KR20230016450A - 클로렐라 불가리스 형질전환용 벡터 시스템 - Google Patents

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심진곤
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Abstract

본 발명은 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 형질전환용 벡터 시스템, 이를 이용한 클로렐라 불가리스 형질전환 방법 및 클로렐라 불가리스 형질전환체에 관한 것이다.

Description

클로렐라 불가리스 형질전환용 벡터 시스템 {Vector system for transformation of Chlorella vulgaris}
본 발명은 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 형질전환용 벡터 시스템, 이를 이용한 클로렐라 불가리스 형질전환 방법 및 클로렐라 불가리스 형질전환체에 관한 것이다.
클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris)는 녹조식물문 (Chlorophyta phylum)에 속하는 단세포 미세조류이다. 클로렐라 불가리스는 광합성 기구를 가지고 있어 광합성을 하면서 빛, 이산화탄소, 물 및 소량의 미네랄만으로도 빠르게 생장하기 때문에, 유용물질 대량생산 (photobioreactor)연구에 많이 이용되고 있다.
또한, 바이오매스 (biomass) 당 지질 함량이 약 42% 정도로 높은 편이어서, 바이오디젤 대용으로 쓸 수 있는 바이오연료 개발 연구에도 많이 이용된다. 최근에는 클로렐라 불가리스를 이용하여 방사성 동위원소인 90Sr을 제거할 수 있다는 연구가 발표된 바 있다.
선택 표지로 하이그로마이신 B 내성 유전자 (hygromycin B resistance gene), 제오신 저항성 유전자 (zeocin resistance gene), 클로람페니콜아세틸전달효소 유전자 (chloramphenicol acetyltransferase gene; CAT gene) 등을 이용하여 전기천공 (electroporation)한 결과, 염색체 DNA에 삽입 (integration)되긴 하였으나, 일시적으로 형질전환체가 만들어져서 이내 저항성 (resistance)를 잃어버렸다.
형질전환 방법으로는 유리 비드 (glass beads), 전기천공 및 아그로박테리움-매개 (agrobacterium-mediated) 형질전환 방법 등이 이용되고 있으나, 효율적인 선택 표지 (selectable marker) 및 형질전환 시스템 (transformation system)의 부재로 인하여, 클로렐라 불가리스의 이용이 제한적인 실정이다.
이에 본 발명자들은 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris)의 형질전환 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, Coccomyxa C-169 (이하, C-169; 이전에는 클로렐라 불가리스로 알려져 있었으나 재명명됨)의 프로모터 (Promotor) 및 터미네이터 (terminator) 부위를 예측하여 서열을 얻어내고, Sh ble 유전자와 융합 (fusion)하여 합성하였다. Streptomyces verticillus bleomycin (Sh ble) 유전자의 중간에 어떤 인트론도 삽입하지 않았고, 합성된 DNA 조각 (fragment)은 SwaI/KpnI 제한효소 처리하여 pSP124S 벡터에 클로닝하였고 이를 pKA650으로 명명하였다.
그 다음, 금 입자 충격법 (gold particle bombardment)으로 형질전환 한 후, 제오신이 포함된 배지에서 배양하여 선택적으로 선별하였다. 선별을 통한 배양으로 콜로니를 얻음으로써 형질전환체를 제조하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 클로렐라 불가리스 형질전환용 벡터 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 클로렐라 불가리스 형질전환 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 클로렐라 불가리스 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명은 본 발명은 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 형질전환용 벡터 시스템, 이를 이용한 클로렐라 불가리스 형질전환 방법 및 미세조류 형질전환체에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 클로렐라 불가리스 형질전환용 벡터 시스템에 관한 것이다:
Coccomyxa C-169 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) small subunit 2 (rbcS2) 유전자의 프로모터;
목적 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열; 및
Coccomyxa C-169 rbcS2 유전자의 터미네이터 서열.
본 발명에 있어서 프로모터는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 2의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 있어서 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프로모터는 서열번호 1에 포함된 서열번호 2의 서열의 3'말단에 1 내지 50 bp의 염기를 추가로 포함하는 서열인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 터미네이터 서열은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 3의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 목적 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 결합되어 (operatively linked) 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 용어 “작동적으로 결합된 (operatively linked)”은 핵산 발현 조절 서열 (예를 들어, 프로모터 서열, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명에 있어서 목적 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 터미네이터 서열의 3'말단에 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 벡터 시스템은 선택 표지를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 선택 표지는 항생제 내성 유전자인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 항생제는 스펙티노마이신, 파로모마이신, 앰피실린, 제오신 및 블레오마이신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 선택 표지는 기존의 사용하고자 하는 항생제에 대한 다양한 선택 표지 유전자를 선택할 수 있다. 그 예로는 카나마이신 항생제 내성을 갖게 하는 아미노글라이코사이드 포스포트랜스퍼레이즈, 클로람페니콜 항생제 내성에 관여하는 클로람페니콜 아세틸트렌스퍼레이즈 등이 있다.
본 발명에 있어서 선택 표지가 블레오마이신인 경우, 선택 표지는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 4의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 선택 표지가 도입된 형질 전환된 클로렐라 불가리스를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명에 있어서 벡터 시스템은 리포터 분자를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 리포터 분자는 성장 촉진 단백질, 형광 단백질 및 가수 분해 효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 형광 단백질은 루시퍼라아제인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 가수 분해 효소는 β-글루쿠로니다아제인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 벡터 시스템은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 1의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 벡터 시스템은 금 입자 충격법 (gold particles bombardment)을 이용한 클로렐라 불가리스 형질전환용인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다.
본 발명에 있어서 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으며, 예를 들어, pSP124S 벡터 골격인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 벡터 시스템은 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.
본 발명에 있어서 발현을 위한 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 목적 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
본 발명에 있어서 용어 "실질적인 동일성"은 각각의 염기서열과 임의의 다른 염기서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임의의 다른 염기서열이 각각의 염기서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 양태는 다음 단계를 포함하는 클로렐라 불가리스 형질전환체 제조방법에 관한 것이다:
Coccomyxa C-169 rbcS2 유전자의 프로모터, 목적 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열, 및 Coccomyxa C-169 rbcS2 유전자의 터미네이터 서열을 포함하는 벡터를 클로렐라 불가리스에 도입하는 형질전환 단계.
본 발명에 있어서 형질전환 단계는 금 입자 충격법 (gold particles bombardment)을 이용하여 수행하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 형질전환 단계의 셀 스테이지는 로그 페이즈인 것일 수 있다. 로그 페이즈일 때가 가장 효율이 높다.
본 발명에 있어서 로그 페이즈는 OD686 값이 0.4 내지 0.6, 0.45 내지 0.6, 0.5 내지 0.6, 0.55 내지 0.6, 예를 들어, 0.6인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 형질전환 단계의 세포 밀도는 5.0*106 내지 8.0*107 per 60mm Diameter, 1.0*107 내지 8.0*107 per 60mm Diameter, 2.0*107 내지 8.0*107 per 60mm Diameter, 3.0*107 내지 8.0*107 per 60mm Diameter, 4.0*107 내지 8.0*107 per 60mm Diameter, 1.0*107 내지 7.0*107 per 60mm Diameter, 2.0*107 내지 7.0*107 per 60mm Diameter, 3.0*107 내지 7.0*107 per 60mm Diameter, 4.0*107 내지 7.0*107 per 60mm Diameter, 1.0*107 내지 6.0*107 per 60mm Diameter, 2.0*107 내지 6.0*107 per 60mm Diameter, 3.0*107 내지 6.0*107 per 60mm Diameter, 4.0*107 내지 6.0*107 per 60mm Diameter, 1.0*107 내지 5.0*107 per 60mm Diameter, 2.0*107 내지 5.0*107 per 60mm Diameter, 3.0*107 내지 5.0*107 per 60mm Diameter, 4.0*107 내지 5.0*107 per 60mm Diameter, 예를 들어, 4.8*107 per 60mm Diameter인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 형질전환 단계의 배큠은 27.0 내지 ２9.0 inchs Hg, 배큠은 27.5 내지 ２9.0 inchs Hg, 28.0 내지 ２9.0 inchs Hg, 28.5 내지 ２9.0 inchs Hg, 예를 들어, ２9.0 inchs Hg 인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 형질전환 단계의 타겟 거리는 3 내지 9인 것일 수 있으며, 예를 들어, 3, 6 또는 9인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 형질전환 단계의 압력은 1200 내지 1300 psi, 1210 내지 1300 psi, 1220 내지 1300 psi, 1230 내지 1300 psi, 1240 내지 1300 psi, 1250 내지 1300 psi, 1260 내지 1300 psi, 1270 내지 1300 psi, 1280 내지 1300 psi, 1290 내지 1300 psi, 예를 들어, 1300 psi인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 프로모터는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 2의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 있어서 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프로모터는 서열번호 1에 포함된 서열번호 2의 서열의 3'말단에 1 내지 50 bp의 염기를 추가로 포함하는 서열인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 터미네이터 서열은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 3의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 목적 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 결합되어 (operatively linked) 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 목적 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 터미네이터 서열의 3'말단에 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 벡터는 선택 표지를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 선택 표지는 항생제 내성 유전자인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 항생제는 스펙티노마이신, 파로모마이신, 앰피실린, 제오신 및 블레오마이신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 선택 표지는 기존의 사용하고자 하는 항생제에 대한 다양한 선택 표지 유전자를 선택할 수 있다. 그 예로는 카나마이신 항생제 내성을 갖게 하는 아미노글라이코사이드 포스포트랜스퍼레이즈, 클로람페니콜 항생제 내성에 관여하는 클로람페니콜 아세틸트렌스퍼레이즈 등이 있다.
본 발명에 있어서 선택 표지가 도입된 형질 전환된 클로렐라 불가리스를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명에 있어서 벡터 시스템은 리포터 분자를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 리포터 분자는 성장 촉진 단백질, 형광 단백질 및 가수 분해 효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 형광 단백질은 루시퍼라아제인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 가수 분해 효소는 β-글루쿠로니다아제인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 벡터는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 또는 상기 서열번호 1의 염기서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 형질전환체 제조방법은 클로렐라 불가리스 형질전환체를 유지하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 벡터 시스템에 의해 형질전환된 클로렐라 불가리스 형질전환체에 관한 것이다.
본 발명의 일 예에서, 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 벡터 시스템을 클로렐라 불가리스에 삽입함으로써 형질전환체를 만들 수 있으며, 상기 형질전환체는 상기 벡터 시스템을 클로렐라 불가리스에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 제조방법에 관한 것이다:
Coccomyxa C-169 rbcS2 유전자의 프로모터, 목적 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열; 및 Coccomyxa C-169 rbcS2유전자의 터미네이터 서열을 포함하는 벡터를 클로렐라 불가리스에 도입하는 형질전환 단계; 및
형질전환된 클로렐라 불가리스를 배양하여 목적 단백질을 수득하는 배양 단계.
본 발명에 있어서 목적 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 결합되어 (operatively linked) 있는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 형질전환 단계는 금 입자 충격법 (gold particles bombardment)을 이용하는 것일 수 있다.
본 발명은 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 형질전환용 벡터 시스템, 이를 이용한 클로렐라 불가리스 형질전환 방법 및 클로렐라 불가리스 형질전환체에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 pKA650 벡터지도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 유리 비드 방법을 이용한 형질전환 시 효율성이 떨어지며 형질전환이 잘 이루어 지지 않았음을 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 벡터 시스템으로 저항유전자를 도입하고 이에 대한 형질전환으로 인해 항생제 내성을 갖는 돌연변이체들을 확보한 결과를 보여주는 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 확보된 돌연변이체의 유전적 정보를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 돌연변이체 유지 확인을 위해 계대 배양한 결과를 보여주는 사진다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 pJG002 벡터지도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 실시예 2와 같은 생체탄도학적으로 형질전환을 실시하였고, 이에 대한 계대 배양 후 항생제 내성이 유지하는 것을 농도별로 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 형질전환체의 유전자, 단백질적 발현을 확인하기 위하여, Whole protein SDS-PAGE를 통하여 목적 단백질인 beta-type carbonic anhydrase의 약 43kDa의 밴드사이즈를 확인한 결과 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 목적단백질의 밴드의 확인을 위하여 MALDI-TOF를 실시한 결과 이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 유전자적 확인을 위하여 southern blot을 통해 목적 유전자의 유무를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 야생형과 형질전환체의 Sr 생광물화를 비교한 결과를 보여주는 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 야생형과 형질전환체의 Sr 생광물화의 정량적인 비교를 위하여 ICP-MS를 통하여 분석 결과이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 플라스미드 구축 및 클로닝
방선균 (Streptomyces verticillus)의 지노믹 DNA로부터 블레오마이신 (bleomycin) 내성 유전자 (Sh ble)의 서열을 얻었다. 블레오마이신 내성 유전자의 5’부분에는 Coccomyxa C-169 rbcS2 유전자의 프로모터 서열을, 3’부분에는 Coccomyxa C-169 rbcS2 유전자의 터미네이터 서열을 접합시켜 얻은 전체 서열인 Sh-ble를 합성하였다 (GenScript, 미국). 합성한 유전자를 Swa I 및 Kpn I로 제한효소 처리하여 pSP124S 벡터에 삽입하였다. 수득한 플라스미드를 pKA650이라고 명명하고 백터지도를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 벡터지도의 OriV는 복제 기원 (replication origin), Sh ble는 Streptomyces verticillus bleomycin의 프로모터 및 터미네이터가 결합된 Sh ble 유전자, AmpR은 앰피실린 내성 유전자), C-169-ble는 Coccomyxa C-169 rbcS2 유전자의 프로모터 서열을, 3’부분에는 Coccomyxa C-169 rbcS2 유전자의 터미네이터 부분이다.
제조예 2. 클로렐라 불가리스에 형질전환
2-1. 유리 비드 방법을 이용한 형질전환
Glass bead를 통한 A Simple and Rapid Glass Bead Transformation Method를 사용하였다. 이 방법은 Glass bead를 넣고 물리적 힘을 가하면 세포와의 물리적인 마찰을 통해 세포의 세포막에 구멍을 만들어 원하는 플라스미드를 도입하는 방법이다.
표 1에 기재된 조건에 따라 실험을 진행하였다. 구체적으로, 세포를 상온 (25℃)에서 유리 비드를 통해 볼텍싱을 진행하여 세포의 일부분을 파쇄하였다. 그 다음, 중력으로 비드와 상층액을 분리하여 상층액에 DNA를 첨가하였다. 그 다음, 37℃에서 천천히 회전시키며 회복을 진행시켰다. 항생제가 포함된 고체 배지에 분주한 후, 형질전환체를 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
Date OD686 Cell number Concentration Amount of DNA Vortexing Results
160810 0.1 1*106 cells/ml 1*108 cells/ml 10 ug linearized 15 sec NO
160811 0.3 1*106 cells/ml 1*108 cells/ml 10 ug linearized 10 sec NO
160816 0.3 1*107 cells/ml 1*109 cells/ml 10 ug non-linearized 20 sec NO
도 2에서 확인할 수 있듯이, 효율성이 떨어지며 형질전환이 잘 이루어 지지 않았음을 확인하였다.
2-2. 유전자 총 방법을 이용한 형질전환
식물 형질전환 방법인 유전자 총 (gene gun)을 이용한 금 입자 충격법 (gold particles bombardment)을 사용하여 형질전환을 하였다. 이 기술은 미세입자 가속 또는 생체탄도학이라고도 부르지만, 유전자 총이라고 부르는 기계의 공식명칭은 미세 입자 충격법 (microparticle bombardment)이다. 미세입자로 플라스미드를 감싸 형질전환 하는 방법이다. 미세 입자는 크기에 비해 아주 무겁기 때문에 세포를 잘 뚫고 들어간다. 미세 입자를 고속으로 세포 방향으로 날려 보내면서 주변을 강철 그물로 감싸서, 입자가 세포로 더 많이 날아가도록 한다. 세포 속으로 들어간 미세입자에 코팅된 DNA가 방출되어 식물의 유전체에 들어갈 수 있다. 이 미세입자로 금을 사용하여 형질전환을 하였다.
구체적으로, 하기 표 2과 같이 금 입자 충격법으로 형질 전환을 시키기 위하여 여러 가지 조건을 바꾸어 주며 실험을 진행하였다. 우선 Vacuum과 Helium Pressure는 고정하여, Cell stage와 농도, 금 입자의 분사 범위, Target Distance, 세포의 실험 환경을 고려하여 실험을 진행하였다.
조건을 확립하는 과정에서 Gene gun의 금 입자의 분사 범위와 압력을 고려하여 47mm, 50mm, 60mm으로 실험을 하였고, Target Distance의 거리를 변화에 따라 진행하여 적정위치로 Target Distance 3으로 실험을 진행하였다. 또한 Cell stage가 많이 진행이 되면 미세조류의 막이 두꺼워지게 되어 실험이 어렵기 때문에 초기 stage부터 OD값의 변화에 따라 실험을 진행하였다. 또한 세포의 밀도는 diameter에 따라 조절하여 실험을 진행하였다.
Date OD686 Cell Density Vacuum
(inchs Hg) 		Target Distance Helium Pressure Results
160603 0.5 4.0*107 per 60mm Diameter 29 3,6,9 1300 NO
160607 0.7 6.0*107 per 50mm Diameter 29 3 1300 NO
160607 0.7 6.0*108 per 50mm Diameter 29 6 1300 NO
160607 0.7 6.0*109 per 50mm Diameter 29 9 1300 NO
160613 0.074 3.6*106 per 50mm Diameter 29 3,6,9 1300 NO
160614 0.1 3.6*106 per 50mm Diameter 29 3.6.9 1300 NO
160615 0.2 3.5*106 per 50mm Diameter 29 3.6.9 1300 NO
160616 0.3 4.0*106 per 50mm Diameter 29 3.6.9 1300 NO
160617 0.6 3.6*106 per 50mm Diameter 29 3.6.9 1300 NO
160629 0.1 4.8*107 per 60mm Diameter 29 3.6.9 1300 NO
160630 0.2 4.8*107 per 60mm Diameter 29 3.6.9 1300 NO
160701 0.3 4.8*107 per 60mm Diameter 29 3.6.9 1300 NO
160704 0.6 4.8*107 per 60mm Diameter 29 3.6.9 1300 YES
160711 0.1 1.0*107 per 47mm Membrane 29 3 1300 NO
160712 0.2 1.0*107 per 47mm Membrane 29 3 1300 NO
160713 0.3 1.0*107 per 47mm Membrane 29 3 1300 NO
160714 0.6 1.0*107 per 47mm Membrane 29 3 1300 NO
160815 0.07 2.0*107 per 47mm Membrane 29 3 1300 -
160816 0.1 2.0*107 per 47mm Membrane 29 3 1300 -
160818 0.3 2.0*107 per 47mm Membrane 29 3 1300 -
표 2 및 도 3에서 확인할 수 있듯이, 실패의 경우 항생제가 포함된 고체 배지에서 생장을 하지 못하고, 성공시 콜로니를 형성하게 되는 바, 160704의 조건의 경우에서만 프로모터의 작동 (돌연변이체)를 확인하였다. 그 다음, 동일한 조건을 통해 목적으로 하는 단백질 (Carbonic anhydrase)를 도입하여 돌연변이체를 형성하였다.
실험예 １. 유전적 정보 확인
이의 유전적 정보 확인을 위하여 genomic DNA를 확보하여 PCR과 DNA 시퀀싱을 통해 도입 유전자를 확인하였다. 구체적으로, 유전자를 확인하는 PCR을 수행하기 위하여, 하기 표 3의 프라이머 세트를 제작하고, 프라이머 세트로 98도 8분으로 pre denaturation을 하고, 98도 1분, 53.5도 30초, 72도 1분을 30 cycle 72도 7분으로 PCR을 수행하였고, 이를 시퀀싱 분석을 통하여 확인하였다. 이는 표 1에 나타내었다.
그리고 본 발명자의 목적으로 하는 블레오마이신 내성 유전자의 5’부분에는 Coccomyxa C-169 rbcS2 유전자의 프로모터 서열을, 3’부분에는 Coccomyxa C-169 rbcS2 유전자의 터미네이터 서열을 접합시켜 얻은 전체 서열인 Sh-ble를 확인하기위하여 M13 primer set으로 PCR을 진행하였다. 98도 8분으로 pre denaturation을 하고, 98도 1분, 54도 40초, 72도 2분 30초을 30 cycle 72도 7분으로 PCR을 수행하였고 PCR를 통해 목적 DNA 밴드를 확인하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
서열번호 명명 서열목록 (5'
Figure pat00001
3')		 비고
5 Forward primer ATGGCCAAGTTGACCAGT
6 Reverse primer TCAGTCCTGCTCCTCGGCCA
도 4에서 확인할 수 있듯이, 타겟 유전자의 총 크기인 약 2kb 정도에서 밴드를 확인하였다. 이를 DNA 유전자 분석을 통해 목적 유전자와 일치하는지를 확인하여, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
sh-ble
TF5ble1		 ------------------------------------------------------------
CGGCAATGACTGATTACGCCAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCA
sh-bleTF5ble1 --------------------ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGC
GTGTGCTGGAATTCGCCCTTATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGC
****************************************
sh-bleTF5ble1 GCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCG
GCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCG
************************************************************
sh-bleTF5ble1 TGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCC
TGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCC
************************************************************
sh-ble
TF5ble1		 AGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGC
AGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGC
************************************************************
sh-ble
TF5ble1		 TGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCA
TGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCA
************************************************************
sh-ble
TF5ble1		 TGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCA
TGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCA
************************************************************
sh-bleTF5ble1 ACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGA
ACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGA
***********************************
표 4에서 확인할 수 있듯이, CLUSTAL 2.1 multiple sequence alignment 결과 목적 유전자인 Sh-ble의 DNA 염기서열을 확보한 유전자정보와 대조하였을 때 완전 일치함을 확인하였다.
실험예 ２. 돌연변이체 유지 확인
돌연변이체 유지를 위하여 계대배양을 통하여 돌연변이체 유지를 확인하여, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 확인할 수 있듯이, 돌연변이체 유지를 위하여 계대배양을 통하여 돌연변이체 유지를 확인하였다.
실험예 ３. 생광물화
실시예 1: 플라스미드 구축 및 클로닝
pKA650벡터에 기반하여 목적 단백질에 대한 유전자를 삽입하여 제오신에 대한 내성을 갖으며, 목적단백질을 발현하기 위한 플라스미드 구축 및 클로닝이다. Streptomyces verticillus(Sh ble)의 지노믹 DNA로부터 bleomycin 내성 유전자(Sh ble)의 서열을 얻었다. Coccomyxa C-169 rbcS2(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit) 유전자의 프로모터 및 터미네이터서열을 각각 Sh ble의 5’및 3’부분에 붙여 만들어진 전체 서열을 합성하였다. 이 서열을 pKA650이라고 명명되었고, 합성된 pKA650에서 상기 전체 서열인 Sh-ble의 중간 유전자인 BleoR을 C-169 beta-type carbonic anhydrase 유전자를 치환하여 합성한 뒤, 제한효소 KpnI, ApaI을 사용하여 중복된 프로모터 부분을 삽입하였다. 클로닝 된 플라스미드를 도 6에 나타내었으며, 이를 pJG002라고 명명하였다.
실시예 2: 클로렐라 불가리스 형질전환
pJG002 벡터를 통한 형질전환 방법은 상기 pKA650 벡터를 통한 형질전환 방법과 동일하다.
구체적으로, 감응세포를 만들기 위하여 500m L 플라스크에 300㎖ 멸균 MBM배지(KNO3 2.5mM, MgSO47H2O 0.3mM, K2HPO4 0.43mM, KH2PO4 1.29mM, NaCl 0.43mM, CaCl2*2H2O 0.068mM, FeSO4*7H2O 0.1g, A5 metal mix ml/L)를 준비하고 Chlorella vulgaris을 접종하여 23℃ 및 100 rpm 조건에서 배양하였다. OD686값이 0.5-0.6에 이르면 Chlorella vulgaris 원심분리기로 수득한 후 셀 수를 확인한다.
셀 수를 확인 후 셀 밀도를 4.8*107로 준비한다. 그 후 gold particles bombardment를 위하여 도입할 pKA650을 제한효소 KpnI로 linearized하게 준비한다. 미리 멸균상태로 준비해 놓은 retaining cap, Brass Adjustable Nest, Micro carrier Holder, Stopping screen, Macrocarrier 을 준비하고 Rupture disk는 70% isopropanol로 씻어준다. Rupture disk를 말리고 그 사이 plasmid와 gold particle mixture를 준비한다. 우선 20번의 bombardment를 위하여 gold를 12mg을 Microfuge tube에 넣고, 70% ethanol을 1ml 첨가한다. 5분 동안 최대속도로 vortexing을 해주고 5초 동안 원심분리기를 돌려 상층액을 제거한다.
gold particle을 증류수 1ml, vortex 1분, 1분 동안 세워두고, 5초 원심분리기를 돌린 후 상층액을 제거하는 순으로 3번 반복하여 씻어준다. 그리고 205ul의 50% 글리세롤을 첨가하고, 5분동안 vortex를 통해 풀어준다. vortexing 속도를 2~3으로 해서 vortexing을 지속하며, 10번의 bombardment를 위하여 100ul의 gold particle을 새로운 microfuge tube에 옮긴 후 vortexing을 하면서 10ul DNA (0.5~20ug/ul), 100ul 2.5M CaCl2, 40ul 0.1M spermidine을 순서대로 첨가하면서 파이펫팅으로 섞어준다. 섞은 후 2분동안 vortexing을 지속하고 1분 동안 세워놓는다. 2초 동안 원심분리기로 다운하고 상층액을 제거한다. 상층액이 제거되면 70% ethanol을 300ul 넣고 1분 기다리고 상층액을 제거한 후 100% ethanol을 300ul 넣고 1분을 기다린다. 다시 제거해주고 100% ethanol 110ul을 첨가하여 지속적인 vortexing으로 pellet을 풀어준다.
Gold Particle Mix가 완성이 되면 microcarrier에 11ul를 중앙에 올리고 5~10분 동안 말려준다. 그 사이 준비된 cell을 배지위에 60mm 지름으로 고루 펴준다. 그리고 Brass Adjustable Nest에 Stopping screen을 올리고 다 마른 Microcarrier를 올린다. 그리고 Holder로 고정을 해주고, gene gun instrument를 키고 5분가 예열해 놓는다. 예열이 다 되면 rupture disk를 retaining cap에 넣고 gun부분에 돌려서 끼워준다. 그리고 Microcarrier가 조합된 Brass Adjustable Nest를 끼워넣고 Target distance 3에 cell이 깔려진 배지를 올려놓고 문을 닫는다. 헬륨가스를 열고 vacuum을 눌러준다. vacuum이 29(inchs Hg), Helium Pressure 1300psi가 되면 fire버튼을 누르고 있으면 압력이 올라가 1100psi가 되면 gold particle이 쏘아지게 된다. bombardment 후 배지를 23도 인큐베이션을 통해 회복기를 갖는다.
실시예 3: 클로렐라 불가리스 형질전환체 확인
실시예 2와 같은 생체탄도학적으로 형질전환을 실시하였고, 이에 대한 계대 배양 후 항생제 내성이 유지하는 것을 농도별로 확인하여, 도 7에 나타내었다. 총 형질전환체는 42개의 형질전환체를 확보하였다. 이는 실시예 2에서의 배지를 활용하여 빛을 조사하면서 계대를 지속하였다.
이러한 형질전환체의 유전자, 단백질적 발현을 확인하기 위하여, Whole protein SDS-PAGE를 통하여 목적 단백질인 beta-type carbonic anhydrase의 약 43kDa의 밴드사이즈를 확인하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
이러한 목적단백질의 밴드의 확인을 위하여 MALDI-TOF를 실시하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
본 발명은 형질전환체의 단백질적 발현의 확인하였고, 내성에 대한 계대 유지를 확인함으로 발명을 진행하였고, 유전자적 확인을 위하여 southern blot을 통해 목적 유전자의 유무를 확인하여, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 확인할 수 있듯이, 목적 유전자의 크기와 같은 위치에서 DNA의 밴드를 확인하였고, 이는 PCR을 통한 DNA sequencing으로도 확인하였다.
실시예 4: Sr 생광물화
형질전환체의 기능은 Sr 생광물화에 대한 기능 증대를 제공하기 위하여 생광물화 결정을 현미경을 통해 같은 양에서의 결정화 시각화를 통해 확인하였다. 우선 야생형 (WT)인 Chlorella vulgaris의 Sr 생광물화 능력을 확인하였다.
구체적으로, OD 0.6까지 Chlorella vulgaris를 빛조건에서 배양한다. 배양 후 25도 4000rpm 15분 조건으로 멸균을 유지한 조건에서 미세조류를 모아준다. 그리고 3mM NaHCO3로 3번 미세조류를 씻어준다. 이후 셀을 1*10^7으로 맞추어 준비된 3mM NaHCO3에 Sr 200ppm을 첨가한 뒤 준비된 Chlorella vulgaris를 혼합하여 4도에서 4시간 이상 배양한다. 그리고 sodium rhodizonate 0.004%로 염색하여 현미경을 통해 관찰하여, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 확인할 수 있듯이, WT의 결정화는 형질전환체에 비해 낮은 양의 생광물화 결정을 확인하였다. 또한, 정량적인 비교를 위하여 ICP-MS를 통하여 분석하여, 그 결과를 도 12 및 표 5에 나타내었다.
Remain metal ion rate (%) RSD(%) : Relative Standard Deviation
Control (200 mM LiCl2) 100 0.56
+ algae 45.27667 0.42
도 12 및 표 5에서 확인할 수 있듯이, 형질전환체는 야생형보다 최대 약 160% 증대된 생광물화 결정을 가짐을 확인하였다.
<110> SOGANG UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION <120> Vector system for transformation of Chlorella vulgaris <130> PN210249 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4686 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pka650 <400> 1 agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 60 ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 120 ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 180 ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 240 tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa 300 gctcgaaatt aaccctcact aaagggaaca aaagctggag ctccaccgcg gtggcggccg 360 ctctagaact agtggatccc ccgggctgca ggaattcgat atcaagctta tcgataccgt 420 cgacctcgag atttaaatca tgcagtactt gattctatgc atttagagca tgcagattat 480 aaacacactg ctcttctcag ggcgcaccca tgatggtgtt atattgcgat gtaatagaag 540 taagcacgat gactggtcat gtacctcagg taaaggctat ttactgggca tatgagcctg 600 agcatataca aatttaagtt caatatccaa gtttacccgg tccagcacaa gctaacgtat 660 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tccagcgccg ctcagagttc catccctcat ttccagcgca agaacagcct 1560 tagcaacttt cgatccctac aacttcagtg caatggccaa gttgaccagt gccgttccgg 1620 tgctcaccgc gcgcgacgtc gccggagcgg tcgagttctg gaccgaccgg ctcgggttct 1680 cccgggactt cgtggaggac gacttcgccg gtgtggtccg ggacgacgtg accctgttca 1740 tcagcgcggt ccaggaccag gtggtgccgg acaacaccct ggcctgggtg tgggtgcgcg 1800 gcctggacga gctgtacgcc gagtggtcgg aggtcgtgtc cacgaacttc cgggacgcct 1860 ccgggccggc catgaccgag atcggcgagc agccgtgggg gcgggagttc gccctgcgcg 1920 acccggccgg caactgcgtg cacttcgtgg ccgaggagca ggactgatcg gctgcacaac 1980 gcaattagaa agacctcagt actgtaaatc attagcgaac ctttaaacct gcagattccc 2040 tgtggcttag ctgctccaag gaatagtact ttcaagactg ggggtgcctg cttgtgattg 2100 ctgaactgtt ggtccatgga ttgtcccatt gtctgtgagc acatgctcca cttccacctg 2160 tattggcggt acccaattcg ccctatagtg agtcgtatta caattcactg gccgtcgttt 2220 tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc 2280 cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt 2340 tgcgcagcct gaatggcgaa tggaaattgt aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt 2400 aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta 2460 taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc 2520 actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg 2580 cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact 2640 aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt 2700 ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc 2760 ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc 2820 aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 2880 ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 2940 aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt 3000 ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca 3060 gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag 3120 ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc 3180 ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca 3240 gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt 3300 aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct 3360 gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt 3420 aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 3480 caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 3540 tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 3600 acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga 3660 gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 3720 agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 3780 gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 3840 ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 3900 taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 3960 agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 4020 aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 4080 ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta 4140 gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 4200 aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 4260 aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 4320 gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 4380 aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 4440 aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 4500 cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 4560 cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 4620 tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 4680 tgagtg 4686 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Promoter <400> 2 atgcagatta taaacacact gctcttctca gggcgcaccc atgatggtgt 50 <210> 3 <211> 198 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Terminator <400> 3 cacaacgcaa ttagaaagac ctcagtactg taaatcatta gcgaaccttt aaacctgcag 60 attccctgtg gcttagctgc tccaaggaat agtactttca agactggggg tgcctgcttg 120 tgattgctga actgttggtc catggattgt cccattgtct gtgagcacat gctccacttc 180 cacctgtatt ggcggtac 198 <210> 4 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> selectable marker <400> 4 atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggagcggtc 60 gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120 gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180 aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240 gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300 ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360 gaggagcagg actga 375 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 atggccaagt tgaccagt 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 tcagtcctgc tcctcggcca 20 <210> 7 <211> 6742 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pJG002 <400> 7 agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 60 ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 120 ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 180 ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 240 tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa 300 gctcgaaatt aaccctcact aaagggaaca aaagctggag ctccaccgcg gtggcggccg 360 ctctagaact agtggatccc ccgggctgca ggaattcgat atcaagctta tcgataccgt 420 cgacctcgag atttaaatca tgcagtactt gattctatgc atttagagca tgcagattat 480 aaacacactg ctcttctcag ggcgcaccca tgatggtgtt atattgcgat gtaatagaag 540 taagcacgat gactggtcat gtacctcagg taaaggctat ttactgggca tatgagcctg 600 agcatataca aatttaagtt caatatccaa gtttacccgg tccagcacaa gctaacgtat 660 gctgccgcat agcgcctgtg ccatcatgat ggtcataccc cgtgtcggcg cgttttattg 720 cgtaatgcat gatgtaccgc ccctgccagg cagtgccagc gctgggttct tatatatctt 780 gtaaacctac acggcaattc aatgaagttc agacgtgatg ctcattaatt ataatggcag 840 tgtccacact gtggactcca cagtgtggag tcaactccac accggtgcta ggtatgcaag 900 gatttagtgg gcaaaagctt gctgcaaaat taagggcaaa agaattagac aggcagctgt 960 cagcctcaga cctgagatct gtatgcaaat attgaagact tcagttgtgc ttaccgtggc 1020 acacagtgca cagactgtgc gtggcttaaa tgcatgcatg caaaagtaat attgatatca 1080 ttgatattct tacacgtgca cgctaatcct gtcaggtggc aagatgcgtc tgcagactat 1140 catggcattc atatgactgt agaagctcgg agcttctgca gtcccaggca agtcttactc 1200 gagtcaatga gagtcggagt caagtgagag gcaagcttgc aatctgtacc cgctggtgca 1260 agactatacc ccaattttgc tcagttgacc tgatatctag cggacatgca ccccacccat 1320 ccatgcataa gcgcttcacg tgcatttcac agtgcaaaat ggggaacctt ctggagcacg 1380 ggtagcgctg tttgatgcaa cgctgccacg actgtccatc actcgtttca gggagggttc 1440 cttcccttga ccagggggtc gatacgtctc taattctggt ggtgcttatc cactgtcgag 1500 agggataagt tccagcgccg ctcagagttc catccctcat ttccagcgca agaacagcct 1560 tagcaacttt cgatccctac aacttcagtg caatggccaa gttgaccagt gccgttccgg 1620 tgctcaccgc gcgcgacgtc gccggagcgg tcgagttctg gaccgaccgg ctcgggttct 1680 cccgggactt cgtggaggac gacttcgccg gtgtggtccg ggacgacgtg accctgttca 1740 tcagcgcggt ccaggaccag gtggtgccgg acaacaccct ggcctgggtg tgggtgcgcg 1800 gcctggacga gctgtacgcc gagtggtcgg aggtcgtgtc cacgaacttc cgggacgcct 1860 ccgggccggc catgaccgag atcggcgagc agccgtgggg gcgggagttc gccctgcgcg 1920 acccggccgg caactgcgtg cacttcgtgg ccgaggagca ggactgatcg gctgcacaac 1980 gcaattagaa agacctcagt actgtaaatc attagcgaac ctttaaacct gcagattccc 2040 tgtggcttag ctgctccaag gaatagtact ttcaagactg ggggtgcctg cttgtgattg 2100 ctgaactgtt ggtccatgga ttgtcccatt gtctgtgagc acatgctcca cttccacctg 2160 tattggcggt accaaatcat gcagtacttg attctatgca tttagagcat gcagattata 2220 aacacactgc tcttctcagg gcgcacccat gatggtgtta tattgcgatg taatagaagt 2280 aagcacgatg actggtcatg tacctcaggt aaaggctatt tactgggcat atgagcctga 2340 gcatatacaa atttaagttc aatatccaag tttacccggt ccagcacaag ctaacgtatg 2400 ctgccgcata gcgcctgtgc catcatgatg gtcatacccc gtgtcggcgc gttttattgc 2460 gtaatgcatg atgtaccgcc cctgccaggc agtgccagcg ctgggttctt atatatcttg 2520 taaacctaca cggcaattca atgaagttca gacgtgatgc tcattaatta taatggcagt 2580 gtccacactg tggactccac agtgtggagt caactccaca ccggtgctag gtatgcaagg 2640 atttagtggg caaaagcttg ctgcaaaatt aagggcaaaa gaattagaca ggcagctgtc 2700 agcctcagac ctgagatctg tatgcaaata ttgaagactt cagttgtgct taccgtggca 2760 cacagtgcac agactgtgcg tggcttaaat gcatgcatgc aaaagtaata ttgatatcat 2820 tgatattctt acacgtgcac gctaatcctg tcaggtggca agatgcgtct gcagactatc 2880 atggcattca tatgactgta gaagctcgga gcttctgcag tcccaggcaa gtcttactcg 2940 agtcaatgag agtcggagtc aagtgagagg caagcttgca atctgtaccc gctggtgcaa 3000 gactataccc caattttgct cagttgacct gatatctagc ggacatgcac cccacccatc 3060 catgcataag cgcttcacgt gcatttcaca gtgcaaaatg gggaaccttc tggagcacgg 3120 gtagcgctgt ttgatgcaac gctgccacga ctgtccatca ctcgtttcag ggagggttcc 3180 ttcccttgac cagggggtcg atacgtctct aattctggtg gtgcttatcc actgtcgaga 3240 gggataagtt ccagcgccgc tcagagttcc atccctcatt tccagcgcaa gaacagcctt 3300 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gcttgtgatt gctgaactgt tggtccatgg attgtcccat tgtctgtgag cacatgctcc 4200 acttccacct gtattggcgg tacgggcccc aattcgccct atagtgagtc gtattacaat 4260 tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 4320 cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 4380 cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgga aattgtaagc gttaatattt 4440 tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa 4500 tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt gttgttccag 4560 tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg 4620 tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt ttggggtcga 4680 ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg 4740 gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg 4800 cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc 4860 cgctacaggg cgcgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt 4920 tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc 4980 ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 5040 ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 5100 aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg 5160 gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 5220 ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 5280 gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 5340 cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 5400 cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 5460 acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 5520 caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 5580 taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 5640 ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 5700 aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 5760 agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 5820 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ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 6720 accgtattac cgcctttgag tg 6742

Claims (11)

  1. 다음을 포함하는 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris) 형질전환용 벡터 시스템:
    Coccomyxa C-169 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCo) small subunit 2 (rbcS2) 유전자의 프로모터;
    목적 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열; 및
    Coccomyxa C-169 rbcS2 유전자의 터미네이터 서열.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것인, 벡터 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 결합되어 (operatively linked) 있는 것인, 벡터 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 상기 터미네이터 서열은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것인, 벡터 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 상기 벡터 시스템은 선택 표지로 항생제 내성 유전자를 추가로 포함하는 것인, 벡터 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항생제는 스펙티노마이신, 파로모마이신, 앰피실린, 제오신 및 블레오마이신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 벡터 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 상기 벡터 시스템은 리포터 분자를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것인, 벡터 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 상기 리포터 분자는 성장 촉진 단백질, 형광 단백질 및 가수 분해 효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 벡터 시스템.
  9. 제7항에 있어서, 상기 형광 단백질은 루시퍼라아제인 것인, 벡터 시스템.
  10. 제7항에 있어서, 상기 가수 분해 효소는 β-글루쿠로니다아제 인 것인, 벡터 시스템.
  11. 제1항에 있어서, 상기 벡터 시스템은 금 입자 충격법 (gold particles bombardment)을 이용한 미세조류 형질전환용인 것인, 벡터 시스템.
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