CN111875699B

CN111875699B - 一种提高枯草芽孢杆菌卵清蛋白表达量的方法

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Publication number: CN111875699B
Application number: CN202010635355.3A
Authority: CN
Inventors: 刘延峰; 刘龙; 宿安琪; 堵国成; 李江华; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2040-07-03
Also published as: CN111875699A

Abstract

本发明公开了一种提高枯草芽孢杆菌卵清蛋白表达量的方法，属于基因工程领域。本发明通过提高枯草芽孢杆菌的比生长速率来提高枯草芽孢杆菌卵清蛋白表达量。本发明以野生型168为出发菌株，通过使用生长相关基因的敲除、适应性进化(Adaptive Laboratory Evolution,ALE)以及两者结合的方法得到比生长速率提高的多个重组菌株，可以通过提高枯草芽孢杆菌比生长速率来提高枯草芽孢杆菌卵清蛋白表达量，为提高枯草芽孢杆菌卵清蛋白表达量提供了一种新的思路与方法。

Description

一种提高枯草芽孢杆菌卵清蛋白表达量的方法

技术领域

本发明涉及一种提高枯草芽孢杆菌卵清蛋白表达量的方法，属于枯草芽孢杆菌代谢工程和基因工程技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性细菌的典型代表，它不产生细胞壁内毒素，所生产的产品被美国食品药品监督管理局(FDA)认证为食品级安全。另外，枯草芽孢杆菌作为一种非致病性微生物，具有生长速度快(20min增殖一代)、培养时间短、培养要求低、遗传背景清晰利于改造、嘌呤合成能力强等优点，因此，在科学研究与工业生产中枯草芽孢杆菌的应用十分广泛。卵清蛋白简称OVA，是蛋清中的主要蛋白成分，占蛋清蛋白总量的54％-69％，其结构与性质会显著影响蛋清蛋白在食品加工过程中的功能性质。卵清蛋白是一种优质蛋白质，在医药、保健品、食品加工业等方面应用前景广泛。

目前，卵清蛋白的主要来源鸡蛋蛋清。然而，养殖厂的产蛋鸡在爆发禽类传播疾病时会导致鸡蛋价格上涨，即鸡蛋的价格具有不确定性，同时也具有疾病从养殖场的产蛋鸡传播向人类的风险。因此，为保证卵清蛋白营养价值的同时稳定甚至降低卵清蛋白价格、消除禽类传播病扩散的风险，亟待开发新的卵清蛋白生产方法。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种提高枯草芽孢杆菌卵清蛋白表达量的方法，通过敲除可以提高菌株比生长速率的ATP结合蛋白基因oppD，以及胞内表达量较高但功能上非必需的鞭毛钩帽组件蛋白基因flgD和鞭毛蛋白基因hag，将卵清蛋白的表达量的提高与枯草芽孢杆菌比生长速率相关联，并结合在特定筛选压力下的适应性进化方法，所述筛选压力为有限的碳氮源，以获得比生长速率提高的菌株，达到提高菌株卵清蛋白表达量的目的。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：实现了枯草芽孢杆菌的卵清蛋白表达量从无到有的转变，并且通过提高枯草芽孢杆菌的比生长速率来提高细胞卵清蛋白表达量，将对卵清蛋白表达量的提高转换为对菌株比生长速率从提高。不仅仅实现了通过枯草芽孢杆菌生产卵清蛋白，另一方面利用比生长速率的提高，提高了卵清蛋白的表达量，使实际的工厂应用中生产的卵清蛋白更有市场竞争力。

本发明提供了一种提高枯草芽孢杆菌目的蛋白表达量的方法，敲除枯草芽孢杆菌的ATP结合蛋白、鞭毛钩帽组件蛋白、鞭毛蛋白中的至少一个蛋白，或沉默了编码ATP结合蛋白、鞭毛钩帽组件蛋白、鞭毛蛋白中的至少一个蛋白的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述ATP结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述鞭毛钩帽组件蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述鞭毛蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白包括卵清蛋白OVA或绿色荧光蛋白GFP。

在本发明的一种实施方式中，所述卵清蛋白OVA的卵清蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.9所示。

在本发明的一种实施方式中，以枯草芽孢杆菌168为出发菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌的出发菌株经过适应性进化。

在本发明的一种实施方式中，所述适应性进化是将枯草芽孢杆菌在特定的培养基中生长扩增，通过分批培养结合反复转接培养，能够适应培养基环境的枯草芽孢杆菌逐渐富集成为优势菌株；其中，转接培养的次数不低于28次。

在本发明的一种实施方式中，所述适应性进化包括如下步骤：控制培养基中的葡萄糖处于低浓度，将枯草芽孢杆菌在多个容器进行平行培养，初始转接时间间隔控制为10～14小时，控制每一批次的起始OD₆₀₀均在0.03～0.05之间，根据每一批次终末的OD₆₀₀值选择生长最快(即OD₆₀₀值最大)的容器中的菌液转接至下一批次的容器中，逐渐缩短转接时长，以此获得将有益突变积累的进化菌株。

本发明提供了一种提高卵清蛋白表达量的枯草芽孢杆菌，其特征在于，敲除或沉默枯草芽孢杆菌的ATP结合蛋白基因oppD、编码鞭毛钩帽组件蛋白的基因flgD或编码鞭毛蛋白的基因hag中的至少一个，并表达卵清蛋白基因OVA。

在本发明的一种实施方式中，所述ATP结合蛋白基因oppD的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，编码鞭毛钩帽组件蛋白的基因flgD的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，编码鞭毛蛋白的基因Hag的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，卵清蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，核苷酸序列见SEQ ID NO.10。

本发明提供了一种生产卵清蛋白的方法，将所述的枯草芽孢杆菌在培养体系中培养。

在本发明的一种实施方式中，所述培养体系为含葡萄糖的复合培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖的浓度为50～70g/L。

在一种实施方式中，所述复合培养基含有10～15g/L酵母粉,5～10g/L蛋白胨，2～5g/L KH₂PO₄，10～15g/L K₂HPO₄·3H₂O，5～10g/L(NH₄)₂SO₄，1～5g/L MgSO₄·7H₂O。

本发明还保护所述提高枯草芽孢杆菌目的蛋白表达量的方法，或生产卵清蛋白的方法在制备含卵清蛋白的产品方面的应用。

本发明还保护所述提高卵清蛋白表达量的枯草芽孢杆菌在制备卵清蛋白或含卵清蛋白的产品方面的应用。

本发明的有益效果：本发明通过适应性进化菌株，并通过抗性序列同源重组替换出发菌株基因组上的目的基因序列，实现对目标基因的敲除，提高了枯草芽孢杆菌的生长速率及卵清蛋白表达量，使枯草芽孢杆菌的比生长速率提高15.73～54.69％甚至更高，并使卵清蛋白表达量提高约20％。本发明的方法可使枯草芽孢杆菌实现卵清蛋白表达量从无到有，并且使菌株在相同时间进行更多批次的发酵、获得更多的产物，缩短生产耗时，提高卵清蛋白的生产力，使生产的卵清蛋白更有市场竞争力

附图说明

图1为使用的适应性进化方法示意图。

图2为比生长速率梯度菌株BS168、BS168ΔflgD、A28、A40、A40ΔflgD的比生长速率柱状图。

图3为比生长速率梯度菌株BS168、BS168ΔflgD、A28、A40、A40ΔflgD转入质粒p43NMK-Ngfp后衍生菌株BS06，BS07，A2802，A4008，A4009的相对荧光强度柱状图。

图4为比生长速率梯度菌株BS168、BS168ΔflgD、A28、A40、A40ΔflgD转入质粒pHT-OVA-gfp后衍生菌株BS08，BS09，A2803，A4010，A4011的相对荧光强度柱状图。

具体实施方式

表1基因敲除菌株的全部引物序列及验证引物序列

1、培养基配方：

种子液培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉。

生长曲线测定测定所使用的培养基配方为：

A.M9培养基5×母液：(每升)42.5g Na₂HPO₄·2H₂O，15g KH₂PO₄，5.0g NH₄Cl，2.5gNaCl，使用4M NaOH调节至pH＝7.0；灭菌条件：121℃，高压灭菌20min；M9培养基易染菌，在4℃冰箱保存。

B.微量元素100×母液(每升)：100mg MnCl₂·4H₂O，170mg ZnCl₂，43mg CuCl₂·2H₂O，60mg CoCl₂·6H₂O，60mg Na₂MoO₄·2H₂O，

C.100mM CaCl₂溶液(每100mL)：1.47g CaCl₂·2H₂O，可在高压灭菌时在室温储存(4℃冰箱保存亦可)。

D.1M MgSO₄溶液(每100mL)：24.6g MgSO₄·7H₂O，可在高压灭菌时在室温储存(4℃冰箱保存亦可)。

E.50mM FeCl ₃溶液(每100mL)：1.35g FeCl₃·6H₂O，因为FeCl ₃是不稳定的，因此过滤灭菌该溶液并在室温下避光保存。

F.50％(w/v)葡萄糖溶液：50g无水葡萄糖，使用去离子水溶解，并定容至100mL，115℃高压灭菌，于室温保存。

G.色氨酸200×母液：1g色氨酸，使用去离子水溶解，并定容至50mL，过滤灭菌,于室温保存。

H.M9(+Trp)1×培养基(每升)：200mL M9基本培养基5×母液，10mL微量元素100×母液，1mL 100mM CaCl₂溶液，1mL 1M MgSO₄溶液，1mL 50mM FeCl ₃溶液，8mL 50％(w/v)葡萄糖溶液，5mL色氨酸200×母液，使用4M NaOH调节pH至7.0，使用去离子水定容至1L，在4℃冰箱保存。

进行蛋白表达的复合培养基配方：12g/L酵母粉,6g/L蛋白胨，2.5g/L KH₂PO₄，12g/L K₂HPO₄·3H₂O，6g/L(NH₄)₂SO₄，3g/L MgSO₄·7H₂O，60g/L葡萄糖。

2、生长曲线与比生长速率测定：首先挑取活化的单菌落至2mL种子液培养基中，于37℃、220rpm培养2-4小时至OD₆₀₀＝0.5-1.0；然后，梯度接种于5ml M9(+Trp)1×培养基，于37℃、220rpm培养10小时；再转接至18ml M9(+Trp)1×培养基的250ml无挡板摇瓶中，控制转接后的初始OD₆₀₀＝0.03-0.05，于37℃、220rpm进行培养。转接时记为起始(第0小时)，随后每间隔2小时测定一次OD₆₀₀，直至测出的OD₆₀₀长时间维持稳定或下降明显。使用Origin做出生长曲线图并计算比生长速率。

3、卵清蛋白表达量测定：使用线性表达的绿色荧光蛋白的荧光强度表征卵清蛋白的表达量。挑取活化的单菌落加入每孔含有1.5ml复合培养基的24深孔板，在37℃、220rpm进行培养。每隔2-5小时进行取样，将取得的样品加入96白色浅孔板并适当稀释，在酶标仪中测定各样品的OD₆₀₀和荧光强度，激发波长为488nm，发射波长为523nm。

实施例1：oppD基因敲除整合框的构建与基因敲除菌株BS168ΔoppD的获得

ATP结合蛋白基因oppD(如SEQ ID NO.2所示)的敲除：

设计引物rh_oppD(S)_1F/rh_oppD(S)_1R，对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，得到整合框左臂；设计引物rh_oppD(S)_2F/rh_oppD(S)_2R，对抗性质粒p7S6(如SEQ IDNO.7所示)进行PCR，得到抗性扩增片段；设计引物rh_oppD(S)_3F/rh_oppD(S)_3R，对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，得到整合框右臂；最后通过融合PCR的方式，将三片段融合后扩增，构建敲除oppD的整合框。

将构建好的整合框转化野生型枯草芽孢杆菌168菌株。采用yz-oppD-750-F：5’-gaatcaggagtatgtgcttgcttca-3’及yz-750-R：5’-ttcaaatatatcctcctcactattttgattagtacct-3’引物挑选转化子进行菌落PCR，出现750bp条带，验证基因敲除枯草芽孢杆菌BS168ΔoppD构建成功。

实施例2：flgD基因敲除整合框的构建与基因敲除菌株BS168ΔflgD的获得

按照实施例1相同策略敲除鞭毛钩帽组件蛋白基因flgD(SQE ID NO.4所示)。具体步骤为：设计引物rh_flgD(423+)_1F/rh_flgD(423+)_1R，对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，得到整合框左臂；设计引物rh_flgD(423+)_2F/rh_flgD(423+)_2R，对抗性质粒p7S6(如SEQ ID NO.7所示)进行PCR，得到抗性扩增片段；设计引物rh_flgD(423+)_3F/rh_flgD(423+)_3R，对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，得到整合框右臂；最后通过融合PCR的方式，将三个片段融合后扩增，构建敲除flgD的整合框。

将构建好的整合框转化野生型枯草芽孢杆菌168菌株。采用yz-flgD-750-F：5’-cctcagctgaagcaatcattgccgaatatgg-3’及yz-750-R：5’-ttcaaatatatcctcctcactattttgattagtacct-3’引物挑选转化子进行菌落PCR，出现750bp条带，验证基因敲除枯草芽孢杆菌BS168ΔflgD构建成功。

实施例3：hag基因敲除整合框的构建与基因敲除菌株BS168Δhag的获得

按照实施例1或2相同策略敲除鞭毛蛋白基因hag(SEQ ID NO.6所示)，具体步骤为：用引物rh_hag(915+)_1F/rh_hag(915+)_1R对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，得到整合框左臂；用引物rh_hag(915+)_2F/rh_hag(915+)_2R，对抗性质粒p7S6(如SEQ ID NO.7所示)进行PCR，得到抗性扩增片段；用引物rh_hag(915+)_3F/rh_hag(915+)_3R，对野生型枯草芽孢杆菌进行菌落PCR，得到整合框右臂；最后通过融合PCR的方式，将三片段融合后扩增，构建敲除hag的整合框。将构建好的整合框转化野生型枯草芽孢杆菌168菌株。采用引物yz-hag-750-F:5’-cagcaagattggtatatgaaacttgatgaacaggaacct-3’及yz-750-R：5’-ttcaaatatatcctcctcactattttgattagtacct-3’挑选转化子进行菌落PCR，出现750bp条带，验证基因敲除枯草芽孢杆菌BS168Δhag构建成功。

实施例4：适应性实验室进化菌株的获得

适应性进化的过程如图1所示。以碳氮源为限制性的筛选条件，控制培养基中葡萄糖始终保持4g/L的低浓度。在每一培养批次使用六个摇瓶进行平行培养，初始转接时间间隔控制为12小时，控制每一批次的起始OD₆₀₀均在0.03-0.05之间，因此可以根据终末OD₆₀₀的大小选择生长最快的摇瓶中的菌液进行下一次的转接，从终末OD₆₀₀最大的那一摇瓶转接至下一批次的六个平行摇瓶，逐渐缩短转接时长，将每一批次可能出现的有益突变积累起来，以比生长速率提高超过30％视为明显提高。以此获得了进化28个批次的菌株A28和进化了40个批次的菌株A40。计算A28的比生长速率较出发菌株提高了39.88％，A40的比生长速率较出发菌株提高了43.53％

实施例5：基因敲除的进化菌株的获得

分别将实施例1构建的oppD基因敲除整合框、实施例2构建的flgD基因敲除整合框、实施例3构建的hag基因敲除整合框转化至实施例4获得的适应性实验室进化菌株A40。采用ALEyz-oppD-750-F：5’-gaatcaggagtatgtgcttgcttca-3’及ALEyz-750-R：5’-ttcaaatatatcctcctcactattttgattagtacct-3’引物挑选转化子进行菌落PCR，出现750bp条带，验证oppD基因敲除的枯草芽孢杆菌A40ΔoppD构建成功。

其余基因敲除的进化菌株，其敲除框的构建和验证方法同理。采用ALEyz-flgD-750-F：5’-cctcagctgaagcaatcattgccgaatatgg-3’及ALEyz-750-R：5’-ttcaaatatatcctcctcactattttgattagtacct-3’引物挑选转化子进行菌落PCR，出现750bp条带，验证flgD基因敲除的枯草芽孢杆菌A40ΔflgD构建成功。采用ALEyz-hag-750-F：5’-cagcaagattggtatatgaaacttgatgaacaggaacct-3’及ALEyz-750-R：5’-ttcaaatatatcctcctcactattttgattagtacct-3’引物挑选转化子进行菌落PCR，出现750bp条带，验证hag基因敲除的枯草芽孢杆菌A40Δhag构建成功。使用的引物序列同见表1。

实施例6：比生长速率的梯度菌株的选取

测定实施例1～5构建的各菌株的生长曲线并计算比生长速率，相同测定条件下，未经改造的野生型菌株BS168作为对照菌株。

挑取活化的单菌落接种至2mL种子液培养基中，于37℃、220rpm培养2～4小时至OD₆₀₀＝0.5-1.0。然后，以培养基体积的1‰接种于10mL M9(+Trp)1×培养基，于37℃、220rpm培养10小时。转接至装有50mL M9(+Trp)1×培养基的250mL无挡板摇瓶中，控制转接后的培养基中初始OD₆₀₀＝0.03-0.05，于37℃、220rpm进行培养。转接时记为起始(第0小时)，取样并测定OD₆₀₀。此后每隔两小时(即2h，4h，6h，8h，10h，12h，14h)取样并测定OD₆₀₀。

上述实施例中构建的突变菌株及适应性进化菌株A28、A40的比生长速率见表2。

选择野生型菌株BS168和各个实验阶段的代表菌株：野生型菌株的基因敲除菌株BS168ΔflgD，进化菌株A28和A40，基因敲除的进化菌株A40ΔflgD，构成了比生长速率的梯度菌株。其比生长速率梯度见图2。

表2获得的不同菌株的比生长速率

实施例7：菌株比生长速率的改变对菌株绿色荧光蛋白表达量的影响

实施例6中所述的比生长速率梯度菌株分别转入实验室保藏的带有GFP序列的质粒p43NMK-Ngfp，质粒的制备方法及相关序列见参考文献(Tian,R.et al.Synthetic N-terminal coding sequences for fine-tuning gene expression and metabolicengineering in Bacillus subtilis.MetabEng 55,131-141,doi:10.1016/j.ymben.2019.07.001(2019).)，得到衍生菌株命名为BS06(以BS168菌株为宿主)，BS07(以BS168ΔflgD菌株为宿主)，A2802(以A28菌株为宿主)，A4008(以A40菌株为宿主)，A4009(以A40ΔflgD菌株为宿主)。

在测定蛋白表达量的复合培养基中进行培养及取样：挑取活化的单菌落加入每孔含有1.5mL复合培养基的24深孔板，在37℃、220rpm进行培养。每隔2-5小时进行取样，将取得的样品加入96白色浅孔板并适当稀释，在酶标仪中测定各样品的OD₆₀₀和荧光强度，激发波长为488nm，发射波长为523nm。测定并计算的各个菌株的相对荧光强度如图3所示。

相对荧光强度＝测定得到的总荧光强度/菌液OD₆₀₀。

相同测定条件下，野生型菌株BS168转入质粒p43NMK-Ngfp后的衍生菌株BS06作为对照菌株。从图中可以看出，对照菌株BS06的荧光强度作为对照100，BS07、A2802、A4008、A4009四个菌株的相对荧光强度分别为101.53、105.1、105.75、109.47，分别提高了1.53％、5.1％、5.75％、9.47％，有力地证明了枯草芽孢杆菌比生长速率的提高对蛋白的表达量有提高作用。

实施例8：重组质粒pHT-OVA-gfp的构建。

为了将编码卵清蛋白的序列和绿色荧光蛋白的序列线性地插入质粒pHT01之中，设计引物N-OVA-F：5’-GGAATGTACACATGGGATCAATAGGCGCGGC-3’，N-OVA-R：5’-GAGTAGGGTACTGATTGAAGATAGGTGAAACACAGCGACCGA-3’对合成的OVA(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)序列进行扩增，得到OVA片段；

设计引物N-GFP-F：5’-CCTATCTTCAATCAGTACCCTACTCCGCCGACGATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGT-3’，N-GFP-R：5’-TGGGCAGTAAATCACTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATCC-3’对GFP序列进行扩增，得到GFP片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)；

设计引物N-pHT-F：5’-TATACAAATAGTGATTTACTGCCCACAAACTGCCCA-3’，N-pHT-R：5’-CCTATTGATCCCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCg-3’对质粒pHT01序列进行扩增，得到pHT01质粒骨架。

最后通过Gibson组装的方式，将扩增的OVA片段、GFP片段、pHT01质粒骨架整合成为重组质粒pHT-OVA-gfp。

设计验证引物YZ-pHT-OVA-F：5’-ATCACCCTCTTGCTAAAGCGGCCAAG-3’，YZ-pHT-OVA-R：5’-agcttgacctatcgccttgtggctttctag-3’对重组质粒pHT-OVA-gfp进行PCR，出现约2600bp条带，验证重组质粒pHT-OVA-gfp构建成功。使用的引物序列同见表1，重组质粒pHT-OVA-gfp核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

实施例9：带有重组质粒pHT-OVA-gfp的重组枯草芽孢杆菌的构建

实施例6中所述的比生长速率梯度菌株分别转入构建好的质粒pHT-OVA-gfp，得到衍生菌株命名为BS08(以BS168菌株为宿主)，BS09(以BS168ΔflgD菌株为宿主)，A2803(以A28菌株为宿主)，A4010(以A40菌株为宿主)，A4011(以A40ΔflgD菌株为宿主)。采用YZ-pHT-OVA-F：5’-ATCACCCTCTTGCTAAAGCGGCCAAG-3’，YZ-pHT-OVA-R：5’-agcttgacctatcgccttgtggctttctag-3’引物挑选转化子进行菌落PCR，出现2.6kb条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。

实施例10：菌株比生长速率的改变对菌株卵清蛋白表达量的影响

衍生菌株BS08，BS09，A2803，A4010，A4011在测定蛋白表达量的复合培养基中进行培养及取样：挑取活化的单菌落加入每孔含有1.5ml复合培养基的24深孔板，在37℃、220rpm进行培养。每隔2-5小时进行取样，将取得的样品加入96白色浅孔板并适当稀释，在酶标仪中测定各样品的OD₆₀₀和荧光强度，激发波长为488nm，发射波长为523nm。

测定并计算的各个菌株的相对荧光强度如图3所示，相同测定条件下，野生型菌株BS168转入质粒pHT-OVA-gfp后的衍生菌株BS08作为对照菌株。从图中可以看出，对照菌株BS08的荧光强度作为对照100，BS09、A2803、A4010、A4011四个菌株的相对荧光强度分别为112.3、120.36、120.69、119.79，分别提高了12.3％、20.36％、20.69％、19.79％。A2803、A4010、A4011三个菌株均为大约20％，相差不大，考虑为比生长速率差距较小的原因。然而，BS08、BS09与其余三个菌株构成了相对荧光强度梯度，有力地证明了枯草芽孢杆菌比生长速率的提高对蛋白的表达量有提高作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高枯草芽孢杆菌卵清蛋白表达量的方法

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 358

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

Met Ile Arg Val Thr Arg Leu Leu Glu Val Lys Asp Leu Ala Ile Ser

1 5 10 15

Phe Lys Thr Tyr Gly Gly Glu Val Gln Ala Ile Arg Gly Val Asn Phe

20 25 30

His Leu Asp Lys Gly Glu Thr Leu Ala Ile Val Gly Glu Ser Gly Ser

35 40 45

Gly Lys Ser Val Thr Ser Gln Ala Ile Met Lys Leu Ile Pro Met Pro

50 55 60

Pro Gly Tyr Phe Lys Arg Gly Glu Ile Leu Phe Glu Gly Lys Asp Leu

65 70 75 80

Val Pro Leu Ser Glu Lys Glu Met Gln Asn Val Arg Gly Lys Glu Ile

85 90 95

Gly Met Ile Phe Gln Asp Pro Met Thr Ser Leu Asn Pro Thr Met Lys

100 105 110

Val Gly Lys Gln Ile Thr Glu Val Leu Phe Lys His Glu Lys Ile Ser

115 120 125

Lys Glu Ala Ala Lys Lys Arg Ala Val Glu Leu Leu Glu Leu Val Gly

130 135 140

Ile Pro Met Pro Glu Lys Arg Val Asn Gln Phe Pro His Glu Phe Ser

145 150 155 160

Gly Gly Met Arg Gln Arg Val Val Ile Ala Met Ala Leu Ala Ala Asn

165 170 175

Pro Lys Leu Leu Ile Ala Asp Glu Pro Thr Thr Ala Leu Asp Val Thr

180 185 190

Ile Gln Ala Gln Ile Leu Glu Leu Met Lys Asp Leu Gln Lys Lys Ile

195 200 205

Asp Thr Ser Ile Ile Phe Ile Thr His Asp Leu Gly Val Val Ala Asn

210 215 220

Val Ala Asp Arg Val Ala Val Met Tyr Ala Gly Gln Ile Val Glu Thr

225 230 235 240

Gly Thr Val Asp Glu Ile Phe Tyr Asp Pro Arg His Pro Tyr Thr Trp

245 250 255

Gly Leu Leu Ala Ser Met Pro Thr Leu Glu Ser Ser Gly Glu Glu Glu

260 265 270

Leu Thr Ala Ile Pro Gly Thr Pro Pro Asp Leu Thr Asn Pro Pro Lys

275 280 285

Gly Asp Ala Phe Ala Leu Arg Ser Ser Tyr Ala Met Lys Ile Asp Phe

290 295 300

Glu Gln Glu Pro Pro Met Phe Lys Val Ser Asp Thr His Tyr Val Lys

305 310 315 320

Ser Trp Leu Leu His Pro Asp Ala Pro Lys Val Glu Pro Pro Glu Ala

325 330 335

Val Lys Ala Lys Met Arg Lys Leu Ala Asn Thr Phe Glu Lys Pro Val

340 345 350

Leu Val Arg Glu Val Glu

355

<210> 2

<211> 1077

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgatacggg tgacacgcct attagaagta aaagatttag caatttcatt taaaacatat 60

ggcggagagg tccaggcgat ccgcggagtg aatttccatc tggataaagg ggagacgctg 120

gccattgttg gagaatcagg ttccggaaaa agtgtaacct ctcaagcgat tatgaagctg 180

attccaatgc ctccgggtta tttcaaacgc ggtgagatcc tgtttgaagg aaaggatctg 240

gtgccgctgt ccgaaaaaga aatgcaaaat gtccggggaa aagagatcgg catgatattc 300

caagatccga tgacctcttt aaatccaacg atgaaggtcg gtaaacaaat tacggaagtg 360

ctttttaaac acgaaaagat ctcgaaggaa gcggctaaaa aacgcgcggt tgaactgctg 420

gaattagtcg gtatcccaat gccggaaaag cgggtgaacc aatttccgca tgaattttca 480

ggcgggatga gacagagggt tgtcattgcc atggcgcttg cagcgaatcc gaaacttctg 540

atcgccgatg agccgacaac tgctcttgat gtaacgattc aagcgcaaat tttggaatta 600

atgaaggatt tgcaaaagaa aattgacacg tccatcatct ttatcacaca cgatcttggt 660

gttgtggcta acgttgctga ccgggtcgct gtcatgtacg cgggacagat tgtagaaact 720

ggtacggtag acgaaatctt ctacgacccg agacatccgt acacttgggg gcttcttgca 780

tccatgccga cactggaaag ttcaggagag gaagagctga ctgcaattcc gggcacgccg 840

cctgatttga caaacccgcc aaaaggagat gcttttgccc tgcggagctc ttacgcgatg 900

aaaatcgatt ttgaacagga gccgccaatg tttaaggtat ccgatactca ttatgtaaaa 960

tcgtggctgc ttcatcctga cgcgccaaag gtagagccgc ctgaagcggt aaaagcgaaa 1020

atgcgtaaac tggcaaacac gtttgaaaaa cctgtcttag tgagagaagt tgaatga 1077

<210> 3

<211> 140

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 3

Met Thr Ser Ile Ser Ser Glu Tyr Lys Leu Pro Glu Lys Thr Asn Thr

1 5 10 15

Val Ser Thr Asn Asn Ser Ser Leu Gly Lys Asp Glu Phe Leu Lys Ile

20 25 30

Leu Met Thr Gln Val Gln Asn Gln Asp Pro Leu Asn Pro Ile Asp Asp

35 40 45

Lys Glu Phe Ile Ser Gln Met Ala Thr Phe Ser Ser Leu Glu Gln Met

50 55 60

Met Asn Leu Asn Thr Thr Met Thr Gln Phe Val Glu Asn Gln Asp Pro

65 70 75 80

Phe Thr Thr Tyr Val Asp Trp Met Gly Lys Glu Val Ser Trp Thr Asp

85 90 95

Gly Lys Ser Ala Thr Asp Lys Thr Gly Thr Val Ser Ser Val Lys His

100 105 110

Phe Lys Gly Asn Tyr Tyr Leu Val Leu Asp Asp Gly Thr Glu Ile Ser

115 120 125

Pro Ala Asn Val Met Ser Val Gly Gln Ser Ser Lys

130 135 140

<210> 4

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgacttcta taagttcaga atataaactg cctgaaaaaa cgaacactgt gtcgacgaac 60

aacagcagct tggggaaaga cgagttttta aaaatattaa tgactcaagt tcaaaaccaa 120

gatccgctta acccgattga cgataaagaa tttatcagcc agatggcgac tttttcaagc 180

ttggagcaaa tgatgaatct gaatacgaca atgactcaat tcgttgaaaa ccaagatccg 240

tttacaacgt atgttgattg gatgggaaaa gaagtatctt ggactgatgg taaaagtgca 300

acagataaaa caggcacagt aagctctgtt aaacatttta aaggaaatta ttatctcgtt 360

cttgatgatg ggaccgagat cagtcctgcg aatgtcatgt ctgtgggaca atcatctaaa 420

taa 423

<210> 5

<211> 304

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 5

Met Arg Ile Asn His Asn Ile Ala Ala Leu Asn Thr Leu Asn Arg Leu

1 5 10 15

Ser Ser Asn Asn Ser Ala Ser Gln Lys Asn Met Glu Lys Leu Ser Ser

20 25 30

Gly Leu Arg Ile Asn Arg Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile

35 40 45

Ser Glu Lys Met Arg Gly Gln Ile Arg Gly Leu Glu Met Ala Ser Lys

50 55 60

Asn Ser Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu

65 70 75 80

Thr Glu Thr His Ala Ile Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Val Val Gln

85 90 95

Ala Gly Asn Thr Gly Thr Gln Asp Lys Ala Thr Asp Leu Gln Ser Ile

100 105 110

Gln Asp Glu Ile Ser Ala Leu Thr Asp Glu Ile Asp Gly Ile Ser Asn

115 120 125

Arg Thr Glu Phe Asn Gly Lys Lys Leu Leu Asp Gly Thr Tyr Lys Val

130 135 140

Asp Thr Ala Thr Pro Ala Asn Gln Lys Asn Leu Val Phe Gln Ile Gly

145 150 155 160

Ala Asn Ala Thr Gln Gln Ile Ser Val Asn Ile Glu Asp Met Gly Ala

165 170 175

Asp Ala Leu Gly Ile Lys Glu Ala Asp Gly Ser Ile Ala Ala Leu His

180 185 190

Ser Val Asn Asp Leu Asp Val Thr Lys Phe Ala Asp Asn Ala Ala Asp

195 200 205

Thr Ala Asp Ile Gly Phe Asp Ala Gln Leu Lys Val Val Asp Glu Ala

210 215 220

Ile Asn Gln Val Ser Ser Gln Arg Ala Lys Leu Gly Ala Val Gln Asn

225 230 235 240

Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Ser Ala Ser Gly Glu Asn Leu

245 250 255

Thr Ala Ala Glu Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala Lys Glu Met

260 265 270

Ser Glu Phe Thr Lys Asn Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ser Gln Ala Met

275 280 285

Leu Ala Gln Ala Asn Gln Gln Pro Gln Asn Val Leu Gln Leu Leu Arg

290 295 300

<210> 6

<211> 915

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgagaatta accacaatat tgcagcgctt aacacactga accgtttgtc ttcaaacaac 60

agtgcgagcc aaaagaacat ggagaaactt tcttcaggtc ttcgcatcaa ccgtgcggga 120

gatgacgcag caggtcttgc gatctctgaa aaaatgagag gacaaatcag aggtcttgaa 180

atggcttcta aaaactctca agacggaatc tctcttatcc aaacagctga gggtgcatta 240

actgaaactc atgcgatcct tcaacgtgtt cgtgagctag ttgttcaagc tggaaacact 300

ggaactcagg acaaagcaac tgatttgcaa tctattcaag atgaaatttc agctttaaca 360

gatgaaatcg atggtatttc aaatcgtaca gaattcaatg gtaagaaatt gctcgatggc 420

acttacaaag ttgacacagc tactcctgca aatcaaaaga acttggtatt ccaaatcgga 480

gcaaatgcta cacagcaaat ctctgtaaat attgaggata tgggtgctga cgctcttgga 540

attaaagaag ctgatggttc aattgcagct cttcattcag ttaatgatct tgacgtaaca 600

aaattcgcag ataatgcagc agatactgct gatatcggtt tcgatgctca attgaaagtt 660

gttgatgaag cgatcaacca agtttcttct caacgtgcta agcttggtgc ggtacaaaat 720

cgtctagagc acacaattaa caacttaagc gcttctggtg aaaacttgac agctgctgag 780

tctcgtatcc gtgacgttga catggctaaa gagatgagcg aattcacaaa gaacaacatt 840

ctttctcagg cttctcaagc tatgcttgct caagcaaacc aacagccgca aaacgtactt 900

caattattac gttaa 915

<210> 7

<211> 3800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220

accatgatta cgaattcgag ctcggtaccc ggggatcctc tagagattgt accgttcgta 2280

tagcatacat tatacgaagt tatcgatttt cgttcgtgaa tacatgttat aataactata 2340

actaataacg taacgtgact ggcaagagat atttttaaaa caatgaatag gtttacactt 2400

actttagttt tatggaaatg aaagatcata tcatatataa tctagaataa aattaactaa 2460

aataattatt atctagataa aaaatttaga agccaatgaa atctataaat aaactaaatt 2520

aagtttattt aattaacaac tatggatata aaataggtac taatcaaaat agtgaggagg 2580

atatatttga atacatacga acaagttaat aaagtgaaaa aaatacttcg gaaacattta 2640

aaaaataacc ttattggtac ttacatgttt ggatcaggag ttgagagtgg actaaaacca 2700

aatagtgatc ttgacttttt agtcgtcgta tctgaaccat tgacagatca aagtaaagaa 2760

atacttatac aaaaaattag acctatttca aaaaaaatag gagataaaag caacttacga 2820

tatattgaat taacaattat tattcagcaa gaaatggtac cgtggaatca tcctcccaaa 2880

caagaattta tttatggaga atggttacaa gagctttatg aacaaggata cattcctcag 2940

aaggaattaa attcagattt aaccataatg ctttaccaag caaaacgaaa aaataaaaga 3000

atatacggaa attatgactt agaggaatta ctacctgata ttccattttc tgatgtgaga 3060

agagccatta tggattcgtc agaggaatta atagataatt atcaggatga tgaaaccaac 3120

tctatattaa ctttatgccg tatgatttta actatggaca cgggtaaaat cataccaaaa 3180

gatattgcgg gaaatgcagt ggctgaatct tctccattag aacataggga gagaattttg 3240

ttagcagttc gtagttatct tggagagaat attgaatgga ctaatgaaaa tgtaaattta 3300

actataaact atttaaataa cagattaaaa aaattataaa taacttcgta tagcatacat 3360

tatacgaacg gtagaatcgt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcactgg ccgtcgtttt 3420

acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc 3480

ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt 3540

gcgcagcctg aatggcgaat ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg 3600

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ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc 3720

atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc 3780

gtcatcaccg aaacgcgcga 3800

<210> 8

<211> 8655

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttaagttatt ggtatgactg gttttaagcg caaaaaaagt tgctttttcg tacctattaa 60

tgtatcgttt tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120

gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180

aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240

tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300

ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360

gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420

ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480

tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540

cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600

aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660

tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720

cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattctaaaa ctagttcatt tgatatgcct 780

cctaaatttt tatctaaagt gaatttagga ggcttacttg tctgctttct tcattagaat 840

caatcctttt ttaaaagtca atattactgt aacataaata tatattttaa aaatatccca 900

ctttatccaa ttttcgtttg ttgaactaat gggtgcttta gttgaagaat aaaagaccac 960

attaaaaaat gtggtctttt gtgttttttt aaaggatttg agcgtagcga aaaatccttt 1020

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aataataaga aacgttcttc agccttcatc agttgattca cagacagcaa tggttcttgt 2100

taacgcaata gtattcaagg gcctttggga gaaggctttc aaagatgaag atacacaggc 2160

aatgcctttc cgagtgacag aacaggaatc aaagccggtg cagatgatgt atcagatagg 2220

attattccga gtggcatcaa tggcatcaga gaagatgaag atactggagc ttcctttcgc 2280

ttctggaaca atgtcaatgc ttgttcttct tcctgatgaa gtttcaggac ttgaacagct 2340

tgaatcaata ataaactttg agaagttaac ggagtggacc tcttcgaatg tcatggagga 2400

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agttcttatg gcaatgggaa taacagatgt gttctccagc tcagcaaacc tttcaggaat 2520

atcatcagca gaatcactta agatcagtca ggcagttcat gcagcacatg cagaaataaa 2580

cgaagcagga agagaagttg ttggatcagc agaagcagga gttgatgcag catcagtgtc 2640

tgaggagttc cgagcggacc acccattcct attctgcata aagcacattg caacaaacgc 2700

agttctcttc ttcggtcgct gtgtttcacc tatcttcaat cagtacccta ctccgccgac 2760

gatgagtaaa ggagaagaac ttttcactgg agttgtccca attcttgttg aattagatgg 2820

tgatgttaat gggcacaaat tttctgtcag tggagagggt gaaggtgatg caacatacgg 2880

aaaacttacc cttaaattta tttgcactac tggaaagctt cctgttcctt ggccaacact 2940

tgtcactact ttttcttatg gtgttcaatg cttttcaaga tacccagatc atatgaagcg 3000

gcacgacttc ttcaagagcg ccatgcctga gggatacgtg caggagagga ccatcttctt 3060

caaggacgac gggaactaca agacacgtgc tgaagtcaag tttgagggag acaccctcgt 3120

caacagaatc gagcttaagg gaatcgattt caaggaggac ggaaacatcc tcggccacaa 3180

gttggaatac aactacaact cccacaacgt atacatcatg gcagacaaac aaaagaatgg 3240

aatcaaagtt aacttcaaaa ttagacacaa cattgaagat ggaagcgttc aactagcaga 3300

ccattatcaa caaaatactc caattggcga tggccctgtc cttttaccag acaaccatta 3360

cctgtccaca caatctgccc tttcgaaaga tcccaacgaa aagagagacc acatggtcct 3420

tcttgagttt gtaacagctg ctgggattac acatggcatg gatgaactat acaaatagtg 3480

atttactgcc cacaaactgc ccacttactc tagagtcgac gtccccgggg cagcccgcct 3540

aatgagcggg cttttttcac gtcacgcgtc catggagatc tttgtctgca actgaaaagt 3600

ttatacctta cctggaacaa atggttgaaa catacgaggc taatatcggc ttattaggaa 3660

tagtccctgt actaataaaa tcaggtggat cagttgatca gtatattttg gacgaagctc 3720

ggaaagaatt tggagatgac ttgcttaatt ccacaattaa attaagggaa agaataaagc 3780

gatttgatgt tcaaggaatc acggaagaag atactcatga taaagaagct ctaaaactat 3840

tcaataacct tacaatggaa ttgatcgaaa gggtggaagg ttaatggtac gaaaattagg 3900

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tattgataag atggttgaga cattacctga gagccaaaaa actttttatg aatatgaatt 4200

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taaatccagt aaaaatatga taagattatt tcagaatatg aagaactctg tttgtttttg 4380

atgaaaaaac aaacaaaaaa aatccaccta acggaatctc aatttaacta acagcggcca 4440

aactgagaag ttaaatttga gaaggggaaa aggcggattt atacttgtat ttaactatct 4500

ccattttaac attttattaa accccataca agtgaaaatc ctcttttaca ctgttccttt 4560

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atcttaaata attacttctt tgatttttgg ggctattttt taggtgctga aggaattgcg 4860

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caaacaatcg ctaaaaaaat ggacaagact cctgttacag ttagaggcta cttgaaactg 4980

cttgaaaggt acggttttat ttggaaggta aacgtccgta ataaaaccaa ggataacaca 5040

gaggaatccc cgatttttaa gattagacgt aaggttcctt tgctttcaga agaactttta 5100

aatggaaacc ctaatattga aattccagat gacgaggaag cacatgtaaa gaaggcttta 5160

aaaaaggaaa aagagggtct tccaaaggtt ttgaaaaaag agcacgatga atttgttaaa 5220

aaaatgatgg atgagtcaga aacaattaat attccagagg ccttacaata tgacacaatg 5280

tatgaagata tactcagtaa aggagaaatt cgaaaagaaa tcaaaaaaca aatacctaat 5340

cctacaacat cttttgagag tatatcaatg acaactgaag aggaaaaagt cgacagtact 5400

ttaaaaagcg aaatgcaaaa tcgtgtctct aagccttctt ttgatacctg gtttaaaaac 5460

actaagatca aaattgaaaa taaaaattgt ttattacttg taccgagtga atttgcattt 5520

gaatggatta agaaaagata tttagaaaca attaaaacag tccttgaaga agctggatat 5580

gttttcgaaa aaatcgaact aagaaaagtg caataaactg ctgaagtatt tcagcagttt 5640

tttttattta gaaatagtga aaaaaatata atcagggagg tatcaatatt taatgagtac 5700

tgatttaaat ttatttagac tggaattaat aattaacacg tagactaatt aaaatttaat 5760

gagggataaa gaggatacaa aaatattaat ttcaatccct attaaatttt aacaaggggg 5820

ggattaaaat ttaattagag gtttatccac aagaaaagac cctaataaaa tttttactag 5880

ggttataaca ctgattaatt tcttaatggg ggagggatta aaatttaatg acaaagaaaa 5940

caatctttta agaaaagctt ttaaaagata ataataaaaa gagctttgcg attaagcaaa 6000

actctttact ttttcattga cattatcaaa ttcatcgatt tcaaattgtt gttgtatcat 6060

aaagttaatt ctgttttgca caaccttttc aggaatataa aacacatctg aggcttgttt 6120

tataaactca gggtcgctaa agtcaatgta acgtagcata tgatatggta tagcttccac 6180

ccaagttagc ctttctgctt cttctgaatg tttttcatat acttccatgg gtatctctaa 6240

atgattttcc tcatgtagca aggtatgagc aaaaagttta tggaattgat agttcctctc 6300

tttttcttca acttttttat ctaaaacaaa cactttaaca tctgagtcaa tgtaagcata 6360

agatgttttt ccagtcataa tttcaatccc aaatctttta gacagaaatt ctggacgtaa 6420

atcttttggt gaaagaattt ttttatgtag caatatatcc gatacagcac cttctaaaag 6480

cgttggtgaa tagggcattt tacctatctc ctctcatttt gtggaataaa aatagtcata 6540

ttcgtccatc tacctatcct attatcgaac agttgaactt tttaatcaag gatcagtcct 6600

ttttttcatt attcttaaac tgtgctctta actttaacaa ctcgatttgt ttttccagat 6660

ctcgagggta actagcctcg ccgatcccgc aagaggcccg gcagtcaggt ggcacttttc 6720

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 6780

cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 6840

gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 6900

ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 6960

tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 7020

aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta 7080

ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 7140

agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 7200

gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 7260

gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 7320

gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 7380

tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 7440

ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 7500

cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 7560

gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 7620

cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 7680

tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 7740

aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 7800

aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 7860

gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 7920

cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 7980

ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc 8040

accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 8100

tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 8160

cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 8220

gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 8280

ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 8340

cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 8400

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 8460

ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 8520

ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 8580

ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 8640

gcccaatacg catgc 8655

<210> 9

<211> 386

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 9

Met Gly Ser Ile Gly Ala Ala Ser Met Glu Phe Cys Phe Asp Val Phe

1 5 10 15

Lys Glu Leu Lys Val His His Ala Asn Glu Asn Ile Phe Tyr Cys Pro

20 25 30

Ile Ala Ile Met Ser Ala Leu Ala Met Val Tyr Leu Gly Ala Lys Asp

35 40 45

Ser Thr Arg Thr Gln Ile Asn Lys Val Val Arg Phe Asp Lys Leu Pro

50 55 60

Gly Phe Gly Asp Ser Ile Glu Ala Gln Cys Gly Thr Ser Val Asn Val

65 70 75 80

His Ser Ser Leu Arg Asp Ile Leu Asn Gln Ile Thr Lys Pro Asn Asp

85 90 95

Val Tyr Ser Phe Ser Leu Ala Ser Arg Leu Tyr Ala Glu Glu Arg Tyr

100 105 110

Pro Ile Leu Pro Glu Tyr Leu Gln Cys Val Lys Glu Leu Tyr Arg Gly

115 120 125

Gly Leu Glu Pro Ile Asn Phe Gln Thr Ala Ala Asp Gln Ala Arg Glu

130 135 140

Leu Ile Asn Ser Trp Val Glu Ser Gln Thr Asn Gly Ile Ile Arg Asn

145 150 155 160

Val Leu Gln Pro Ser Ser Val Asp Ser Gln Thr Ala Met Val Leu Val

165 170 175

Asn Ala Ile Val Phe Lys Gly Leu Trp Glu Lys Ala Phe Lys Asp Glu

180 185 190

Asp Thr Gln Ala Met Pro Phe Arg Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Pro

195 200 205

Val Gln Met Met Tyr Gln Ile Gly Leu Phe Arg Val Ala Ser Met Ala

210 215 220

Ser Glu Lys Met Lys Ile Leu Glu Leu Pro Phe Ala Ser Gly Thr Met

225 230 235 240

Ser Met Leu Val Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu

245 250 255

Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn

260 265 270

Val Met Glu Glu Arg Lys Ile Lys Val Tyr Leu Pro Arg Met Lys Met

275 280 285

Glu Glu Lys Tyr Asn Leu Thr Ser Val Leu Met Ala Met Gly Ile Thr

290 295 300

Asp Val Phe Ser Ser Ser Ala Asn Leu Ser Gly Ile Ser Ser Ala Glu

305 310 315 320

Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn

325 330 335

Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Ser Ala Glu Ala Gly Val Asp Ala

340 345 350

Ala Ser Val Ser Glu Glu Phe Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Cys

355 360 365

Ile Lys His Ile Ala Thr Asn Ala Val Leu Phe Phe Gly Arg Cys Val

370 375 380

Ser Pro

385

<210> 10

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgggatcaa taggcgcggc ttcgatggag ttctgcttcg acgtattcaa ggagctaaag 60

gtccaccacg ccaatgagaa tatattctac tgccctatag caataatgtc agcacttgca 120

atggtttatc ttggagcaaa ggacagcaca agaacacaga taaacaaagt tgttagattt 180

gataaacttc ctggatttgg agattcaata gaagcacagt gtggaacatc agttaacgtt 240

cattcatcac ttagagatat acttaaccag ataacaaagc cgaatgatgt ttattcattc 300

agcctagcat caagacttta tgcagaagaa agatatccta tacttcctga atatcttcag 360

tgtgttaaag aactttatag aggaggactt gaacctataa actttcagac agcagcagat 420

caggcaagag aacttataaa ctcatgggtt gaatcacaga caaacggaat aataagaaac 480

gttcttcagc cttcatcagt tgattcacag acagcaatgg ttcttgttaa cgcaatagta 540

ttcaagggcc tttgggagaa ggctttcaaa gatgaagata cacaggcaat gcctttccga 600

gtgacagaac aggaatcaaa gccggtgcag atgatgtatc agataggatt attccgagtg 660

gcatcaatgg catcagagaa gatgaagata ctggagcttc ctttcgcttc tggaacaatg 720

tcaatgcttg ttcttcttcc tgatgaagtt tcaggacttg aacagcttga atcaataata 780

aactttgaga agttaacgga gtggacctct tcgaatgtca tggaggagcg caagattaaa 840

gtatatttgc cgcgcatgaa gatggaggag aagtacaatc ttacatcagt tcttatggca 900

atgggaataa cagatgtgtt ctccagctca gcaaaccttt caggaatatc atcagcagaa 960

tcacttaaga tcagtcaggc agttcatgca gcacatgcag aaataaacga agcaggaaga 1020

gaagttgttg gatcagcaga agcaggagtt gatgcagcat cagtgtctga ggagttccga 1080

gcggaccacc cattcctatt ctgcataaag cacattgcaa caaacgcagt tctcttcttc 1140

ggtcgctgtg tttcacctta a 1161

<210> 11

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaagcttc ctgttccttg gccaacactt 180

gtcactactt tttcttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaagcgg 240

cacgacttct tcaagagcgc catgcctgag ggatacgtgc aggagaggac catcttcttc 300

aaggacgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgagggaga caccctcgtc 360

aacagaatcg agcttaaggg aatcgatttc aaggaggacg gaaacatcct cggccacaag 420

ttggaataca actacaactc ccacaacgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaatag 717

Claims

1.一种提高枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）目的蛋白表达量的方法，其特征在于，敲除或沉默了鞭毛钩帽组件蛋白；以枯草芽孢杆菌168为出发菌株；所述鞭毛钩帽组件蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述目的蛋白包括卵清蛋白OVA或荧光蛋白GFP。

2.权利要求1所述方法在制备卵清蛋白或含卵清蛋白的产品方面的应用。