA靶位点下游和上游的未被直接缺失或靶向的其他鞭毛基因。
我们预期该发现也适用于其他蛋白质，如其他具有酶活性的蛋白质、酶和多肽。基于实例中靶向的每个鞭毛基因的破坏都导致蛋白质活性增加的事实，预期该发现也适用于除本披露中靶向的鞭毛基因之外的其他鞭毛基因的缺失/突变/沉默。
因此，在第一方面，本发明涉及突变的细菌宿主细胞，其包含与编码一种或多种目的多肽的第一异源多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中与未突变的原本的等基因细胞或亲本细胞相比，至少一个鞭毛基因的表达减少或消除。
在第二方面，本发明涉及用于生产一种或多种目的多肽的方法，该方法包括：
i)提供根据第一方面的细菌宿主细胞；
ii)在有利于该一种或多种目的多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；以及
iii)任选地，回收该一种或多种目的多肽。
在第三方面，本发明涉及核酸构建体，该核酸构建体包含编码至少一种含有以下多肽序列或由其组成的鞭毛多肽的多核苷酸，该多肽序列与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63中的任一个具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性。
在最后和第四方面，本发明还涉及表达载体，该表达载体包含根据本发明第三方面的核酸构建体。
附图说明
图1显示了鞭毛基因表达受损的宿主细胞的游泳/运动测定。
图2显示了鞭毛基因表达受损的培养的宿主细胞的淀粉酶活性数据。
图3显示了(A)游泳/运动测定和(B)鞭毛基因缺失的宿主细胞的淀粉酶活性数据。
图4显示了靶向的鞭毛操纵子的鞭毛基因。
图5显示了用CISP在不同位置处靶向时对鞭毛操纵子的稳态RNA水平的影响。
图6显示了由标记基因缺失flgE基因时对鞭毛操纵子的稳态RNA水平的影响。
图7显示了鞭毛基因缺失的宿主细胞的重组蛋白产量增加。
定义
根据该详细描述，以下定义适用。注意，单数形式“一种/个(a/an)”以及“该/这些(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。
本文提及“约”值或参数包括针对该值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括方面“X”。
除非另外定义或由上下文明确指示，否则本文所用的所有技术与科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
淀粉酶：术语淀粉酶、JE1淀粉酶或JE1意指糖苷酶(EC 3.2)，更特别地催化含有三个或更多个(1→4)-α连接的D-葡萄糖单元的多糖中的(1→4)-α-D-葡糖苷键的内水解的糖苷酶(EC 3.2.1)或α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序确定淀粉酶活性。在一个方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:8的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的淀粉酶活性。
催化无活性的位点定向多肽：术语“催化无活性的位点定向多肽”或CISP意指具有减少或灭活的核酸酶活性的定点多肽，其中CISP朝RNA序列或DNA序列定向。催化无活性位点定向多肽的非限制性实例是催化无活性的CRISPR相关蛋白(如催化无活性MAD7/Cas12a核酸内切酶)、催化无活性的锌指核酸酶(ZFN)、锌指、催化无活性的转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、TALE和催化无活性的兆核酸酶。CISP的位点特异性由CISP的多肽序列确定，例如对于ZFN、TALEN、TALE或兆核酸酶；或者CISP的位点特异性由指导RNA(如CRISPR/Cas核酸酶(例如CRISPR/Cas12a核酸酶MAD7)的单个指导RNA)确定。从而，CISP朝靶RNA序列或靶DNA序列定向以分别通过RNA聚合酶在空间上阻断靶基因的转录或通过核糖体亚基防止靶mRNA的翻译。
催化结构域：术语“催化结构域”意指含有酶的催化机构的该酶的区域。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框确定，该开放阅读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码多肽的多核苷酸而言可以是天然的(即，来自相同基因)或异源的(即，来自不同基因)，或者相对于彼此是天然的或异源的。这样的控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子。最少，这些控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有助于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”意指多肽产生中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
鞭毛：术语鞭毛(flagellum)(复数：鞭毛(flagella))描述了专门为细菌行进而演化出的旋转装置。它以每秒几百转的速度旋转。多于40个基因参与鞭毛的构建。鞭毛的数目、丝的螺旋利手性和鞭毛马达的旋转方向确定每种细菌物种的行为范围。
鞭毛活性：术语鞭毛活性(flagella activity或flagellum activity)描述了宿主细胞的一条或多条完整的鞭毛的活性。鞭毛活性包括细胞进行细胞运动的能力，如在液体中的细胞运动(游泳运动)或在固体表面上的细胞运动。固体表面运动的实例是群游运动、滑行运动和蹭行运动。鞭毛活性依赖于由多于40个基因编码的多个鞭毛亚基(鞭毛多肽)的表达、组装和功能性。鞭毛基因中的一个或多个的基因破坏、基因缺失、基因突变或基因表达减少可导致鞭毛活性受损和减少。MotI蛋白的过表达可以进一步用于抑制鞭毛活性。
鞭毛基因：术语鞭毛基因描述了编码鞭毛复合物中包含的鞭毛多肽的多核苷酸序列，并且还包括鞭毛操纵子的鞭毛相关调节基因。鞭毛基因的非限制性实例是基因flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhC、flhD、flhE、flhF、flhG、flhO、flhP、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliR、fliS、fliT、fliY、fliZ、hag、motA、motB、ylxF、swrD、cheY、cheB、cheA、cheW、cheC、cheD、sigD和swrB，如具有SEQ ID NO:15(flgE)、SEQ ID NO:16(fliR)和SEQ ID NO:17(flhG)的多核苷酸序列。由鞭毛基因编码的鞭毛多肽的非限制性实例是鞭毛多肽FlgA、FlgB、FlgC、FlgD、FlgE、FlgF、FlgG、FlgH、FlgI、FlgJ、FlgK、FlgL、FlgM、FlgN、FlhA、FlhB、FlhC、FlhD、FlhE、FlhF、FlhG、FlhO、FlhP、FliA、FliD、FliE、FliF、FliG、FliH、FliI、FliJ、FliK、FliL、FliM、FliN、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliS、FliT、FliY、FliZ、Hag、MotA、MotB、MotI、YlxF、SwrD、CheY、CheB、CheA、CheW、CheC、CheD、SigD和SwrB。在一个方面，本发明的鞭毛基因编码鞭毛多肽，该鞭毛多肽与选自以下列表的多肽序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63和SEQ ID NO:71。
鞭毛多肽：术语鞭毛多肽意指一条或多条鞭毛中包含的多肽，或在鞭毛操纵子内具有调节功能的多肽，其中该鞭毛多肽由鞭毛基因(如上述鞭毛基因)编码。鞭毛多肽的非限制性实例是鞭毛多肽FlgA、FlgB、FlgC、FlgD、FlgE、FlgF、FlgG、FlgH、FlgI、FlgJ、FlgK、FlgL、FlgM、FlgN、FlhA、FlhB、FlhC、FlhD、FlhE、FlhF、FlhG、FlhO、FlhP、FliA、FliD、FliE、FliF、FliG、FliH、FliI、FliJ、FliK、FliL、FliM、FliN、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliS、FliT、FliY、FliZ、Hag、MotA、MotB、MotI、YlxF、SwrD、CheY、CheB、CheA、CheW、CheC、CheD、SigD和SwrB。在一个方面，本发明的鞭毛多肽与选自以下列表的多肽序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性：SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:71。
片段：术语“片段”意指从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，几个)氨基酸的鞭毛多肽亚基或鞭毛复合物亚基；其中该片段不具有鞭毛活性或功能性。
融合多肽：术语“融合多肽”是其中一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端融合的多肽。通过将编码另一多肽的多核苷酸与本发明的多核苷酸融合来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，并且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物学与生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。
异源：对于宿主细胞，术语“异源”意指多肽或核酸不是天然存在于宿主细胞中。对于多肽或核酸，术语“异源”意指控制序列(例如多肽或核酸的启动子或结构域)不与该多肽或核酸天然地相关联，即，控制序列来自除编码SEQ ID NO:8的成熟多肽的基因以外的基因。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指其中引入了包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的任何微生物或植物细胞。引入方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、电穿孔、接合和转导。在一些实施例中，宿主细胞是分离的重组宿主细胞，其与至少一种其他组分(包括但不限于蛋白质、核酸、细胞等)部分或完全分离。
杂合多肽：术语“杂合多肽”意指包含来自两个或更多个多肽的结构域的多肽，例如，来自一个多肽的结合模块和来自另一多肽的催化结构域。结构域可以在N-末端或C-末端处融合。
杂交：术语“杂交”意指使用标准DNA印迹程序将核酸的基本上互补的链配对。杂交可以在中、中-高、高或非常高严格条件下进行。中严格条件意指在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑鱼精子DNA、以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时，随后在55℃下使用0.2X SSC、0.2％ SDS洗涤三次，每次15分钟。中-高严格条件意指在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑鱼精子DNA、以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时，随后在60℃下使用0.2X SSC、0.2％ SDS洗涤三次，每次15分钟。高严格条件意指在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑鱼精子DNA、以及50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时，随后在65℃下使用0.2X SSC、0.2％ SDS洗涤三次，每次15分钟。非常高严格条件意指在42℃下在5X SSPE、0.3％ SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑鱼精子DNA、以及50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时，随后在70℃下使用0.2XSSC、0.2％ SDS洗涤三次，每次15分钟。
分离的：术语“分离的”意指多肽、核酸、细胞或其他指定材料或组分与在自然界中发现的与其天然相关联的至少一种其他材料或组分(包括但不限于，例如，其他蛋白质、核酸、细胞等)分离。分离的多肽包括但不限于含有分泌的多肽的培养液。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在N-末端加工(例如，信号肽的去除)后呈其成熟形式的多肽。在一个方面，成熟多肽是SEQ ID NO:8。在另一方面，多肽是具有SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:71的氨基酸序列中的任一个的成熟多肽。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有淀粉酶活性的成熟多肽或包含在鞭毛复合物中并具有鞭毛活性或鞭毛功能性的成熟多肽的多核苷酸。
天然的：术语“天然的”意指核酸或多肽天然存在于宿主细胞中。
非编码RNA：术语非编码RNA(ncRNA)或非编码RNA分子意指不翻译成蛋白质的RNA分子。丰富且功能上重要的ncRNA类型包括tRNA、rRNA以及小RNA，如微小RNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA、lncRNA或合成ncRNA。通常，ncRNA的功能是在转录和转录后水平调节基因表达，或协助核酸内切酶(如CISP)靶向DNA或RNA序列。因此，可以设计ncRNA来减少或消除靶基因的表达。另外地或可替代地，可以减少或耗竭ncRNA的表达以增加某些基因的表达。ncRNA的实例是CRISPR/Cas核酸内切酶的指导RNA。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
蛋白酶：术语“纳豆激酶”或“蛋白酶”意指催化蛋白质的水解的蛋白酶(EC3.4.21.62)，其对肽键具有广泛的特异性，并且偏好P1中的大的不带电荷的残基。蛋白酶或纳豆激酶通过水解肽键进行蛋白酶解，这些肽键将多肽链中的氨基酸连接在一起，从而形成蛋白质。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序确定蛋白酶/纳豆激酶活性。在一个方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:72的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的蛋白酶活性。在另一方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:73的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的纳豆激酶活性。
纯化的：术语“纯化的”意指基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术(例如，在电泳凝胶、色谱洗脱物和/或经受密度梯度离心的培养基中，纯化的多肽或核酸可形成离散的条带)所确定。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，基于摩尔的按重量计的百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后分子的浓度大幅度增加时，组合物富集了该分子。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他指定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
重组：当用于提及细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”意指其已经从其天然状态经修饰。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或与在自然界中发现的相比，以不同水平表达或在不同条件下表达天然基因。重组核酸与天然序列的差异在于一个或多个核苷酸和/或与异源序列(例如，表达载体中的异源启动子)可操作地连接。重组蛋白与天然序列的差异可以在于一个或多个氨基酸和/或与异源序列融合。包含编码多肽的核酸的载体是重组载体。术语“重组”与“遗传修饰的”和“转基因的”同义。
异源双链体：术语异源双链体意指由DNA分子和RNA分子组成的双链核酸分子(RNA:DNA异源双链体)，或由两个RNA分子组成的双链核酸分子(RNA:RNA异源双链体)。异源双链体可以不含核酸序列之间的核苷酸错配(非互补)，或者异源双链体可以包含至少一个核苷酸错配或核苷酸错配的区域。在体内，这些异源双链体可以由突变、基因重组、通过ncRNA或通过用程序化核酸酶(如CISP)靶向选定的基因或其转录物进行的基因沉默来产生。在本发明的上下文内，RNA:DNA异源双链体包含靶向的基因序列的DNA区域和构造为与所述DNA靶序列结合或杂交的非编码RNA分子。在本发明的上下文内，RNA:RNA异源双链体包含从靶基因转录的mRNA分子和构造为与所述靶mRNA分子结合或杂交的非编码RNA分子。
RNA转录物：术语RNA转录物意指由RNA聚合酶从基因序列转录的信使RNA或mRNA。RNA转录物的非限制性实例是从鞭毛基因flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhC、flhD、flhE、flhF、flhG、flhO、flhP、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliR、fliS、fliT、fliY、fliZ、hag、motA、motB、motI、ylxF、swrD、cheY、cheB、cheA、cheW、cheC、cheD、sigD和swrB转录的mRNA分子。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选6.6.0版本或更新版本)的Needle程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使Needle程序报告最长同一性，必须在命令行中指定-nobrief选项。Needle标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个多核苷酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,同上)(优选6.6.0版本或更新版本)的Needle程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使Needle程序报告最长同一性，必须在命令行中指定nobrief选项。Needle标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度–比对中的空位总数)
指导RNA：术语单个指导RNA、指导RNA或ncRNA意指如下RNA分子的RNA序列，其与基因靶标或转录物靶标结合以形成DNA:RNA异源双链体或RNA:RNA异源双链体，并从而促进CISP(如CRISPR/Cas 12a核酸酶或灭活的核酸酶)与所述异源双链体的结合。为了高效地执行该功能，ncRNA包含对靶序列具有特异性的第一序列和对核酸酶具有特异性并促进该核酸酶与该ncRNA的结合的第二序列。在本发明的上下文内，将指导RNA分类为ncRNA。在一个实施例中，指导RNA与SEQ ID NO:18至23的核苷酸序列中的任一个互补，或者指导RNA包含具有SEQ ID NO:18至23的核苷酸序列中的任一个。
子序列：术语“子序列”意指从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码鞭毛复合物中包含的片段。
靶多核苷酸序列：术语“靶多核苷酸序列”意指靶基因的多核苷酸序列或所述靶基因的RNA转录物的多核苷酸序列。每个靶基因(如鞭毛基因)可促进一个或几个靶多核苷酸序列。在本发明的上下文内，靶多核苷酸序列经受ncRNA或CISP的结合或与其杂交。另外地或可替代地，靶多核苷酸序列包含鞭毛基因的整个编码区、由其组成或基本上由其组成，例如当鞭毛基因或其编码区完全或部分缺失时。另外地或可替代地，靶多核苷酸序列位于鞭毛靶基因附近，通过侧翼DNA区域的同源重组促进靶基因的缺失，从而能够部分或全部缺失鞭毛基因或其编码区。在一个实施例中，靶多核苷酸序列包含具有SEQ ID NO:18至23的核苷酸序列中的一个。
变体：术语“变体”意指具有淀粉酶活性的多肽或有助于减少或消除鞭毛活性的多肽，所述变体在一个或多个(例如，几个)位置处包含人为突变(即取代、插入和/或缺失(例如截短))。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；并且插入意指添加与占据某一位置的氨基酸相邻的一个或多个(例如，几个)氨基酸，例如1-5个氨基酸。
野生型：提及氨基酸序列或核酸序列时术语“野生型”意指该氨基酸序列或核酸序列是天然或天然存在的序列。如本文所用，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在的”是指在自然界中未发现的任何物质(例如，在实验室中产生的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。
黄原胶裂解酶：术语“黄原胶裂解酶”意指如下黄原胶裂解酶(黄原胶降解酶(EC4.2.2.12))，其催化多糖黄原胶侧链的末端β-D-甘露糖基-(1->4)-β-D-葡糖醛酸基键的切割，在该侧链的末端处留下4-脱氧-α-L-苏式-己-4-烯醛糖基基团。黄原胶裂解酶经由消除切割释放丙酮酸化甘露糖，同时产生Δ4,5-不饱和葡糖醛酸(Δ4,5-烯-GlcA)侧链。出于本发明的目的，根据实例中描述的程序确定黄原胶裂解酶活性。在一个方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:75的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的黄原胶裂解酶活性。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指催化木聚糖中(1->4)-β-D-木糖苷键的内水解的内-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)，如内-1,4-木聚糖水解酶。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序确定木聚糖酶活性。在一个方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:74的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的木聚糖酶活性。
具体实施方式
宿主细胞
在第一方面，本发明涉及突变的细菌宿主细胞，其包含与一个或多个编码目的多肽的第一异源多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中与未突变的原本的等基因细胞或亲本细胞相比，至少一个鞭毛基因的表达减少或消除。另外地或可替代地，至少一个鞭毛基因的表达类似于未突变的原本的等基因细胞或亲本细胞，其中与未突变的原本的等基因细胞或亲本细胞相比，该至少一个鞭毛基因的多核苷酸序列被改变，所述改变选自以下列表：提前终止密码子、核苷酸插入、和核苷酸缺失，如该鞭毛基因的多核苷酸序列的一个或多个核苷酸的缺失。
将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自我复制的染色体外载体维持，如较早前所述。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。
在一个实施例中，鞭毛基因编码选自以下列表的鞭毛多肽：FlgA、FlgB、FlgC、FlgD、FlgE、FlgF、FlgG、FlgH、FlgI、FlgJ、FlgK、FlgL、FlgM、FlgN、FlhA、FlhB、FlhC、FlhD、FlhE、FlhF、FlhG、FlhO、FlhP、FliA、FliD、FliE、FliF、FliG、FliH、FliI、FliJ、FliK、FliL、FliM、FliN、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliS、FliT、FliY、FliZ、Hag、MotA、MotB、YlxF、SwrD、CheY、CheB、CheA、CheW、CheC、CheD、SigD、和/或SwrB；优选地，鞭毛基因编码鞭毛多肽FlgE、FliR和/或FlhG。鞭毛多肽的天然表达可因物种而变化。因此，可以使靶向的鞭毛基因的选择适应某一宿主细胞物种的鞭毛基因表达谱。优选地，单个鞭毛多肽的表达的减少或消除导致宿主细胞的鞭毛活性减少或消除。可替代地，两种、三种或四种鞭毛多肽的表达的同时减少或消除导致鞭毛活性减少或消除。另外地或可替代地，通过编码与SEQ ID NO:71具有至少60％序列相似性的MotI多肽的motI基因的过表达实现鞭毛活性的减少或消除。
在一个实施例中，至少一个鞭毛基因选自以下列表：flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhC、flhD、flhE、flhF、flhG、flhO、flhP、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliR、fliS、fliT、fliY、fliZ、hag、motA、motB、ylxF、swrD、cheY、cheB、cheA、cheW、cheC、cheD、sigD、和/或swrB；优选地，该至少一个鞭毛基因是flgE、fliR和/或flhG。
可以减少或消除鞭毛基因中的一个或多个的表达，如彼此独立地选择的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或多于八个鞭毛基因的表达减少或消除。
在一个实施例中，将鞭毛基因flgE的表达的减少或消除与鞭毛基因fliR的表达的减少或消除组合。
在一个实施例中，将鞭毛基因flgE的表达的减少或消除与鞭毛基因flhG的表达的减少或消除组合。
在一个实施例中，将鞭毛基因flhG的表达的减少或消除与鞭毛基因fliR的表达的减少或消除组合。
在一个实施例中，将鞭毛基因flgE的表达的减少或消除与鞭毛基因fliR的表达的减少或消除、以及与鞭毛基因flhG的表达的减少或消除组合。
在另一实施例中，将至少一个鞭毛基因flgE、fliR和/或flhG的表达的减少或消除与至少一个选自以下列表的鞭毛基因的表达的减少或消除组合：flgA、flgB、flgC、flgD、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhC、flhD、flhE、flhF、flhO、flhP、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliS、fliT、fliY、fliZ、hag、motA、motB、ylxF、swrD、cheY、cheB、cheA、cheW、cheC、cheD、sigD、和/或swrB。
在又另一实施例中，两个、三个、四个或多于四个鞭毛基因的表达减少或消除，其中该鞭毛基因选自以下列表：flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhC、flhD、flhE、flhF、flhG、flhO、flhP、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliR、fliS、fliT、fliY、fliZ、hag、motA、motB、ylxF、swrD、cheY、cheB、cheA、cheW、cheC、cheD、sigD、和/或swrB。
在一个实施例中，至少一个鞭毛基因包含与选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的列表的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多核苷酸序列或由其组成。
在一个实施例中，至少一个鞭毛基因包含与选自以下列表的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多核苷酸序列：SEQ ID NO:18(flgE)、SEQ ID NO:19(flgE)、SEQ ID NO:20(fliR)、SEQ ID NO:21(fliR)、SEQ ID NO:22(flhG)和SEQ ID NO:23(flhG)。
在另一实施例中，至少一个鞭毛基因编码包含与选自以下列表的多肽序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成的鞭毛多肽：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:62、和/或SEQ ID NO:63。
在一个实施例中，至少一个鞭毛基因的多核苷酸序列包含至少一个选自以下列表的改变：提前终止密码子、核苷酸插入、和核苷酸缺失，如该鞭毛基因或其编码区的多核苷酸序列的一个或多个核苷酸的缺失、或该至少一个鞭毛基因或其编码区的多核苷酸序列的基本上所有核苷酸的缺失；或其中该至少一个鞭毛基因或其编码区的多核苷酸序列以其整体缺失。可以通过用另一多核苷酸序列(如编码选择标记的多核苷酸序列)取代鞭毛基因的开放阅读框来实现至少一个鞭毛基因的缺失。在优选的实施例中，通过同源重组缺失至少一个鞭毛基因。
在一个实施例中，至少一个鞭毛基因的至少一个改变产生包含与选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的列表的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性的多核苷酸序列或由其组成的鞭毛基因多核苷酸序列。
在另一实施例中，至少一个鞭毛基因的至少一个改变产生包含与选自以下列表的多肽序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性的多肽序列或由其组成的鞭毛多肽序列：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63。
在另外的实施例中，宿主细胞包含减少或消除的鞭毛活性、减少或消除的细胞运动、或减少或消除的游泳活性。减少或消除的细胞运动通过将突变体细胞运动与未突变的亲本细胞的细胞运动进行比较来鉴定，并且其指示减少或消除的鞭毛活性和/或减少或消除的鞭毛基因表达。
在一个实施例中，与未突变的原本的等基因细胞或亲本细胞相比，突变的宿主细胞的细胞运动减少至少10％，例如至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或减少100％。
在优选的实施例中，宿主细胞是选自由弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)和脲原体属(Ureaplasma)细胞组成的组的革兰氏阴性细菌，或者宿主细胞是选自由以下组成的组的革兰氏阳性细胞：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)或链霉菌属(Streptomyces)细胞，如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、和马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)、产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)细胞，优选地宿主细胞是芽孢杆菌属细胞、最优选地枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌细胞。
在优选的实施例中，宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
在另一优选的实施例中，宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。
在另一实施例中，一种或多种目的多肽包含酶；优选地，该酶选自由以下组成的组：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、核酸酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、和β-木糖苷酶；甚至更优选地，该目的多肽包含淀粉酶。
在一个实施例中，一种或多种目的多肽包含淀粉酶，如包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的淀粉酶。
在一个实施例中，一种或多种目的多肽包含蛋白酶、由其组成或基本上由其组成。
在一个实施例中，一种或多种目的多肽包含蛋白酶，如包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的蛋白酶。
在另一实施例中，一种或多种目的多肽包含磷酸二酯酶(PDE)、由其组成、或基本上由其组成。
在另一实施例中，一种或多种目的多肽包含纳豆激酶、由其组成、或基本上由其组成。
在一个实施例中，一种或多种目的多肽包含纳豆激酶，如包含与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的纳豆激酶。
在另一实施例中，一种或多种目的多肽包含木聚糖酶、由其组成、或基本上由其组成。
在一个实施例中，一种或多种目的多肽包含木聚糖酶，如包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的木聚糖酶。
在另一实施例中，一种或多种目的多肽包含黄原胶裂解酶、由其组成、或基本上由其组成。
在一个实施例中，一种或多种目的多肽包含黄原胶裂解酶，如包含与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的黄原胶裂解酶。
在一些实施例中，一个或多个多肽与重组宿主细胞是异源的。
在一些实施例中，一个或多个控制序列中的至少一个与编码一个或多个多肽的多核苷酸是异源的。
在一些实施例中，重组宿主细胞包含本发明的多核苷酸的至少两个拷贝，例如三个、四个或五个。
在一个实施例中，当在相同条件下培养时，相对于不包含减少或消除的鞭毛活性的亲本宿主细胞中目的多肽的表达，该目的多肽的表达增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少155％、至少160％、至少165％、至少170％、至少175％、至少180％、至少185％、至少190％、至少195％、至少200％、至少205％、至少210％、至少215％、至少220％、至少225％、至少230％、至少235％、至少240％、至少245％、至少250％、至少255％、至少260％、至少265％、至少270％、至少275％、至少280％、至少285％、至少290％、至少295％、至少300％、至少305％、至少310％、至少315％、至少320％、至少325％、至少330％、至少335％、至少340％、至少345％、至少350％、至少355％、至少360％、至少365％、至少370％、至少375％、至少380％、至少385％、至少390％、至少395％或至少400％。优选地，亲本宿主细胞对于根据第一方面的宿主细胞是原本等基因的。
在一个实施例中，当细胞以分批发酵模式培养时，目的多肽的表达增加。
在一个实施例中，当细胞以分批给料发酵模式培养时，目的多肽的表达增加。
在一个实施例中，在培养24小时、48小时、72小时、96小时或120小时后实现目的多肽的表达增加。
在一个实施例中，在培养24小时后或在培养至少24小时后实现目的多肽的表达增加，优选地该培养是分批模式。
在一个实施例中，在培养120小时后或在培养至少120小时后实现目的多肽的表达增加，优选地该培养是分批给料模式。
在一个实施例中，目的多肽是蛋白酶，并且当在相同条件下培养时，相对于不包含减少或消除的鞭毛活性的亲本宿主细胞中该目的多肽的表达，该蛋白酶的表达增加高达11％、高达15％、高达20％、高达25％、高达30％、高达35％、高达40％、高达45％、高达50％、高达55％、高达60％、高达65％、高达70％、高达75％、高达80％、高达85％、高达90％、高达100％、高达105％、高达110％、高达115％、高达120％、高达125％、高达130％、高达135％、高达140％、高达145％、高达150％、高达155％、高达160％、高达165％、高达170％、高达175％、高达180％、高达185％、高达190％、高达195％、高达200％、高达205％、高达210％、高达215％、高达220％、高达225％、高达230％、高达235％、高达240％、高达245％、高达250％、高达255％、高达260％、高达265％、高达270％、高达275％、高达280％、高达285％、高达290％、高达295％、高达300％、高达305％、高达310％、高达315％、高达320％、高达325％、高达330％、高达335％、高达340％、高达345％、高达350％、高达355％、高达360％、高达365％、高达370％、高达375％、高达380％、高达385％、高达390％、高达395％或高达400％，优选地高达11％。优选地，亲本宿主细胞对于根据第一方面的宿主细胞是原本等基因的。
在一个实施例中，目的多肽是纳豆激酶，并且当在相同条件下培养时，相对于不包含减少或消除的鞭毛活性的亲本宿主细胞中该目的多肽的表达，该纳豆激酶的表达增加高达4％、高达5％、高达10％、高达15％、高达20％、高达25％、高达30％、高达35％、高达40％、高达45％、高达50％、高达55％、高达60％、高达65％、高达70％、高达75％、高达80％、高达85％、高达90％、高达100％、高达104％、高达105％、高达110％、高达115％、高达120％、高达125％、高达130％、高达135％、高达140％、高达145％、高达150％、高达155％、高达160％、高达165％、高达170％、高达175％、高达180％、高达185％、高达190％、高达195％、高达200％、高达205％、高达210％、高达215％、高达220％、高达225％、高达230％、高达235％、高达240％、高达245％、高达250％、高达255％、高达260％、高达265％、高达270％、高达275％、高达280％、高达285％、高达290％、高达295％、高达300％、高达305％、高达310％、高达315％、高达320％、高达325％、高达330％、高达335％、高达340％、高达345％、高达350％、高达355％、高达360％、高达365％、高达370％、高达375％、高达380％、高达385％、高达390％、高达395％或高达400％，优选地高达104％。优选地，亲本宿主细胞对于根据第一方面的宿主细胞是原本等基因的。
在一个实施例中，目的多肽是木聚糖酶，并且当在相同条件下培养时，相对于不包含减少或消除的鞭毛活性的亲本宿主细胞中该目的多肽的表达，该木聚糖酶的表达增加高达4％、高达5％、高达10％、高达15％、高达20％、高达25％、高达30％、高达35％、高达40％、高达45％、高达50％、高达55％、高达60％、高达65％、高达69％、高达70％、高达75％、高达80％、高达85％、高达90％、高达100％、高达105％、高达110％、高达115％、高达120％、高达125％、高达130％、高达135％、高达140％、高达145％、高达150％、高达155％、高达160％、高达165％、高达170％、高达175％、高达180％、高达185％、高达190％、高达195％、高达200％、高达205％、高达210％、高达215％、高达220％、高达225％、高达230％、高达235％、高达240％、高达245％、高达250％、高达255％、高达260％、高达265％、高达270％、高达275％、高达280％、高达285％、高达290％、高达295％、高达300％、高达305％、高达310％、高达315％、高达320％、高达325％、高达330％、高达335％、高达340％、高达345％、高达350％、高达355％、高达360％、高达365％、高达370％、高达375％、高达380％、高达385％、高达390％、高达395％或高达400％，优选地高达69％。优选地，亲本宿主细胞对于根据第一方面的宿主细胞是原本等基因的。
在一个实施例中，目的多肽是黄原胶裂解酶，并且当在相同条件下培养时，相对于不包含减少或消除的鞭毛活性的亲本宿主细胞中该目的多肽的表达，该黄原胶裂解酶的表达增加高达32％、高达45％、高达50％、高达55％、高达60％、高达65％、高达70％、高达75％、高达80％、高达85％、高达90％、高达100％、高达105％、高达110％、高达115％、高达120％、高达125％、高达130％、高达135％、高达140％、高达145％、高达150％、高达155％、高达160％、高达165％、高达170％、高达175％、高达180％、高达185％、高达190％、高达195％、高达200％、高达205％、高达210％、高达215％、高达220％、高达225％、高达230％、高达235％、高达240％、高达245％、高达250％、高达255％、高达260％、高达265％、高达270％、高达275％、高达280％、高达285％、高达290％、高达295％、高达300％、高达305％、高达310％、高达315％、高达320％、高达325％、高达330％、高达335％、高达340％、高达345％、高达350％、高达355％、高达360％、高达365％、高达370％、高达375％、高达380％、高达385％、高达390％、高达395％或高达400％，优选地高达32％。优选地，亲本宿主细胞对于根据第一方面的宿主细胞是原本等基因的。
宿主细胞可以是可用于重组产生本发明的一个或多个多肽的任何微生物细胞，例如原核细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic AcidsRes.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单胞菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下来实现：天然感受态(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick,1991,Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
在一个实施例中，宿主细胞进一步包含与编码非编码RNA分子的第二异源多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述非编码RNA分子被构造为通过与鞭毛基因的靶多核苷酸序列杂交或结合而与所述鞭毛基因的靶多核苷酸序列形成RNA:DNA异源双链体，或被构造为通过与该鞭毛基因的RNA转录物的靶多核苷酸序列杂交或结合而与所述RNA转录物的靶多核苷酸序列形成RNA:RNA异源双链体。
在优选的实施例中，第二异源多核苷酸编码非编码RNA分子，该非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多核苷酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
在另一优选的实施例中，第二异源多核苷酸由单个指导RNA组成、基本上由其组成、或包含其。
在又另一实施例中，宿主细胞包含编码催化无活性的位点定向多肽(CISP)的第三异源多核苷酸，该CISP选自由以下组成的组：催化无活性的CRISPR相关蛋白、催化无活性的锌指核酸酶(ZFN)、锌指、催化无活性的转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、TALE、催化无活性的兆核酸酶和催化无活性的MAD7/Cas12a核酸内切酶。
在优选的实施例中，CISP被构造为与以下的结合序列结合：
i)非编码RNA分子或ncRNA的多核苷酸序列，或
ii)RNA:DNA异源双链体的DNA或RNA多核苷酸序列，或
iii)RNA:RNA异源双链体的RNA多核苷酸序列，如RNA:RNA异源双链体的ncRNA；
在优选的实施例中，CISP被构造为与非编码RNA分子(如ncRNA分子)的多核苷酸序列的结合序列结合。
在另一实施例中，CISP被构造为与指导RNA分子结合。
在另一实施例中，CISP和ncRNA或指导RNA被构造为增加编码与SEQ ID NO:71具有至少60％序列同一性的MotI多肽的motI基因的表达。
在另一方面，本发明涉及一种突变的细菌宿主细胞，其包含与编码一种或多种目的多肽的第一异源多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中至少一个鞭毛基因被改变，从而所述改变的鞭毛基因编码改变的鞭毛多肽。优选地，改变的鞭毛多肽通过减少或消除宿主细胞的鞭毛活性来影响所述宿主细胞的鞭毛活性。在一个实施例中，改变的鞭毛多肽的表达类似于未突变的亲本细胞中的鞭毛多肽的表达。在另一实施例中，改变的鞭毛基因包含选自核苷酸缺失、核苷酸插入和提前终止密码子的改变。优选地，该改变影响鞭毛的功能性和/或活性，其中鞭毛活性减少或消除。
在另一方面，本发明涉及产生亲本细胞的突变体的方法，其包括灭活编码至少一个鞭毛多肽的多核苷酸，从而导致与该亲本细胞相比，该突变体产生的鞭毛多肽更少。
在另一方面，本发明涉及突变体细胞，其通过所述产生亲本细胞的突变体的方法产生。
在一个实施例中，所述突变体细胞进一步包含编码一种或多种天然或异源蛋白的基因。
在另外的方面，本发明涉及双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含至少一个鞭毛基因的多核苷酸序列的子序列，其中任选地该dsRNA是siRNA或miRNA分子。
在一个实施例中，双链抑制性RNA(dsRNA)分子的长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个双链体核苷酸。
在另外的方面，本发明涉及抑制细胞中至少一种鞭毛多肽的表达的方法，其包括向该细胞施用所述双链抑制性RNA(dsRNA)分子或者在该细胞中表达所述双链抑制性RNA(dsRNA)分子。
在另外的方面，本发明涉及突变体细胞，其通过所述抑制至少一种鞭毛多肽的表达的方法产生。
生产方法
在第二方面，本发明还涉及用于生产一种或多种目的多肽的方法，该方法包括：i)提供根据第一方面的细菌宿主细胞；ii)在有利于该一种或多种目的多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；以及iii)任选地回收该一种或多种目的多肽。
在一个方面，细胞是芽孢杆菌属细胞。在另一方面，细胞是枯草芽孢杆菌细胞。在另一方面，细胞是地衣芽孢杆菌细胞。
在一个实施例中，以分批发酵模式培养细胞。
在一个实施例中，以分批给料发酵模式培养细胞。
在一个实施例中，培养的持续时间为至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时或至少120小时。
在一个实施例中，培养的持续时间为至少24小时，优选地该培养为分批模式。
在一个实施例中，培养的持续时间为至少120小时，优选地该培养为分批给料模式。
宿主细胞是在适用于使用本领域已知的方法生产多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批给料或固态发酵)培养细胞，该培养在合适的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的合适的营养培养基中。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果多肽被分泌到营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不被分泌，则可以从细胞裂解物中将其回收。
可以使用本领域已知的对于多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规程序从发酵培养基回收多肽，这些程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一个方面，回收包含多肽的全发酵液。
可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和尺寸排阻色谱法)、电泳程序(例如，制备型等电聚焦电泳)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCHPublishers[VCH出版公司],纽约,1989)。
鞭毛多肽
在一些实施例中，本发明涉及鞭毛多肽，其与以下的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63，这些鞭毛多肽有助于减少或消除鞭毛活性。在一些实施例中，本发明涉及一种鞭毛多肽，其与SEQ ID NO:71的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，当存在于宿主细胞中时，该鞭毛多肽有助于减少或消除鞭毛活性。
在一个方面，这些多肽与以下的成熟多肽的差异在于多达10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63。
鞭毛多肽优选地包含以下的氨基酸序列的变体或该变体的成熟多肽、基本上由其组成、或由其组成：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63；或者是其有助于减少或消除鞭毛活性的片段。
在一些实施例中，本发明涉及有助于减少或消除活性的由多核苷酸编码的鞭毛多肽，其在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与编码以下的多肽的成熟多肽编码序列的全长互补序列或其cDNA杂交：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:62和SEQ ID NO:63(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第2版,Cold Spring Harbor[冷泉港实验室],纽约)。
编码鞭毛多核苷酸序列或其子序列、以及以下的成熟多肽或其片段可以用于设计核酸探针：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63，以根据本领域熟知的方法从不同属或物种的菌株中鉴定和克隆编码鞭毛多肽的DNA。这样的探针可以用于遵循标准DNA印迹程序与目的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中对应的基因。这样的探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15个，例如至少25个、至少35个或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如，长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地对探针加标签(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)，用于检测对应的基因。本发明涵盖这样的探针。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码鞭毛多肽的DNA来筛选由这样的其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这样的其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝酸纤维素或另一合适的运载体材料上。为了鉴定与鞭毛基因或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用运载体材料。
出于本发明的目的，杂交指示多核苷酸与对应于以下各项的经加标签的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17；(ii)SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列；(iv)其全长互补序列；或(v)其子序列，如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQID NO:23的子序列；该杂交在中至非常高严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在一些实施例中，本发明涉及鞭毛多肽，其由与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的多核苷酸或其cDNA序列编码。
编码该多肽的多核苷酸优选地包含具有SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:17的多核苷酸，基本上由其组成，或由其组成。
在一些实施例中，本发明涉及多肽，其通过在SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQID NO:62和/或SEQ ID NO:63的成熟多肽中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而衍生自SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和/或SEQ ID NO:63的成熟多肽。在一些实施例中，本发明涉及以下的成熟多肽的变体：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:62和/或SEQ ID NO:63，其在一个或多个(例如，几个)位置处包含取代、缺失和/或插入。在一个方面，引入SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和/或SEQ ID NO:63的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目为多达10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)。在实施例中，多肽具有1-10个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的N-末端延伸和/或C-末端延伸。氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合模块)来促进纯化。优选地，氨基酸变化通过减少或消除鞭毛活性来影响该鞭毛活性。
可以根据本领域中已知的程序来鉴定多肽中的必需氨基酸，这些程序如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得分子的鞭毛活性以鉴定对于该分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如由如以下技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
可以使用已知的诱变、重组和/或混编方法，随后进行相关的筛选程序来做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序如由以下披露的那些：Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/混编方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
在一些实施例中，编码至少一种鞭毛多肽的基因包含提前终止密码子。在一个实施例中，包含提前终止密码子的鞭毛基因编码缩短的鞭毛多肽，其通过减少或消除鞭毛活性来影响该鞭毛活性。优选地，编码鞭毛多肽的基因或其编码区从宿主细胞基因组中完全或部分缺失，例如通过同源重组。在优选的实施例中，鞭毛基因缺失通过减少或消除鞭毛活性来影响宿主细胞的鞭毛活性。
鞭毛基因和鞭毛多肽的来源
本发明的鞭毛基因或鞭毛多肽可获得自任何属的微生物。出于本发明的目的，如本文结合给定来源使用的术语“获得自”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。
应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全状态以及其他分类学等同物，例如无性型，而与它们已知的物种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，这些培养物保藏中心如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)和美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用以上提及的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得鞭毛基因和鞭毛多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)分离或克隆该多核苷酸。
多核苷酸
本发明还涉及分离的多核苷酸，其编码至少一种本发明的突变的鞭毛多肽，如本文所述。优选地，突变的鞭毛多肽通过减少或消除宿主细胞的鞭毛活性和/或细胞运动来影响该宿主细胞的鞭毛活性和/或细胞运动。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。从基因组DNA克隆多核苷酸可以例如通过使用聚合酶链式反应(PCR)或用以检测具有共有的结构特征的克隆的DNA片段的表达文库的抗体筛选来实现。参见例如，Innis等人,1990,PCR:AGuide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南],Academic Press[学术出版社],纽约。可以使用其他核酸扩增程序如连接酶链式反应(LCR)、连接激活的转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆自芽孢杆菌属的菌株或相关生物，并且因此例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的物种变体。
编码本发明突变的鞭毛多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。这些多肽可以因某种工程化方式而与从其天然来源分离的多肽不同，例如减少或消除鞭毛活性的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的成熟多肽编码序列、或其cDNA序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入导致该多肽的氨基酸序列变化的核苷酸取代，或通过引入可以产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如Ford等人,1991,Protein Expression andPurification[蛋白质表达与纯化]2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体，其中任选地，该多核苷酸与一个或多个控制序列可操作地连接，在与这些控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式操纵多核苷酸以提供至少一种鞭毛多肽、目的多肽、CISP或ncRNA的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可能是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达本发明的编码多肽的多核苷酸或ncRNA。启动子含有介导多肽的表达或ncRNA的转录的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变体启动子、截短启动子和杂合启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明多核苷酸的转录的合适启动子的实例是获得自以下基因的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。另外的启动子描述于以下文献中：Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Useful proteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子与编码多肽的多核苷酸或ncRNA的3'-末端可操作地连接。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子获得自以下的基因：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例获得自苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,J.Bacteriol.[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导序列，即，对宿主细胞翻译而言重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码多肽的多核苷酸或ncRNA的5'-末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即，与多核苷酸的3’-末端可操作地连接并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。
还可能希望的是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长调节多肽或ncRNA的表达。调节序列的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节序列包括lac、tac和trp操纵子系统。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。
在第三方面，本发明涉及核酸构建体，该核酸构建体包含编码至少一种含有以下多肽序列或由其组成的突变的鞭毛多肽的多核苷酸，该多肽序列与SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ IDNO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63中的任一个的多肽序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，启动子与编码至少一种突变的鞭毛多肽的多核苷酸可操作地连接。在优选的实施例中，突变的鞭毛多肽影响宿主细胞的鞭毛活性或细胞运动，其中该宿主细胞的鞭毛活性或细胞运动减少或消除。启动子可以是任何同源或异源启动子。优选地，启动子是异源的。在一个实施例中，将根据第三方面的核酸构建体通过同源重组整合到宿主细胞基因组中，其中缺失未突变的鞭毛基因。
在一个方面，核酸构建体包含与编码非编码RNA分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中该非编码RNA分子被构造为通过与至少一个细菌鞭毛基因的靶多核苷酸序列杂交而与所述细菌鞭毛基因的靶多核苷酸序列形成RNA:DNA异源双链体，或被构造为通过与该鞭毛基因的RNA转录物的靶多核苷酸序列杂交而与所述RNA转录物的靶多核苷酸序列形成RNA:RNA异源双链体。
在一个实施例中，非编码RNA分子包含与以下的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多核苷酸序列，基本上由其组成，或由其组成：(i)SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ IDNO:17的多核苷酸序列；(ii)SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的转录物；或(iii)SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的互补多核苷酸序列。
在一个实施例中，非编码RNA分子包含与以下的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多核苷酸序列，基本上由其组成，或由其组成：(i)至少一个选自以下的细菌鞭毛基因的编码链的多核苷酸序列：flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhC、flhD、flhE、flhF、flhG、flhO、flhP、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliR、fliS、fliT、fliY、fliZ、hag、motA、motB、ylxF、swrD、cheY、cheB、cheA、cheW、cheC、cheD、sigD、和swrB；(ii)至少一个选自以下的细菌鞭毛基因的转录物：flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhC、flhD、flhE、flhF、flhG、flhO、flhP、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliR、fliS、fliT、fliY、fliZ、hag、motA、motB、ylxF、swrD、cheY、cheB、cheA、cheW、cheC、cheD、sigD、和swrB；或(iii)至少一个选自以下的细菌鞭毛基因的编码链的多核苷酸序列的互补多核苷酸序列：flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhC、flhD、flhE、flhF、flhG、flhO、flhP、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliR、fliS、fliT、fliY、fliZ、hag、motA、motB、ylxF、swrD、cheY、cheB、cheA、cheW、cheC、cheD、sigD、和swrB。
在一个实施例中，非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多核苷酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，其包含本发明的多核苷酸、和任选地启动子、以及转录和翻译终止信号。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码多肽的多核苷酸或ncRNA在这样的位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
在第四方面，本发明涉及表达载体，其包含根据第三方面的核酸构建体。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制的载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当引入宿主细胞中时，它整合到基因组中并与已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单个载体或质粒、或一起含有待引入宿主细胞基因组的总DNA的两个或更多个载体或质粒、或转座子。在一个实施例中，将载体整合到至少一个鞭毛基因的多核苷酸序列中，其中该至少一个鞭毛基因的表达减少或消除。在另一实施例中，使载体经受与至少一个鞭毛基因的多核苷酸序列的同源重组或非同源重组，其中缺失该至少一个鞭毛基因或其编码区。
载体优选地含有允许容易地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素或四环素抗性)的标记。
选择性标记可以是如WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选地含有允许将该载体整合到宿主细胞的基因组中或使该载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码多肽的多核苷酸的序列或ncRNA或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而在一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处整合到宿主细胞基因组中的另外的多核苷酸。为了提高在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，这些核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增加同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。在优选的实施例中，载体或非同源重组能够缺失或部分缺失编码鞭毛多肽的基因。
为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体能够在讨论中的宿主细胞中自主复制。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入宿主细胞中以增加目的多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
鞭毛活性的去除或减少
本发明还涉及产生亲本细胞的突变体的方法，其包括破坏或缺失多核苷酸序列的多核苷酸、或多核苷酸序列的一部分，所述多核苷酸序列编码本发明的鞭毛多肽，从而导致当在相同条件下培养时，与亲本细胞相比，突变体细胞产生的鞭毛多肽更少。另外地或可替代地，可以通过MotI多肽(如SEQ ID NO:71的多肽)的过表达来抑制鞭毛活性。
可以使用本领域熟知的方法(例如插入、破坏、替代或缺失)通过减少或消除多核苷酸的表达来构建突变体细胞。在一些实施例中，灭活鞭毛多核苷酸。例如，待修饰或灭活的多核苷酸可以是鞭毛活性必需的编码区或其一部分，或该编码区的表达所需的调节元件。这样的调节或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响多核苷酸的表达的部分。用于可能的修饰的其他控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活子。
鞭毛多核苷酸的修饰或灭活可以通过使亲本细胞经受诱变，并且选择该鞭毛多核苷酸的表达减少或消除的突变体细胞来进行。该诱变可以是特异的或随机的，例如可以通过使用适合的物理或化学诱变剂、通过使用适合的寡核苷酸、或通过使DNA序列经受PCR产生的诱变来进行。此外，诱变可通过使用这些诱变剂的任何组合来进行。
适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、邻甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。
当使用这样的试剂时，诱变典型地在适合条件下在所选的诱变剂的存在下通过孵育待诱变的亲本细胞并筛选和/或选择展示基因表达减少或不表达的突变体细胞来进行。
多核苷酸的修饰或灭活可以通过在基因中或在其转录或翻译所需的调节元件中插入、取代或缺失一个或多个核苷酸来完成。例如，可插入或去除核苷酸从而导致终止密码子的引入、起始密码子的去除、或开放阅读框的变化。这样的修饰或灭活可根据本领域已知的方法通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成。尽管原则上修饰可以在体内进行，即直接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但是优选的是如下所示例地在体外进行修饰。
消除或减少多核苷酸的表达的便利方法基于基因沉默(如实例2-8和实例11所呈现)、基因缺失和替代(如实例9-10和实例12-13所呈现)、或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，将对应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行诱变以产生缺陷的核酸序列，然后将其转化到亲本细胞中以产生缺陷的基因。通过同源重组，缺陷的核酸序列替代内源多核苷酸。可能令人希望的是，缺陷的多核苷酸还编码可用于选择其中该多核苷酸已经被修饰或破坏的转化体的标记。在一方面，用选择性标记(如本文描述的那些)来破坏多核苷酸。
本发明还涉及抑制细胞中至少一种鞭毛多肽的表达的方法，其包括向该细胞施用双链RNA(dsRNA)分子或者在该细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中该dsRNA包含本发明的多核苷酸的子序列。在优选的方面，dsRNA的长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个双链体核苷酸。
dsRNA优选地是小干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。在优选的方面，dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一优选的方面，dsRNA是用于抑制翻译的微小RNA。
本发明还涉及这样的双链RNA(dsRNA)分子，其包含至少一个选自以下的鞭毛基因的成熟多肽编码序列的一部分：flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhC、flhD、flhE、flhF、flhG、flhO、flhP、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliR、fliS、fliT、fliY、fliZ、hag、motA、motB、ylxF、swrD、cheY、cheB、cheA、cheW、cheC、cheD、sigD、和swrB，优选地SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的序列的一部分，用于抑制至少一种鞭毛多肽在细胞中的表达。在一个实施例中，dsRNA针对与选自以下列表的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多核苷酸序列：SEQ ID NO:18(flgE)、SEQ ID NO:19(flgE)、SEQID NO:20(fliR)、SEQ ID NO:21(fliR)、SEQ ID NO:22(flhG)和SEQ ID NO:23(flhG)。
在一个实施例中，当在相同条件下培养时，相对于不包含减少或消除的鞭毛活性的亲本宿主细胞中的鞭毛靶基因mRNA的水平，该鞭毛靶基因mRNA的水平降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。优选地，亲本宿主细胞对于根据第一方面的宿主细胞是原本等基因的。
虽然本发明不受任何特定的作用机制限制，但是dsRNA可以进入细胞并且导致相似的或相同的序列的单链RNA(ssRNA)(包括内源mRNA)的降解。当使细胞暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地受到称为RNA干扰(RNAi)的过程的降解。
本发明的dsRNA可以用于基因沉默。在一个方面，本发明提供了使用本发明的dsRNAi来选择性地降解RNA的方法。可以在体外、离体或体内进行该过程。在一个方面，可以使用dsRNA分子来在细胞、器官或动物中产生功能缺失突变。用于制备并使用dsRNA分子选择性降解RNA的方法在本领域中是熟知的；参见例如美国专利号6,489,127、6,506,559、6,511,824、以及6,515,109。
也可以通过以下来利用基因破坏：用位点特异性核酸内切酶靶向至少一个鞭毛基因，以在鞭毛多核苷酸中产生框外插入或缺失。合适的位点特异性核酸内切酶是熟知的，并且包括ZFN、TALEN、兆核酸酶或RNA指导的核酸内切酶，如CRISPR/Cas9或CRISPR/Cas12a，例如MAD7。
本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码至少一种鞭毛多肽的多核苷酸或其控制序列的破坏或缺失、或沉默的编码该多核苷酸的基因，从而导致与该亲本细胞相比，该突变体细胞产生的鞭毛多肽更少或不产生该鞭毛多肽。
多肽缺陷型突变体细胞作为用于天然和异源多肽的表达的宿主细胞特别有用。因此，本发明进一步涉及生产一种或多种天然或异源多肽的方法，其包括(a)在有利于生产该一种或多种多肽的条件下培养突变体细胞；以及(b)回收该多肽。术语“异源多肽”意指对宿主细胞而言不是天然的多肽，例如天然蛋白质的变体。宿主细胞可以包含编码天然或异源多肽的多核苷酸的多于一个拷贝。
用于培养和纯化目的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。
本发明进一步涉及亲本细胞的突变体细胞，其包含编码多肽的多核苷酸或其控制序列的破坏或缺失、或沉默的编码至少一种鞭毛多肽的基因，从而导致与该亲本细胞相比，该突变体细胞产生的鞭毛多肽更少或不产生多肽。
鞭毛多肽缺陷型突变体细胞作为用于天然和异源多肽的表达的宿主细胞是有用的。因此，本发明进一步涉及生产一种或多种天然或异源多肽的方法，其包括(a)在有利于生产该一种或多种多肽的条件下培养突变体细胞；以及(b)回收该多肽。术语“异源多肽”意指对宿主细胞而言不是天然的多肽，例如天然蛋白质的变体。
用于培养和纯化目的产物的方法可以通过本领域已知的方法进行。
实例
培养基
使芽孢杆菌属菌株在LB琼脂(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/LNaCI、15g/L琼脂)板上或在TY液体培养基(20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物、7mg/L FeCI2、1mg/LMnCI2、15mg/L MgCI2)中生长。为了选择红霉素抗性，对琼脂和液体培养基补充5μg/ml红霉素。为了选择氯霉素抗性，对琼脂和液体培养基补充6μg/ml氯霉素。为了选择壮观霉素抗性，对琼脂和液体培养基补充120μg/mL壮观霉素。对携带alr基因破坏的菌株的生长培养基补充D-丙氨酸至终浓度为0.4mg/mL。在Spizizen I培养基中转化芽孢杆菌，该培养基由以下组成：1x Spizizen盐(6g/L KH2PO4、14g/LK2HPO4、2g/L(NH4)2SO4、1g/L柠檬酸钠、0.2g/LMgSO4，pH 7.0)、0.5％葡萄糖、0.1％酵母提取物以及0.02％酪蛋白水解物。
分子生物学方法
通过如在以下描述的标准分子生物学方法进行DNA操纵和转化：
·Sambrook等人(1989):Molecular cloning:A laboratory manual.[分子克隆：实验室手册]Cold Spring Harbor laboratory[冷泉港实验室],纽约冷泉港(Cold SpringHarbor,NY).
·Ausubel等人(编辑)(1995):Current pro7tocols in Molecular Biology.[当前分子生物学方案]John Wiley and Sons[约翰威利父子出版公司].
·Harwood和Cutting(编辑)(1990):Molecular Biological Methods forBacillus[用于芽孢杆菌属的分子生物学方法].John Wiley and Sons[约翰威利父子出版公司].
用于DNA操纵的酶获得自新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs,Inc.)并且基本上如供应商推荐的进行使用。
枯草芽孢杆菌的感受态细胞和转化如在Yasbin等人(1975,Transformation andtransfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis:evidence for selectiveinduction of prophage in competent cells[枯草芽孢杆菌的溶原性菌株中的转化和转染：感受态细胞中原噬菌体的选择性诱导的证据].J.Bacteriol[细菌学杂志].121:296-304)中所描述的来获得。通过使用来自凯杰公司(Qiagen)的市售QIAamp DNA血液试剂盒(QIAamp DNA Blood Kit)制备基因组DNA。使用Phusion热启动DNA聚合酶系统(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))通过PCR扩增相应的DNA片段。PCR扩增反应混合物含有1μL(0.1pg)的模板DNA、1μL的正义引物(20pmol/μL)、1μL的反义引物(20pmol/μL)、10μL的5XPCR缓冲液(具有7.5mM MgCl2)、8μL的dNTP混合物(各1.25mM)、39μL水和0.5μL(2U/)DNA聚合酶。使用热循环仪来扩增片段。根据制造商的说明书，使用Qiagen QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司，加利福尼亚州巴伦西亚(Valencia,CA))，用1x TBE缓冲液从1.2％琼脂糖凝胶中纯化PCR产物。
用于SOE-PCR的条件如下：将纯化的PCR产物用于随后的PCR反应中，以使用剪接重叠PCR(SOE)使用Phusion热启动DNA聚合酶系统(赛默飞世尔科技公司)如下产生单个片段。PCR扩增反应混合物含有三种凝胶纯化的PCR产物，每种50ng。添加与外部PCR产物的每条链的3’-端互补的引物，并使用热循环仪组装和扩增SOE片段。
用于POE-PCR的条件如下：将纯化的PCR产物用于随后的PCR反应中，以使用剪接重叠PCR(SOE)使用Phusion热启动DNA聚合酶系统(赛默飞世尔科技公司)如下产生单个片段。5’端片段和3’端片段具有互补端，这将允许SOE串联到POE PCR产物中。PCR扩增反应混合物含有三种凝胶纯化的PCR产物，每种50ng。如(You,C等人(2017)Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]116,183-92)中所述进行POE PCR。
游泳/运动测定
在37C、250rpm下将菌株接种到10mL TY中过夜(ON)。将过夜(ON)培养物按10mL稀释至OD(450nm)＝0.05，并使其在37C、250rpm下生长4hr。将2μL培养物点在新鲜制备的0.26％ LB琼脂板上。板的浇注如下进行：使LB琼脂在微波炉中熔化。将15mL LB琼脂倒入LAF台中的陪替氏培养皿中。干燥10min。从10mL过夜(ON)培养物中将2μL培养物点到板上。再干燥5min。将其置于37C下的培养箱中过夜(ON)。
Biolector发酵
使菌株在Biolector(m2p实验室(m2p-labs))中在花板(MTP-48-B)中于1mL TY培养基中在37C、1000rpm下发酵24hr。由在37C、250rpm下在M管中于10mL TY培养基中生长的过夜培养物接种培养板。将花板接种至OD(450nm)为0.05。
淀粉酶测定
使用AMYL(罗氏公司(Roche)/日立公司(Hitachi)编号11876473 001)在培养上清液中测量淀粉酶活性。将来自DWP的培养上清液在稳定子缓冲液(0.03M CaCl2；0,0083％Brij 35)中稀释至1/50。将来自生物反应器样品的样品稀释在稳定子缓冲液中。将AMYL试剂盒的试剂1和试剂2以10:1混合以产生测定底物。将20μL稀释的样品与180μL测定底物混合。将测定在37C w/振荡下孵育30min。在板读取器中在405nm处测量吸光度。包括淀粉酶标准品，并确定最终活性值KNU(N)/g。
蛋白酶测定
丝氨酸内肽酶水解底物N-琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Phe对硝基酰苯胺。反应在室温下于pH 9.0下进行。pNA的释放导致在405nm处的吸光度增加，并且该增加与针对标准品测量的酶活性成比例。
黄原胶裂解酶测定
在50℃、pH 7.0下使用黄原胶(Keltrol T)作为底物进行还原端部测定。反应由含有PAHBAH和铋的碱性试剂终止，该碱性试剂与还原糖形成复合物。复合物形成导致颜色产生，其可以通过分光光度计在405nm处读取。所产生的颜色与黄原胶裂解酶活性成比例。
木聚糖酶测定：
在50℃、pH 6.0下使用小麦阿拉伯糖基木聚糖(WAXY-M，麦格酶公司(Megazyme))作为底物进行还原端部测定。反应由含有PAHBAH和铋的碱性试剂终止，该碱性试剂与还原糖形成复合物。复合物形成导致颜色产生，其可以通过分光光度计在405nm处读取。所产生的颜色与木聚糖酶活性成比例。
RNA提取
qRT-PCR的样品获得自在每种菌株的YT培养基中的过夜培养物，将该菌株一式三份稀释至OD450为0.05，然后在OD450为约0.8处将其收获。对于所有样品，在4℃下以3,220g收集细胞4分钟。将沉淀在0.5ml玻璃珠(西格玛公司(Sigma)编号G8772)、1ml提取缓冲液(10mM NaOAc、150mM蔗糖、1％ SDS)和1ml 5:1的苯酚:氯仿(pH 4.5)(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)编号AM9720)中涡旋4分钟，并去除玻璃珠。将样品在65℃下孵育5分钟，然后在液氮中冷冻，并在4℃下以13,000g离心20分钟，然后转移水相以重复热苯酚提取。然后将水相转移到1体积的氯仿中并反转，然后在4℃下以13,000离心10分钟以进行相分离。最后在室温下将RNA在1体积异丙醇中沉淀10分钟，然后在4℃下以15,000g离心45分钟。用70％乙醇洗涤RNA沉淀并将其溶解在水中。使用TURBO DNA酶(英杰公司(Invitrogen)编号AM2238)对qRT-PCR样品进行DNA酶消化，并根据制造商的说明书使用RNA Clean&Concentrator(Zymo研究公司(Zymo research)编号R1016)进行纯化。使用DNA酶I(凯杰公司编号79254)对发酵RNA-seq样品进行DNA酶消化，并根据制造商的说明书使用RNeasyMinElute Cleanup试剂盒(凯杰公司编号74204)进行纯化。使用凝胶电泳或生物分析仪评估RNA的完整性。
qRT-PCR
根据制造商的方案，使用Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green qRT-PCR预混液(安捷伦科技有限公司(Agilent Technologies)编号600886)进行定量RT-PCR，其中在10μl反应中具有5ng RNA，使用0.5μM的每种寡聚物(SEQ ID NO:80-91中列出的寡聚物)。使用Quantstudio 6Flex(应用生物系统公司(Applied Biosystems)编号4485694)在50℃下孵育10分钟、在95℃下孵育3分钟以及40个在95℃下持续5秒和在60℃下持续15秒的循环，以技术上一式两份的方式对三个生物学重复样品中的每一个进行量化。使用2-ΔΔCt方法计算折叠变化，并使用citA作为参考基因。
质粒
pE194(SEQ ID NO:9)：分离自金黄色葡萄球菌的质粒(Horinouchi,S4Weisbium,B..Journal of Bacteriology[细菌学杂志],1982,150(2):804-814)。
pTK0001：用于在枯草芽孢杆菌中表达ncRNA的质粒(本披露)
菌株
枯草芽孢杆菌168：Kunst F,Ogasawara N,Moszer I等人,Nature[自然].1997年11月20日；390(6657).249-56。
AEB2718：枯草芽孢杆菌168，其在基因sigF、nprE、aprE、amyE和srfAC中具有缺失，使它们全部无活性。相同的缺失如在以下中所述：Sloma,A.和L.Christianson(1999).Nucleic acids encoding a polypeptide having protease activity[编码具有蛋白酶活性的多肽的核酸].美国专利号5,891,701。
ThKK0007：枯草芽孢杆菌AEB2718，pel::P4199-JE1zyn-cat
ThKK0016：枯草芽孢杆菌ThKK0007；amyE::spec P4199'-CISP
ThKK0086：枯草芽孢杆菌ThKK0016；amyE::spec P4199'-CISP,'dal-
ThKK0108：枯草芽孢杆菌ThKK0086；amyE::spec P4199'-CISP,'dal+Pq_ncRNA::GFP
ThKK0273：枯草芽孢杆菌ThKK0086；amyE::spec P4199'-CISP,'dal+Pq_ncRNA::ncRNA_19_0003_1
ThKK0274：枯草芽孢杆菌ThKK0086；amyE::spec P4199'-CISP,'dal+Pq_ncRNA::ncRNA_19_0003_2
ThKK0275：枯草芽孢杆菌ThKK0086；amyE::spec P4199'-CISP,'dal+Pq_ncRNA::ncRNA_19_0003_3
ThKK0276：枯草芽孢杆菌ThKK0086；amyE::spec P4199'-CISP,'dal+Pq_ncRNA::ncRNA_19_0003_4
ThKK0277：枯草芽孢杆菌ThKK0086；amyE::spec P4199'-CISP,'dal+Pq_ncRNA::ncRNA_19_0003_5
ThKK0278：枯草芽孢杆菌ThKK0086；amyE::spec P4199'-CISP,'dal+Pq_ncRNA::ncRNA_19_0003_6
BT11018：枯草芽孢杆菌ThKK0007，flgE::ERM
BT11019：枯草芽孢杆菌AEB2718，flgE::ERM
BT11103：枯草芽孢杆菌AEB2718，amyE::Pcons-aprH-cat
BT11104：枯草芽孢杆菌BT11019，amyE::Pcons-aprH-cat，flgE::ERM
BT11105：枯草芽孢杆菌AEB2718，amyE::Pcons-纳豆激酶-cat
BT11106：枯草芽孢杆菌BT11019，amyE::Pcons-纳豆激酶-cat，flgE::ERM
BT11109：枯草芽孢杆菌AEB2718，amyE::Pcons-木聚糖酶-cat
BT11110：枯草芽孢杆菌BT11019，amyE::Pcons-木聚糖酶-cat，flgE::ERM
BT11111：枯草芽孢杆菌AEB2718，pel::P4199-黄原胶裂解酶-cat
BT11112：枯草芽孢杆菌BT11019，pel::P4199-黄原胶裂解酶，flgE::ERM
引物
表1：引物和序列概述
ncRNA靶序列
表2：枯草芽孢杆菌中ncRNA靶序列和靶基因的列表
实例1：淀粉酶菌株的产生
订购了含有在P4199启动子控制下的JE1zyn淀粉酶(SEQ ID NO:10)的表达盒的合成DNA。JE1zyn淀粉酶是来自盐敏芽孢杆菌(Bacillus halmapalus)的JE1淀粉酶的密码子优化版本。P4199启动子先前描述于WO 1993010249中。将构建体插入AEB2718中的pel基因座中，产生菌株ThKK0007。
实例2：具有CISP的淀粉酶菌株的产生
在amyE基因座处将表达盒插入ThKK0007中，其中cisp基因编码从P4199启动子表达的CISP。P4199启动子先前描述于WO 1993010249中。将所得菌株命名为ThKK0016
实例3：ncRNA::GFP表达质粒的产生
为了促进CISP与鞭毛基因的靶DNA序列的结合，ncRNA的存在是必要的，所述ncRNA被构造为与该鞭毛靶基因的DNA序列结合并使CISP能够与RNA:DNA异源双链体结合，以减少或消除鞭毛靶基因的表达。ncRNA由来自解淀粉芽孢杆菌的amyQ启动子表达(WO1999043835A2)。从基因艺术公司(GeneArt)订购作为具有针对GFP的ncRNA靶序列的DNA串的表达盒，该表达盒包括Pq启动子、ncRNA靶序列、ncRNA恒定结构域和终止子。通过POE-PCR将ncRNA表达盒克隆到pE194中。如(You,C等人(2017)Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]116,183-92)中所述进行POE-PCR。所得质粒是pTK0001。
将转化体铺板在红霉素(1μg/mL)LBPG板上。在红霉素(1μg/mL)LBPG板上再次限制生长的菌落，并将质粒纯化并测序。将正确的质粒保存为pTK0001
实例4：用于ncRNA染色体整合的受体菌株的产生
根据标准实验室实践，通过插入新霉素抗性基因NeoR，灭活alr基因座，从而使菌株在不向生长培养基中补充D-丙氨酸的情况下无法生长。在ThKK0016中进行了alr破坏，产生了ThKK0086菌株。
实例5：具有针对GFP的染色体整合的ncRNA的菌株(ThKK0108)的产生
为了整合ncRNA表达构建体，将附加体克隆的ncRNA::GFP表达盒从pTK0001移动到适当的受体菌株(ThKK0086)的alr基因座中。从携带功能性alr的野生型菌株(在该情况中为ThKK0007)扩增指导同源物重组的侧翼序列。将上游侧翼区域序列列为SEQ ID NO:11，并将下游侧翼区域列为SEQ ID NO:12。通过SOE PCR组装侧翼区域和ncRNA::GFP表达盒。
进行SOE PCR产物的转化，如先前描述于Yasbin等人(1975,Transformation andtransfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis:evidence for selectiveinduction of prophage in competent cells[枯草芽孢杆菌的溶原性菌株中的转化和转染：感受态细胞中原噬菌体的选择性诱导的证据].J.Bacteriol.[细菌学杂志]121,296-304)中，其中将400μL 10mg/mL D-丙氨酸添加到10mL Spitz转化培养基中。所得的具有ncRNA::GFP的菌株是ThKK0108
实例6：基于ThKK0108的具有染色体整合的ncRNA的菌株的产生
对于ncRNA的高通量克隆，通过寡聚物重叠用新的20bp靶序列取代染色体整合的ncRNA::GFP(ThKK0108)中的20bp ncRNA靶序列。
从Eurofins基因组公司(Eurofins Genomics)订购在板中的新的ncRNA靶序列寡聚物。在来自ThKK0108的基因组DNA上制备上游整合片段(Up_frag)的模板(对于Up_flag序列，参见SEQ ID NO:13)，在来自ThKK0108的基因组DNA上制备下游整合片段(Down_frag)的模板(对于Down_frag序列，参见SEQ ID NO:14)。使用ncRNA_up寡聚物产生up_ncRNA_片段，使用ncRNA_down寡聚物生成down_ncRNA_片段(Bp，SEQ ID NO:12)。这些PCR产生了用于整合到alr中的上游和下游侧翼区域。然后将模板Ap和Bp组合，并产生携带新的ncRNA序列的新SOE片段(详见表2)。使用GC缓冲液(Phusion Hot Start DNA聚合酶系统(赛默飞世尔科技公司)，添加了2％ DMSO)进行SOE PCR。如上所述在ThKK0086中转化SOE。
实例7：将CISP引导至鞭毛操纵子的影响
为了评价将CISP机制引导至鞭毛操纵子对细胞形成功能性鞭毛的能力的影响，克隆了ncRNA以靶向鞭毛操纵子中的三个鞭毛基因(见表2)。发现flgE、fliR和flhG的DNA序列为SEQ ID NO:15(flgE)、SEQ ID NO:16(fliR)和SEQ ID NO:17(flhG)。发现靶向的鞭毛基因的靶核苷酸序列为SEQ ID NO:18(flgE)、SEQ ID NO:19(flgE)、SEQ ID NO:20(fliR)、SEQ ID NO:21(fliR)、SEQ ID NO:22(flhG)和SEQ ID NO:23(flhG)。进行游泳/运动测定以评价鞭毛操纵子的阻断的效果(图1：游泳测定，针对鞭毛操纵子的ncRNA抑制游泳，黑圈指示菌株沉积在板上的位置)。对照菌株(ThKK0108)向外扩散并覆盖整个板，显示出其在薄琼脂板中游泳的能力(图1，左板)。与对照ncRNA::GFP(ThKK0108)相比，携带针对鞭毛操纵子的ncRNA的所有六个菌株(ThKK0273：flgE，ThKK0274：flgE，ThKK0275：fliR，ThKK0276：fliR，ThKK0277：flhG和ThKK0278：flhG)导致游泳能力下降，这表明通过破坏鞭毛基因flgE、fliR或flhG中的任一个的基因表达降低了鞭毛的功能性(图1，中板和右板)。
实例8：鞭毛操纵子破坏后淀粉酶活性增加
将ThKK0273(破坏的flgE表达)、ThKK0274(破坏的flgE表达)、ThKK0275(破坏的fliR表达)、ThKK0276(破坏的fliR表达)、ThKK0277(破坏的flhG表达)和ThKK0278(破坏的flhG表达)在Biolector装置中培养，以评价鞭毛破坏对淀粉酶活性和产率的影响。包括ThKK0108(完整的鞭毛基因表达)作为对照，并且活性测定的结果可见于图2(图2：来自Biolector发酵的JE1淀粉酶活性数据，相对于ncRNA::GFP归一化，n＝3，误差条描绘了标准偏差)。
如图2中所示，在biolector中，与ThKK0108相比，ThKK0273展现出淀粉酶活性的2.76倍(±0.25，CV(％)＝9.0)增加，而与ThKK0108相比，ThKK0274展现出淀粉酶活性的2.67倍(±0.10，CV(％)＝3.8)增加，这表明flgE基因表达的破坏增加了重组蛋白的活性和/或产率。
如图2中进一步显示，与ThKK0108相比，ThKK0275展现出淀粉酶活性的2.63倍(±0.13，CV(％)＝5.1)增加，而与ThKK0108相比，ThKK0276展现出淀粉酶活性的2.61倍(±0.23，CV(％)＝8.7)增加，这表明fliR基因表达的破坏增加了重组蛋白的活性和/或产率。
如图2中进一步显示，与ThKK0108相比，ThKK0277展现出淀粉酶活性的2.02倍(±0.20，CV(％)＝10.6)增加，并且与ThKK0108相比，ThKK0278展现出淀粉酶活性的2.56倍(±0.26，CV(％)＝10.1)增加，这表明flhG基因表达的破坏增加了重组蛋白的活性和/或产率。
实例9：ThKK0007中flgE的缺失
通过用后接发夹终止子的红霉素(Erm)选择标记取代flgE的开放阅读框，在ThKK0007菌株中缺失编码鞭毛钩蛋白的flgE基因。将用于缺失的单个片段鉴定为SEQ IDNO:64至69。根据标准实验室程序，通过SOE PCR组装片段。对于完整的缺失片段，参见SEQID NO:70。将SOE转化到ThKK0007中。将转化体铺板到红霉素(1μg/mL)LBPG板上。将菌落铺板在红霉素(1μg/mL)LBPG板上。在红霉素(1μg/mL)LBPG板上再次限制生长的菌落，并将其测序。将所得的缺失菌株命名为BT11018。还在AEB2718中进行了缺失，产生BT11019。
表3：用于flgE缺失的SOE产生的PCR方案
实例10：flgE基因缺失后观察到淀粉酶活性增加
为了评价BT11018的性能，将菌株在Biolector中发酵并使其经受游泳测定。包括ThKK0007作为对照。与对照ThKK0007相比，BT11018没有展示出游泳(图3A)，这表明flgE基因的减少或消除的表达降低或消除了鞭毛活性。如图3B中所示(n＝4，误差条描绘了标准偏差)，与ThKK0007相比，BT11018展现出淀粉酶活性的1.27倍(±0.06，CV(％)＝4.8)增加，这清楚地表明flgE基因表达的破坏增加了重组蛋白的活性和/或产率。因此，已经发现鞭毛基因的缺失产生与实例1-8中鞭毛基因沉默类似的效果。
实例11：沿鞭毛操纵子放置CISP破坏转录
通过qRT-PCR评价了当使CISP靶向鞭毛操纵子时，对其稳态mRNA水平的影响(图5)。sgRNA和qRT-PCR扩增子的精确定位如图4中所示。如在图4中可见，为靶标flgE、fliR和flhG中的每一个设计了两个sgRNA。我们发现靶向所述基因高效地抑制了sgRNA中的每一个的表达。凭借该方法，不仅高效抑制了由sgRNA靶向的基因的表达，而且高效抑制了操纵子中sgRNA靶位点下游的其他鞭毛基因，即在靶向flgE后，fliR、flhG和cheD的表达减少，在靶向fliR后，flhG和cheD的表达减少，并且在靶向flhG后，cheD的表达减少(图5)。另外，与在表达针对gfp的sgRNA的菌株中的表达水平相比，sgRNA上游的基因的表达减少至约30％(图5)。
实例12：用ERM加终止子取代flgE破坏下游操纵子的转录。
通过qRT-PCR评价了BT11018中鞭毛操纵子的稳态mRNA水平(图6)。用后接发夹终止子的红霉素(Erm)选择标记取代flgE基因消除了flgE的表达，并严重阻遏了包含fliR、flhG和cheD的下游操纵子的表达(图6)。flgE上游的转录物(即flgB的转录物)的表达减少至野生型水平的约40％。
实例13：将各种产物基因插入flgE缺失的菌株中
为了评价flgE缺失对不同产物基因的影响，订购了表4中列出的合成构建体。
表4.
SEQ ID NO: 构建体名称 产物(氨基酸(AA)序列)
76 Pcons-aprH-cat 蛋白酶(SEQ ID NO:72)
77 Pcons-纳豆激酶-cat 纳豆激酶(SEQ ID NO:73)
78 Pcons-木聚糖酶-cat 木聚糖酶(SEQ ID NO:74)
79 P4199-黄原胶裂解酶-cat 黄原胶裂解酶(SEQ ID NO:75)
在所有构建体中包括cat选择标记。然后将合成构建体转化到AEB2718(wt对照)和BT11019(flgE缺失菌株)两者中，并在氯霉素上进行筛选，得到以下菌株：
BT11103：枯草芽孢杆菌AEB2718，amyE::Pcons-aprH-cat
BT11104：枯草芽孢杆菌BT11019，amyE::Pcons-aprH-cat，flgE::ERM
BT11105：枯草芽孢杆菌AEB2718，amyE::Pcons-纳豆激酶-cat
BT11106：枯草芽孢杆菌BT11019，amyE::Pcons-纳豆激酶-cat，flgE::ERM
BT11109：枯草芽孢杆菌AEB2718，amyE::Pcons-木聚糖酶-cat
BT11110：枯草芽孢杆菌BT11019，amyE::Pcons-木聚糖酶-cat，flgE::ERM
BT11111：枯草芽孢杆菌AEB2718，pel::P4199-黄原胶裂解酶-cat
BT11112：枯草芽孢杆菌BT11019，pel::P4199-黄原胶裂解酶，flgE::ERM
实例14：flgE的缺失增加多种酶的生产率。
为了评价菌株BT11103、BT11104、BT11105、BT11106、BT11109、BT11110、BT11111和BT11112的性能，使这些菌株在Biolector中发酵，并测量酶活性(图7，误差条描绘了标准偏差)。当将flgE缺失相对于对应的野生型归一化时，观察到以下生产率改善：纳豆激酶的表达改善了2.04倍，即增加了104％(+/-0.24，n＝3，BT11106相对于BT11105归一化)，木聚糖酶的表达改善了1.69倍，即增加了69％(+/-0.12，n＝3，BT11110相对于BT11109归一化)，黄原胶裂解酶的表达改善了1.32倍，即增加了32％(+/-0.10，n＝8，BT11112相对于BT11111归一化)，并且aprH(蛋白酶)的表达改善了1.11倍，即增加了11％(+/-0.004，n＝8，BT11104相对于BT11103归一化)。本文披露的实例还表明鞭毛基因的下调、破坏和/或缺失增加了不同类型的酶(例如，淀粉酶、纳豆激酶、木聚糖酶、黄原胶裂解酶和蛋白酶)的生产率。
本文描述和要求保护的发明不限于本文披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明几个方面的说明。任何等同方面均旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改因前述描述而对本领域的技术人员变得显而易见。这样的修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
通过以下编号的段落进一步定义本发明：
1.一种突变的细菌宿主细胞，其包含与编码一种或多种目的多肽的第一异源多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中至少一个鞭毛基因被改变以编码改变的鞭毛多肽；或其中至少一个鞭毛基因被过表达，如MotI多肽。
2.如段落1所述的细菌宿主细胞，其中该改变的鞭毛多肽通过减少或消除该宿主细胞的鞭毛活性来影响所述宿主细胞的鞭毛活性。
3.如段落1至2中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该改变的鞭毛多肽的表达类似于未突变的亲本细胞中的鞭毛多肽的表达。
4.如段落1至3中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该改变的鞭毛基因包含选自核苷酸缺失、核苷酸插入和提前终止密码子的改变。
5.如段落4所述的细菌宿主细胞，其中该改变的鞭毛基因影响该鞭毛的功能性和/或活性，其中该鞭毛活性减少或消除。
6.一种突变的细菌宿主细胞，其包含与编码一种或多种目的多肽的第一异源多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中与未突变的原本的等基因细胞或亲本细胞相比，至少一个鞭毛基因的表达减少或消除。
7.如段落1至6中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该鞭毛基因编码选自以下列表的鞭毛多肽：FlgA、FlgB、FlgC、FlgD、FlgE、FlgF、FlgG、FlgH、FlgI、FlgJ、FlgK、FlgL、FlgM、FlgN、FlhA、FlhB、FlhC、FlhD、FlhE、FlhF、FlhG、FlhO、FlhP、FliA、FliD、FliE、FliF、FliG、FliH、FliI、FliJ、FliK、FliL、FliM、FliN、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliS、FliT、FliY、FliZ、Hag、MotA、MotB、YlxF、SwrD、CheY、CheB、CheA、CheW、CheC、CheD、SigD、和SwrB；优选地，该鞭毛基因编码鞭毛多肽FlgE、FliR或FlhG。
8.如段落1至7中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该鞭毛基因选自以下列表：flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhC、flhD、flhE、flhF、flhG、flhO、flhP、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliR、fliS、fliT、fliY、fliZ、hag、motA、motB、ylxF、swrD、cheY、cheB、cheA、cheW、cheC、cheD、sigD、和swrB；优选地，该鞭毛基因是flgE、fliR或flhG。
9.如段落6至8中任一项所述的细菌宿主细胞，其中一个或多个鞭毛基因的表达减少或消除，如彼此独立地选择的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或多于八个鞭毛基因的表达减少或消除。
10.如段落6至9中任一项所述的细菌宿主细胞，其中将鞭毛基因flgE的表达的减少或消除与鞭毛基因fliR的表达的减少或消除组合。
11.如段落6至10中任一项所述的细菌宿主细胞，其中将鞭毛基因flgE的表达的减少或消除与鞭毛基因flhG的表达的减少或消除组合。
12.如段落6至11中任一项所述的细菌宿主细胞，其中将鞭毛基因flhG的表达的减少或消除与鞭毛基因fliR的表达的减少或消除组合。
13.如段落6至12中任一项所述的细菌宿主细胞，其中将鞭毛基因flgE的表达的减少或消除与鞭毛基因fliR的表达的减少或消除、以及与鞭毛基因flhG的表达的减少或消除组合。
14.如段落6至13中任一项所述的细菌宿主细胞，其中将鞭毛基因flgE、fliR和/或flhG的表达的减少或消除与至少一个选自以下列表的鞭毛基因的表达的减少或消除组合：flgA、flgB、flgC、flgD、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhC、flhD、flhE、flhF、flhO、flhP、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliS、fliT、fliY、fliZ、hag、motA、motB、ylxF、swrD、cheY、cheB、cheA、cheW、cheC、cheD、sigD、和swrB。
15.如段落6至14中任一项所述的细菌宿主细胞，其中两个、三个、四个或多于四个鞭毛基因的表达减少或消除，其中该鞭毛基因选自以下列表：flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhC、flhD、flhE、flhF、flhG、flhO、flhP、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliR、fliS、fliT、fliY、fliZ、hag、motA、motB、ylxF、swrD、cheY、cheB、cheA、cheW、cheC、cheD、sigD、和swrB。
16.如段落1至15中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该鞭毛基因包含与选自以下列表的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多核苷酸序列：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23，或由其组成。
17.如段落1至16中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该鞭毛基因编码包含与选自以下列表的多肽序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成的鞭毛多肽：SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、和SEQ ID NO:63。
18.如段落1至17中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该鞭毛基因的多核苷酸序列包含至少一个选自以下列表的改变：提前终止密码子、核苷酸插入、和核苷酸缺失，如该鞭毛基因或其编码区的多核苷酸序列的一个或多个核苷酸的缺失、或该鞭毛基因或其编码区的多核苷酸序列的基本上所有核苷酸的缺失；或其中该鞭毛基因或其编码区的多核苷酸序列以其整体缺失。
19.如段落18所述的细菌宿主细胞，其中通过用另一多核苷酸序列，如编码选择标记的多核苷酸序列取代该鞭毛基因的开放阅读框来缺失该鞭毛基因。
20.如段落19所述的细菌宿主细胞，其中通过同源重组缺失该鞭毛基因。
21.如段落1至20中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该鞭毛基因的至少一个改变产生包含与选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的列表的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性的多核苷酸序列或由其组成的鞭毛基因多核苷酸序列。
22.如段落1至21中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该鞭毛基因的至少一个改变产生包含与选自以下列表的多肽序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性的多肽序列或由其组成的鞭毛多肽序列：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、和SEQ ID NO:63。
23.如段落1至22中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该宿主细胞包含减少或消除的鞭毛活性、减少或消除的细胞运动、或减少或消除的游泳活性。
24.如段落23所述的细菌宿主细胞，其中与未突变的原本的等基因细胞或亲本细胞相比，该突变的宿主细胞的细胞运动减少至少10％，例如至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或减少100％。
25.如段落1至24中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该宿主细胞是选自由弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属细胞组成的组的革兰氏阴性细菌，或者其中该宿主细胞是选自由以下组成的组的革兰氏阳性细胞：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属或链霉菌属细胞，如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、类马链球菌、化脓性链球菌、乳房链球菌、和马链球菌兽疫亚种、产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞，优选地该宿主细胞是芽孢杆菌属细胞、最优选地枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌细胞。
26.如段落1至24中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
27.如段落1至24中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。
28.如段落1至27中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该目的多肽包含酶；优选地，该酶选自由以下组成的组：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、核酸酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、和β-木糖苷酶；甚至更优选地，该目的多肽包含淀粉酶。
29.如段落1至28中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该目的多肽包含淀粉酶，如包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的淀粉酶。
30.如段落1至28中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该目的多肽包含蛋白酶、由其组成、或基本上由其组成。
31.如段落1至28中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该一种或多种目的多肽包含蛋白酶，如包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的蛋白酶。
32.如段落1至28中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该一种或多种目的多肽包含纳豆激酶，如包含与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的纳豆激酶。
33.如段落1至28中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该一种或多种目的多肽包含木聚糖酶，如包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的木聚糖酶。
34.如段落1至28中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该一种或多种目的多肽包含黄原胶裂解酶，如包含与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的黄原胶裂解酶。
35.如段落1至28中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该一种或多种目的多肽包含黄原胶酶。
36.如段落1至28中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该目的多肽包含磷酸二酯酶(PDE)、由其组成、或基本上由其组成。
37.如段落1至36中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该多肽对于该重组宿主细胞是异源的。
38.如段落1至37中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该一个或多个控制序列中的至少一个与编码该多肽的多核苷酸是异源的。
39.如段落1至38中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该宿主细胞包含编码该目的多肽的多核苷酸的至少两个拷贝，例如三个、四个或五个。
40.如段落1至39中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该宿主细胞进一步包含与编码非编码RNA分子的第二异源多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述非编码RNA分子被构造为通过与鞭毛基因的靶多核苷酸序列杂交或结合而与所述鞭毛基因的靶多核苷酸序列形成RNA:DNA异源双链体，或被构造为通过与该鞭毛基因的RNA转录物的靶多核苷酸序列杂交或结合而与所述RNA转录物的靶多核苷酸序列形成RNA:RNA异源双链体。
41.如段落40所述的宿主细胞，其中该第二异源多核苷酸编码非编码RNA分子，该非编码RNA分子包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多核苷酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
42.如段落40至41中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该第二异源多核苷酸由单个指导RNA组成、基本上由其组成、或包含其。
43.如段落40至42中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该宿主细胞包含编码催化无活性的位点定向多肽(CISP)的第三异源多核苷酸，该CISP选自由以下组成的组：催化无活性的CRISPR相关蛋白、催化无活性的锌指核酸酶(ZFN)、锌指、催化无活性的转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、TALE、催化无活性的兆核酸酶和催化无活性的MAD7/Cas12a核酸内切酶。
44.如段落43所述的细菌宿主细胞，其中该CISP被构造为与以下的结合序列结合：
i)非编码RNA分子或ncRNA的多核苷酸序列，或
ii)RNA:DNA异源双链体的DNA或RNA多核苷酸序列，或
iii)RNA:RNA异源双链体的RNA多核苷酸序列，如RNA:RNA异源双链体的ncRNA。
45.如段落43至44中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该CISP被构造为与该非编码RNA分子，如ncRNA分子的多核苷酸序列的结合序列结合。
46.如段落43至45中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该CISP被构造为与指导RNA分子结合。
47.一种产生亲本细胞的突变体的方法，其包括灭活至少一个编码鞭毛多肽的多核苷酸，从而导致与该亲本细胞相比，该突变体产生的鞭毛多肽更少。
48.一种突变体细胞，其通过如段落47所述的产生亲本细胞的突变体的方法产生。
49.如段落48所述的突变体细胞，其进一步包含编码天然或异源蛋白的基因。
50.一种双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其包含鞭毛基因的多核苷酸序列的子序列，其中任选地该dsRNA是siRNA或miRNA分子。
51.如段落50所述的dsRNA，其中该双链抑制性RNA(dsRNA)分子的长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个双链体核苷酸。
52.一种抑制细胞中鞭毛多肽的表达的方法，其包括向该细胞施用如段落50至51中任一项所述的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，或者在该细胞中表达如段落50至51中任一项所述的双链抑制性RNA(dsRNA)分子。
53.一种突变体细胞，其通过如段落52所述的抑制鞭毛多肽的表达的方法产生。
54.一种用于生产一种或多种目的多肽的方法，该方法包括：
i)提供如段落1至49中任一项或如段落53所述的细菌宿主细胞；
ii)在有利于该一种或多种目的多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；以及
iii)任选地回收该目的多肽。
55.一种核酸构建体，该核酸构建体包含至少一种编码含有以下多肽序列或由其组成的鞭毛多肽的多核苷酸，该多肽序列与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:62和SEQ ID NO:63中的任一个具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性。
56.一种核酸构建体，其包含与编码非编码RNA分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中该非编码RNA分子被构造为通过与细菌鞭毛基因的靶多核苷酸序列杂交而与所述细菌鞭毛基因的靶多核苷酸序列形成RNA:DNA异源双链体，或被构造为通过与该鞭毛基因的RNA转录物的靶多核苷酸序列杂交而与所述RNA转录物的靶多核苷酸序列形成RNA:RNA异源双链体。
57.如段落56所述的核酸构建体，其中该非编码RNA分子包含与以下的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多核苷酸序列，基本上由其组成，或由其组成：(i)SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的多核苷酸序列；(ii)SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的转录物；或(iii)SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的互补多核苷酸序列。
58.如段落56至57中任一项所述的核酸构建体，其中该非编码RNA分子包含与SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多核苷酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的多核苷酸序列，基本上由其组成，或由其组成。
59.如段落56至58中任一项所述的核酸构建体，其包含编码CISP的多核苷酸序列。
60.如段落55至59中任一项所述的核酸构建体，其中启动子与编码该突变的鞭毛多肽的多核苷酸、该非编码RNA或该CISP中的任一个可操作地连接，如同源或异源启动子，优选地异源启动子。
61.一种表达载体，其包含如段落55至60中任一项所述的核酸构建体。
62.一种重组宿主细胞，其包含如段落55至60中任一项所述的多核苷酸、或如段落61所述的表达载体。
63.一种产生亲本细胞的突变体的方法，其包括灭活一个或多个编码鞭毛多肽的多核苷酸，从而导致与该亲本细胞相比，该突变体产生的鞭毛多肽更少，优选地通过基因沉默、基因缺失、核苷酸插入、核苷酸缺失或提前终止密码子来灭活该多核苷酸。
64.如段落63所述的方法，其中该多核苷酸是选自以下列表的鞭毛基因：flgA、flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgH、flgI、flgJ、flgK、flgL、flgM、flgN、flhA、flhB、flhC、flhD、flhE、flhF、flhG、flhO、flhP、fliA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliJ、fliK、fliL、fliM、fliN、fliO、fliP、fliQ、fliR、fliS、fliT、fliY、fliZ、hag、motA、motB、ylxF、swrD、cheY、cheB、cheA、cheW、cheC、cheD、sigD、和swrB。
65.一种突变体细胞，其通过如段落63或64所述的方法产生。
66.如段落65所述的突变体细胞，其进一步包含编码天然或异源蛋白的基因。
67.一种生产蛋白质的方法，其包括在有利于生产该蛋白质的条件下培养如段落65或66所述的突变体细胞。
68.如段落67所述的方法，其进一步包括回收该蛋白质。
序列表
<110> 哥本哈根大学（UNIVERSITY OF COPENHAGEN）
诺维信公司（NOVOZYMES A/S）
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> flgE ncRNA_19_003_1
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tttatccaat ccatcactgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> flgE ncRNA_19_003_2
<400> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> fliR ncRNA_19_003_4
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acatttcgat gtccaaatag 20
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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caaacagcac ataatcgaac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP ncRNA
<400> 7
tctgttagtg gagagggtga 20
<210> 8
<211> 512
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> JE1淀粉酶多肽
<400> 8
Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe
1 5 10 15
Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala His His Asn
20 25 30
Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His Leu Pro Asn
35 40 45
Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser Asn Leu Arg
50 55 60
Asn Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp Lys Gly Thr
65 70 75 80
Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly
85 90 95
Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Arg Ser
100 105 110
Gln Leu Glu Ser Ala Ile His Ala Leu Lys Asn Asn Gly Val Gln Val
115 120 125
Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu
130 135 140
Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn Gln Glu Ile
145 150 155 160
Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe Pro Gly
165 170 175
Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe Asp
180 185 190
Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg Ile Tyr Lys
195 200 205
Phe Arg Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Ser Glu Asn Gly Asn
210 215 220
Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met Asp His Pro Glu Val
225 230 235 240
Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr Thr Asn Thr Leu Asn
245 250 255
Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys Tyr Ser Phe
260 265 270
Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala Thr Gly Lys Glu Met
275 280 285
Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn
290 295 300
Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
305 310 315 320
His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly Gly Asn Tyr Asp Met
325 330 335
Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys His Pro Met His Ala
340 345 350
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu
355 360 365
Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Leu Ile Leu
370 375 380
Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly
385 390 395 400
Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala Lys Ile Asp Pro Ile
405 410 415
Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe
420 425 430
Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asn Thr Thr His
435 440 445
Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Pro Gly Gly Glu
450 455 460
Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Asn Lys Ala Gly Gln Val Trp His Asp
465 470 475 480
Ile Thr Gly Asn Lys Pro Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala Asp Gly Trp
485 490 495
Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Trp Val Lys Arg
500 505 510
<210> 9
<211> 3727
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒pE194
<400> 9
gatcagtaca agaaagatac tgtatttcat aaacaggaac tgcaagaagt taaggatgag 60
ttacagaagg caaataagca gttacagagt ggaatagagc atatgaggtc tacgaaaccc 120
tttgattatg aaaatgagcg tacaggtttg ttctctggac gtgaagagac tggtagaaag 180
atattaactg ctgatgaatt tgaacgcctg caagaaacaa tctcttctgc agaacggatt 240
gttgatgatt acgaaaatat taagagcaca gactattaca cagaaaatca agaattaaaa 300
aaacgtagag agagtttgaa agaagtagtg aatacatgga aagaggggta tcacgaaaaa 360
agtaaagagg ttaataaatt aaagcgagag aatgatagtt tgaatgagca gttgaatgta 420
tcagagaaat ttcaagctag tacagtgact ttatatcgtg ctgcgagggc gaatttccct 480
gggtttgaga aagggtttaa taggcttaaa gagaaattct ttaatgattc caaatttgag 540
cgtgtgggac agtttatgga tgttgtacag gataatgtcc agaaggtcga tagaaagcgt 600
gagaaacagc gtacagacga tttagagatg tagaggtact tttatgccga gaaaactttt 660
tgcgtgtgac agtccttaaa atatacttag agcgtaagcg aaagtagtag cgacagctat 720
taactttcgg ttgcaaagct ctaggatttt taatggacgc agcgcatcac acgcaaaaag 780
gaaattggaa taaatgcgaa atttgagatg ttaattaaag acctttttga ggtctttttt 840
tcttagattt ttggggttat ttaggggaga aaacataggg gggtactacg acctcccccc 900
taggtgtcca ttgtccattg tccaaacaaa taaataaata ttgggttttt aatgttaaaa 960
ggttgttttt tatgttaaag tgaaaaaaac agatgttggg aggtacagtg atagttgtag 1020
atagaaaaga agagaaaaaa gttgctgtta ctttaagact tacaacagaa gaaaatgaga 1080
tattaaatag aatcaaagaa aaatataata ttagcaaatc agatgcaacc ggtattctaa 1140
taaaaaaata tgcaaaggag gaatacggtg cattttaaac aaaaaaagat agacagcact 1200
ggcatgctgc ctatctatga ctaaattttg ttaagtgtat tagcaccgtt attatatcat 1260
gagcgaaaat gtaataaaag aaactgaaaa caagaaaaat tcaagaggac gtaattggac 1320
atttgtttta tatccagaat cagcaaaagc cgagtggtta gagtatttaa aagagttaca 1380
cattcaattt gtagtgtctc cattacatga tagggatact gatacagaag gtaggatgaa 1440
aaaagagcat tatcatattc tagtgatgta tgagggtaat aaatcttatg aacagataaa 1500
aataattaca gaagaattga atgcgactat tccgcagatt gcaggaagtg tgaaaggtct 1560
tgtgagatat atgcttcaca tggacgatcc taataaattt aaatatcaaa aagaagatat 1620
gatagtttat ggcggtgtag atgttgatga attattaaag aaaacaacaa cagatagata 1680
taaattaatt aaagaaatga ttgagtttat tgatgaacaa ggaatcgtag aatttaagag 1740
tttaatggat tatgcaatga agtttaaatt tgatgattgg ttcccgcttt tatgtgataa 1800
ctcggcgtat gttattcaag aatatataaa atcaaatcgg tataaatctg accgatagat 1860
tttgaattta ggtgtcacaa gacactcttt tttcgcacca gcgaaaactg gtttaagccg 1920
actgcgcaaa agacataatc gattcacaaa aaataggcac acgaaaaaca agttaaggga 1980
tgcagtttat gcatccctta acttacttat taaataattt atagctattg aaaagagata 2040
agaattgttc aaagctaata ttgtttaaat cgtcaattcc tgcatgtttt aaggaattgt 2100
taaattgatt ttttgtaaat attttcttgt attctttgtt aacccatttc ataacgaaat 2160
aattatactt ttgtttatct ttgtgtgata ttcttgattt ttttctactt aatctgataa 2220
gtgagctatt cactttaggt ttaggatgaa aatattctct tggaaccata cttaatatag 2280
aaatatcaac ttctgccatt aaaagtaatg ccaatgagcg ttttgtattt aataatcttt 2340
tagcaaaccc gtattccacg attaaataaa tctcattagc tatactatca aaaacaattt 2400
tgcgtattat atccgtactt atgttataag gtatattacc atatatttta taggattggt 2460
ttttaggaaa tttaaactgc aatatatcct tgtttaaaac ttggaaatta tcgtgatcaa 2520
caagtttatt ttctgtagtt ttgcataatt tatggtctat ttcaatggca gttacgaaat 2580
tacacctctt tactaattca agggtaaaat ggccttttcc tgagccgatt tcaaagatat 2640
tatcatgttc atttaatctt atatttgtca ttattttatc tatattatgt tttgaagtaa 2700
taaagttttg actgtgtttt atatttttct cgttcattat aaccctcttt aatttggtta 2760
tatgaatttt gcttattaac gattcattat aaccacttat tttttgtttg gttgataatg 2820
aactgtgctg attacaaaaa tactaaaaat gcccatattt tttcctcctt ataaaattag 2880
tataattata gcacgagctc tgataaatat gaacatgatg agtgatcgtt aaatttatac 2940
tgcaatcgga tgcgattatt gaataaaaga tatgagagat ttatctaatt tcttttttct 3000
tgtaaaaaaa gaaagttctt aaaggtttta tagttttggt cgtagagcac acggtttaac 3060
gacttaatta cgaagtaaat aagtctagtg tgttagactt tatgaaatct atatacgttt 3120
atatatattt attatccgga ggtgtagcat gtctcattca attttgaggg ttgccagagt 3180
taaaggatca agtaatacaa acgggataca aagacataat caaagagaga ataaaaacta 3240
taataataaa gacataaatc atgaggaaac atataaaaat tatgatttga ttaacgcaca 3300
aaatataaag tataaagata aaattgatga aacgattgat gagaattatt cagggaaacg 3360
taaaattcgg tcagatgcaa ttcgacatgt ggacggactg gttacaagtg ataaagattt 3420
ctttgatgat ttaagcggag aagaaataga acgatttttt aaagatagct tggagtttct 3480
agaaaatgaa tacggtaagg aaaatatgct gtatgcgact gtccatctgg atgaaagagt 3540
cccacatatg cactttggtt ttgtcccttt aacagaggac gggagattgt ctgcaaaaga 3600
acagttaggc aacaagaaag actttactca attacaagat agatttaatg agtatgtgaa 3660
tgagaaaggt tatgaacttg aaagaggcac gtccaaagag gttacagaac gagaacataa 3720
agcgatg 3727
<210> 10
<211> 1653
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> JE1zyn表达盒
<400> 10
ttgttaaaaa ttcggaatat ttatacaata tcatatgtat cacattgaaa gggaggagaa 60
tcatgaaaca acaaaaacgg ctttacgccc gattgctgac gctgttattt gcgctcatct 120
tcttgctgcc tcattctgca gccgcggcac atcacaatgg tacgaatggg acgatgatgc 180
agtatttcga gtggcatctg ccgaatgacg gcaaccattg gaacaggctg cgggacgacg 240
cgtccaattt aaggaatcgc ggcataactg cgatctggat accaccggcg tggaagggta 300
cgtcacaaaa cgacgtggga tatggagcgt acgacctcta cgatttagga gaattcaacc 360
agaaaggcac agttcgaaca aagtacggga cgcgctctca attggagtca gcgatccatg 420
ctctgaaaaa caacggcgtt caagtttatg gcgatgttgt catgaaccat aaaggcggtg 480
cagatgcgac agaaaatgtg ctcgcagttg aagtaaatcc aaacaatcga aaccaagaga 540
tttccggaga ctatacgatc gaagcctgga caaaatttga ttttccaggt cggggcaaca 600
catatagtga ttttaaatgg cgctggtacc atttcgacgg cgtagattgg gatcagtcac 660
ggcaattcca aaaccgaatc tataagttta gaggcaaagc ttgggactgg gaagttgatt 720
cggaaaacgg aaactatgat tatttaatgt atgcggacgt ggatatggat catccggagg 780
tggtgaacga acttcgccgt tggggggaat ggtataccaa tacgttaaac ctggatggat 840
ttcgcataga tgccgtgaaa catattaaat actcatttac ccgggattgg ttaacgcatg 900
tccggaacgc cacgggtaaa gagatgttcg ccgtcgcgga attttggaaa aatgacctgg 960
gcgccttgga aaattacctt aacaaaacga actggaatca cagcgtcttt gacgtaccgc 1020
ttcactacaa cttatataat gcatctaact caggaggcaa ttatgacatg gccaagcttt 1080
tgaatggaac ggtggttcaa aagcacccga tgcatgcagt gacgttcgtc gataaccatg 1140
attcacagcc tggggagtcc ctcgaaagtt tcgtccagga gtggttcaaa ccattagcat 1200
atgcccttat tttgacgagg gaacaaggat atcctagtgt tttttacggc gactattatg 1260
gaatcccgac acattctgtg ccggccatga aggcaaaaat cgatccaatc ttggaagcgc 1320
gtcaaaactt cgcctatggg acgcaacatg attactttga ccaccataat attattggat 1380
ggacacgcga agggaatacc acacacccca attcaggatt agcaacaatt atgtcggacg 1440
gtccaggggg cgaaaaatgg atgtatgtcg gacaaaacaa agcaggccaa gtgtggcatg 1500
acataacagg caataaaccg gggacagtga cgattaacgc agatggctgg gcaaattttt 1560
cagtcaacgg aggttcggtc tccatttggg tgaaaagata aatcaataaa aaaacgctgt 1620
gcggttaaag ggcacagcgt tttttttgtg tat 1653
<210> 11
<211> 1790
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 11
cagccagaga acagcttgca aagccaatat aaaggtgaca acggggtaaa gcctgataaa 60
tgtttgaaaa ttttcagtcc gtataaacat tccgagcccc ttttcttcat tttggtatat 120
ctatagtaac acgtttatga gacaaaccat ttaaatagta cgtacgcaaa ggaggttatc 180
atacatgatt tacggcattg ggctggacat taccgagctt aaacggatcg cctctatggc 240
tgggcgccag aaaaggtttg ccgagcggat tttgacgcga agcgagcttg accaatacta 300
tgagctttca gagaaaagaa aaaacgaatt tctcgcgggc agattcgcgg caaaagaagc 360
gttctcgaaa gcatttggca ccggcattgg gaggcagctc agctttcagg acattgaaat 420
taggaaagac caaaatggca agccctatat catttgtacg aaactgagcc aggccgccgt 480
tcacgtatcg atcactcata caaaagaata cgctgccgcg caggttgtga ttgaaaggtt 540
gtcaagctag tctgcatatt agggaaaccc cactcatata tttgatagtg cattaaggga 600
gacaagttgt ttgaggcttt tatggtacgc atctgttctg cctaaacgtg taccgagcgt 660
accgttaaag tcaaacaagc gatttcttcc ttttacatca attgagaaaa aggggttgaa 720
aaaggtgaga aaaagctttg ttttgctttt aacgggactg cttgctgttc ttattctttc 780
tgcctgcggg caaaaaacac agcaagatat tgtggccggg ttagatgaaa aggcgaaaga 840
atacacctcg tacaaagcaa aagcgaaaat gaccatcgag acagggagtg agcctcaagt 900
atacaatgtg gaaatctggc acaaaaagcc gtctctgtac agggtttatt tagaaaatcc 960
gaaaaaggac caaaaccaag tcattttacg aaatgaaaac ggagtattcg ttctcacgcc 1020
gtctttaaat aagagcttca gatttcaaag cgattggccg aacaacagca gccaggttta 1080
tctgtttgaa tcgctcgtaa aggatgttca aaacgattcg gatgcagttt tcacagcgaa 1140
agaaaagaaa tacgtatttg aaacaaaaac aaactatcag cataacaaaa tgctgcccac 1200
gcaagaaatc acatttaaca aaaaagatat gagcccgtca tctgtcaaag tgatggatac 1260
tgaccggaaa gtgatggtca aagtagaatt cagcagcttt gaatttaata aacaatttga 1320
taaagaatca tttgatgaaa agaaaaatat gaccctttct caaatggatg tcgccacaag 1380
cgcaaagcct tccgatacat ttgcggtcaa aacgccgctg gaactgccgc ttggcgtcaa 1440
gctgcttgaa gaaaaagata tatctactga agacgggaag cgcatcatca tgacgtacgg 1500
aggagaaaaa tcatttacgt taattcagga aaaagcccag attgccaagg cttcctcctc 1560
cgttacgctg aacggcgaac cggtaaatct cggctacacc atcggcgccc tgtcggatgc 1620
atcattatca tggacatatg acggcgtaga ttaccttctc tcttctaaag atctttctaa 1680
agaggaaatg gtgacagtag cgaaaagcat gcagggacaa tcatcgaaat aaccgccaaa 1740
ggccaaacat gatttggcct ttttttcgtt agacatcgtt tccctttagc 1790
<210> 12
<211> 2292
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 12
ttagacatcg tttcccttta gcctttaatt ttagtatgat atgtaaatga tattgaataa 60
aagctaggaa gtgtcgtaat gagcacaaaa cctttttaca gagatacgtg ggcggaaatt 120
gacttgtccg cgataaagga aaatgtcagc aatatgaaaa aacatatcgg tgaacatgtc 180
cacttgatgg cagttgtgaa agcaaacgcc tacgggcatg gtgatgcaga aacagcaaag 240
gctgctcttg acgcaggtgc ttcatgcttg gccgtggcca ttttggatga agcgatttca 300
ctgcgcaaaa agggattgaa ggcgcctata ttggtgcttg gcgcggttcc cccggagtat 360
gtggcaatcg ctgctgagta tgacgtgacc ttaacaggtt attctgttga atggcttcag 420
gaggcagccc gccacacgaa aaaaggttct cttcattttc atctgaaggt cgatacgggg 480
atgaacagac ttggtgtaaa aacagaggaa gaagttcaga acgtgatggc aattcttgac 540
cgcaaccctc gtttaaagtg caaaggggta tttacccatt ttgcgacagc ggatgaaaaa 600
gaaagaggct atttcttaat gcagtttgag cgctttaaag agctgattgc tccgctgccg 660
ttaaagaatc taatggtcca ctgcgcgaac agcgccgctg gactccggct gaaaaaaggc 720
ttttttaatg cagtcagatt cggcatcggc atgtatggcc ttcgcccgtc tgctgacatg 780
tcggacgaga taccgtttca gctgcgtccg gcatttaccc tgcattcgac actgtcacat 840
gtcaaactga tcagaaaagg cgagagcgtc agctacggag ccgagtacac agcggaaaaa 900
gacacatgga tcgggacggt gcctgtaggc tatgcggacg gctggctccg aaaattgaaa 960
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caatttatgg tggagctgga tcaggaatat ccgccgggca caaaagtcac attaataggc 1080
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ataatggaag taagaaatcc tttattgcag gtaaatataa gcaattaact tacctaaatg 1260
gagaattcat aaaacagctt tgcttgaaga gtgaataatg gtatcattat cactggatgg 1320
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aagaaccgaa atgaaaatca gcttgcccga aaacctagta gctgaattgg atggtgtagc 1440
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tgagcgctta gtcagcggag gataatcatt tgattgtgaa acgcggcgat gtttattttg 1680
ctgatttatc tcctgttgtt ggctcagagc aaggcggggt gcgcccggtt ttagtgatcc 1740
aaaatgacat cggaaatcgc ttcagcccaa ctgctattgt tgcagccata acagcacaaa 1800
tacagaaagc gaaattacca acccacgtcg aaatcgatgc aaaacgctac ggttttgaaa 1860
gagattccgt tattttgctg gagcaaattc ggacgattga caagcaaagg ttaacggata 1920
agattactca tctggatgat gaaatgatgg ataaggttga tgaagcctta caaatcagtt 1980
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tttcaaaaaa cataaacgat ataatagtga aataacgaaa aaatatgttg ttttttattg 2100
ggaggtaagc gaatttgatg tcgaaccaga ctgtatacca gttcattgcc gaaaatcaaa 2160
atgaactgct ccaactgtgg actgacacac taaaagaatt aagcgagcaa gaatcctatc 2220
agctgactga ccaagtgtat gaaaatatat ctaaagaata tatcgacatt ctgctgctgt 2280
ctgttaagga cg 2292
<210> 13
<211> 2089
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于将HTP整合到alr中的Up_frag序列
<400> 13
gaaggaaacg cgcttttccc agcatgcgtt ccaaagccgg ggcaaataaa aagatggaca 60
tggaattaaa cagcagatgt gtgaaaccgg cgtgcagcaa aatcggtgtg ataagccgcc 120
accattcacc gtttgcgaca cctagattat agcctgtgac ggtatccctc cataacacga 180
ctgaatgggc aggaagtgaa aaaaacagcc agagaacagc ttgcaaagcc aatataaagg 240
tgacaacggg gtaaagcctg ataaatgttt gaaaattttc agtccgtata aacattccga 300
gccccttttc ttcattttgg tatatctata gtaacacgtt tatgagacaa accatttaaa 360
tagtacgtac gcaaaggagg ttatcataca tgatttacgg cattgggctg gacattaccg 420
agcttaaacg gatcgcctct atggctgggc gccagaaaag gtttgccgag cggattttga 480
cgcgaagcga gcttgaccaa tactatgagc tttcagagaa aagaaaaaac gaatttctcg 540
cgggcagatt cgcggcaaaa gaagcgttct cgaaagcatt tggcaccggc attgggaggc 600
agctcagctt tcaggacatt gaaattagga aagaccaaaa tggcaagccc tatatcattt 660
gtacgaaact gagccaggcc gccgttcacg tatcgatcac tcatacaaaa gaatacgctg 720
ccgcgcaggt tgtgattgaa aggttgtcaa gctagtctgc atattaggga aaccccactc 780
atatatttga tagtgcatta agggagacaa gttgtttgag gcttttatgg tacgcatctg 840
ttctgcctaa acgtgtaccg agcgtaccgt taaagtcaaa caagcgattt cttcctttta 900
catcaattga gaaaaagggg ttgaaaaagg tgagaaaaag ctttgttttg cttttaacgg 960
gactgcttgc tgttcttatt ctttctgcct gcgggcaaaa aacacagcaa gatattgtgg 1020
ccgggttaga tgaaaaggcg aaagaataca cctcgtacaa agcaaaagcg aaaatgacca 1080
tcgagacagg gagtgagcct caagtataca atgtggaaat ctggcacaaa aagccgtctc 1140
tgtacagggt ttatttagaa aatccgaaaa aggaccaaaa ccaagtcatt ttacgaaatg 1200
aaaacggagt attcgttctc acgccgtctt taaataagag cttcagattt caaagcgatt 1260
ggccgaacaa cagcagccag gtttatctgt ttgaatcgct cgtaaaggat gttcaaaacg 1320
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atcagcataa caaaatgctg cccacgcaag aaatcacatt taacaaaaaa gatatgagcc 1440
cgtcatctgt caaagtgatg gatactgacc ggaaagtgat ggtcaaagta gaattcagca 1500
gctttgaatt taataaacaa tttgataaag aatcatttga tgaaaagaaa aatatgaccc 1560
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tcgtttccct ttagctgctg tccagactgt ccgctgtgta aaaaaaagga ataaaggggg 2040
gttgacatta ttttactgat atgtataata taatttgtat aagaaaatg 2089
<210> 14
<211> 2430
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于将HTP整合到alr中的Down_frag序列
<400> 14
tcaataaaaa aacgctgtgc ggttaaaggg cacagcgttt ttttgtgtat gtcgattcac 60
aaaaataggc acacgaaaaa cttagacatc gtttcccttt agcctttaat tttagtatga 120
tatgtaaatg atattgaata aaagctagga agtgtcgtaa tgagcacaaa acctttttac 180
agagatacgt gggcggaaat tgacttgtcc gcgataaagg aaaatgtcag caatatgaaa 240
aaacatatcg gtgaacatgt ccacttgatg gcagttgtga aagcaaacgc ctacgggcat 300
ggtgatgcag aaacagcaaa ggctgctctt gacgcaggtg cttcatgctt ggccgtggcc 360
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tattctgttg aatggcttca ggaggcagcc cgccacacga aaaaaggttc tcttcatttt 540
catctgaagg tcgatacggg gatgaacaga cttggtgtaa aaacagagga agaagttcag 600
aacgtgatgg caattcttga ccgcaaccct cgtttaaagt gcaaaggggt atttacccat 660
tttgcgacag cggatgaaaa agaaagaggc tatttcttaa tgcagtttga gcgctttaaa 720
gagctgattg ctccgctgcc gttaaagaat ctaatggtcc actgcgcgaa cagcgccgct 780
ggactccggc tgaaaaaagg cttttttaat gcagtcagat tcggcatcgg catgtatggc 840
cttcgcccgt ctgctgacat gtcggacgag ataccgtttc agctgcgtcc ggcatttacc 900
ctgcattcga cactgtcaca tgtcaaactg atcagaaaag gcgagagcgt cagctacgga 960
gccgagtaca cagcggaaaa agacacatgg atcgggacgg tgcctgtagg ctatgcggac 1020
ggctggctcc gaaaattgaa agggaccgac atccttgtga agggaaaacg cctgaaaatt 1080
gccggccgaa tttgcatgga ccaatttatg gtggagctgg atcaggaata tccgccgggc 1140
acaaaagtca cattaatagg ccggcagggg gatgaatata tttccatgga tgagattgca 1200
ggaaggctcg aaaccattaa ctatgaggtg gcctgtacaa taagttcccg tgttccccgt 1260
atgtttttgg aaaatgggag tataatggaa gtaagaaatc ctttattgca ggtaaatata 1320
agcaattaac ttacctaaat ggagaattca taaaacagct ttgcttgaag agtgaataat 1380
ggtatcatta tcactggatg gataaaagag tcgtatccgt aagtttggtg gaggtgtatg 1440
ttttttgtct gaatccagcg caagaaccga aatgaaaatc agcttgcccg aaaacctagt 1500
agctgaattg gatggtgtag cgatgcggga gaaacgaagc agaaacgaac tgatatcaca 1560
agcagtgaga gcgtatgtca gcgaacgaac aactcgtcac aaccgtgatt tgatgagacg 1620
cggctatatg gaaatggcga aaatcaacct gaatatttct tctgaggctc actttgcgga 1680
gtgcgaggct gaaacgacag ttgagcgctt agtcagcgga ggataatcat ttgattgtga 1740
aacgcggcga tgtttatttt gctgatttat ctcctgttgt tggctcagag caaggcgggg 1800
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ttgcagccat aacagcacaa atacagaaag cgaaattacc aacccacgtc gaaatcgatg 1920
caaaacgcta cggttttgaa agagattccg ttattttgct ggagcaaatt cggacgattg 1980
acaagcaaag gttaacggat aagattactc atctggatga tgaaatgatg gataaggttg 2040
atgaagcctt acaaatcagt ttggcactca ttgattttta gacatatttg caggttgctc 2100
aaatagagca actttttttg ttttcaaaaa acataaacga tataatagtg aaataacgaa 2160
aaaatatgtt gttttttatt gggaggtaag cgaatttgat gtcgaaccag actgtatacc 2220
agttcattgc cgaaaatcaa aatgaactgc tccaactgtg gactgacaca ctaaaagaat 2280
taagcgagca agaatcctat cagctgactg accaagtgta tgaaaatata tctaaagaat 2340
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<210> 15
<211> 795
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 15
atgttacgtt cactttattc tggaatcagc ggtatgaaaa actttcaaac aaagcttgac 60
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attgttgatg ctgaggggaa aacacaagac gggggacaaa tcgggattgt tacttttgcc 540
aacagtgatg gattggataa aatcggaagc aacctatacc gtgaatcttt aaactctgga 600
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ggattccaat caaactcaaa aattattaca acatctgatg aaatccttca agaactggtt 780
aaccttaaac gttaa 795
<210> 16
<211> 780
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 16
atgaattcaa ttattgactt atttcctgct tttttattgg tttttattag aatctctgct 60
ttttttgtaa cgattccgct atttggacat cgaaatgtgc cagctgttca tcgcataggt 120
tttgcttttt ttcttgcggt catttgtttc agcaccattg ataaaccgcc ctctttggag 180
atagatgagc actatatgct tttggcgttt aaagaagctt tggtcggcct atgtctgggt 240
ttaattgctt atatgatgat tgccgcagtg cagattgccg gctcgtttat tgattttcaa 300
atgggatttt caatagcaaa cgttattgat ccgcaaaccg gtgcacaaag tccgttgatt 360
ggccagttta tctatacgat ggcacttttg tttatgctga gtgtcaatgc ccaccatttg 420
ttgctggatg gtatttacta cagctttcag tatatttcag ttgatcaggc atttccgaat 480
ttcggcgatg aaaagtttgc ctattttatt gcgaaaagct ttaatgcaat gtttattatc 540
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gctgtcagtt tcattatgct cattgtatgt atgtccgtta tcttcgtcgt tgtccggaat 720
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<210> 17
<211> 891
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 17
atgaacagat atgaccaagc agcaacttta cgggcgaaaa tggaaaaacg tgagcgcgtt 60
ctgccaatgg tttattcaca aaaagcgaag acacttgctg tcatcagcgg caagggcggt 120
gtcggaaaat ccaatattac cttaaatatg gcacttgcgc tgcaggataa aggtaagaag 180
gtgctgctca tcgaccttga tatcgggatg gggaacattg atatattaat aggaaattca 240
tcgtctgcca cgataatcga tgttttaacc gatcgtaagc ctttgctgca gtcattatcc 300
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agcgctgtca agcacttggt tttgacagaa aataagcttt caatgaaggt ggctgtcaat 600
cggtgccgtg accaaaagga agggcttgac gcttttgccc gcctctcccg tacaattcat 660
atgtttttgg atgttcaggt tcagtttgcc ggttccgttt ctgacgatgt gatcgtgagc 720
aaagcggttg tcgaacaggt tccttttttc ataaaaagcc ctcaggcaaa agccagccgg 780
tcagtccgta ttttagcgga cgccttgttt gaaagagaag aaacgagaca caaagaagac 840
aaacagacat ttattgagaa attatcttct tttttaatga ggagggctta a 891
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 18
acagtgatgg attggataaa 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 19
tagcattggt tctgatggaa 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 20
gctgttcatc gcataggttt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 21
ctatttggac atcgaaatgt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 22
tttattttat cagcagaaga 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 23
gttcgattat gtgctgtttg 20
<210> 24
<211> 129
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 24
Met Ser Leu Phe Ser Gly Thr Ile Gln Asn Leu Glu Asn Ala Leu Ser
1 5 10 15
Arg Ala Asp Ile Lys Gln Lys Val Ile Thr Asn Asn Ile Ala Asn Ile
20 25 30
Asp Thr Pro Asn Tyr Lys Ala Lys Lys Val Ser Phe Gln Asn Leu Leu
35 40 45
Asp Gln Glu Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Thr Asp Tyr Arg His
50 55 60
Val Asp Phe Ser Asp Thr Asp Ser Asn Tyr Ser Ile Val Ala Ser Gly
65 70 75 80
Asp Thr Ser Tyr Gln Gln Asn Gly Asn Asn Val Asp Val Asp Lys Glu
85 90 95
Met Thr Glu Leu Ala Gln Asn Gln Ile Asn Tyr Gln Ala Leu Val Glu
100 105 110
Arg Met Asn Gly Lys Phe Asn Ser Leu Lys Thr Val Leu Thr Gly Gly
115 120 125
Lys
<210> 25
<211> 150
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 25
Met Thr Ala Phe His Ser Leu Asn Val Ser Ala Ser Ala Leu Thr Ala
1 5 10 15
Gln Arg Val Arg Met Asp Val Val Ser Ser Asn Leu Ala Asn Met Asp
20 25 30
Thr Thr Arg Ala Lys Gln Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Tyr Arg Arg
35 40 45
Lys Met Val Ser Leu Gln Ser Lys Gly Glu Ser Phe Ser Ser Ile Leu
50 55 60
Asn Ser Gln Met Ser Gly Ser Gly Asn Ala Gly Asn Gly Val Lys Val
65 70 75 80
Ser Lys Ile Thr Glu Asp Asp Ser Asp Phe Asn Leu Val Tyr Asp Pro
85 90 95
Thr Asp Pro Asp Ala Asn Ala Glu Gly Tyr Val Gln Lys Pro Asn Val
100 105 110
Asp Pro Leu Lys Glu Met Val Asp Leu Val Ser Ser Thr Arg Ser Tyr
115 120 125
Glu Ala Asn Val Thr Ala Met Asn Ala Thr Lys Gly Met Leu Met Lys
130 135 140
Ala Leu Glu Ile Gly Lys
145 150
<210> 26
<211> 140
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 26
Met Thr Ser Ile Ser Ser Glu Tyr Lys Leu Pro Glu Lys Thr Asn Thr
1 5 10 15
Val Ser Thr Asn Asn Ser Ser Leu Gly Lys Asp Glu Phe Leu Lys Ile
20 25 30
Leu Met Thr Gln Val Gln Asn Gln Asp Pro Leu Asn Pro Ile Asp Asp
35 40 45
Lys Glu Phe Ile Ser Gln Met Ala Thr Phe Ser Ser Leu Glu Gln Met
50 55 60
Met Asn Leu Asn Thr Thr Met Thr Gln Phe Val Glu Asn Gln Asp Pro
65 70 75 80
Phe Thr Thr Tyr Val Asp Trp Met Gly Lys Glu Val Ser Trp Thr Asp
85 90 95
Gly Lys Ser Ala Thr Asp Lys Thr Gly Thr Val Ser Ser Val Lys His
100 105 110
Phe Lys Gly Asn Tyr Tyr Leu Val Leu Asp Asp Gly Thr Glu Ile Ser
115 120 125
Pro Ala Asn Val Met Ser Val Gly Gln Ser Ser Lys
130 135 140
<210> 27
<211> 264
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 27
Met Leu Arg Ser Leu Tyr Ser Gly Ile Ser Gly Met Lys Asn Phe Gln
1 5 10 15
Thr Lys Leu Asp Val Ile Gly Asn Asn Ile Ala Asn Val Asn Thr Val
20 25 30
Gly Phe Lys Lys Ser Arg Val Thr Phe Lys Asp Met Val Ser Gln Thr
35 40 45
Ile Ala Gly Gly Ser Ala Ala Gly Ala Thr Ile Gly Gly Thr Asn Ser
50 55 60
Lys Gln Ile Gly Leu Gly Ser Ser Ser Gly Thr Ile Asp Thr Ile His
65 70 75 80
Ser Thr Ser Ala Thr Gln Ser Thr Gly Arg Thr Leu Asp Leu Ala Ile
85 90 95
Asp Gly Asp Gly Tyr Phe Arg Ile Asp Thr Gly Asp Gly Thr Ala Tyr
100 105 110
Thr Arg Ala Gly Asn Phe Tyr Leu Asp Asn Thr Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125
Gly Asp Gly Tyr His Val Leu Asn Met Asn Gly Gly Thr Ile Lys Ile
130 135 140
Pro Thr Asp Ala Gln Ser Phe Ser Ile Gly Ser Asp Gly Lys Val Ser
145 150 155 160
Ile Val Asp Ala Glu Gly Lys Thr Gln Asp Gly Gly Gln Ile Gly Ile
165 170 175
Val Thr Phe Ala Asn Ser Asp Gly Leu Asp Lys Ile Gly Ser Asn Leu
180 185 190
Tyr Arg Glu Ser Leu Asn Ser Gly Thr Ala Ser Ala Ala Asn Gln Pro
195 200 205
Gly Asp Gly Gly Thr Gly Ala Leu Lys Ser Gly Phe Leu Glu Met Ser
210 215 220
Asn Val Asp Leu Thr Asp Glu Phe Thr Glu Met Ile Val Ala Gln Arg
225 230 235 240
Gly Phe Gln Ser Asn Ser Lys Ile Ile Thr Thr Ser Asp Glu Ile Leu
245 250 255
Gln Glu Leu Val Asn Leu Lys Arg
260
<210> 28
<211> 507
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 28
Met Thr Ser Thr Phe Met Gly Leu Glu Thr Ala Arg Arg Ala Leu Ser
1 5 10 15
Ala Gln Gln Ala Ala Leu Ser Thr Thr Ala Asn Asn Val Ala Asn Ala
20 25 30
Asn Thr Asp Gly Tyr Thr Arg Gln Arg Val Ser Leu Glu Ala Thr Asp
35 40 45
Tyr Phe Pro Ala Val Ser Lys Asn Ala Glu Lys Thr Ala Gly Gln Met
50 55 60
Gly Thr Gly Val Gln Gly Lys Ser Val Glu Arg Ile Arg Asp Ile Phe
65 70 75 80
Leu Asp Tyr Gln Tyr Arg Leu Gln Asn Asn Ser Ala Gly Tyr Tyr Asp
85 90 95
Thr Lys Ala Lys Ala Leu Ser Gln Met Glu Gly Val Leu Asn Glu Thr
100 105 110
Asp Asp Ser Gly Leu Asn Ser Val Leu Asn Ser Phe Trp Asn Ser Leu
115 120 125
Gln Glu Leu Ser Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ser Ala Arg Ser Val Val
130 135 140
Ala Arg Lys Gly Gln Ala Val Ala Glu Thr Phe Asn Tyr Ile Ser Glu
145 150 155 160
Ser Leu Thr Asn Val Gln Ser Asn Leu Lys Ala Glu Leu Asn Thr Thr
165 170 175
Val Leu Asp Val Asn Ser Leu Leu Ser Gln Leu Asn Ser Leu Asn Lys
180 185 190
Gln Ile Ala Gln Val Glu Pro Val Gly Leu Leu Pro Asn Gly Leu Tyr
195 200 205
Asp Gln Arg Asp Leu Leu Ile Asp Lys Leu Ser Ser Met Val Asp Ile
210 215 220
Lys Val Ser Tyr Asn Lys Ser Gly Gly Asn Ala Leu Ala Ser Ala Glu
225 230 235 240
Gly Thr Val Ser Ile Glu Ile Leu Asp Lys Asn Lys Gln Ser Leu Gly
245 250 255
Thr Val Leu Asp Gly Lys Asn Tyr Glu Val Ser Glu Leu Ala Ala Asn
260 265 270
Tyr Asp Asn Glu Thr Gly Leu Val Ser Ser Ile Ser Ile Gly Asp Thr
275 280 285
Ala Val Gln Ala Glu Ser Phe Ser Ser Lys Gly Ser Leu Leu Gly Phe
290 295 300
Ile Glu Ser Tyr Gly Tyr Ile Thr Ala Asp Gly Gln Glu Lys Gly Val
305 310 315 320
Tyr Pro Glu Met Leu Ser Asp Leu Asp Asn Met Ala Leu Glu Phe Ala
325 330 335
Lys Ala Phe Asn Glu Val His Arg Asn Gly Val Thr Lys Ser Gly Glu
340 345 350
Gln Gly Gly Asp Phe Phe Asp Phe Thr Gly Gly Glu Thr Glu Pro Ala
355 360 365
Lys Gly Ala Ala Gly Lys Ile Lys Val Ala Asp Ser Ile Ile Asp Ser
370 375 380
Lys Gly Ala Asn Ile Ala Phe Ser Leu Thr Gly Ala Ala Asn Asp Asn
385 390 395 400
Ala Asn Ala Thr Lys Leu Ala Asn Val Leu Thr Gly Lys Ile Thr Ile
405 410 415
Asn Gly Lys Glu Thr Ser Val Leu Asp Tyr Tyr Ala Gly Leu Ile Gly
420 425 430
Glu Leu Gly Ile Glu Ala Gln Glu Ala Asn Arg Leu Ala Ser Asn Thr
435 440 445
Glu Thr Gln Leu Asn Asp Ala Asp Ile Asn Arg Gln Gln Met Ser Ala
450 455 460
Val Ser Leu Asp Glu Glu Met Thr Asn Met Ile Gln Phe Gln His Ala
465 470 475 480
Tyr Asn Ala Ala Ala Arg Met Val Thr Leu Gln Asp Glu Leu Leu Asp
485 490 495
Lys Val Ile Asn Gly Met Gly Val Gly Gly Arg
500 505
<210> 29
<211> 298
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 29
Met Arg Val Thr Gln Gly Met Ile Gln Gln Asn Ser Leu Arg Tyr Ile
1 5 10 15
Gly Ser Ser Tyr Ser Lys Leu Asp Lys Leu Gln Ser Gln Ile Ser Ser
20 25 30
Gly Lys Lys Ile Ser Lys Ala Ser Asp Asp Pro Val Val Ala Met Lys
35 40 45
Ser Leu Lys Tyr Asn Thr Gln Leu Ser Gln Val Gln Gln Tyr Lys Ser
50 55 60
Asn Ala Ser Gln Ala Phe Thr Trp Leu Glu Asn Thr Glu Thr Asn Ile
65 70 75 80
Thr Glu Gly Ile Asp Ile Leu Ser Lys Val Arg Glu Leu Ala Val Glu
85 90 95
Ala Gln Asn Asp Thr Asn Gly Glu Pro Glu Arg Gln Ala Ile Gly Val
100 105 110
Glu Val Lys Gln Leu Lys Glu Gln Leu Leu Asn Ile Ala Asn Thr Gln
115 120 125
Val Asn Gly Arg Tyr Ile Phe Asn Gly Thr Asn Ser Asp Lys Pro Pro
130 135 140
Val Thr Asp Asn Gly Asp Gly Thr Tyr Thr Ile Ser Asp Thr Ala Asp
145 150 155 160
Val Val Val Asn Ile Ser Asn Asn Met Ser Leu Lys Val Asn Ser Asp
165 170 175
Pro Lys Ser Ala Phe Gly Gly Thr Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val Phe
180 185 190
Glu Met Leu Asp Ser Phe Glu Lys Ala Leu Asn Ser Gly Ser Leu Asp
195 200 205
Gly Met Asp Ser Val Leu Asn Asp Ile Asp His Phe Ser Asp Gly Met
210 215 220
Ser Ala Glu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Arg Tyr Asn Arg Leu Glu Leu
225 230 235 240
Val Asn Thr Arg Leu Ser Ala Gln Glu Glu Thr Ala Thr Lys Val Leu
245 250 255
Ser Asp Asn Glu Asp Val Glu Leu Glu Glu Val Ile Thr Glu Phe Ile
260 265 270
Ala Gln Gln Ser Val His Arg Ala Thr Leu Ala Val Asn Ala Gln Ile
275 280 285
Val Gln Pro Thr Leu Ile Asp Phe Leu Lys
290 295
<210> 30
<211> 677
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 30
Met Ser Thr Arg Asp Leu Ser Val Leu Ile Ser Val Val Leu Ile Val
1 5 10 15
Ala Met Leu Val Ile Pro Phe Pro Pro Trp Leu Leu Ser Ile Leu Ile
20 25 30
Ile Ile Asn Ile Ser Leu Ala Leu Ile Val Leu Leu Thr Thr Met Asn
35 40 45
Met Gln Glu Ala Leu Gln Phe Ser Ile Phe Pro Ser Leu Leu Leu Leu
50 55 60
Leu Thr Leu Phe Arg Leu Gly Leu Asn Val Ser Thr Thr Arg Ser Ile
65 70 75 80
Leu Ser His Gly Glu Gly Gly Lys Val Val Glu Thr Phe Gly Asn Phe
85 90 95
Val Val Gly Gly Asn Val Leu Val Gly Leu Val Val Phe Ile Ile Leu
100 105 110
Ile Ile Ile Gln Phe Ile Val Ile Thr Lys Gly Ala Glu Arg Val Ser
115 120 125
Glu Val Ala Ala Arg Phe Thr Leu Asp Ala Met Pro Gly Lys Gln Met
130 135 140
Ser Ile Asp Ala Asp Leu Asn Ala Gly Met Ile Thr Glu Gln Glu Ala
145 150 155 160
Lys His Arg Arg Glu Lys Val Ala Arg Glu Ala Asp Phe Tyr Gly Ala
165 170 175
Met Asp Gly Ala Ser Lys Phe Val Lys Gly Asp Ala Ile Ala Gly Ile
180 185 190
Ile Ile Val Met Ile Asn Ile Ile Phe Gly Ile Val Ile Gly Met Leu
195 200 205
Gln Gln Gly Met Ser Ile Gln Glu Ala Ala Ser His Phe Thr Met Leu
210 215 220
Thr Val Gly Asp Gly Ile Val Ser Gln Ile Pro Ala Leu Leu Ile Ser
225 230 235 240
Thr Ala Thr Gly Ile Val Val Thr Arg Ala Ala Ser Glu Gly Asn Leu
245 250 255
Gly His Asp Ile Thr Gly Gln Leu Phe Ala Tyr Pro Lys Leu Leu Tyr
260 265 270
Val Ala Ala Ala Thr Ile Met Leu Leu Gly Ile Phe Thr Pro Ile Gly
275 280 285
Ile Leu Leu Thr Gly Pro Leu Ala Gly Leu Leu Ala Phe Gly Ala Tyr
290 295 300
Thr Leu Ser Lys Ser Gly Lys Glu Lys Glu Glu Val Asp Glu Ile Leu
305 310 315 320
Glu Glu Glu Ala Glu Val Asp Glu Leu Lys Ser Pro Glu Ser Val Val
325 330 335
Gln Leu Leu His Ile Asp Pro Ile Glu Phe Glu Phe Gly Tyr Gly Leu
340 345 350
Ile Pro Leu Ala Asp Ala Asn Gln Gly Gly Asp Leu Leu Asp Arg Ile
355 360 365
Val Met Ile Arg Arg Gln Leu Ala Leu Glu Leu Gly Leu Val Ile Pro
370 375 380
Val Val Arg Ile Arg Asp Asn Ile Ala Leu Gln Pro Asn Glu Tyr Arg
385 390 395 400
Leu Lys Ile Lys Gly Asn Glu Val Ala Lys Gly Glu Leu Leu Leu Asp
405 410 415
His Tyr Leu Ala Met Ser Pro Thr Pro Glu Asp Asp Leu Ile Glu Gly
420 425 430
Ile Glu Thr Val Glu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Ala Lys Trp Ile Ser
435 440 445
Glu Ala Val Lys Asp Glu Ala Asp Met Leu Gly Tyr Thr Val Val Asp
450 455 460
Pro Ala Ser Val Val Ser Thr His Ile Thr Glu Lys Ile Lys Gln His
465 470 475 480
Ala His Glu Leu Ile Gly Arg Gln Glu Thr Lys Gln Leu Ile Asp His
485 490 495
Leu Lys Glu Ser Tyr Pro Val Leu Val Glu Glu Val Thr Pro Asn Pro
500 505 510
Leu Ser Val Gly Asp Ile Gln Lys Val Leu Ala Lys Leu Leu Lys Glu
515 520 525
Lys Val Ser Ile Arg Asn Leu Val Thr Ile Phe Glu Thr Leu Ala Asp
530 535 540
Tyr Gly Lys Leu Thr Thr Asp Ser Asp Leu Leu Thr Glu Tyr Thr Arg
545 550 555 560
Gln Ala Leu Ala Lys Gln Ile Thr Ala Gln Phe Ala Lys Glu Asn Glu
565 570 575
Val Leu Lys Val Val Thr Cys Ser Gly Arg Val Glu Lys Ala Ile Ala
580 585 590
Asp Gly Val Gln Gln Thr Glu His Gly Asn Tyr Leu Ser Leu Glu Pro
595 600 605
Asp Ile Ser Glu Ser Ile Val Arg Ser Val Ala Lys Glu Ala Glu Gln
610 615 620
Leu Ser Leu Arg Gln Glu Thr Ala Ile Leu Leu Cys Ser Pro Pro Val
625 630 635 640
Arg Met Tyr Val Lys Gln Leu Leu Glu Arg Tyr Phe Pro Asp Leu Pro
645 650 655
Val Leu Ser Tyr Asn Glu Leu Glu Ala Asn Val Glu Val Gln Ser Ile
660 665 670
Gly Val Val Asp Ile
675
<210> 31
<211> 360
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 31
Met Lys Leu Arg Val Asp Leu Gln Phe Phe Ala Gly Glu Lys Thr Glu
1 5 10 15
Lys Ala Thr Pro Lys Lys Arg Lys Asp Thr Arg Lys Lys Gly Gln Val
20 25 30
Ala Lys Ser Ser Asp Val Asn Thr Ala Val Ser Leu Leu Val Ile Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Ile Ala Ile Gly Pro Tyr Met Arg Asp Arg Leu Leu Ser
50 55 60
Phe Ile Glu Thr Phe Tyr Thr Glu Ser Leu Thr Met Lys Leu Ser Glu
65 70 75 80
Ser Asn Val His Thr Leu Phe Val Ser Leu Leu Lys Asp Met Gly Met
85 90 95
Ile Leu Ala Pro Ile Leu Leu Val Ala Leu Val Ala Gly Val Val Ser
100 105 110
Asn Tyr Met Gln Val Gly Phe Leu Phe Ser Ala Glu Val Ile Gln Pro
115 120 125
Lys Leu Glu Lys Leu Asp Pro Ile Lys Gly Phe Lys Arg Ile Tyr Ser
130 135 140
Met Arg Ala Ile Val Glu Leu Ile Lys Ser Ile Leu Lys Ile Val Val
145 150 155 160
Val Gly Phe Ala Ala Phe Ala Val Leu Trp Leu His Tyr Gly Glu Ile
165 170 175
Leu Arg Leu Pro Leu Leu Thr Pro Glu Glu Ala Leu Ser Phe Val Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Leu Trp Met Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Leu Leu Ile
195 200 205
Leu Ala Gly Leu Asp Tyr Leu Tyr Gln Arg Phe Asp Tyr Glu Lys Asn
210 215 220
Ile Lys Met Ser Lys Gln Asp Ile Lys Asp Glu Tyr Lys Lys Ser Glu
225 230 235 240
Gly Asp Pro Ile Ile Lys Ser Lys Ile Lys Gln Arg Gln Arg Glu Met
245 250 255
Ala Met Arg Arg Met Met Gln Glu Val Pro Lys Ala Asp Val Ile Ile
260 265 270
Thr Asn Pro Thr His Tyr Ala Ile Ala Leu Lys Tyr Asp Glu Glu Lys
275 280 285
Met Asp Ala Pro Tyr Ile Val Ala Lys Gly Val Asp His Leu Ala Leu
290 295 300
Lys Ile Arg Lys Ile Ala Lys Glu His Asp Val Met Met Val Glu Asn
305 310 315 320
Arg Pro Leu Ala Arg Ala Leu Tyr Asp Gln Val Glu Ile Asp Gln Ala
325 330 335
Val Pro Glu Glu Phe Phe Lys Val Leu Ala Glu Ile Leu Ala Tyr Val
340 345 350
Tyr Lys Thr Lys Gln Lys Val Tyr
355 360
<210> 32
<211> 366
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 32
Met Lys Ile Lys Lys Phe Thr Ala Ala Ser Met Gln Glu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Ile Arg Lys Glu Leu Gly Asn Glu Ala Val Ile Leu Asn Ser Lys
20 25 30
Lys Ile Lys Lys Arg Lys Trp Phe Gly Leu Val Asn Lys Pro Ala Val
35 40 45
Glu Val Ile Ala Val Leu Asp Gln Asp Phe Leu Glu Lys Lys Thr Pro
50 55 60
Gln Lys Ala Ala Glu Pro Lys Gln Thr Leu Lys Thr Pro Val Ser Ser
65 70 75 80
Pro Lys Ile Glu Glu Arg Thr Tyr Pro Pro Gln Ile Pro Ala Gln Gln
85 90 95
Glu Leu Gly Asp Phe Ser Ala Tyr Gln Ser Val Leu Pro Glu Pro Leu
100 105 110
Arg Lys Ala Glu Lys Leu Leu Gln Glu Thr Gly Ile Lys Glu Ser Thr
115 120 125
Lys Thr Asn Thr Leu Lys Lys Leu Leu Arg Phe Ser Val Glu Ala Gly
130 135 140
Gly Leu Thr Glu Glu Asn Val Val Gly Lys Leu Gln Glu Ile Leu Cys
145 150 155 160
Asp Met Leu Pro Ser Ala Asp Lys Trp Gln Glu Pro Ile His Ser Lys
165 170 175
Tyr Ile Val Leu Phe Gly Ser Thr Gly Ala Gly Lys Thr Thr Thr Leu
180 185 190
Ala Lys Leu Ala Ala Ile Ser Met Leu Glu Lys His Lys Lys Ile Ala
195 200 205
Phe Ile Thr Thr Asp Thr Tyr Arg Ile Ala Ala Val Glu Gln Leu Lys
210 215 220
Thr Tyr Ala Glu Leu Leu Gln Ala Pro Leu Glu Val Cys Tyr Thr Lys
225 230 235 240
Glu Glu Phe Gln Gln Ala Lys Glu Leu Phe Ser Glu Tyr Asp His Val
245 250 255
Phe Val Asp Thr Ala Gly Arg Asn Phe Lys Asp Pro Gln Tyr Ile Asp
260 265 270
Glu Leu Lys Glu Thr Ile Pro Phe Glu Ser Ser Ile Gln Ser Phe Leu
275 280 285
Val Leu Ser Ala Thr Ala Lys Tyr Glu Asp Met Lys His Ile Val Lys
290 295 300
Arg Phe Ser Ser Val Pro Val Asn Gln Tyr Ile Phe Thr Lys Ile Asp
305 310 315 320
Glu Thr Thr Ser Leu Gly Ser Val Phe Asn Ile Leu Ala Glu Ser Lys
325 330 335
Ile Gly Val Gly Phe Met Thr Asn Gly Gln Asn Val Pro Glu Asp Ile
340 345 350
Gln Thr Val Ser Pro Leu Gly Phe Val Arg Met Leu Cys Arg
355 360 365
<210> 33
<211> 298
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 33
Met Gln Met Asn Arg Tyr Asp Gln Ala Ala Thr Leu Arg Ala Lys Met
1 5 10 15
Glu Lys Arg Glu Arg Val Leu Pro Met Val Tyr Ser Gln Lys Ala Lys
20 25 30
Thr Leu Ala Val Ile Ser Gly Lys Gly Gly Val Gly Lys Ser Asn Ile
35 40 45
Thr Leu Asn Met Ala Leu Ala Leu Gln Asp Lys Gly Lys Lys Val Leu
50 55 60
Leu Ile Asp Leu Asp Ile Gly Met Gly Asn Ile Asp Ile Leu Ile Gly
65 70 75 80
Asn Ser Ser Ser Ala Thr Ile Ile Asp Val Leu Thr Asp Arg Lys Pro
85 90 95
Leu Leu Gln Ser Leu Ser Val Gly Pro Lys Gly Leu Arg Tyr Ile Ser
100 105 110
Gly Gly Thr Gly Leu Asp Val Met Phe Gln Leu Asp Gln Arg Lys Trp
115 120 125
Thr Phe Phe Ala Asn Glu Leu Ser His Ala Leu Ser Gln Phe Asp Tyr
130 135 140
Val Leu Phe Asp Met Gly Ala Gly Leu Ser Lys Asp Gln Leu Pro Phe
145 150 155 160
Ile Leu Ser Ala Glu Asp Ile Leu Ile Ile Thr Thr Pro Glu Pro Thr
165 170 175
Ala Ile Met Asp Ala Tyr Ser Ala Val Lys His Leu Val Leu Thr Glu
180 185 190
Asn Lys Leu Ser Met Lys Val Ala Val Asn Arg Cys Arg Asp Gln Lys
195 200 205
Glu Gly Leu Asp Ala Phe Ala Arg Leu Ser Arg Thr Ile His Met Phe
210 215 220
Leu Asp Val Gln Val Gln Phe Ala Gly Ser Val Ser Asp Asp Val Ile
225 230 235 240
Val Ser Lys Ala Val Val Glu Gln Val Pro Phe Phe Ile Lys Ser Pro
245 250 255
Gln Ala Lys Ala Ser Arg Ser Val Arg Ile Leu Ala Asp Ala Leu Phe
260 265 270
Glu Arg Glu Glu Thr Arg His Lys Glu Asp Lys Gln Thr Phe Ile Glu
275 280 285
Lys Leu Ser Ser Phe Leu Met Arg Arg Ala
290 295
<210> 34
<211> 270
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 34
Met Leu Lys Gly Leu Tyr Thr Ala Thr Ser Ala Met Ile Ala Gln Gln
1 5 10 15
Arg Arg Thr Glu Met Leu Ser Asn Asn Ile Ala Asn Ala Asn Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Lys Ala Asp Gln Gly Ser Met Arg Ala Phe Pro Glu Met Leu
35 40 45
Leu Ser Arg Ile Glu Ser Lys Ser Pro Ala Gly Thr Ser Arg Thr Glu
50 55 60
Ile Gly Ser Val Asn Thr Gly Val Tyr Met Gln Glu Leu Lys Pro Leu
65 70 75 80
Phe Thr Gln Gly Ser Leu Lys Ser Thr Asp Gln Pro Thr Asp Ile Ala
85 90 95
Leu Ile Glu Asn Gln Val Pro Met Ser Ala Glu Thr Asn Glu Lys Ala
100 105 110
Ala Leu Phe Tyr Pro Val Gln Thr Ala Asp Gly Ile Arg Tyr Ser Lys
115 120 125
Ser Ser Thr Phe Ser Leu Asn Glu Asn Asn Gln Leu Thr Ile Asn Gly
130 135 140
Arg Pro Ile Leu Ser Thr Asp Arg Gln Pro Ile Thr Val Asp Asn Glu
145 150 155 160
Asn Phe Thr Val Ser Glu Asn Gly Thr Val Thr Thr Asn Gly Arg Thr
165 170 175
Ala Gly Gln Ile Asp Val Arg Met Ala Glu Asp Val Arg Asn Leu Lys
180 185 190
Arg Asp Gly Asn Asp Leu Tyr Ser Thr Ala Asp Gly Asn Asp Leu Pro
195 200 205
Ser Ala Ala Gly Asn Asn Gln Val Ala Tyr Ser Leu Lys Gln Gly Val
210 215 220
Ser Glu Leu Ser Asn Val Asp Val Thr Ser Ala Tyr Thr Glu Met Thr
225 230 235 240
Glu Ala Tyr Arg Ser Phe Glu Ala Asn Gln Lys Val Ile Gln Ala Tyr
245 250 255
Asp Lys Ser Met Asp Lys Ala Ala Asn Glu Ile Gly Lys Ile
260 265 270
<210> 35
<211> 269
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 35
Met Leu Arg Ser Met Leu Thr Ala Ser Thr Thr Leu Asn Gln Leu Gln
1 5 10 15
Gln Gln Ile Asp Thr Ile Ser Ser Asn Leu Ser Asn Ser Asn Thr Thr
20 25 30
Gly Tyr Lys Ala Lys Asp Thr Asn Phe Ser Glu Leu Val Arg Gln Gln
35 40 45
Phe Asp Gln Val Asp Glu Lys Asn Glu Glu Val Ala Lys Ala Arg Lys
50 55 60
Thr Pro Pro Gly Leu Arg Leu Gly Val Gly Ala Met Met Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Val Ser Asp Gln Gly Ser Ile Gln Lys Thr Asp Arg Asp Leu Asp
85 90 95
Ile Ala Phe Thr Ser Pro Tyr Gln Tyr Leu Gln Val Asn Val Asn Gly
100 105 110
Asn Arg Gln Tyr Thr Arg Asp Gly Ala Leu Tyr Val Thr Pro Ser Ala
115 120 125
Ala Asn Ala Asn Gln Leu Gln Leu Val Thr Gly Asn Gly Tyr Pro Val
130 135 140
Leu Asp Glu Asn Gly Asn Thr Val Asn Ile Asp Ser Ser Met Lys Asn
145 150 155 160
Ile Thr Ile Asn Lys Asn Gly Thr Leu Thr Ala Ser Asp Gly Asn Ala
165 170 175
Val Gln Arg Phe Asn Leu Gly Val Val Gln Val Asn Asn Pro Gln Glu
180 185 190
Leu Lys Ser Glu Gly Asn Asn Leu Phe Ser Ile Asp Asn Ala Ala Ala
195 200 205
Phe Glu Glu Leu Asn Gly Ala Asn Arg Gln Asn Ile Gly Met Gln Gln
210 215 220
Gly Ser Leu Glu Met Ser Asn Val Asp Ile Ser Glu Gln Met Thr Asp
225 230 235 240
Leu Ile Thr Ser Gln Arg Ser Tyr Gln Leu Asn Ser Arg Thr Ile Thr
245 250 255
Met Gly Asp Gln Met Leu Gly Leu Ile Asn Ser Val Arg
260 265
<210> 36
<211> 498
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 36
Met Val Thr Arg Ile Thr Gly Leu Ala Ser Gly Met Asp Ile Asp Asp
1 5 10 15
Ile Val Ser Lys Leu Met Gln Thr Glu Arg Ala Pro Leu Asp Lys Leu
20 25 30
Thr Gln Lys Lys Gln Thr Leu Glu Trp Gln Arg Asp Ser Tyr Arg Glu
35 40 45
Val Asn Ser Lys Ile Lys Glu Leu Gln Asp Tyr Met Ser Lys Asn Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Pro Ser Thr Tyr Gln Ser Lys Thr Val Thr Ser Ser Asn
65 70 75 80
Glu Ser Val Leu Thr Ala Thr Gly Ser Val Ser Ala Pro Asn Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Val Glu Val Ala Ser Leu Ala Thr Ala Ala Thr Tyr Lys Ala
100 105 110
Asn Asn Tyr Thr Gly Tyr Thr Gln Gly Asp Tyr Asn Leu Ala Phe Asn
115 120 125
Val Val Ala Pro Gly Glu Thr Thr Ala Lys Thr Val Asn Ile Ser Val
130 135 140
Thr Ser Ala Asp Thr Ile Asp Asn Val Ile Ser Lys Leu Asn Ser Ser
145 150 155 160
Asp Leu Gly Val Ser Ala Phe Lys Asp Lys Ile Trp Asn Gly Thr Glu
165 170 175
Tyr Val Glu Thr Ile Ala Phe Ser Ser Lys Ala Thr Gly Ala Gly Gly
180 185 190
Ser Ile Gln Ala Ala Asp Ser Ala Thr Ala Asp Phe Met Ser Gly Gln
195 200 205
Leu Gly Phe Ser Leu Asp Ala Asp Asn Lys Leu Thr Ala Tyr Lys Glu
210 215 220
Gly Thr Asn Ala Lys Val Thr Ile Asn Gly Phe Glu Met Glu Lys Leu
225 230 235 240
Thr Asn Asn Phe Thr Val Asn Gly Val Thr Tyr Ser Ile Lys Asn Thr
245 250 255
Thr Ala Ala Thr Gly Pro Val Thr Thr Ser Val Ser Thr Asp Val Asp
260 265 270
Gly Ile Tyr Asn Gln Ile Lys Glu Phe Val Asp Lys Tyr Asn Glu Leu
275 280 285
Val Asp Ser Leu Asn Glu Lys Leu Lys Glu Glu Lys Tyr Arg Asp Tyr
290 295 300
Thr Pro Leu Thr Ser Glu Gln Lys Glu Ala Met Ser Asp Lys Glu Val
305 310 315 320
Glu Leu Trp Glu Glu Lys Ala Lys Ser Gly Leu Leu Arg Asn Asp Ser
325 330 335
Ser Ile Ser Thr Gly Thr Asn Gln Met Arg Thr Asp Phe Tyr Thr Gln
340 345 350
Val Asn Ala Asp Gly Lys Thr Tyr Gln Leu Thr Glu Phe Gly Ile Thr
355 360 365
Thr Ser Ser Ala Tyr Gln Leu Arg Gly His Leu Glu Ile Asn Glu Glu
370 375 380
Lys Leu Lys Ala Lys Ile Ala Glu Asp Pro Gln Gly Val Ala Asn Leu
385 390 395 400
Phe Thr Ser Gly Thr Asn Asp Ser Asn Tyr Ser Asp Lys Gly Ile Met
405 410 415
Lys Arg Ile Thr Asn Thr Leu Arg Ser Thr Val Lys Ser Ile Glu Ala
420 425 430
Lys Ala Gly Asn Ser Thr Met Gly Ala Ser Ser Tyr Ser Ile Gly Lys
435 440 445
Asn Leu Asn Ser Ile Ser Thr Glu Ile Thr Asp Met Gln Asp Arg Leu
450 455 460
Asn Thr Ile Glu Asn Arg Tyr Tyr Ser Lys Phe Ser Ala Met Asp Ser
465 470 475 480
Ala Ile Gln Lys Met Asn Glu Gln Ala Ser Tyr Leu Ser Gln Leu Leu
485 490 495
Val Gln
<210> 37
<211> 106
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 37
Met Ile Asn Ala Ile Ser Pro Phe Gln Val Gln Asn Thr Gln Asn Thr
1 5 10 15
Gln Asn Ala Thr Asn Gln Val Asn Asn Ser Gln Lys Thr Asp Ser Ser
20 25 30
Asn Gln Thr Ser Phe Ser Glu Leu Leu Lys Asn Ser Ile Ser Ser Leu
35 40 45
Asn Glu Ser Gln Val Ala Ser Asp Asn Met Thr Asn Ala Leu Ala Ala
50 55 60
Gly Lys Asp Val Asn Leu Asp Glu Val Met Ile Ala Ala Gln Lys Ala
65 70 75 80
Ser Ile Ser Leu Thr Ala Ala Thr Glu Phe Arg Asn Lys Ala Val Glu
85 90 95
Ala Tyr Gln Glu Ile Met Arg Met Gln Met
100 105
<210> 38
<211> 536
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 38
Met Asn Arg Thr Leu Met Gln Met Lys Asn Lys Thr Ser Glu Phe Trp
1 5 10 15
Lys Asn Arg Ser Lys Leu Gln Lys Ile Leu Met Val Ser Ala Leu Ala
20 25 30
Ala Ile Ile Ile Ile Gly Ile Ile Ile Ser Val Phe Ala Ser Asn Ser
35 40 45
Lys Met Ala Pro Leu Tyr Lys Asp Leu Ser Ala Glu Glu Ala Gly Gln
50 55 60
Ile Lys Glu Glu Leu Asp Ala Lys Lys Val Pro Asn Glu Leu Ser Asn
65 70 75 80
Gly Gly Thr Val Ile Ser Val Pro Glu Asp Gln Val Asp Ser Leu Lys
85 90 95
Val Gln Met Ala Ala Glu Gly Leu Pro Lys Thr Gly Ser Ile Asp Tyr
100 105 110
Ser Phe Phe Gly Gln Asn Ala Gly Phe Gly Leu Thr Asp Asn Glu Phe
115 120 125
Asp Met Val Lys Val Lys Ala Thr Gln Thr Glu Leu Ser Asn Leu Ile
130 135 140
Asn Glu Met Asp Gly Ile Lys Asn Ser Lys Val Met Ile Asn Leu Pro
145 150 155 160
Lys Asp Ala Val Phe Val Gly Glu Glu Gln Ser Ala Ala Ser Ala Ser
165 170 175
Ile Val Leu Gln Ile Gln Pro Gly Tyr Thr Leu Asp Gln Ser Gln Ile
180 185 190
Asn Gly Leu Tyr His Leu Val Ser Lys Ser Val Pro Asn Leu Lys Glu
195 200 205
Asp Asn Ile Val Ile Met Asp Gln Asn Ser Thr Tyr Tyr Asp Lys Ser
210 215 220
Asp Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Asp Ser Tyr Ser Ser Gln Gln Gly
225 230 235 240
Ile Lys Ser Gln Val Glu Lys Asp Ile Gln Lys His Val Gln Ser Leu
245 250 255
Leu Gly Thr Met Met Gly Gln Asp Lys Val Val Val Ser Val Thr Ala
260 265 270
Asp Ile Asp Phe Thr Lys Glu Asn Arg Thr Glu Asp Ile Val Glu Pro
275 280 285
Val Asp Lys Glu Asn Met Glu Gly Ile Ala Val Ser Ala Glu Lys Val
290 295 300
Ser Glu Thr Tyr Gln Gly Asp Gly Ala Ala Asn Gly Gly Thr Ala Gly
305 310 315 320
Thr Gly Glu Glu Asp Val Thr Asn Tyr Lys Ala Asp Gly Glu Asn Thr
325 330 335
Glu Ser Gly Asn Tyr Glu Lys Asn Ser Asn Lys Ile Asn Tyr Glu Val
340 345 350
Asn Arg Ile His Lys Glu Ile Ala Glu Ser Pro Tyr Lys Val Arg Asp
355 360 365
Leu Gly Ile Gln Val Met Val Glu Pro Pro Asp Ala Lys Asn Thr Ala
370 375 380
Ser Leu Ser Thr Glu Arg Gln Asp Asp Ile Gln Lys Ile Leu Ser Thr
385 390 395 400
Val Val Arg Thr Ser Leu Asp Lys Asp Glu Thr Gln Asn Gln Asn Leu
405 410 415
Ser Asp Ala Asp Ile Asn Asn Lys Ile Val Val Ser Val Gln Pro Phe
420 425 430
Asp Gly Lys Val Asn Leu Asp Thr Asn Thr Glu Glu Ser Ser Gly Ile
435 440 445
Pro Leu Trp Ala Tyr Ile Val Gly Gly Val Leu Ile Ala Ala Ile Ile
450 455 460
Val Leu Ile Ile Met Leu Ile Arg Lys Lys Arg Ala Gln Glu Asp Glu
465 470 475 480
Phe Glu Glu Tyr Glu Tyr Glu Val Pro Gln Glu Pro Ile Asn Leu Pro
485 490 495
Asp Ile Asn Glu Glu Glu Asn Glu Thr Ala Glu Ser Val Arg Arg Lys
500 505 510
Gln Leu Glu Lys Met Ala Lys Asp Lys Pro Glu Asp Phe Ala Lys Leu
515 520 525
Leu Arg Ser Trp Leu Ala Glu Asp
530 535
<210> 39
<211> 338
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 39
Met Ala Arg Arg Asp Gln Asp Lys Leu Thr Gly Lys Gln Lys Ala Ala
1 5 10 15
Ile Leu Met Ile Ser Leu Gly Leu Asp Val Ser Ala Ser Val Tyr Lys
20 25 30
His Leu Thr Asp Glu Glu Ile Glu Arg Leu Thr Leu Glu Ile Ser Gly
35 40 45
Val Arg Ser Val Asp His Gln Lys Lys Asp Glu Ile Ile Glu Glu Phe
50 55 60
His Asn Ile Ala Ile Ala Gln Asp Tyr Ile Ser Gln Gly Gly Leu Ser
65 70 75 80
Tyr Ala Arg Gln Val Leu Glu Lys Ala Leu Gly Glu Asp Lys Ala Glu
85 90 95
Asn Ile Leu Asn Arg Leu Thr Ser Ser Leu Gln Val Lys Pro Phe Asp
100 105 110
Phe Ala Arg Lys Ala Glu Pro Glu Gln Ile Leu Asn Phe Ile Gln Gln
115 120 125
Glu His Pro Gln Thr Met Ala Leu Ile Leu Ser Tyr Leu Asp Pro Val
130 135 140
Gln Ala Gly Gln Ile Leu Ser Glu Leu Asn Pro Glu Val Gln Ala Glu
145 150 155 160
Val Ala Arg Arg Ile Ala Val Met Asp Arg Thr Ser Pro Glu Ile Ile
165 170 175
Asn Glu Val Glu Arg Ile Leu Glu Gln Lys Leu Ser Ser Ala Phe Thr
180 185 190
Gln Asp Tyr Thr Gln Thr Gly Gly Ile Glu Ala Val Val Glu Val Leu
195 200 205
Asn Gly Val Asp Arg Gly Thr Glu Lys Thr Ile Leu Asp Ser Leu Glu
210 215 220
Ile Gln Asp Pro Asp Leu Ala Glu Glu Ile Lys Lys Arg Met Phe Val
225 230 235 240
Phe Glu Asp Ile Val Thr Leu Asp Asn Arg Ala Ile Gln Arg Val Ile
245 250 255
Arg Asp Val Glu Asn Asp Asp Leu Leu Leu Ser Leu Lys Val Ala Ser
260 265 270
Glu Glu Val Lys Glu Ile Val Phe Asn Asn Met Ser Gln Arg Met Val
275 280 285
Glu Thr Phe Lys Glu Glu Met Glu Phe Met Gly Pro Val Arg Leu Lys
290 295 300
Asp Val Glu Glu Ala Gln Ser Arg Ile Val Ser Ile Val Arg Lys Leu
305 310 315 320
Glu Glu Ala Gly Glu Ile Val Ile Ala Arg Gly Gly Gly Asp Asp Ile
325 330 335
Ile Val
<210> 40
<211> 253
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 40
Met Ile Leu Leu Ser Asn Ile Ile Lys Gln Glu Ser Ser Ile Ser Pro
1 5 10 15
Gln Lys Glu Lys Arg Lys Leu Ser Ile Gln Glu Val Arg Ile Asp His
20 25 30
Ser His Leu Leu Gln Ala Glu Glu Asn Pro Glu Ala Leu Met Ala Arg
35 40 45
Val Lys Glu Glu Ala Asp Arg Ile Ser Glu Gln Ala Asn Ser His Ile
50 55 60
Glu Asn Ile Arg Arg Gln Ile Glu Gln Glu Lys Asn Asp Trp Ala Ala
65 70 75 80
Glu Lys Gln Lys Leu Ile Glu Glu Ala Lys Ala Glu Gly Phe Glu Gln
85 90 95
Gly Val Ala Leu Gly Lys Ala Glu Ala Met Lys Gln Tyr Ala Glu Leu
100 105 110
Ile Gly Gln Ala Asn Ser Ile Thr Glu Met Ser Arg Lys Ala Val Glu
115 120 125
Asp Lys Leu Glu Asp Ala Asn Glu Glu Ile Val Glu Leu Ala Val Ala
130 135 140
Leu Ala Lys Lys Val Trp Gln Gln Lys Ser Asp Asp Lys Glu Ala Phe
145 150 155 160
Leu Leu Leu Val Gln Gln Val Ile Asn Glu Val Lys Glu Tyr Asp Asp
165 170 175
Ile Ser Ile Tyr Val Asp Pro Tyr Tyr Tyr Glu Thr Ile Phe Gln Gln
180 185 190
Lys Asp Glu Ile Gln Gln Leu Leu Tyr Lys Glu Cys Arg Leu Gly Ile
195 200 205
Tyr Ala Asp Glu Lys Ala Gln Lys Gly Thr Cys Tyr Ile Glu Thr Pro
210 215 220
Phe Gly Arg Val Asp Ala Ser Val Asp Thr Gln Leu Met Gln Leu Lys
225 230 235 240
Asp Lys Leu Leu Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ala Ala Glu
245 250
<210> 41
<211> 438
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 41
Met Lys Thr Gln Ser Leu Ile Asp Cys Ile Glu Met Thr Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Lys Arg Tyr Gly Lys Val Lys Arg Val Ile Gly Leu Met Ile Glu Ser
20 25 30
Lys Gly Pro Ala Ser Ser Ile Gly Asp Leu Cys Leu Ile Tyr Ala Lys
35 40 45
Gly Gln Ser Gly Lys Val Ile Lys Ala Glu Val Val Gly Phe Gln Glu
50 55 60
Glu Asn Ile Leu Leu Met Pro Tyr Leu Glu Ala Ala Ser Ile Ala Pro
65 70 75 80
Gly Ser Ile Val Glu Ala Thr Gly Glu Ser Leu Arg Val Lys Val Gly
85 90 95
Thr Gly Leu Ile Gly Gln Val Ile Asp Ala Phe Gly Glu Pro Leu Asp
100 105 110
Gly Lys Leu Leu Pro Lys Gly Leu Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Ser
115 120 125
Pro Pro Asn Pro Met Lys Arg Pro Pro Ile Arg Glu Lys Met Gly Val
130 135 140
Gly Val Arg Ser Ile Asp Ser Leu Leu Thr Val Gly Lys Gly Gln Arg
145 150 155 160
Ile Gly Ile Phe Ala Gly Ser Gly Val Gly Lys Ser Thr Leu Met Gly
165 170 175
Met Ile Ala Lys Gln Thr Glu Ala Asp Leu Asn Val Ile Ala Leu Val
180 185 190
Gly Glu Arg Gly Arg Glu Val Arg Glu Phe Ile Glu Lys Asp Leu Gly
195 200 205
Lys Glu Gly Leu Lys Arg Ser Ile Val Val Val Ala Thr Ser Asp Gln
210 215 220
Pro Ala Leu Met Arg Leu Lys Ala Ala Tyr Thr Ala Thr Ala Ile Ala
225 230 235 240
Glu Tyr Phe Arg Asp Lys Gly Gln Asn Val Met Phe Met Met Asp Ser
245 250 255
Val Thr Arg Val Ala Met Ala Gln Arg Glu Ile Gly Leu Ala Ala Gly
260 265 270
Glu Pro Pro Thr Thr Lys Gly Tyr Thr Pro Ser Val Phe Ala Ile Leu
275 280 285
Pro Arg Leu Leu Glu Arg Thr Gly Ala Asn Glu His Gly Thr Ile Thr
290 295 300
Ala Phe Tyr Thr Val Leu Val Asp Gly Asp Asp Met Asn Glu Pro Ile
305 310 315 320
Ala Asp Thr Val Arg Gly Ile Leu Asp Gly His Ile Val Leu Asp Arg
325 330 335
Ala Leu Ala Asn Lys Gly Gln Phe Pro Ala Val Asn Val Leu Lys Ser
340 345 350
Ile Ser Arg Val Met Ser Asn Ile Ser Thr Lys Gln His Leu Asp Ala
355 360 365
Ala Asn Lys Phe Arg Glu Leu Leu Ser Thr Tyr Gln Asn Ser Glu Asp
370 375 380
Leu Ile Asn Ile Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Ser Ser Arg Glu Ile Asp
385 390 395 400
Glu Ala Ile Gln Phe Tyr Pro Gln Leu Ile Gln Phe Leu Lys Gln Gly
405 410 415
Thr Asp Glu Pro Ala Leu Leu Glu Glu Ser Ile Ala Ala Leu Thr Ser
420 425 430
Leu Thr Gly Asn Glu Glu
435
<210> 42
<211> 147
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 42
Met Ala Tyr Gln Phe Arg Phe Gln Lys Leu Leu Glu Leu Lys Glu Asn
1 5 10 15
Glu Lys Asp Gln Ser Leu Ser Glu Tyr Gln Gln Ser Val Ser Glu Phe
20 25 30
Glu Asn Val Ala Glu Lys Leu Tyr Glu Asn Met Ser Lys Lys Glu Leu
35 40 45
Leu Glu Gln Asn Lys Glu Lys Lys Leu Lys Ser Gly Met Ser Val Gln
50 55 60
Glu Met Arg His Tyr Gln Gln Phe Val Ser Asn Leu Asp Asn Thr Ile
65 70 75 80
Tyr His Tyr Gln Lys Leu Val Ile Met Lys Arg Asn Gln Met Asn Gln
85 90 95
Lys Gln Glu Ile Leu Thr Glu Lys Asn Ile Glu Val Lys Lys Phe Glu
100 105 110
Lys Met Arg Glu Lys Gln Phe Lys Met Phe Ala Leu Glu Asp Lys Ala
115 120 125
Ala Glu Met Lys Glu Met Asp Asp Ile Ser Ile Lys Gln Phe Met Ile
130 135 140
Gln Gly His
145
<210> 43
<211> 487
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 43
Met Lys Leu Leu Glu Leu Ala Gly Pro Leu Leu Gln Thr Thr Thr Gly
1 5 10 15
Ser Ala Ala Lys Asn Met Lys Ser Ser Gln Gly Val Phe Gln Asn Trp
20 25 30
Leu Met Ser Glu Ala Gly Leu Lys Glu Leu Ser Glu Gln Gly Lys Gly
35 40 45
Thr Pro Asn Ser Glu Asp Gln Leu Leu Ala Asp Ala Leu Lys Lys Ile
50 55 60
Gly Glu Trp Leu Asn Ala Ser Pro Glu Asp Gln Asp Lys Gln Asn Ala
65 70 75 80
Asp Leu Leu Gln Thr Leu Ser Lys Leu Thr Gly Lys Gln Leu Asp Ala
85 90 95
Asn Ala Leu Gln Met Leu Gln Asn Leu Leu Gln Ala Val Glu Ser Lys
100 105 110
Met Ser Gly Gly Thr Asp Gln Leu Leu Thr Glu Thr Glu Lys Ile Phe
115 120 125
Ser Glu Ala Lys Thr Ala Leu Ser Ala Asn Asp Ser Ala Ser Asp Ile
130 135 140
Asn Gly Ala Leu Lys Ser Asp Lys Glu Gln Ser Asn Gln Glu Asn Glu
145 150 155 160
Val Ser Glu Pro Ala Lys Glu Leu Ile Tyr Ile Gln Met Phe Ile Ser
165 170 175
Gln Leu Val Glu Gly Asn Lys Leu Thr Asp Leu Gly Asn Gly Asn Glu
180 185 190
Ala His Ala Ile Tyr Gln Asn Gly Asp Gln Phe Leu Ser Ala Leu Glu
195 200 205
Lys Lys Gly Val Ser Gln Gln Leu Ile Gln Asp Leu Lys Gln Gln Ile
210 215 220
Phe Thr Lys Ala Glu Ser Ser Ser Lys Leu Tyr Ser Met Thr Ala Ser
225 230 235 240
Glu Leu Lys Ser Phe Gln Ser Leu Met Asp Gln Met Ser Met Leu Pro
245 250 255
Gln Lys Gly Thr Lys Glu Trp Ser Leu Ala Glu Ser Gln Leu Lys Ala
260 265 270
Phe Leu Leu Ser Lys Ser Ser Glu Ser Ser Gln Asp Phe Gly Lys Ser
275 280 285
Val Leu Thr Pro Leu Ser Gln Ser Ser Ser Ser Lys Asn Ala Ser Asp
290 295 300
Val Ser Gly Ser Ile Gln Pro Val Asp Ser Lys Ser Gly Leu Gln Met
305 310 315 320
Leu Phe Ser Gly Tyr Arg Gly Ile Gly Gly Val Gln Thr Leu Asp Leu
325 330 335
Gln Gln Met Ser Ser Asp Ile Pro Asn Ala Glu Thr Lys Thr Val Ala
340 345 350
Asp Gln Val Ile Asn Ala Trp Lys Gln Met Lys Tyr Thr Pro Phe Gly
355 360 365
Arg Ser Thr Gly Ser Phe Thr Ile Arg Leu Asn Pro Glu His Leu Gly
370 375 380
Phe Val Thr Ile Lys Leu Thr Asn Glu Asn Gly Met Phe Gln Ser Lys
385 390 395 400
Ile Ile Ala Ser Ser Gln Ser Ala Lys Glu Leu Leu Glu Gln His Leu
405 410 415
Pro Gln Leu Lys Gln Ser Leu Pro Asn Met Ala Val Gln Ile Asp Arg
420 425 430
Phe Thr Leu Pro Val Gln Ser Gly Asp Gln Pro Ile Tyr Gly Gln Leu
435 440 445
Ala Asp Glu Gln Lys Gln Gln Gln Glu Gly Gln Arg Gln Gln Arg Gln
450 455 460
Lys Lys Gln Ser Asn Asp Phe Gly Asp Leu Leu Asp Glu Val Ser Met
465 470 475 480
Val Glu Met Glu Glu Glu Glu
485
<210> 44
<211> 140
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 44
Met Lys Lys Lys Leu Met Ile Ile Leu Leu Ile Ile Leu Ile Val Ile
1 5 10 15
Gly Ala Leu Gly Ala Ala Ala Tyr Phe Val Leu Gly Gly Lys Ser Glu
20 25 30
Lys Ser Glu Ala Lys Lys Ser Ile Asp Glu Ile Val Ala Ser Ser Val
35 40 45
Asp Val Glu Glu Ile Thr Thr Asn Leu Lys Ser Asp Asn Ile Ile Arg
50 55 60
Leu Ala Ile Lys Leu Glu Thr Asp Ser Asp Lys Ser Lys Glu Glu Leu
65 70 75 80
Glu Lys Arg Asp Phe Gln Val Lys Asp Ala Val Ile Ser Leu Leu Ala
85 90 95
Asp Thr Asn Ala Asp Gln Ile Glu Gly Asp Lys Gly Lys Glu Thr Phe
100 105 110
Lys Lys Glu Leu Lys Asp Lys Ile Asn Ser Tyr Leu Gln Glu Gly Lys
115 120 125
Val Glu Lys Val Tyr Ile Thr Ser Phe Asn Leu Gln
130 135 140
<210> 45
<211> 332
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 45
Met Ser Gly Glu Val Leu Ser Gln Asn Glu Ile Asp Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ala Ile Ser Thr Gly Glu Met Asp Ala Glu Glu Leu Lys Lys Glu Glu
20 25 30
Lys Glu Lys Lys Val Lys Val Tyr Asp Phe Lys Arg Ala Leu Arg Phe
35 40 45
Ser Lys Asp Gln Ile Arg Ser Leu Thr Arg Ile His Asp Asn Phe Ala
50 55 60
Arg Leu Leu Thr Thr His Phe Ser Ala Gln Leu Arg Thr Tyr Ile His
65 70 75 80
Ile Ser Val Ser Ser Val Asp Gln Val Pro Tyr Glu Glu Phe Ile Arg
85 90 95
Ser Ile Pro Asn Met Thr Ile Leu Asn Leu Phe Asp Val His Pro Met
100 105 110
Glu Gly Arg Ile Met Met Glu Val Asn Pro Thr Ile Ala Tyr Thr Met
115 120 125
Met Asp Arg Val Met Gly Gly Ile Gly Ile Ser His Asn Lys Val Asp
130 135 140
Ser Leu Thr Glu Ile Glu Thr Lys Ile Ile Ser Asn Leu Phe Glu Asn
145 150 155 160
Ala Leu Gly Asn Tyr Lys Glu Ala Trp Gln Ser Ile Ala Asp Ile Glu
165 170 175
Pro Glu Met Thr Glu Phe Glu Val Asn Pro Gln Phe Val Gln Met Val
180 185 190
Ser Pro Asn Glu Thr Val Val Val Ile Ser Leu Asn Thr Gln Ile Gly
195 200 205
Glu Ile Ser Gly Val Ile Asn Leu Cys Ile Pro His Ile Val Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Ile Pro Lys Leu Ser Val His Tyr Trp Met Gln Ser Asp Arg
225 230 235 240
Asn Glu Pro Lys Pro Glu Glu Thr Lys Ser Leu Glu Lys Arg Ile Met
245 250 255
Thr Ala Gln Ile Pro Val Val Ala Glu Leu Gly Thr Ser Glu Leu Thr
260 265 270
Ile Glu Glu Phe Leu Ser Leu Glu Val Gly Asp Cys Ile Thr Leu Asp
275 280 285
Lys Ser Val Thr Asp Pro Leu Thr Val Leu Val Gly Asp Lys Pro Lys
290 295 300
Phe Leu Gly Gln Ala Gly Arg Val Asn Arg Lys Gln Ala Val Gln Ile
305 310 315 320
Leu Asp His Asp Ile Arg Gly Glu Gln Asp Gly Glu
325 330
<210> 46
<211> 221
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 46
Met Asn Glu Phe Ile Asn Ile Phe Ser Ser Ser Asp Pro Glu Asn Val
1 5 10 15
Ser Ser Thr Val Lys Leu Leu Leu Leu Leu Thr Val Phe Ser Val Ala
20 25 30
Pro Gly Ile Leu Ile Leu Met Thr Cys Phe Thr Arg Ile Val Ile Val
35 40 45
Leu Ser Phe Val Arg Thr Ser Leu Ala Thr Gln Ser Met Pro Pro Asn
50 55 60
Gln Val Leu Ile Gly Leu Ala Leu Phe Leu Thr Phe Phe Ile Met Ala
65 70 75 80
Pro Thr Phe Ser Glu Ile Asn Lys Glu Ala Leu Thr Pro Leu Met Asp
85 90 95
Asn Lys Ile Ser Leu Asp Glu Ala Tyr Thr Lys Ala Glu Glu Pro Ile
100 105 110
Lys Glu Phe Met Ser Lys His Thr Arg Gln Lys Asp Leu Ala Leu Phe
115 120 125
Met Asn Tyr Ala Lys Met Asp Lys Pro Glu Ser Leu Lys Asp Ile Pro
130 135 140
Leu Thr Thr Met Val Pro Ala Phe Ala Ile Ser Glu Leu Lys Thr Ala
145 150 155 160
Phe Gln Ile Gly Phe Met Ile Phe Ile Pro Phe Leu Ile Ile Asp Met
165 170 175
Val Val Ala Ser Val Leu Met Ser Met Gly Met Met Met Leu Pro Pro
180 185 190
Val Met Ile Ser Leu Pro Phe Lys Ile Leu Leu Phe Val Leu Val Asp
195 200 205
Gly Trp Tyr Leu Ile Val Lys Ser Leu Leu Gln Ser Phe
210 215 220
<210> 47
<211> 89
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 47
Met Ser Ser Glu Phe Val Ile Ser Met Ala Glu Lys Ala Val Tyr Val
1 5 10 15
Thr Leu Met Ile Ser Gly Pro Leu Leu Ala Ile Ala Leu Leu Val Gly
20 25 30
Leu Ile Val Ser Ile Phe Gln Ala Thr Thr Gln Ile Gln Glu Gln Thr
35 40 45
Leu Ala Phe Ile Pro Lys Ile Val Ala Val Leu Leu Ala Leu Ile Phe
50 55 60
Phe Gly Pro Trp Met Leu Ser Thr Ile Leu Ser Phe Thr Thr Glu Leu
65 70 75 80
Phe Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ala Gly
85
<210> 48
<211> 259
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 48
Met Asn Ser Ile Ile Asp Leu Phe Pro Ala Phe Leu Leu Val Phe Ile
1 5 10 15
Arg Ile Ser Ala Phe Phe Val Thr Ile Pro Leu Phe Gly His Arg Asn
20 25 30
Val Pro Ala Val His Arg Ile Gly Phe Ala Phe Phe Leu Ala Val Ile
35 40 45
Cys Phe Ser Thr Ile Asp Lys Pro Pro Ser Leu Glu Ile Asp Glu His
50 55 60
Tyr Met Leu Leu Ala Phe Lys Glu Ala Leu Val Gly Leu Cys Leu Gly
65 70 75 80
Leu Ile Ala Tyr Met Met Ile Ala Ala Val Gln Ile Ala Gly Ser Phe
85 90 95
Ile Asp Phe Gln Met Gly Phe Ser Ile Ala Asn Val Ile Asp Pro Gln
100 105 110
Thr Gly Ala Gln Ser Pro Leu Ile Gly Gln Phe Ile Tyr Thr Met Ala
115 120 125
Leu Leu Phe Met Leu Ser Val Asn Ala His His Leu Leu Leu Asp Gly
130 135 140
Ile Tyr Tyr Ser Phe Gln Tyr Ile Ser Val Asp Gln Ala Phe Pro Asn
145 150 155 160
Phe Gly Asp Glu Lys Phe Ala Tyr Phe Ile Ala Lys Ser Phe Asn Ala
165 170 175
Met Phe Ile Ile Ala Phe Gln Met Ser Ala Pro Val Val Ala Ser Leu
180 185 190
Phe Leu Val Asp Leu Ala Leu Gly Ile Val Ala Arg Thr Val Pro Gln
195 200 205
Leu Asn Val Phe Val Val Gly Leu Pro Leu Lys Ile Ala Val Ser Phe
210 215 220
Ile Met Leu Ile Val Cys Met Ser Val Ile Phe Val Val Val Arg Asn
225 230 235 240
Val Phe Ser Leu Thr Ile Glu Thr Met Arg Asn Leu Leu Ala Leu Val
245 250 255
Gly Val Ser
<210> 49
<211> 378
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 49
Met Glu Asn Asn Arg Leu Ser Gln Asp Glu Ile Asp Ala Leu Leu Asn
1 5 10 15
Gly Thr Gly Ser Thr Leu Asp Glu Pro Glu Ile Pro Glu Val Asp Asp
20 25 30
Leu Ser Glu Met Glu Arg Asp Ala Ile Gly Glu Ile Gly Asn Ile Ser
35 40 45
Phe Gly Ser Ser Ala Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Asn Gln Lys Val
50 55 60
Asp Ile Thr Thr Pro Ser Val Thr Val Ile Pro Arg Ser Lys Ile Ser
65 70 75 80
Asp Ala Phe Pro Glu Pro Tyr Val Ala Ile Glu Val Asn Tyr Thr Glu
85 90 95
Gly Phe Ser Gly Ser Asn Leu Leu Val Val Glu Gln Ser Asp Ala Ala
100 105 110
Ile Ile Ala Asp Leu Met Ile Gly Gly Asp Gly Lys Gly Ala Asp Pro
115 120 125
Ser Leu Gly Glu Ile His Leu Ser Ala Val Gln Glu Ala Met Asn Gln
130 135 140
Met Met Gly Ser Ala Ala Thr Ser Met Ser Thr Val Phe Ser Lys Lys
145 150 155 160
Ile Asp Ile Ser Pro Pro Arg Val Glu Leu Leu Asp Val Thr Glu Glu
165 170 175
Lys Gly Thr Asp Arg Ile Pro Asp Asp Glu Met Leu Val Lys Val Ser
180 185 190
Phe Asn Leu Lys Val Gly Glu Leu Ile Asp Ser Ser Ile Met Gln Leu
195 200 205
Tyr Pro Leu Thr Phe Ala Lys Asp Leu Ile Ser Ser Leu Met Asn Ser
210 215 220
Glu Ser Ala Glu Glu Glu Glu Thr Val Gln Pro Glu Val Thr Tyr Glu
225 230 235 240
Gln Pro Lys Glu Pro Val Thr Pro Glu Pro Arg Ile Glu Pro Lys Gln
245 250 255
Gln Gln Gln Pro Pro Lys Arg Gln Gly Thr Ala Lys Lys Ala Ala Pro
260 265 270
Val Gln Val Ser Pro Val Glu Phe Ser Ala Phe Asp Pro Asn Glu Ala
275 280 285
Val Gln Ala Pro Ile His Asn Leu Asp Met Leu Leu Asp Ile Pro Leu
290 295 300
Ser Ile Thr Val Glu Leu Gly Arg Thr Lys Arg Ser Val Lys Glu Ile
305 310 315 320
Leu Glu Leu Ser Ala Gly Ser Ile Ile Glu Leu Asp Lys Leu Ala Gly
325 330 335
Glu Pro Val Asp Ile Leu Val Asn Gln Arg Ile Val Ala Lys Gly Glu
340 345 350
Val Val Val Ile Glu Glu Asn Phe Gly Val Arg Val Thr Asp Ile Leu
355 360 365
Ser Gln Ala Glu Arg Ile Asn Asn Leu Lys
370 375
<210> 50
<211> 219
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 50
Met Lys Lys Ser Gln Tyr Phe Ile Val Phe Ile Cys Phe Phe Val Leu
1 5 10 15
Phe Ser Val His Pro Ile Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ser Asp Asn Ser
20 25 30
Thr Val Asn Glu Trp Phe Gln Lys Lys Asp Glu Lys Thr Ala Asp Gln
35 40 45
Ser Glu Gln Lys Lys Glu Lys Thr Thr Lys Thr Ala Asp Glu Thr Glu
50 55 60
Gly Ala Ala Ala Pro Ser Val Ser Ala Phe Asp Phe Val Lys Met Ile
65 70 75 80
Phe Ala Leu Leu Phe Val Ile Val Leu Ile Tyr Gly Leu Val Lys Leu
85 90 95
Met Asn Lys Arg Asn Arg Leu Leu Lys Pro Phe Gln Tyr Val Glu Asn
100 105 110
Ile Gly Gly Thr Ser Val Gly Gln Asn Arg Ser Ile Gln Leu Ile Lys
115 120 125
Val Gly Lys Ser Val Leu Val Val Gly Val Gly Glu Thr Ile Gln Leu
130 135 140
Leu Lys Glu Ile Glu Asp Glu Lys Glu Ile Glu Val Ile Leu Ser Gln
145 150 155 160
His Glu Glu Ala Met Ser Ser Lys Ile Glu Trp Gln Lys Phe Val Lys
165 170 175
Pro Leu Lys Ser Ser Glu His Gln Pro Gln Gln Lys Leu Pro Ser Phe
180 185 190
Ser Lys Ala Leu Lys Glu Gln Leu Glu Glu Leu Lys Gln Asn Arg Ser
195 200 205
Glu Gly Lys Lys Lys Gly Pro Arg His His Glu
210 215
<210> 51
<211> 304
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 51
Met Arg Ile Asn His Asn Ile Ala Ala Leu Asn Thr Leu Asn Arg Leu
1 5 10 15
Ser Ser Asn Asn Ser Ala Ser Gln Lys Asn Met Glu Lys Leu Ser Ser
20 25 30
Gly Leu Arg Ile Asn Arg Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile
35 40 45
Ser Glu Lys Met Arg Gly Gln Ile Arg Gly Leu Glu Met Ala Ser Lys
50 55 60
Asn Ser Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu
65 70 75 80
Thr Glu Thr His Ala Ile Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Val Val Gln
85 90 95
Ala Gly Asn Thr Gly Thr Gln Asp Lys Ala Thr Asp Leu Gln Ser Ile
100 105 110
Gln Asp Glu Ile Ser Ala Leu Thr Asp Glu Ile Asp Gly Ile Ser Asn
115 120 125
Arg Thr Glu Phe Asn Gly Lys Lys Leu Leu Asp Gly Thr Tyr Lys Val
130 135 140
Asp Thr Ala Thr Pro Ala Asn Gln Lys Asn Leu Val Phe Gln Ile Gly
145 150 155 160
Ala Asn Ala Thr Gln Gln Ile Ser Val Asn Ile Glu Asp Met Gly Ala
165 170 175
Asp Ala Leu Gly Ile Lys Glu Ala Asp Gly Ser Ile Ala Ala Leu His
180 185 190
Ser Val Asn Asp Leu Asp Val Thr Lys Phe Ala Asp Asn Ala Ala Asp
195 200 205
Thr Ala Asp Ile Gly Phe Asp Ala Gln Leu Lys Val Val Asp Glu Ala
210 215 220
Ile Asn Gln Val Ser Ser Gln Arg Ala Lys Leu Gly Ala Val Gln Asn
225 230 235 240
Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Ser Ala Ser Gly Glu Asn Leu
245 250 255
Thr Ala Ala Glu Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala Lys Glu Met
260 265 270
Ser Glu Phe Thr Lys Asn Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ser Gln Ala Met
275 280 285
Leu Ala Gln Ala Asn Gln Gln Pro Gln Asn Val Leu Gln Leu Leu Arg
290 295 300
<210> 52
<211> 270
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 52
Met Asp Lys Thr Ser Leu Ile Gly Ile Ile Leu Ala Phe Val Ala Leu
1 5 10 15
Ser Val Gly Met Val Leu Lys Gly Val Ser Phe Ser Ala Leu Ala Asn
20 25 30
Pro Ala Ala Ile Leu Ile Ile Ile Ala Gly Thr Ile Ser Ala Val Val
35 40 45
Ile Ala Phe Pro Thr Lys Glu Ile Lys Lys Val Pro Thr Leu Phe Arg
50 55 60
Val Leu Phe Lys Glu Asn Lys Gln Leu Thr Ile Glu Glu Leu Ile Pro
65 70 75 80
Met Phe Ser Glu Trp Ala Gln Leu Ala Arg Arg Glu Gly Leu Leu Ala
85 90 95
Leu Glu Ala Ser Ile Glu Asp Val Asp Asp Ala Phe Leu Lys Asn Gly
100 105 110
Leu Ser Met Ala Val Asp Gly Gln Ser Ala Glu Phe Ile Arg Asp Ile
115 120 125
Met Thr Glu Glu Val Glu Ala Met Glu Asp Arg His Gln Ala Gly Ala
130 135 140
Ala Ile Phe Thr Gln Ala Gly Thr Tyr Ala Pro Thr Leu Gly Val Leu
145 150 155 160
Gly Ala Val Ile Gly Leu Ile Ala Ala Leu Ser His Met Asp Asn Thr
165 170 175
Asp Glu Leu Gly His Ala Ile Ser Ala Ala Phe Val Ala Thr Leu Leu
180 185 190
Gly Ile Phe Thr Gly Tyr Val Leu Trp His Pro Phe Ala Asn Lys Leu
195 200 205
Lys Arg Lys Ser Lys Gln Glu Val Lys Leu Arg Glu Val Met Ile Glu
210 215 220
Gly Val Leu Ser Val Leu Glu Gly Gln Ala Pro Lys Val Ile Glu Gln
225 230 235 240
Lys Leu Leu Met Tyr Leu Pro Ala Lys Asp Arg Leu Lys Phe Ala Glu
245 250 255
Gln Gly Glu Ala Gln Asn Gly Glu Lys Lys Glu Glu Glu Ala
260 265 270
<210> 53
<211> 261
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 53
Met Ala Arg Lys Lys Lys Lys Lys His Glu Asp Glu His Val Asp Glu
1 5 10 15
Ser Trp Leu Val Pro Tyr Ala Asp Ile Leu Thr Leu Leu Leu Ala Leu
20 25 30
Phe Ile Val Leu Tyr Ala Ser Ser Ser Ile Asp Ala Ala Lys Phe Gln
35 40 45
Met Leu Ser Lys Ser Phe Asn Glu Val Phe Thr Gly Gly Thr Gly Val
50 55 60
Leu Asp Tyr Ser Ser Val Thr Pro Pro Glu Asn Glu Ser Asp Gly Ile
65 70 75 80
Asp Glu Val Lys Lys Glu Lys Glu Glu Lys Glu Lys Asn Lys Lys Glu
85 90 95
Lys Glu Lys Ala Ala Asp Gln Glu Glu Leu Glu Asn Val Lys Ser Gln
100 105 110
Val Glu Lys Phe Ile Lys Asp Lys Lys Leu Glu His Gln Leu Glu Thr
115 120 125
Lys Met Thr Ser Glu Gly Leu Leu Ile Thr Ile Lys Asp Ser Ile Phe
130 135 140
Phe Asp Ser Gly Lys Ala Thr Ile Arg Lys Glu Asp Val Pro Leu Ala
145 150 155 160
Lys Glu Ile Ser Asn Leu Leu Val Ile Asn Pro Pro Arg Asn Ile Ile
165 170 175
Ile Ser Gly His Thr Asp Asn Met Pro Ile Lys Asn Ser Glu Phe Gln
180 185 190
Ser Asn Trp His Leu Ser Val Met Arg Ala Val Asn Phe Met Gly Leu
195 200 205
Leu Ile Glu Asn Pro Lys Leu Asp Ala Lys Val Phe Ser Ala Lys Gly
210 215 220
Tyr Gly Glu Tyr Lys Pro Val Ala Ser Asn Lys Thr Ala Glu Gly Arg
225 230 235 240
Ser Lys Asn Arg Arg Val Glu Val Leu Ile Leu Pro Arg Gly Ala Ala
245 250 255
Glu Thr Asn Glu Lys
260
<210> 54
<211> 204
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 54
Met Ser Gly Lys Lys Lys Glu Ser Gly Lys Phe Arg Ser Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Ile Ile Leu Pro Leu Met Phe Leu Leu Ile Ala Gly Gly Ile Val
20 25 30
Leu Trp Ala Ala Gly Ile Asn Val Leu Lys Pro Ile Gln Asp Ala Ala
35 40 45
Ala Lys Thr Pro Val Leu Lys Glu Leu Val Pro Glu Thr Glu Asn Lys
50 55 60
Lys Gly Ala Ala Ser Ser Lys Asp Ser Ser Asn Thr Ala Ala Leu Glu
65 70 75 80
Lys Thr Ile Lys Asp Gln Lys Ser Glu Ile Ser Ile Leu Asn Lys Asp
85 90 95
Leu Glu Thr Ser Lys Ser Glu Ile Asp Arg Leu Asn Gln Lys Ile Arg
100 105 110
Ser Leu Glu Lys Thr Ala Glu Asp Gln Lys Lys Ser Ser Glu Asp His
115 120 125
Thr Glu Gly Ser Ala Asp Ser Lys Ala Ser Ser Glu Asn Asp Lys Val
130 135 140
Ile Ser Val Tyr Lys Ser Met Asp Ser Gly Lys Ala Ala Lys Ile Ile
145 150 155 160
Ala Gln Leu Lys Glu Gln Glu Ala Leu Lys Ile Leu Asn Gly Leu Ser
165 170 175
Lys Lys Gln Leu Ala Asp Ile Leu Ala Lys Met Thr Pro Glu Gln Ala
180 185 190
Ala Thr Tyr Thr Glu Lys Ile Ala Ala Ser Gln Glu
195 200
<210> 55
<211> 71
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 55
Met Ile Lys Val Thr Arg Leu Asn Gly Gln Pro Phe Thr Leu Asn Ala
1 5 10 15
Leu Phe Ile Glu Gln Ile Glu Cys Phe Pro Asp Thr Thr Ile Thr Leu
20 25 30
Ser Asn Gly Lys Lys Phe Val Val Lys Glu Asp Glu Glu Ala Val Leu
35 40 45
Glu Lys Ile Ala Ala Phe Tyr Arg Lys Ile Gln Ile Phe Ala Met Asp
50 55 60
Gln Gly Ile Glu Glu Pro Glu
65 70
<210> 56
<211> 120
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 56
Met Ala His Arg Ile Leu Ile Val Asp Asp Ala Ala Phe Met Arg Met
1 5 10 15
Met Ile Lys Asp Ile Leu Val Lys Asn Gly Phe Glu Val Val Ala Glu
20 25 30
Ala Glu Asn Gly Ala Gln Ala Val Glu Lys Tyr Lys Glu His Ser Pro
35 40 45
Asp Leu Val Thr Met Asp Ile Thr Met Pro Glu Met Asp Gly Ile Thr
50 55 60
Ala Leu Lys Glu Ile Lys Gln Ile Asp Ala Gln Ala Arg Ile Ile Met
65 70 75 80
Cys Ser Ala Met Gly Gln Gln Ser Met Val Ile Asp Ala Ile Gln Ala
85 90 95
Gly Ala Lys Asp Phe Ile Val Lys Pro Phe Gln Ala Asp Arg Val Leu
100 105 110
Glu Ala Ile Asn Lys Thr Leu Asn
115 120
<210> 57
<211> 357
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 57
Met Ile Arg Val Leu Val Val Asp Asp Ser Ala Phe Met Arg Lys Met
1 5 10 15
Ile Ser Asp Phe Leu Thr Glu Glu Lys Gln Ile Glu Val Ile Gly Thr
20 25 30
Ala Arg Asn Gly Glu Glu Ala Leu Lys Lys Ile Glu Leu Leu Lys Pro
35 40 45
Asp Val Ile Thr Leu Asp Val Glu Met Pro Val Met Asn Gly Thr Asp
50 55 60
Thr Leu Arg Lys Ile Ile Glu Ile Tyr Asn Leu Pro Val Ile Met Val
65 70 75 80
Ser Ser Gln Thr Glu Lys Gly Lys Glu Cys Thr Ile Asn Cys Leu Glu
85 90 95
Ile Gly Ala Phe Asp Phe Ile Thr Lys Pro Ser Gly Ser Ile Ser Leu
100 105 110
Asp Leu Tyr Lys Ile Lys Glu Gln Leu Val Glu Arg Val Val Ala Ala
115 120 125
Gly Leu Ser Gly Lys Arg Lys Arg Pro Val Ser Gln Thr Val Arg Pro
130 135 140
Glu Pro Ile Val Arg Ala Val Val Lys Pro Glu Leu Ser Lys Pro Lys
145 150 155 160
Pro Gly Thr Gly Arg Gln Ile Val Cys Ile Gly Thr Ser Thr Gly Gly
165 170 175
Pro Arg Ala Leu Gln Lys Val Ile Pro Lys Leu Pro Lys Asp Leu Asn
180 185 190
Ala Pro Val Val Val Val Gln His Met Pro Glu Gly Phe Thr Ala Ser
195 200 205
Leu Ala Asp Arg Leu Asn His Leu Ser Asp Ile Gln Val Lys Glu Ala
210 215 220
Lys Asp Gly Glu Ala Ala Leu Asn Gly Cys Val Tyr Ile Ala Pro Gly
225 230 235 240
Gly Lys Asn Ile Ser Val Ile Lys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Val Val
245 250 255
Leu Asp Asn His Asp Thr Pro Ser Arg His Lys Pro Ser Ala Asp Tyr
260 265 270
Leu Phe Arg Ser Val Gly Lys Leu Thr Asp Tyr Glu Lys Val Ala Val
275 280 285
Ile Met Thr Gly Met Gly Ser Asp Gly Thr Ala Gly Leu Lys Asp Met
290 295 300
Leu Thr Ala Gly Asn Val Lys Ala Ile Ala Glu Ser Glu Glu Ser Cys
305 310 315 320
Val Val Tyr Gly Met Pro Lys Ala Ala Val Lys Ala Gly Leu Ile His
325 330 335
Glu Ile Lys His Val Glu Asp Ile Ala Ala Ser Ile Thr Ser Cys Val
340 345 350
Lys Lys Glu Arg Val
355
<210> 58
<211> 672
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 58
Met Asp Met Asn Gln Tyr Leu Asp Val Phe Ile Asp Glu Ser Lys Glu
1 5 10 15
His Leu Gln Thr Cys Asn Glu Lys Leu Leu Leu Leu Glu Lys Asp Pro
20 25 30
Thr Asp Leu Gln Leu Val His Asp Ile Phe Arg Ala Ala His Thr Leu
35 40 45
Lys Gly Met Ser Ala Thr Met Gly Tyr Thr Asp Leu Ala His Leu Thr
50 55 60
His Leu Leu Glu Asn Val Leu Asp Ala Ile Arg Asn Gly Asp Met Glu
65 70 75 80
Val Thr Ser Asp Trp Leu Asp Ile Leu Phe Glu Ala Leu Asp His Leu
85 90 95
Glu Thr Met Val Gln Ser Ile Ile Asp Gly Gly Asp Gly Lys Arg Asp
100 105 110
Ile Ser Glu Val Ser Ala Lys Leu Asp Val Asn Gly Ala His Ala Glu
115 120 125
Ser Ala Ala Ser Ala Glu Pro Ala Glu Ala Gln Ser Ser Ala Ser Asp
130 135 140
Trp Glu Tyr Asp Glu Phe Glu Arg Thr Val Ile Gln Glu Ala Glu Glu
145 150 155 160
Gln Gly Phe Lys Arg Tyr Glu Ile Lys Ile Ser Leu Asn Glu Asn Cys
165 170 175
Met Leu Lys Ala Val Arg Val Tyr Met Val Phe Glu Lys Leu Asn Glu
180 185 190
Val Gly Glu Val Ala Lys Thr Ile Pro Ser Ala Glu Val Leu Glu Thr
195 200 205
Glu Asp Phe Gly Thr Asp Phe Gln Val Cys Phe Leu Thr His Gln Ser
210 215 220
Ala Glu Asp Ile Glu Gln Leu Ile Asn Gly Val Ser Glu Ile Glu His
225 230 235 240
Val Glu Val Ile Gln Gly Ala Pro Leu Thr Ser Ala Glu Lys Pro Glu
245 250 255
Glu Ser Lys Gln Glu Asp Ser Pro Ala Ala Ala Val Pro Ala Lys Gln
260 265 270
Glu Lys Gln Lys Gln Pro Ala Lys Asn Asp Glu Gln Ala Lys His Ser
275 280 285
Ala Gly Gly Ser Lys Thr Ile Arg Val Asn Ile Asp Arg Leu Asp Ser
290 295 300
Leu Met Asn Leu Phe Glu Glu Leu Val Ile Asp Arg Gly Arg Leu Glu
305 310 315 320
Gln Ile Ala Lys Glu Leu Glu His Asn Glu Leu Thr Glu Thr Val Glu
325 330 335
Arg Met Thr Arg Ile Ser Gly Asp Leu Gln Ser Ile Ile Leu Asn Met
340 345 350
Arg Met Val Pro Val Glu Thr Val Phe Asn Arg Phe Pro Arg Met Ile
355 360 365
Arg Gln Leu Gln Lys Glu Leu Asn Lys Lys Ile Glu Leu Ser Ile Ile
370 375 380
Gly Ala Glu Thr Glu Leu Asp Arg Thr Val Ile Asp Glu Ile Gly Asp
385 390 395 400
Pro Leu Val His Leu Ile Arg Asn Ser Ile Asp His Gly Ile Glu Ala
405 410 415
Pro Glu Thr Arg Leu Gln Lys Gly Lys Pro Glu Ser Gly Lys Val Val
420 425 430
Leu Lys Ala Tyr His Ser Gly Asn His Val Phe Ile Glu Val Glu Asp
435 440 445
Asp Gly Ala Gly Leu Asn Arg Lys Lys Ile Leu Glu Lys Ala Leu Glu
450 455 460
Arg Gly Val Ile Thr Glu Lys Glu Ala Glu Thr Leu Glu Asp Asn Gln
465 470 475 480
Ile Tyr Glu Leu Ile Phe Ala Pro Gly Phe Ser Thr Ala Asp Gln Ile
485 490 495
Ser Asp Ile Ser Gly Arg Gly Val Gly Leu Asp Val Val Lys Asn Lys
500 505 510
Leu Glu Ser Leu Gly Gly Ser Val Ser Val Lys Ser Ala Glu Gly Gln
515 520 525
Gly Ser Leu Phe Ser Ile Gln Leu Pro Leu Thr Leu Ser Ile Ile Ser
530 535 540
Val Leu Leu Ile Lys Leu Glu Glu Glu Thr Phe Ala Ile Pro Ile Ser
545 550 555 560
Ser Ile Ile Glu Thr Ala Val Ile Asp Arg Lys Asp Ile Leu Gln Thr
565 570 575
His Asp Arg Glu Val Ile Asp Phe Arg Gly His Ile Val Pro Val Val
580 585 590
Tyr Leu Lys Glu Glu Phe Lys Ile Glu Asp Thr Arg Lys Asp Ala Glu
595 600 605
Gln Leu His Ile Ile Val Val Lys Lys Gly Asp Lys Pro Thr Ala Phe
610 615 620
Val Val Asp Ser Phe Ile Gly Gln Gln Glu Val Val Leu Lys Ser Leu
625 630 635 640
Gly Asp Tyr Leu Thr Asn Val Phe Ala Ile Ser Gly Ala Thr Ile Leu
645 650 655
Gly Asp Gly Glu Val Ala Leu Ile Ile Asp Cys Asn Ala Leu Ile Ile
660 665 670
<210> 59
<211> 156
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 59
Met Thr Ala Glu Ile Lys Thr Gly Glu Lys Met Ile Val Phe Met Val
1 5 10 15
Asn Gly Lys Glu Tyr Ala Ile Ser Val Thr Gln Val Lys Ser Ile Glu
20 25 30
Lys Trp Gln Lys Pro Thr Arg Val Pro Gly Val Glu Pro Tyr Ile Cys
35 40 45
Gly Val Ile Asn Leu Arg Gly Val Val Thr Pro Val Ile Asp Leu Arg
50 55 60
Lys Arg Leu Asn Leu Pro Glu Tyr Glu Ile Thr Asp Glu Thr Arg Ile
65 70 75 80
Ile Ile Ile Ala Tyr Arg Asp Ile Glu Val Gly Trp Ile Val Asp Glu
85 90 95
Ala Asn Asp Val Ile Thr Val His Glu Ser Glu Ile Glu Ser Ala Pro
100 105 110
Glu Gly Val Gln Lys Asp Thr Asp Val Ser Ile Glu Gln Ile Val Lys
115 120 125
Gln Glu Asn Arg Leu Leu Asn Ile Ile Asp Ala Asn Ala Val Leu Asp
130 135 140
Lys Glu Ser Ser Gln Ser Ala Val Pro Asp Gln Ala
145 150 155
<210> 60
<211> 209
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 60
Met Ser Ile Phe Asn Gly Ile Lys Glu Glu Gln Met Asp Ile Leu Arg
1 5 10 15
Glu Val Gly Asn Ile Gly Ala Gly His Ser Ala Ser Ala Met Ala Gln
20 25 30
Leu Leu Asn Arg Lys Ile Asp Met Glu Val Pro Phe Ala Lys Leu Leu
35 40 45
Ser Phe Asp Glu Leu Val Asp Phe Phe Gly Gly Ala Asp Val Pro Val
50 55 60
Ala Ser Ile Phe Leu Arg Met Glu Gly Asp Leu Thr Gly Ser Met Phe
65 70 75 80
Phe Ile Met Pro Phe Phe Gln Ala Glu Gln Phe Ile Arg Glu Leu Ile
85 90 95
Gly Asn Pro Asp Phe Asp Ile Glu Asp Leu Gly Glu Asp His Met Ser
100 105 110
Ser Ser Ala Leu His Glu Leu Gly Asn Ile Leu Ala Gly Ser Tyr Leu
115 120 125
Thr Ala Leu Ala Asp Leu Thr Lys Leu Gln Leu Tyr Pro Ser Val Pro
130 135 140
Glu Val Ser Leu Asp Met Phe Gly Ala Val Ile Ser Glu Gly Leu Met
145 150 155 160
Glu Leu Ser Gln Val Gly Glu His Ala Ile Val Val Asp Thr Ser Ile
165 170 175
Phe Asp Gln Ser His Gln Gln Glu Leu Lys Ala His Met Phe Met Leu
180 185 190
Pro Asp Tyr Asp Ser Phe Glu Lys Leu Phe Val Ala Leu Gly Ala Ser
195 200 205
Leu
<210> 61
<211> 166
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 61
Met Ser Thr Thr Glu Ala Val Val Ile Lys Val Gly Ile Ala Asp Val
1 5 10 15
Lys Ile Ala Arg Phe Pro Asp Thr Ile Arg Thr Ser Gly Leu Gly Ser
20 25 30
Cys Val Gly Leu Val Leu Tyr Asp Lys Glu Lys Gln Thr Ala Gly Leu
35 40 45
Val His Val Met Leu Pro Asp Ser Thr Leu Ser Lys Thr Ala Glu Leu
50 55 60
Asn Arg Ala Lys Tyr Ala Asp Thr Ala Val Gln Thr Thr Ile Asp Met
65 70 75 80
Leu Ile Glu Ala Gly Cys Arg Lys Phe Ala Leu Lys Ala Lys Leu Ala
85 90 95
Gly Gly Ser Glu Met Phe Lys Phe Lys Ser Thr Asn Asp Leu Met Lys
100 105 110
Ile Gly Pro Arg Asn Val Leu Ala Ile Lys Glu Gln Leu Ser Leu Phe
115 120 125
Asn Ile Pro Ile Ile Ser Glu Asp Thr Gly Gly Ser Ser Gly Arg Thr
130 135 140
Ile Glu Phe Glu Pro Lys Ser Cys Met Leu His Ile Arg Thr Val Lys
145 150 155 160
Gln Gly Glu Lys Thr Ile
165
<210> 62
<211> 254
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 62
Met Gln Ser Leu Asn Tyr Glu Asp Gln Val Leu Trp Thr Arg Trp Lys
1 5 10 15
Glu Trp Lys Asp Pro Lys Ala Gly Asp Asp Leu Met Arg Arg Tyr Met
20 25 30
Pro Leu Val Thr Tyr His Val Gly Arg Ile Ser Val Gly Leu Pro Lys
35 40 45
Ser Val His Lys Asp Asp Leu Met Ser Leu Gly Met Leu Gly Leu Tyr
50 55 60
Asp Ala Leu Glu Lys Phe Asp Pro Ser Arg Asp Leu Lys Phe Asp Thr
65 70 75 80
Tyr Ala Ser Phe Arg Ile Arg Gly Ala Ile Ile Asp Gly Leu Arg Lys
85 90 95
Glu Asp Trp Leu Pro Arg Thr Ser Arg Glu Lys Thr Lys Lys Val Glu
100 105 110
Ala Ala Ile Glu Lys Leu Glu Gln Arg Tyr Leu Arg Asn Val Ser Pro
115 120 125
Ala Glu Ile Ala Glu Glu Leu Gly Met Thr Val Gln Asp Val Val Ser
130 135 140
Thr Met Asn Glu Gly Phe Phe Ala Asn Leu Leu Ser Ile Asp Glu Lys
145 150 155 160
Leu His Asp Gln Asp Asp Gly Glu Asn Ile Gln Val Met Ile Arg Asp
165 170 175
Asp Lys Asn Val Pro Pro Glu Glu Lys Ile Met Lys Asp Glu Leu Ile
180 185 190
Ala Gln Leu Ala Glu Lys Ile His Glu Leu Ser Glu Lys Glu Gln Leu
195 200 205
Val Val Ser Leu Phe Tyr Lys Glu Glu Leu Thr Leu Thr Glu Ile Gly
210 215 220
Gln Val Leu Asn Leu Ser Thr Ser Arg Ile Ser Gln Ile His Ser Lys
225 230 235 240
Ala Leu Phe Lys Leu Lys Asn Leu Leu Glu Lys Val Ile Gln
245 250
<210> 63
<211> 167
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 63
Met Ser Thr Leu Leu Trp Leu Leu Ser Phe Met Leu His Gly Val Leu
1 5 10 15
Leu Tyr Ala Val Ile Ile Leu Tyr Thr Arg Leu Ala Ala Val Lys Glu
20 25 30
Thr Glu Lys Gln Gln Lys Gln Ile Leu Glu Glu Thr Glu Asn Thr Leu
35 40 45
Ala Ala Phe Leu Leu Glu Leu Lys Glu Glu Asn Glu Lys Leu Ile Glu
50 55 60
Asn Lys Ala Ser Ser Ala Ser Gln Ser Asp Glu Glu Ser Gln Lys Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Thr Ser Glu Thr Tyr Gln Glu Arg Asp Pro Val Gln Glu
85 90 95
Ala Glu Asn Leu Pro Glu His Ile Glu Gly Leu Ile Thr Glu Val Asp
100 105 110
Arg Arg Glu Glu Leu Val Asn Ser Glu Val Gln Ser Phe Glu Asp Gln
115 120 125
Val Ile Glu Leu Tyr Glu Gln Gly Tyr Ser Ala Ser Gln Ile Ala Gln
130 135 140
Lys Met Lys Ser Gly Lys Thr Glu Ile Glu Leu Phe Leu Lys Phe Arg
145 150 155 160
Ser Lys Gly Val Lys Asp Ser
165
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oTK0558
<400> 64
gagtgccaat gattctgctt ctgac 25
<210> 65
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oTK0578
<400> 65
atactgcaat cggatgcgat tattgaatat attcccccag atgtttttat 50
<210> 66
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oTK0579
<400> 66
gacctgcagg catgcaagct tagagtaatc gcttctccgc tgtttta 47
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oTK0561
<400> 67
ctatcgtcag ttcagatgtg ccga 24
<210> 68
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oTK0577
<400> 68
ataaaaacat ctgggggaat atattcaata atcgcatccg attgcagtat 50
<210> 69
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> oTK0580
<400> 69
taaaacagcg gagaagcgat tactctaagc ttgcatgcct gcaggtc 47
<210> 70
<211> 4055
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 70
gagtgccaat gattctgctt ctgacattaa tggagcactg aagtctgata aagagcaatc 60
aaatcaggaa aatgaagtat ccgagcctgc aaaagagctt atctatatcc agatgttcat 120
tagccagctc gtagaaggga ataagctgac tgatctcggg aatggcaatg aagctcatgc 180
catttaccaa aatggagatc aattcctttc tgcattagaa aagaagggtg tatctcaaca 240
actaattcag gatcttaaac agcaaatatt cactaaagct gagtcaagtt caaaacttta 300
ctcgatgaca gcgtcagagc tgaaaagttt tcaaagctta atggatcaaa tgtctatgct 360
tcctcaaaaa gggaccaaag aatggagttt agctgaaagc cagctgaaag ccttcttgtt 420
atcgaaatca tccgaatcat cacaagactt tgggaagagt gttctcacac cgctctcgca 480
gagttcatcc agcaaaaatg catcggatgt ttctggaagt attcagcctg tagatagtaa 540
atcaggactc caaatgctgt tttcggggta tcggggcata ggaggagttc aaacacttga 600
tctgcagcag atgtcatctg atataccaaa tgccgaaaca aaaacggtgg ctgatcaagt 660
gattaatgcg tggaagcaga tgaaatatac gcctttcggc agatcgacgg gaagtttcac 720
tattcggctg aaccctgaac atttaggatt tgtcacaatc aagctgacaa atgaaaatgg 780
aatgtttcag agtaaaatca tagcatctag ccaatcagca aaagaattgc ttgaacagca 840
tcttcctcag ctgaagcaat cattgccgaa tatggccgtc caaattgacc gttttactct 900
tccggtccaa agcggggatc agccgatata cggccagctt gctgatgaac agaaacagca 960
gcaagagggg cagagacagc aaagacagaa aaagcaatca aatgattttg gcgatctgct 1020
cgatgaagtg tcgatggttg aaatggagga agaagaatga cttctataag ttcagaatat 1080
aaactgcctg aaaaaacgaa cactgtgtcg acgaacaaca gcagcttggg gaaagacgag 1140
tttttaaaaa tattaatgac tcaagttcaa aaccaagatc cgcttaaccc gattgacgat 1200
aaagaattta tcagccagat ggcgactttt tcaagcttgg agcaaatgat gaatctgaat 1260
acgacaatga ctcaattcgt tgaaaaccaa gatccgttta caacgtatgt tgattggatg 1320
ggaaaagaag tatcttggac tgatggtaaa agtgcaacag ataaaacagg cacagtaagc 1380
tctgttaaac attttaaagg aaattattat ctcgttcttg atgatgggac cgagatcagt 1440
cctgcgaatg tcatgtctgt gggacaatca tctaaataaa aacatctggg ggaatatatt 1500
caataatcgc atccgattgc agtataaatt taacgatcac tcatcatgtt catatttatc 1560
agagctcgtg ctataattat actaatttta taaggaggaa aaaatatggg catttttagt 1620
atttttgtaa tcagcacagt tcattatcaa ccaaacaaaa aataagtggt tataatgaat 1680
cgttaataag caaaattcat ataaccaaat taaagagggt tataatgaac gagaaaaata 1740
taaaacacag tcaaaacttt attacttcaa aacataatat agataaaata atgacaaata 1800
taagattaaa tgaacatgat aatatctttg aaatcggctc aggaaaaggc cattttaccc 1860
ttgaattagt aaagaggtgt aatttcgtaa ctgccattga aatagaccat aaattatgca 1920
aaactacaga aaataaactt gttgatcacg ataatttcca agttttaaac aaggatatat 1980
tgcagtttaa atttcctaaa aaccaatcct ataaaatata tggtaatata ccttataaca 2040
taagtacgga tataatacgc aaaattgttt ttgatagtat agctaatgag atttatttaa 2100
tcgtggaata cgggtttgct aaaagattat taaatacaaa acgctcattg gcattacttt 2160
taatggcaga agttgatatt tctatattaa gtatggttcc aagagaatat tttcatccta 2220
aacctaaagt gaatagctca cttatcagat taagtagaaa aaaatcaaga atatcacaca 2280
aagataaaca aaagtataat tatttcgtta tgaaatgggt taacaaagaa tacaagaaaa 2340
tatttacaaa aaatcaattt aacaattcct taaaacatgc aggaattgac gatttaaaca 2400
atattagctt tgaacaattc ttatctcttt tcaatagcta taaattattt aataagtaag 2460
ttaagggatg cataaactgc atcccttaac ttgtttttcg tgtgcctatt ttttgtgaat 2520
cgacctgcag gcatgcaagc ttagagtaat cgcttctccg ctgttttatg attaaagtaa 2580
cccgtttgaa cgggcagccc tttacactga atgcgctatt tattgaacag attgaatgtt 2640
ttccggatac tacaattact ctgtcaaatg gtaagaagtt tgtagtaaaa gaagatgaag 2700
aagctgttct ggaaaagatc gcagctttct accgaaaaat acaaatattt gcaatggatc 2760
aaggaataga ggaaccggaa tgaagaaaaa gttaatgatc atattactaa ttattcttat 2820
cgtaattggt gctctcgggg cggcggctta ttttgtttta ggcggaaagt ccgaaaaaag 2880
tgaagcgaaa aaaagtattg atgaaatcgt tgcgtcttct gttgatgtag aagagatcac 2940
aacaaattta aagtctgata acattatccg tcttgctatt aaacttgaaa ctgattctga 3000
taaatcaaaa gaagaacttg agaaacgtga tttccaagtg aaagacgctg ttatatcact 3060
gctggctgat acgaatgctg atcagattga gggagacaag ggaaaagaaa cctttaagaa 3120
ggaactaaaa gataaaataa atagctacct ccaagaagga aaagtagaaa aagtgtatat 3180
tacctccttt aatctgcaat aaagcataat ttgacagaat acggaggtga ggaaaatgtc 3240
aggagaagtt ctctcccaaa atgaaataga tgcactgctc tctgcaatat caactggtga 3300
aatggacgct gaagagctga aaaaagaaga aaaagagaag aaagtcaagg tttatgattt 3360
caaacgtgcg ctgcggtttt ctaaggatca gatccgcagt ttaacgagaa ttcatgacaa 3420
ttttgcaaga cttcttacca ctcatttttc tgctcagctc agaacctata ttcacatatc 3480
tgtcagttct gttgatcagg ttccgtatga ggaatttatc agatcgattc caaacatgac 3540
gattctgaat ctatttgatg ttcatccgat ggaaggaaga attatgatgg aggtcaaccc 3600
cacgatagct tatacgatga tggatcgagt catgggcggg attggaatca gtcataacaa 3660
ggttgacagt ttgacagaaa ttgaaacaaa aatcatttct aatttatttg aaaatgcact 3720
gggtaattat aaagaagctt ggcagtcaat tgctgatatt gaaccggaaa tgactgagtt 3780
tgaagtgaat ccgcaatttg ttcagatggt atctcctaat gaaacagtcg tggtgatctc 3840
gctcaatact caaattggtg aaatcagcgg tgtcattaat ctctgtatcc cgcatattgt 3900
actcgagccg ctcataccga agctttcagt ccactattgg atgcaatcag accgaaatga 3960
gccaaagcct gaggaaacaa agtcgcttga aaaacgtatc atgacagcac aaatacctgt 4020
cgtggccgag ctcggcacat ctgaactgac gatag 4055
<210> 71
<211> 217
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 71
Met Ile Glu Ile Gly Glu Asn Val Leu Leu Glu Tyr Ile Glu Glu Asn
1 5 10 15
Glu Leu Lys Lys Ala Lys Ser Lys Ala Val Ser Ile Glu Asn Asn Glu
20 25 30
Leu Leu Ile Ala Tyr Pro Val Asp Val Val Thr Gly Arg Thr Val Ile
35 40 45
Leu His Asn Asp Met Glu Val Thr Val Glu Phe Val Gly Lys Asp Glu
50 55 60
Val Pro Tyr Arg Phe Ile Ser Arg Ile Lys Gly Lys Val Lys Asp Lys
65 70 75 80
Leu Gln Met Ile Cys Leu Glu Met Pro Pro Arg Glu Lys Met Lys Arg
85 90 95
Ile Gln Arg Arg Gln Tyr Val Arg Thr Asp Ala Val Leu Asp Val Gln
100 105 110
Ile Gln Pro Gly Asn Glu Glu Glu Ile Arg Thr Leu Ser Tyr Asn Ile
115 120 125
Ser Ala Gly Gly Ile Ala Val Val Leu Ala Asp Gly Leu Ser Phe Gln
130 135 140
Ser Gly Glu Ser Leu Arg Leu Ile Ile Arg Leu Pro Glu Glu Glu His
145 150 155 160
Thr Arg Gln Ile Glu Thr Glu Ala Val Val Arg Arg Ile Phe Asn Asp
165 170 175
Pro Lys Ser Glu Lys Arg Lys Met Thr Leu Glu Tyr Ser Glu Ile Ala
180 185 190
Ala Gly Asp Gln Gln Ala Leu Leu Gln Tyr Cys Ile Arg Arg Gln Leu
195 200 205
Asn Lys Arg Arg Lys Ala Arg Met Glu
210 215
<210> 72
<211> 382
<212> PRT
<213> 克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）
<400> 72
Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met
1 5 10 15
Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Glu Glu
20 25 30
Ala Lys Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser
35 40 45
Glu Phe Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser
50 55 60
Glu Glu Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile
65 70 75 80
Pro Val Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu
85 90 95
Leu Asp Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr
100 105 110
Met Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala
115 120 125
Ala His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu
130 135 140
Asp Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala
145 150 155 160
Ser Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly
165 170 175
Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val
180 185 190
Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly
195 200 205
Ala Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp
210 215 220
Ala Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro
225 230 235 240
Ser Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg
245 250 255
Gly Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile
260 265 270
Ser Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp
275 280 285
Gln Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp
290 295 300
Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly
325 330 335
Ala Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln
340 345 350
Ile Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn
355 360 365
Leu Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
370 375 380
<210> 73
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，纳豆激酶
<400> 73
Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu
1 5 10 15
Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Ala Gly Lys
20 25 30
Ser Ser Thr Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met Ser
35 40 45
Ala Met Ser Ser Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly Gly
50 55 60
Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asn Ala Ala Ala Ala Thr Leu
65 70 75 80
Asp Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala Tyr
85 90 95
Val Glu Glu Asp His Ile Ala His Glu Tyr Ala Gln Ser Val Pro Tyr
100 105 110
Gly Ile Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr Thr
115 120 125
Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser Ser
130 135 140
His Pro Asp Leu Asn Val Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Pro Ser Glu
145 150 155 160
Thr Asn Pro Tyr Gln Asp Gly Ser Ser His Gly Thr His Val Thr Gly
165 170 175
Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro
180 185 190
Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asp Ser Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ser Asn Asn
210 215 220
Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Thr Gly Ser Thr Ala
225 230 235 240
Leu Lys Thr Val Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Gly Ile Val Val Ala
245 250 255
Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Ser Ser Gly Ser Thr Ser Thr Val Gly
260 265 270
Tyr Pro Ala Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Ala Val Gly Ala Val Asn Ser
275 280 285
Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ser Glu Leu Asp Val
290 295 300
Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Gly Thr Tyr
305 310 315 320
Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
325 330 335
Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Thr Trp Thr Asn Ala Gln Val
340 345 350
Arg Asp Arg Leu Glu Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Asn Ser Phe Tyr
355 360 365
Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln
370 375 380
<210> 74
<211> 210
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，木聚糖酶
<400> 74
Met Phe Lys Phe Val Thr Lys Val Leu Thr Val Val Ile Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ile Ser Phe Cys Leu Ser Ala Val Pro Ala Ser Ala Asn Thr Tyr Trp
20 25 30
Gln Tyr Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val Asn Ala Thr Asn Gly Pro
35 40 45
Gly Gly Asn Tyr Ser Val Thr Trp Arg Asp Thr Gly Asn Phe Val Val
50 55 60
Gly Lys Gly Trp Glu Ile Gly Ser Pro Asn Arg Thr Ile His Tyr Asn
65 70 75 80
Ala Gly Val Trp Glu Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly
85 90 95
Trp Thr Arg Asn Gln Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Asn Trp Gly
100 105 110
Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr His Arg Gly Thr Val Val Ser Asp Gly
115 120 125
Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Met Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile
130 135 140
Asp Gly Thr Gln Thr Phe Gln Gln Phe Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys
145 150 155 160
Arg Pro Thr Gly Asn Asn Val Ser Ile Thr Phe Ser Asn His Val Asn
165 170 175
Ala Trp Arg Asn Ala Gly Met Asn Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln
180 185 190
Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Arg Ser Asn Val Thr
195 200 205
Val Trp
210
<210> 75
<211> 1065
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，黄原胶裂解酶
<400> 75
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Asp Glu Phe Asp
20 25 30
Thr Leu Arg Glu Lys Tyr Lys Ala Met Leu Asn Gly Gly Thr Thr Tyr
35 40 45
Asn Leu Ser Asp Pro Asp Ile Ala Ala Arg Val Asn Ala Ile Thr Val
50 55 60
Thr Ala Gln Gly Tyr Trp Asp Ser Met Leu Lys Asp Pro Asn Arg Asn
65 70 75 80
Arg Leu Trp Asn Asp Ala Pro Phe Gly Ser Asp Ser Thr Ser Ile Thr
85 90 95
Thr Thr Tyr Arg His Leu Tyr Asp Met Ala Leu Ala Tyr Thr Thr Tyr
100 105 110
Gly Ser Ser Leu Gln Gly Asn Ala Ala Leu Lys Ala Asp Ile Ile Ser
115 120 125
Gly Leu Asp Trp Met Asn Ala Asn Gln Phe Tyr Asn Gly Cys Ser Gln
130 135 140
Tyr Gln Asn Trp Trp His Trp Gln Ile Gly Gly Pro Met Ala Leu Asn
145 150 155 160
Asp Ile Val Ala Leu Met Tyr Thr Glu Leu Thr Ala Thr Gln Ile Ser
165 170 175
Asn Tyr Met Ala Ala Ile Tyr Tyr Thr Gln Ala Ser Val Thr Met Thr
180 185 190
Gly Ala Asn Arg Leu Trp Glu Ser Gln Val Ile Ala Ile Ser Gly Ile
195 200 205
Leu Asn Lys Asp Ser Ala Arg Val Ala Ala Gly Arg Asp Gly Ile Ser
210 215 220
Ala Leu Leu Pro Tyr Val Ala Lys Gly Asp Gly Phe Tyr Asn Asp Gly
225 230 235 240
Ser Phe Val Gln His Thr Tyr Tyr Ala Tyr Asn Gly Gly Tyr Gly Ser
245 250 255
Ser Leu Leu Ser Gly Ile Ala Asp Leu Ile Phe Ile Leu Asn Gly Ser
260 265 270
Ser Trp Gln Val Thr Asp Pro Asn Lys Asn Asn Val Tyr Arg Trp Ile
275 280 285
Tyr Asp Ser Tyr Glu Pro Phe Ile Tyr Lys Gly Asn Leu Met Asp Met
290 295 300
Val Arg Gly Arg Glu Ile Ser Arg His Gly Leu Gln Asp Asp Lys Ala
305 310 315 320
Ala Val Thr Val Met Ala Ser Ile Ile Arg Leu Ser Gln Thr Ala Ala
325 330 335
Ser Ala Asp Ala Thr Ala Phe Lys Arg Met Val Lys Tyr Trp Leu Leu
340 345 350
Leu Asp Thr Asp Lys Thr Phe Leu Lys Ala Val Ser Ile Asp Leu Ile
355 360 365
Ile Ala Ala Asn Gln Leu Val Asn Asp Ser Thr Val Thr Ser Arg Gly
370 375 380
Glu Leu Val Lys Tyr Lys Gln Phe Ser Gly Met Asp Arg Ala Val Gln
385 390 395 400
Leu Arg Pro Gly Phe Gly Phe Gly Leu Ser Met Phe Ser Ser Arg Ile
405 410 415
Gly Asn Tyr Glu Ser Ile Asn Ala Glu Asn Asn Lys Gly Trp His Thr
420 425 430
Gly Asp Gly Met Thr Tyr Leu Tyr Asn Thr Asp Leu Ser Gln Phe Asn
435 440 445
Asp His Phe Trp Ala Thr Val Asp Asn Tyr Arg Leu Pro Gly Thr Thr
450 455 460
Val Leu Gln Lys Thr Thr Gln Thr Ala Asn Ser Arg Ser Asp Lys Ser
465 470 475 480
Trp Ala Gly Gly Thr Asp Ile Leu Gly Gln Tyr Gly Val Ser Gly Met
485 490 495
Glu Leu His Thr Val Gly Lys Ser Leu Thr Ala Lys Lys Ser Trp Phe
500 505 510
Met Phe Asp Asp Glu Ile Val Ala Leu Gly Ser Gly Ile Ala Ser Thr
515 520 525
Asp Gly Ile Ala Thr Glu Thr Ile Val Glu Asn Arg Lys Leu Asn Ser
530 535 540
Ser Gly Asn Asn Ala Leu Ile Val Asn Gly Thr Ala Lys Pro Gly Ser
545 550 555 560
Leu Gly Trp Ser Glu Thr Met Thr Gly Thr Asn Tyr Ile His Leu Ala
565 570 575
Gly Ser Val Pro Gly Ser Asp Ile Gly Tyr Tyr Phe Pro Gly Gly Ala
580 585 590
Ala Val Lys Gly Leu Arg Glu Ala Arg Ser Gly Ser Trp Ser Ser Leu
595 600 605
Asn Lys Ser Ala Ser Trp Lys Asp Ser Thr Leu His Thr Arg Asn Phe
610 615 620
Met Thr Leu Trp Phe Asp His Gly Met Asn Pro Thr Asn Gly Ser Tyr
625 630 635 640
Ser Tyr Val Leu Leu Pro Asn Lys Thr Ser Ser Glu Val Ala Ser Tyr
645 650 655
Ala Ala Thr Pro Gln Ile Glu Ile Leu Glu Asn Ser Ser Ser Ala Gln
660 665 670
Ala Val Lys Glu Thr Gln Leu Asn Val Thr Gly Ile Asn Phe Trp Asn
675 680 685
Asp Glu Pro Thr Thr Val Gly Leu Val Thr Ser Asp Arg Lys Ala Ser
690 695 700
Val Met Thr Lys Glu Thr Ala Ser Asp Phe Glu Ile Ser Val Ser Asp
705 710 715 720
Pro Thr Gln Ser Asn Val Gly Thr Ile Tyr Ile Asp Val Asn Lys Ser
725 730 735
Ala Thr Gly Leu Ile Ser Lys Asp Asn Glu Ile Thr Val Ile Gln Tyr
740 745 750
Tyr Pro Thr Met Lys Phe Lys Val Asn Val Asn Asn Ser Leu Gly Lys
755 760 765
Ser Tyr Lys Val Lys Phe Ser Leu Thr Gly Thr Pro Glu Glu Asn Pro
770 775 780
Asp Pro Ile Pro Ile Pro Asn Pro Tyr Glu Ala Glu Asp Leu Pro Ile
785 790 795 800
Asn Ala Ala Thr Asp Thr Pro Val Val Tyr Asn Asp Ala Asn Ala Ser
805 810 815
Gly Gly Lys Lys Leu Gly Phe Asn Asn Asn Ala Val Gly Asp Tyr Val
820 825 830
Glu Phe Ser Leu Asp Val Thr Gln Pro Gly Thr Tyr Asp Val Lys Ser
835 840 845
Arg Ile Met Lys Ser Thr Asn Ser Gly Ile Tyr Gln Leu Ser Ile Asn
850 855 860
Gly Thr Asn Val Gly Ser Ala Gln Asp Met Phe Trp Thr Thr Ser Glu
865 870 875 880
Leu Ser Lys Glu Phe Thr Met Gly Ser Tyr Ser Phe Ser Thr Pro Gly
885 890 895
Ser Tyr Leu Phe Arg Leu Thr Thr Thr Gly Lys Asn Val Ser Ser Ser
900 905 910
Gly Tyr Lys Leu Met Leu Asp Tyr Phe Ser Leu Val Ser Thr Gly Ile
915 920 925
Asp Thr Thr Val Ile Val Asp Asn Ala Asp Ala Ala Gly Val Thr Lys
930 935 940
Val Gly Thr Trp Thr Gly Thr Asn Thr Gln Thr Asp Arg Tyr Gly Ala
945 950 955 960
Asp Tyr Ile His Asp Gly Asn Thr Gly Lys Gly Thr Lys Ser Val Thr
965 970 975
Phe Thr Pro Asn Val Pro Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Val Tyr Met Met
980 985 990
Trp Ala Ala His Thr Asn Arg Ala Thr Asn Val Pro Val Asp Val Thr
995 1000 1005
His Ser Gly Gly Thr Ala Thr Leu Asn Val Asn Gln Gln Gly Asn
1010 1015 1020
Gly Gly Val Trp Asn Leu Leu Gly Thr Tyr Ser Phe Asn Ala Gly
1025 1030 1035
Ser Thr Gly Ala Ile Lys Ile Arg Thr Asp Ala Thr Asn Gly Tyr
1040 1045 1050
Val Val Ala Asp Ala Val Lys Leu Val Lys Val Pro
1055 1060 1065
<210> 76
<211> 2327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，Pcons-aprH-cat
<400> 76
ttgacattat tttactgata tgtataatat aatttgtata agaaaatgag agggagagga 60
aacatgaaga aaccgttggg gaaaattgtc gcaagcaccg cactactcat ttctgttgct 120
tttagttcat cgatcgcatc ggctgctgaa gaagcaaaag aaaaatattt aattggcttt 180
aatgagcagg aagctgtcag tgagtttgta gaacaagtag aggcaaatga cgaggtcgcc 240
attctctctg aggaagagga agtcgaaatt gaattgcttc atgaatttga aacgattcct 300
gttttatccg ttgagttaag cccagaagat gtggacgcgc ttgaactcga tccagcgatt 360
tcttatattg aagaggatgc agaagtaacg acaatggcgc aatcagtgcc atggggaatt 420
agccgtgtgc aagccccagc tgcccataac cgtggattga caggttctgg tgtaaaagtt 480
gctgtcctcg atacaggtat ttccactcat ccagacttaa atattcgtgg tggcgctagc 540
tttgtaccag gggaaccatc cactcaagat gggaatgggc atggcacgca tgtggccggg 600
acgattgctg ctttaaacaa ttcgattggc gttcttggcg tagcgccgag cgcggaacta 660
tacgctgtta aagtattagg ggcgagcggt tcaggttcgg tcagctcgat tgcccaagga 720
ttggaatggg cagggaacaa tggcatgcac gttgctaatt tgagtttagg aagcccttcg 780
ccaagtgcca cacttgagca agctgttaat agcgcgactt ctagaggcgt tcttgttgta 840
gcggcatctg ggaattcagg tgcaggctca atcagctatc cggcccgtta tgcgaacgca 900
atggcagtcg gagctactga ccaaaacaac aaccgcgcca gcttttcaca gtatggcgca 960
gggcttgaca ttgtcgcacc aggtgtaaac gtgcagagca catacccagg ttcaacgtat 1020
gccagcttaa acggtacatc gatggctact cctcatgttg caggtgcagc agcccttgtt 1080
aaacaaaaga acccatcttg gtccaatgta caaatccgca atcatctaaa gaatacggca 1140
acgagcttag gaagcacgaa cttgtatgga agcggacttg tcaatgcaga agcggcaaca 1200
cgctaaggta ataaaaaaac acctccaagc tgagtgcggg tatcagcttg gaggtgcgtt 1260
tattttttca gccgtatgac aaggtcggca tcaggtgtga caacgcgtga tctagaccag 1320
ttccctgagc ttccgtcagt cggatcccat tgcggatttt cctcctctaa tatgctcaac 1380
ttaaatgacc tattcaataa atctattatg ctgctaaata gtttatagga caaataagta 1440
tactctaatg acctataaaa gatagaaaat taaaaaatca agtgttcgct tctctctcac 1500
ggagctgtaa tataaaaacc ttcttcagct aacggggcag gttagtgaca ttagaaaacc 1560
gactgtagaa agtacagtcg gcattatctc atattataaa agccagtcat taggcctatc 1620
tgacaattcc tgaatagagt tcataaacaa tcctgcatga taaccatcac aaacagaatg 1680
atgtacctgt aaagatagcg gtaaatatat tgaattacct ttattaatga attttcctgc 1740
tgtaataatg ggtagaaggt aattactatt attattgata tttaagttaa acccagtaaa 1800
tgaagtccat ggaataatag aaagagaaaa agcattttca ggtataggtg ttttgggaaa 1860
caatttcccc gaaccattat atttctctac atcagaaagg tataaatcat aaaactcttt 1920
gaagtcattc tttacaggag tccaaatacc agagaatgtt ttagatacac catcaaaaat 1980
tgtataaagt ggctctaact tatcccaata acctaactct ccgtcgctat tgtaaccagt 2040
tctaaaagct gtatttgagt ttatcaccct tgtcactaag aaaataaatg cagggtaaaa 2100
tttatatcct tcttgtttta tgtttcggta taaaacacta atttcaattt ctgtggttat 2160
actaaaagtc gtttgttggt tcaaataatg attaaatatc tcttttctct tccaattgtc 2220
taaatcaatt ttattaaagt tcatttgata tgcctcctaa atttttatct aaagtgaatt 2280
taggaggctt acttgtctgc tttcttcatt agaatcaatc ctttttt 2327
<210> 77
<211> 2338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，Pcons-纳豆激酶-cat
<400> 77
ttgacattat tttactgata tgtataatat aatttgtata agaaaatgag agggagagga 60
aacatgagaa gcaaaaaatt gtggatcagc ttgttgtttg cgttaacgtt aatctttacg 120
atggcgttca gcaacatgtc tgcgcaggct gccggaaaaa gcagtacaga aaagaaatac 180
attgtcggat ttaagcagac aatgagtgcc atgagttccg ccaagaaaaa ggatgttatt 240
tctgaaaaag gcggaaaggt tcaaaagcaa tttaagtatg ttaacgcggc cgcagcaaca 300
ttggatgaaa aagctgtaaa agaattgaaa aaagatccga gcgttgcata tgtggaagaa 360
gatcatattg cacatgaata tgcgcaatct gttccttatg gcatttctca aattaaagcg 420
ccggctcttc actctcaagg ctacacaggc tctaacgtaa aagtagctgt tatcgacagc 480
ggaattgact cttctcatcc tgacttaaac gtcagaggcg gagcaagctt cgttccttct 540
gaaacaaacc cataccagga cggcagttct cacggtacgc atgtcaccgg tacgattgcc 600
gctcttaata actcaatcgg tgttctgggc gtagcgccaa gcgcatcatt atatgcagta 660
aaagtgcttg attcaacagg aagcggccaa tatagctgga ttattaacgg cattgagtgg 720
gccatttcca acaatatgga tgttatcaac atgagccttg gcggacctac tggttctaca 780
gcgctgaaaa cagtagttga taaagcggtt tccagcggta tcgtcgttgc tgccgcagcc 840
ggaaacgaag gttcatccgg aagcacaagc acagtcggct accctgcaaa atatccttct 900
actattgcag taggtgcggt aaacagcagc aaccaaagag cttcattctc cagcgtaggt 960
tctgagcttg atgtaatggc tcctggcgtg tccatccaaa gcacacttcc tggaggcact 1020
tacggcgctt ataacggaac gtccatggcg actcctcacg ttgccggagc agcagcgcta 1080
attctttcta agcacccgac ttggacaaac gcgcaagtcc gtgatcgttt agaaagcact 1140
gcaacatatc ttggaaactc tttctactat ggaaaagggt taatcaacgt acaagcagct 1200
gcacaataat aaggtaataa aaaaacacct ccaagctgag tgcgggtatc agcttggagg 1260
tgcgtttatt ttttcagccg tatgacaagg tcggcatcag gtgtgacaac gcgtgatcca 1320
gaccagttcc ctgagcttcc gtcagtcgga tcccattgcg gattttcctc ctctaatatg 1380
ctcaacttaa atgacctatt caataaatct attatgctgc taaatagttt ataggacaaa 1440
taagtatact ctaatgacct ataaaagata gaaaattaaa aaatcaagtg ttcgcttctc 1500
tctcacggag ctgtaatata aaaaccttct tcagctaacg gggcaggtta gtgacattag 1560
aaaaccgact gtagaaagta cagtcggcat tatctcatat tataaaagcc agtcattagg 1620
cctatctgac aattcctgaa tagagttcat aaacaatcct gcatgataac catcacaaac 1680
agaatgatgt acctgtaaag atagcggtaa atatattgaa ttacctttat taatgaattt 1740
tcctgctgta ataatgggta gaaggtaatt actattatta ttgatattta agttaaaccc 1800
agtaaatgaa gtccatggaa taatagaaag agaaaaagca ttttcaggta taggtgtttt 1860
gggaaacaat ttccccgaac cattatattt ctctacatca gaaaggtata aatcataaaa 1920
ctctttgaag tcattcttta caggagtcca aataccagag aatgttttag atacaccatc 1980
aaaaattgta taaagtggct ctaacttatc ccaataacct aactctccgt cgctattgta 2040
accagttcta aaagctgtat ttgagtttat cacccttgtc actaagaaaa taaatgcagg 2100
gtaaaattta tatccttctt gttttatgtt tcggtataaa acactaattt caatttctgt 2160
ggttatacta aaagtcgttt gttggttcaa ataatgatta aatatctctt ttctcttcca 2220
attgtctaaa tcaattttat taaagttcat ttgatatgcc tcctaaattt ttatctaaag 2280
tgaatttagg aggcttactt gtctgctttc ttcattagaa tcaatccttt tttaaaag 2338
<210> 78
<211> 1817
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，Pcons-木聚糖酶-cat
<400> 78
ttgacattat tttactgata tgtataatat aatttgtata agaaaatgag agggagagga 60
aacatgttta agttcgttac gaaagttttg acggtagtaa ttgcagctac aattagtttt 120
tgtttgagtg cagtaccggc aagtgctaat acctattggc aatattggac cgatggtggt 180
ggaacagtaa atgctacaaa tggacctggt ggaaattaca gtgtgacatg gagagataca 240
gggaactttg ttgtcggtaa aggttgggaa atcggttcac caaatcgaac gatccattac 300
aatgctggtg tttgggaacc gtctggaaat ggatatttga ctctctatgg gtggacaagg 360
aatcagctca tagaatatta tgtcgttgat aattggggaa cttacagacc tactggaacc 420
catcgaggca ccgttgtcag tgatggggga acatatgata tctatacgac tatgcgatac 480
aatgcacctt ccattgatgg cacacaaacg ttccaacagt tctggagtgt gaggcaatcg 540
aagagaccga ctggaaataa cgttagcatt acgtttagca accacgtgaa tgcgtggaga 600
aatgcaggaa tgaatctggg aagtagttgg tcttaccagg tattagcaac agaaggctat 660
caaagtagcg ggagatcgaa tgtgacggtt tggtagggta ataaaaaaac acctccaagc 720
tgagtgcggg tatcagcttg gaggtgcgtt tattttttca gccgtatgac aaggtcggca 780
tcaggtgtga caacgcgtga tctagaccag ttccctgagc ttccgtcagt cggatcccat 840
tgcggatttt cctcctctaa tatgctcaac ttaaatgacc tattcaataa atctattatg 900
ctgctaaata gtttatagga caaataagta tactctaatg acctataaaa gatagaaaat 960
taaaaaatca agtgttcgct tctctctcac ggagctgtaa tataaaaacc ttcttcagct 1020
aacggggcag gttagtgaca ttagaaaacc gactgtagaa agtacagtcg gcattatctc 1080
atattataaa agccagtcat taggcctatc tgacaattcc tgaatagagt tcataaacaa 1140
tcctgcatga taaccatcac aaacagaatg atgtacctgt aaagatagcg gtaaatatat 1200
tgaattacct ttattaatga attttcctgc tgtaataatg ggtagaaggt aattactatt 1260
attattgata tttaagttaa acccagtaaa tgaagtccat ggaataatag aaagagaaaa 1320
agcattttca ggtataggtg ttttgggaaa caatttcccc gaaccattat atttctctac 1380
atcagaaagg tataaatcat aaaactcttt gaagtcattc tttacaggag tccaaatacc 1440
agagaatgtt ttagatacac catcaaaaat tgtataaagt ggctctaact tatcccaata 1500
acctaactct ccgtcgctat tgtaaccagt tctaaaagct gtatttgagt ttatcaccct 1560
tgtcactaag aaaataaatg cagggtaaaa tttatatcct tcttgtttta tgtttcggta 1620
taaaacacta atttcaattt ctgtggttat actaaaagtc gtttgttggt tcaaataatg 1680
attaaatatc tcttttctct tccaattgtc taaatcaatt ttattaaagt tcatttgata 1740
tgcctcctaa atttttatct aaagtgaatt taggaggctt acttgtctgc tttcttcatt 1800
agaatcaatc ctttttt 1817
<210> 79
<211> 5175
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，P4199-黄原胶裂解酶-cat
<400> 79
gcaacgttcg cagatgctgc tgaagagatt attaaaaagc tgaaagcaaa aggctatcaa 60
ttggtaactg tatctcagct tgaagaagtg aagaagcaga gaggctattg aataaatgag 120
tagaaagcgc catatcggcg cttttctttt ggaagaaaat atagggaaaa tggtacttgt 180
taaaaattcg gaatatttat acaatatcat atgtatcaca ttgaaaggag gggcctgctg 240
tccagactgt ccgctgtgta aaaaaaagga ataaaggggg gttgacatta ttttactgat 300
atgtataata taatttgtat aagaaaatgg aggggccctc gaaacgtaag atgaaacctt 360
agataaaagt gctttttttg ttgcaattga agaattatta atgttaagct taattaaaga 420
taatatcttt gaattgtaac gcccctcaaa agtaagaact acaaaaaaag aatacgttat 480
atagaaatat gtttgaacct tcttcagatt acaaatatat tcggacggac tctacctcaa 540
atgcttatct aactatagaa tgacatacaa gcacaacctt gaaaatttga aaatataact 600
accaatgaac ttgttcatgt gaattatcgc tgtatttaat tttctcaatt caatatataa 660
tatgccaata cattgttaca agtagaaatt aagacaccct tgatagcctt actataccta 720
acatgatgta gtattaaatg aatatgtaaa tatatttatg ataagaagcg acttatttat 780
aatcattaca tatttttcta ttggaatgat taagattcca atagaatagt gtataaatta 840
tttatcttga aaggagggat gcctaaaaac gaagaacatt aaaaacatat atttgcaccg 900
tctaatggat ttatgaaaat catttttatc agtttgaaaa ttatgtatta tggagctcta 960
taaaaatgag gagggaaccg aatgaagaaa ccgttgggga aaattgtcgc aagcaccgca 1020
ctactcattt ctgttgcttt tagttcatcg atagcatcgg ctgcggacga gtttgacacg 1080
ctaagggaaa agtataaggc catgctgaac ggagggacaa cctataatct ctccgacccg 1140
gatatagcgg cgcgtgttaa tgccattacg gtgactgccc agggatactg ggactccatg 1200
cttaaagatc cgaaccgtaa ccgtctttgg aacgatgcac cctttggctc ggattcgact 1260
tccatcacca cgacctacag acacctttat gatatggcgc tagcttatac gacttatggc 1320
tccagtctgc agggcaatgc cgcacttaaa gcggatatta tcagcggttt ggactggatg 1380
aatgccaatc aattttataa tggctgcagc caatatcaaa actggtggca ctggcaaatt 1440
ggcggtccca tggccttgaa tgatatcgtg gcattaatgt acacggagct aaccgcaaca 1500
caaatttcca attacatggc ggccatttat tacacccaag cgagtgttac gatgacgggg 1560
gcaaaccggc tatgggaaag tcaggttatt gccatctccg gaatcttgaa taaggattcc 1620
gccagagttg ccgctggtcg ggatggcatc agcgctttgc tgccgtatgt cgccaagggt 1680
gacggatttt acaacgatgg atcattcgtt cagcatactt attatgctta caacggtggt 1740
tatggttcaa gcctgttatc tggcattgca gacttgatat ttattttgaa tggctcttca 1800
tggcaggtaa cggatcctaa taaaaacaat gtataccgtt ggatttatga ttcctacgag 1860
cctttcatct ataaagggaa tctgatggac atggtccgcg gtagagagat ctcaaggcat 1920
ggattgcagg acgataaggc agccgtgact gtgatggcat cgatcattcg tctgtcacaa 1980
accgctgctt ccgccgatgc taccgcattt aagagaatgg tgaaatattg gctgctgctg 2040
gatacggata agactttcct taaagcagta tcgattgatc tgattattgc cgcgaaccaa 2100
ctggtgaacg attccaccgt tacctctcga ggggagctag tgaaatataa acaattctcc 2160
ggaatggacc gcgctgtaca gcttagacct ggcttcggtt ttgggcttag catgttttcc 2220
agccggatcg gtaattatga gtcgattaat gcagagaaca acaaaggctg gcataccggc 2280
gacggcatga cctaccttta caatactgac ctgagtcagt tcaatgacca tttctgggca 2340
actgtggata attaccgatt gccgggtacc acagtgctcc agaagacgac gcaaaccgcg 2400
aacagccgca gcgacaaaag ctgggccgga ggaacggata ttcttgggca atatggtgtt 2460
tccggcatgg aactgcatac cgtaggtaag agcctgacag ccaagaaatc ctggttcatg 2520
tttgacgatg agatcgtcgc gctgggttca ggtattgcca gcaccgatgg catcgcaacc 2580
gaaacgattg tagagaatcg aaagctcaat agcagcggca ataatgcatt gattgttaac 2640
gggacggcga agccgggctc ccttggatgg tcggaaacaa tgaccggaac caattatatt 2700
catctagccg gcagcgtacc cggctccgat atcggttatt attttcctgg tggagcagca 2760
gtcaaaggct tgcgtgaagc ccggtcggga agctggagct cgctgaataa gtccgcatcc 2820
tggaaggact cgacattgca tacacgcaac tttatgacgc tttggttcga tcatggcatg 2880
aacccgacaa acggtagtta ttcttatgtg ctgcttccga ataagaccag cagtgaggtg 2940
gccagctatg ctgcaacgcc tcagatcgag attctggaga attctagctc ggcgcaagcg 3000
gtgaaggaga cgcaattgaa tgtcaccgga attaactttt ggaacgatga gccaaccacg 3060
gtgggcctgg ttacttccga tcggaaagca tccgttatga caaaagaaac ggctagtgat 3120
ttcgagatat ccgtttccga cccgacccaa agtaatgtgg ggaccatcta tattgatgtc 3180
aacaaaagtg caaccggatt gatttcgaag gataatgaaa taacggtcat tcagtactac 3240
ccaaccatga agtttaaagt caatgtaaac aattctctgg ggaagtccta taaagtaaag 3300
tttagcctga caggaacacc cgaggagaac ccggatccaa tcccgatacc gaatccttac 3360
gaagcggaag atttgccaat taacgctgcc acagatactc ccgtggttta caatgatgcc 3420
aatgccagtg gtggcaagaa gcttggcttc aataacaatg cagtgggcga ttatgtggag 3480
ttcagtctgg acgtcacaca gcccggcacc tacgatgtca aatcccggat tatgaaatca 3540
acgaacagcg ggatttatca gctgtctatt aatgggacca acgtagggag cgcgcaggat 3600
atgttctgga cgacctccga gctgtctaag gagtttacta tgggctcata cagcttcagc 3660
acacccggga gctatttgtt ccgattaacg acaaccggca agaatgtcag ttcttcagga 3720
tataagctga tgctggacta ttttagtctg gtatcaacag gtattgatac aacggtgatt 3780
gtggacaatg ccgatgcagc tggtgttacg aaggtgggta cttggaccgg aaccaatacg 3840
cagaccgatc ggtacggcgc cgactacatt cacgatggga acacggggaa aggtacgaag 3900
agcgttacct ttactccaaa tgtacctatc agtggaactt atcaggttta catgatgtgg 3960
gctgcccata cgaatagggc aacgaatgtt cccgtagacg taacgcattc aggcggtaca 4020
gcaacgctaa atgttaacca acaaggtaat ggtggtgtgt ggaatttact gggtacgtat 4080
agctttaatg ctgggtccac gggggctatc aagatccgta cggacgcgac gaatggatat 4140
gttgtagccg atgccgtgaa gctggtaaag gtcccataaa cgcgttaatc aataaaaaaa 4200
cgctgtgcgg ttaaagggca cagcgttttt ttgtgtatcg gcaatagtta cccttattat 4260
caagataaga aagaaaagga tttttcgcta cgctcaaatc ctttaaaaaa acacaaaaga 4320
ccacattttt taatgtggtc tttattcttc aactaaagca cccattagtt caacaaacga 4380
aaattggata aagtgggata tttttaaaat atatatttat gttacagtaa tattgacttt 4440
taaaaaagga ttgattctaa tgaagaaagc agacaagtaa gcctcctaaa ttcactttag 4500
ataaaaattt aggaggcata tcaaatgaac tttaataaaa ttgatttaga caattggaag 4560
agaaaagaga tatttaatca ttatttgaac caacaaacga cttttagtat aaccacagaa 4620
attgatatta gtgttttata ccgaaacata aaacaagaag gatataaatt ttaccctgca 4680
tttattttct tagtgacaag ggtgataaac tcaaatacag cttttagaac tggttacaat 4740
agcgacggag agttaggtta ttgggataag ttagagccac tttatacaat ttttgatggt 4800
gtatctaaaa cattctctgg tatttggact cctgtaaaga atgacttcaa agagttttat 4860
gatttatacc tttctgatgt agagaaatat aatggttcgg ggaaattgtt tcccaaaaca 4920
cctatacctg aaaatgcttt ttctctttct attattccat ggacttcatt tactgggttt 4980
aacttaaata tcaataataa tagtaattac cttctaccca ttattacagc aggaaaattc 5040
attaataaag gtaattcaat atatttaccg ctatctttac aggtacatca ttctgtttgt 5100
gatggttatc atgcaggatt gtttatgaac tctattcagg aattgtcaga taggcctaat 5160
gactggcttt tataa 5175
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> citA - fwd寡聚物
<400> 80
gccaaacaac atggacgata tg 22
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> citA - rev寡聚物
<400> 81
gcaatgatag aaggcgtgat tg 22
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> flgE - fwd寡聚物
<400> 82
tcggcggaac aaactctaag 20
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> flgE - rev寡聚物
<400> 83
gtcgccgtca attgctaaat c 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> flgB - fwd寡聚物
<400> 84
ccttgagcag agcggatatt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> flgB - rev寡聚物
<400> 85
gacgcgagga ttcttgatct 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> fliR - fwd寡聚物
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> fliR - rev寡聚物
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<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，flhG - fwd寡聚物
<400> 88
gcgttctgcc aatggtttat tc 22
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，flhG - rev寡聚物
<400> 89
cagcgcaagt gccatattta ag 22
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，cheD - fwd寡聚物
<400> 90
gtcttgttca tgtcatgctt cc 22
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列，cheD - rev寡聚物
<400> 91
agcatatcaa tcgtggtctg t 21

Claims (15)

1.一种突变的细菌宿主细胞，其包含与编码一种或多种目的多肽的第一异源多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中与未突变的原本的等基因细胞或亲本细胞相比，至少一个鞭毛基因的表达减少或消除。
2.根据权利要求1所述的细菌宿主细胞，其中该至少一个鞭毛基因编码选自以下列表的鞭毛多肽：FlgA、FlgB、FlgC、FlgD、FlgE、FlgF、FlgG、FlgH、FlgI、FlgJ、FlgK、FlgL、FlgM、FlgN、FlhA、FlhB、FlhC、FlhD、FlhE、FlhF、FlhG、FlhO、FlhP、FliA、FliD、FliE、FliF、FliG、FliH、FliI、FliJ、FliK、FliL、FliM、FliN、FliO、FliP、FliQ、FliR、FliS、FliT、FliY、FliZ、Hag、MotA、MotB、YlxF、SwrD、CheY、CheB、CheA、CheW、CheC、CheD、SigD、和SwrB；优选地，该至少一个鞭毛基因编码鞭毛多肽FlgE、FliR和/或FlhG。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该至少一个鞭毛基因编码一种或多种包含与选自以下列表的多肽序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的氨基酸序列或由其组成的鞭毛多肽：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、和SEQ ID NO:63。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该至少一个鞭毛基因的多核苷酸序列包含至少一个选自以下列表的改变：提前终止密码子、核苷酸插入、和核苷酸缺失，如该鞭毛基因或其编码区的至少一个多核苷酸序列的一个或多个核苷酸的缺失、或该至少一个鞭毛基因或其编码区的多核苷酸序列的基本上所有核苷酸的缺失；或其中该至少一个鞭毛基因或其编码区的多核苷酸序列完全缺失。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该宿主细胞包含减少或消除的鞭毛活性、减少或消除的细胞运动、或减少或消除的游泳活性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该宿主细胞是选自由弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属细胞组成的组的革兰氏阴性细菌，或者其中该宿主细胞是选自由以下组成的组的革兰氏阳性细胞：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属或链霉菌属细胞，如嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、类马链球菌、化脓性链球菌、乳房链球菌、和马链球菌兽疫亚种、产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞，优选地该宿主细胞是芽孢杆菌属细胞、最优选地枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌细胞。
7.根据前述权利要求中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该一种或多种目的多肽包含酶；优选地，该酶选自由以下组成的组：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、核酸酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷酸二酯酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、和β-木糖苷酶；甚至更优选地，该一种或多种目的多肽包含淀粉酶、蛋白酶、纳豆激酶、木聚糖酶和/或黄原胶裂解酶。
8.根据前述权利要求中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该一种或多种目的多肽包含淀粉酶，如包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的淀粉酶。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该一种或多种目的多肽包含蛋白酶，如包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的蛋白酶。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该一种或多种目的多肽包含纳豆激酶，如包含与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的纳豆激酶。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该一种或多种目的多肽包含木聚糖酶，如包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的木聚糖酶。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的细菌宿主细胞，其中该一种或多种目的多肽包含黄原胶裂解酶，如包含与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的成熟多肽，基本上由其组成，或由其组成的黄原胶裂解酶。
13.一种用于生产一种或多种目的多肽的方法，该方法包括：
i)提供根据权利要求1至12中任一项所述的细菌宿主细胞；
ii)在有利于该一种或多种目的多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；以及
iii)任选地回收该一种或多种目的多肽。
14.一种核酸构建体，该核酸构建体包含编码至少一种含有以下多肽序列或由其组成的鞭毛多肽的多核苷酸，该多肽序列与SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63中的任一个具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性。
15.一种表达载体，其包含根据权利要求14所述的核酸构建体。
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