CN113372440A - 一种识别EB病毒gH糖蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗体技术领域，公开了一种识别EB病毒gH糖蛋白的单克隆抗体及其应用。该单克隆抗体或其抗原结合片段与gH蛋白的第573、625、627、655位氨基酸特异性结合；所述gH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。该单克隆抗体或其抗原结合片段的结合活性要优于其他的单克隆抗体(AMMO1、M3和1D8)；对gLgH蛋白有较高亲和力；在上皮细胞感染模型中均有较强中和活性；对细胞膜融合具有显著抑制效果；该单克隆抗体或其抗原结合片段与gH蛋白的第573、625、627、655位氨基酸特异性结合，不同于其他已报道的gLgH中和抗体的识别、结合表位。

Description

一种识别EB病毒gH糖蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于抗体技术领域，具体涉及一种识别EB病毒gH糖蛋白的单克隆抗体及其应用。

背景技术

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)最早于1964年由Epstein和Barr从Burkitt淋巴瘤细胞中成功培养并建株。EBV属于γ亚型疱疹病毒，是首个被发现的人类致癌病毒。EBV在人群中的感染非常普遍，据报道全球约有95％以上的成年人携带有EBV。在儿童和青少年中，EBV感染多造成传染性单核细胞增多症。EBV的潜伏感染与人类多种淋巴肿瘤和上皮肿瘤发生有关，如霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤及NK/T细胞淋巴瘤等，上皮肿瘤包括鼻咽癌和大约10％的胃癌等。而对于器官移植病人以及艾滋病患者等免疫抑制病人来说，罹患EBV相关肿瘤的概率大大增加。据统计，全球每年新增约200000例EBV相关的肿瘤病例，美国国立卫生研究院NIH已于2016年正式将EBV列入第14版致癌物名录。

目前针对EB病毒尚无有效的疫苗，由EBV感染引起的疾病也缺乏特异的治疗手段。传染性单核细胞增多症的治疗大多应用抗病毒药物如阿昔洛韦等，虽然可一定程度上缓解症状，但并不能消除B淋巴细胞内及咽喉部上皮的EB病毒。EBV相关肿瘤的治疗主要为化疗和放疗，但对于复发或转移的患者来说，疗效较差。

单克隆抗体可大量生产，其与抗原结合的高亲和性和高特异性，大大减少了临床应用时的不良反应。同时可以对抗体分子进行改造以增加其抗病毒效力。抗体以其特异性和使用的灵活性成为感染性疾病治疗中非常有前景的手段。而至今仍未有针对EBV囊膜糖蛋白的单克隆抗体上市。因此开发抗EBV的单克隆抗体，将为EBV感染相关疾病提供更有效的预防和治疗手段。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一种单克隆抗体或其抗原结合片段。

本发明第二方面的目的，在于提供编码本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

本发明第三方面的目的，在于提供一种包含本发明第二方面的核酸分子的载体。

本发明第四方面的目的，在于提供一种包含本发明第三方面的载体的宿主细胞。

本发明第五方面的目的，在于提供一种杂交瘤细胞株。

本发明第六方面的目的，在于提供一种包含本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的偶联物。

本发明第七方面的目的，在于提供本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或本发明第六方面的偶联物在制备产品中的应用。

本发明第八方面的目的，在于提供一种包含本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或本发明第六方面的偶联物的试剂盒。

本发明第九方面的目的，在于提供一种包含本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或本发明第六方面的偶联物的药物。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与gH蛋白的第573、625、627、655位氨基酸特异性结合；

所述gH蛋白的氨基酸序列为：MQLLCVFCLVLLWEVGAASLSEVKLHLDIEGHASHYTIPWTELMAKVPGLSPEALWREANVTEDLASMLNRYKLIYKTSGTLGIALAEPVDIPAVSEGSMQVDASKVHPGVISGLNSPACMLSAPLEKQLFYYIGTMLPNTRPHSYVFYQLRCHLSYVALSINGDKFQYTGAMTSKFLMGTYKRVTEKGDEHVLSLIFGKTKDLPDLRGPFSYPSLTSAQSGDYSLVIVTTFVHYANFHNYFVPNLKDMFSRAVTMTAASYARYVLQKLVLLEMKGGCREPELDTETLTTMFEVSVAFFKVGHAVGETGNGCVDLRWLAKSFFELTVLKDIIGICYGATVKGMQSYGLERLAAMLMATVKMEELGHLTTEKQEYALRLATVGYPKAGVYSGLIGGATSVLLSAYNRHPLFQPLHTVMRETLFIGSHVVLRELRLNVTTQGPNLALYQLLSTALCSALEIGEVLRGLALGTESGLFSPCYLSLRFDLTRDKLLSMAPQEAMLDQAAVSNAVDGFLGRLSLEREDRDAWHLPAYKCVDRLDKVLMIIPLINVTFIISSDREVRGSALYEASTTYLSSSLFLSPVIMNKCSQGAVAGEPRQIPKIQNFTRTQKSCIFCGFALLSYDEKEGLETTTYITSQEVQNSILSSNYFDFDNLHVHYLLLTTNGTVMEIAGLYEERAHVVLAIILYFIAFALGIFLVHKIVMFFL(SEQ ID NO.11)。

优选地，所述gH蛋白为gHgL蛋白中的gH蛋白。

优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3；

所述重链可变区CDR1的氨基酸序列为：GFDFSRYW(SEQ ID NO:12)；

所述重链可变区CDR2的氨基酸序列为：INPDSSTI(SEQ ID NO:13)；

所述重链可变区CDR3的氨基酸序列为：ARSPYYYGSSYDV(SEQ ID NO:14)；

所述轻链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3；

所述轻链可变区CDR1的氨基酸序列为：QSLLNSRTRKNY(SEQ ID NO:15)；

所述轻链可变区CDR2的氨基酸序列为：WAS(SEQ ID NO:16)；

所述轻链可变区CDR3的氨基酸序列为：KQSYNLPT(SEQ ID NO:17)。

优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区；

所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明的第二个方面，提供编码本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

本发明的第三个方面，提供一种载体，包含本发明第二方面的核酸分子。

本发明的第四个方面，提供一种宿主细胞，包含本发明第三方面的载体。

本发明的第五个方面，提供一种偶联物，包含本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段及偶联部分，所述偶联部分为可检测的标记。

优选地，所述偶联部分为放射性同位素、发光物质、有色物质或酶。

优选地，所述发光物质为荧光物质。

本发明第六方面，提供本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或本发明第五方面的偶联物在制备产品中的应用。

优选地，所述产品包括试剂盒、药物。

优选地，所述试剂盒用于检测：

a)gH蛋白在样品中的存在或水平；或

b)EB病毒。

优选地，所述gH蛋白为gHgL蛋白中的gH蛋白。

优选地，所述药物用于治疗和/或预防EB病毒感染所引起的疾病。

优选地，所述疾病包括：鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、淋巴组织增生性疾病、传染性单核细胞增多症。

本发明的第七个方面，提供一种试剂盒，包含本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或本发明第五方面的偶联物。

本发明的第八个方面，提供一种药物，包含本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或本发明第五方面的偶联物。

优选地，所述药物还包含药学上可接受的载体。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段的结合活性要优于其他的单克隆抗体(AMMO1、M3和1D8，EC50为13.36ng/mL)；对gLgH蛋白有较高亲和力(平衡解离常数(K_D)为2.80nM)；在上皮细胞和B细胞感染模型中均有较强中和活性：在上皮细胞感染模型的IC50分别为0.1084μg/mL；对细胞膜融合具有显著抑制效果；该单克隆抗体或其抗原结合片段与gH蛋白的第573、625、627、655位氨基酸特异性结合，不同于其他已报道的gLgH中和抗体的识别、结合表位。

附图说明

图1是不同单抗(6H2、10C3、10F3)的EC50检测结果图。

图2是不同单抗(6H2、AMMO1、M3、1D8)的EC50检测结果图。

图3是单抗6H2与gLgH蛋白结合的动力学分析图。

图4是不同单抗(6H2、mIgG)与共转了gH、gL蛋白全长基因质粒的293T细胞反应活性鉴定结果图。

图5是不同单抗的表位竞争结果图。

图6是不同单抗在EBV感染的上皮细胞模型的中和结果图。

图7是不同单抗在细胞融合模型的阻断结果图。

图8是嵌合单抗C6H2的EC50检测结果图。

图9是嵌合单抗C6H2与gLgH蛋白结合的动力学分析图。

图10是嵌合单抗C6H2在EBV感染的上皮细胞模型的中和结果图。

图11是NSG人源小鼠模型构建及抗体治疗实验流程图。

图12是不同治疗方案的小鼠外周血中DNA拷贝数变化图：其中，A是经单抗C6H2治疗后的小鼠外周血中DNA拷贝数变化图；B是经单抗AMMO1治疗后的小鼠外周血中DNA拷贝数变化图；C是经单抗2G4治疗后的小鼠外周血中DNA拷贝数变化图；D是经PBS治疗后的小鼠外周血中DNA拷贝数变化图。

图13是不同治疗方案的小鼠体重变化图：其中，**表示P<0.01；****表示P<0.0001；ns表示P≥0.05。

图14是不同治疗方案的小鼠生存率变化图：其中，***表示P<0.001；ns表示P≥0.05。

图15是不同治疗方案的小鼠脾脏形态变化、H&E染色和EBER原位杂交结果图。

图16是gLgH蛋白特异性中和抗体的识别表位比较图。

图17是单抗6H2的识别表位分析图。

图18是单抗6H2与丙氨酸点突变的gLgH蛋白ELISA反应结果图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1抗EB病毒gLgH蛋白单克隆抗体(单抗)的制备

(1)蛋白抗原的制备：参考EB病毒M81毒株全基因序列(KF373730.1)将gL蛋白膜外区序列(对应病毒BKRF2基因aa24-aa137)C端通过柔性氨基酸序列连接gH蛋白膜外区序列(对应病毒BXLF2基因aa19-aa678)，gL蛋白的N端连接上信号肽编码序列，gH蛋白的C端连接上便于亲和层析纯化的多聚组氨酸多肽(6×His)，将以上序列构建到合适的真核表达载体，把构建成功的重组质粒转染至293F细胞表达并进行纯化，最终获得gLgH蛋白(gLgH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括：gH蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示)，链接序列(氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS，SEQ ID NO.18)，gL蛋白(氨基酸序列如SEQ IDNO.19所示)，标签蛋白(氨基酸序列为HHHHHH，SEQ ID NO.20)。

(2)杂交瘤的制备：采用标准的体内免疫方式和PEG融合方法获得单克隆抗体(详细方法参见Ed Harlow et al.,“Antibodies A Laboratory Manual”,Cold SpringHarbor Laboratory 1988)，简要过程如下：

1)小鼠免疫：将步骤(1)制备得到的gLgH蛋白按照100μg/只剂量对小白鼠(6周龄雌性Balb/c鼠，由厦门大学实验动物中心提供)进行免疫：将gLgH蛋白与弗氏完全佐剂(CFA)等体积混合乳化，经皮下多点注射，每只小鼠共注射400μL，首次免疫后，分别于第14、28d，将gLgH蛋白与弗氏不完全佐剂(IFA)等体积混合后进行加强免疫，经皮下多点注射，每只小鼠共注射400μL；最后于第42d对小鼠进行脾脏免疫加强，免疫原为上述gLgH蛋白，按照50μg/只剂量注射，每只小鼠注射100μL，3d后取小鼠脾脏进行融合实验；

2)细胞融合及杂交瘤筛选：取小鼠脾脏研磨得到脾细胞悬液，与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，经PEG1500作用下进行细胞融合，融合细胞重悬于200ml融合培养基(含HAT和20％FBS的RPMI1640完全筛选培养基)，分装到10块96孔细胞培养板中培养，经3次克隆化后，通过ELISA方法筛选得到稳定的单克隆抗体细胞株A1、A2、A3；

3)杂交瘤的培养：将步骤2)得到的稳定的单克隆抗体细胞株A1、A2、A3先在二氧化碳培养箱中扩增培养，经96孔转移至24孔，再转移至50mL细胞培养瓶扩增培养然后收集细胞瓶内的细胞注射到小鼠腹腔内，7～10天后从小鼠腹腔中吸取腹水；

4)单克隆抗体的纯化：腹水先用50％的硫铵沉淀处理，然后用PBS将沉淀溶解，之后经Protein A柱在AKTA系统下纯化，得到纯化后的单克隆抗体6H2(单克隆抗体细胞株A1产生)、10F3(单克隆抗体细胞株A2产生)、10C3(单克隆抗体细胞株A3产生)，经SDS-PAGE鉴定纯化后的单克隆抗体纯度；

5)不同细胞株产生的抗体的ELISA检测：将gLgH蛋白用CB缓冲液(NaHCO₃/Na₂CO₃缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，终浓度为2μg/mL；在96孔酶标板每孔中加入100μL的包被液，37℃包被2小时；用PBST洗涤液(20mM PBS7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次；然后每孔加入200μL的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mMNa₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时；弃去封闭液；干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。分别取步骤4)得到的单克隆抗体6H2、10F3、10C3，以20mM PBS缓冲液从1μg/mL为起始浓度开始2倍梯度稀释，共稀释12个梯度；取已包被gLgH蛋白的酶标板，每孔加入100μL已稀释的抗体，置于37℃温箱反应30min。将酶标板用PBST洗液(20mM PBS7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG反应液，置于37℃温箱反应30min。完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mM PBS7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μL，置于37℃温箱反应15min。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值，结果如图1所示：单克隆抗体6H2、10C3、10F3的EC50为13.36ng/mL、43.71ng/mL、208.20ng/mL，可见，单克隆抗体6H2的结合活性明显优于10C3、10F3，因此，选择杂交瘤细胞A1及其抗体6H2。

实施例2抗EB病毒gLgH蛋白的单克隆抗体6H2轻链基因和重链基因的分离与序列分析

半贴壁培养约10⁷个杂交瘤细胞，吹起贴壁细胞使其悬浮，悬液转移到新的4mL离心管中，1500rpm离心3min，收集细胞沉淀，重悬于100μL无菌PBS中，转移到新的1.5mL离心管中；加入800uL Trizol(Roche,Germany)，轻轻颠倒混匀，静置10min；加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，静置10min，4℃12000rpm离心15min，转移上层液体至新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，静置10min；4℃12000rpm离心10min，弃上清，加入600μL 75％乙醇洗涤，4℃12000rpm离心5min，弃上清，沉淀于60℃烘干5min；透明的沉淀溶于70μL焦碳酸二乙酯(DEPC)中，分装成两管。每管加入1uL10μM反转录引物,其中一管加入的反转录引物为MuIgκVL3’-1(5'-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3'，SEQ ID NO.3)，用于扩增轻链可变区基因，另一管加入的反转录引物为MuIgGVH3'-2(5'-CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG-3'，SEQ ID NO.4)，用于扩增重链可变区基因；每管再加入1uL dNTP，置72℃水浴10min，立即放到冰浴中置5min,加入10μL 5x反转录缓冲液，1uLAMV酶(10u/μL,Promega)，1μL RNA酶抑制剂(RNasin，40u/μL，Promega)，混匀后于42℃将RNA反转录成cDNA。

抗体基因可变区的分离采用聚合酶链式反应(PCR)法：使用相应配对引物，以上述的cDNA为模板进行PCR扩增：其中，重链配对引物：上游引物：5'-ACTAGTCGACATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG-3'(SEQ ID NO.21)；下游引物：5'-CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGG-3'(SEQ ID NO.22)；轻链配对引物：上游引物：5'-ACTAGTCGACATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG-3'(SEQ ID NO.23)；下游引物：5'-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3'(SEQID NO.24)；PCR反应体系：Takara Taq(R500A)0.25μL；10x PCR buffer 5μL；模板50ng；上/下游引物各1μL(10nM)；灭菌水至50μL；PCR反应程序：95℃10s；98℃10s，55℃30s，72℃30s，30次循环；72℃10min；4℃保存。回收目的片段并克隆至pMD 18-T载体，送至厦门铂瑞公司测序，测序结果通过Vbase2数据库(http://www.vbase2.org/)分析抗体CDR区(complementary determinant region，互补决定区)序列；单克隆抗体6H2的重链可变区(VH)为：EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMTWVRQAPGQGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQVSKLRSEDTALYYCARSPYYYGSSYDVWGAGTAVTVSS(SEQ ID NO.5)，下划线部分为CDR区；单克隆抗体6H2的轻链可变区(VH)为：DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMNCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAFYYCKQSYNLPTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.6)。

实施例3中和抗体6H2与其他抗体AMMO1、M3、1D8的EC50对比

将gLgH蛋白用CB缓冲液(NaHCO₃/Na₂CO₃缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，终浓度为2μg/mL；在96孔酶标板每孔中加入100μL的包被液，37℃包被2小时；用PBST洗涤液(20mM PBS7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次；然后每孔加入200μL的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时；弃去封闭液；干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。分别取单克隆抗体6H2、AMMO1(AMMO1制备方法参考文献Snijder et al.,2018,Immunity 48,799–811；AMMO1轻链的PDB：6C5V_L；AMMO1轻链的PDB：6C5V_H)、M3(已在专利文献CN111548411A中公开)、1D8(已在专利文献CN111690056A中公开)，以20mM PBS缓冲液从1μg/mL为起始浓度开始2倍梯度稀释，共稀释12个梯度；取已包被gLgH蛋白的酶标板，每孔加入100μL已稀释的抗体，置于37℃温箱反应30min。将酶标板用PBST洗液(20mM PBS7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG反应液，置于37℃温箱反应30min。完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mM PBS7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μL，置于37℃温箱反应15min。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值，结果如图2所示：单抗6H2、AMMO1、M3、1D8的EC50分别为13.36ng/mL、25.46ng/mL、105.40ng/mL、20.57ng/mL；表明6H2的结合活性要优于AMMO1、M3和1D8。

实施例4抗EB病毒gLgH蛋白6H2单克隆抗体对gLgH蛋白的亲和力检测

采用Biacore 8K系统对单克隆抗体(6H2)和抗原进行结合的动力学分析(具体方法参照说明书)，所有步骤都在PBS缓冲液下进行，采用该公司配套的Protein A芯片捕获稀释为1μg/mL的单克隆抗体，使用gLgH蛋白作为检测抗原，检测6H2对gLgH蛋白的亲和力时抗原分别稀释为50nM、25nM、12.5nM、6.75nM、3.125nM，检测按照下述程序进行：捕获(Captue)60s，分析(Analyte)300s，解离(Dissociation)600s，再生(Regeneration)60s。采用仪器配套数据采集和分析软件进行抗体平衡解离常数的计算。

结果如图3所示，单抗6H2对gLgH蛋白的平衡解离常数(K_D)为2.80nM，有较高亲和力。

实施例5抗EB病毒gLgH蛋白6H2单克隆抗体用于检测细胞中表达的gLgH蛋白

(1)将293T接种到10cm细胞培养板中，待细胞汇合率达到60～80％时进行转染。

(2)A管：2mL Opti-MEM中分别加入30μg gH、gL蛋白全长基因的真核表达质粒(pTT5-gH质粒，序列如SEQ ID NO.25所示；pTT5-gL质粒，序列如SEQ ID NO.26所示)。

(3)B管：2mL Opti-MEM中加入60μL诺唯赞公司

TransfectionReagent。

(4)将A、B管分别轻柔混匀，室温静置5min，再将稀释好的质粒(A管)滴加至稀释的转染试剂(B管)中，轻柔混匀，室温孵育10min。

(5)将质粒-转染试剂复合物滴加至细胞中，置于5％CO₂浓度，37℃细胞培养箱中培养。

(6)转染48h后，用胰酶消化细胞，按照5x10⁵细胞/管标准加入3μg单抗(以mIgG作为对照组，mIgG对照为72A1，已在文献：Monoclonal antibody against a 250,000-daltonglycoprotein of Epstein-Barr virus identifies a membrane antigen and aneutralizing antigen中公开，通过杂交瘤细胞株HB-168细胞(ATCC)得到)并用PBS补足到100μL，4℃孵育30min，每管加入1mL PBS缓冲液洗涤细胞，1500rpm，5min，4℃离心，弃去上清保留细胞，共洗涤3次。

(7)每管样品中加入FITC荧光染料标记的羊抗鼠IgG二抗2μL，4℃避光孵育30min，每管加入1mL PBS缓冲液洗涤细胞，1500rpm，5min，4℃离心，弃去上清保留细胞，共洗涤3次。

(8)用1mL PBS重悬细胞，使用BD公司的流式细胞仪LSRFortessaX-20检测FITC阳性细胞比例。

结果如图4所示，单抗6H2对共转了gH、gL蛋白全长基因质粒的293T细胞有明显反应，而对照组(Ctrl mIgG)没有反应性，说明6H2能特异识别表达在细胞表面的天然gH、gL蛋白。

实施例6抗EB病毒gLgH蛋白6H2单克隆抗体与其他gLgH蛋白中和抗体(AMMO1)表位竞争鉴定

(1)辣根过氧化物酶(HRP)偶联抗体制备：以浓度为1mg/mL的目的抗体(6H2、AMMO1)1mg在4℃条件透析至CB缓冲液(NaHCO₃/Na₂CO₃缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)，每隔4小时换液一次，共换液两次；分别将HRP干粉和NaIO4干粉，用超纯水溶解至20mg/mL，再将两种溶液按照体积比1:1混匀，4℃避光孵育30min进行HRP活化，加入乙二醇终止HRP活化，按照20mg HRP中加入20μL乙二醇为标准加入相应量乙二醇，室温避光孵育30min；往抗体溶液中加入1mg终止活化后的HRP，混合均匀后在4℃条件透析至CB缓冲液，每隔4小时换液一次，共换液两次；使用超纯水配制浓度为20mg/mL的NaBH₄溶液，在以上抗体溶液中加入10μL NaBH4溶液终止酶标反应，在4℃条件下，每隔30min混匀一次，共混匀3次；加入等体积饱和硫酸铵溶液沉降酶标抗体，12000rpm离心10min，弃去上清，用PBS缓冲液配制成的终浓度为50％甘油，10％NBS(新生牛血清)的缓冲液重悬溶解饱和硫酸铵沉淀的抗体。

(2)反应板的制备：将gLgH蛋白用CB缓冲液(NaHCO₃/Na₂CO₃缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，终浓度为0.1μg/mL；在96孔酶标板每孔中加入100μL的包被液，37℃包被2小时；用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次；然后每孔加入200μL的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液溶液)，放入37℃封闭2h后弃去封闭液；干燥后装入铝箔袋2～8℃保存备用。

(3)gLgH蛋白中和抗体表位竞争检测：取步骤(1)得到的辣根过氧化物酶(HRP)偶联抗体标记的单克隆抗体(6H2、AMMO1)，以20mM PBS缓冲液按照1:100比例开始稀释，并5倍梯度稀释，共稀释8个梯度；取已包被gLgH蛋白的酶标板，每孔加入100μL已稀释的抗体样品，置于37℃温箱反应30min；将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μL，置于37℃温箱反应15min；完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。选择OD值在1左右对应的HRP标记抗体的稀释倍数作为后续使用的稀释倍数。

(4)取单抗6H2、已报道抗体72A1(针对EB病毒gp350糖蛋白的鼠源中和单抗，已在文献：Monoclonal antibody against a 250,000-dalton glycoprotein of Epstein-Barr virus identifies a membrane antigen and a neutralizing antigen中公开，通过杂交瘤细胞株HB-168细胞(ATCC)得到)、AMMO1(针对EB病毒gLgH糖蛋白的人源中和单抗，AMMO1制备方法参考文献Snijder et al.,2018,Immunity 48,799–811)、VRC01(针对HIV病毒gp120糖蛋白的人源中和单抗，已在文献：Rational Design of Envelope IdentifiesBroadly Neutralizing Human Monoclonal Antibodies to HIV-1中公开，其重链可变区的GenBank：GU980702.1，轻链可变区的GenBank：GU980703.1)，以20mM PBS缓冲液分别稀释为10μg/mL，取已包被gLgH蛋白的酶标板，每孔加入100μL已稀释的抗体样品(6H2、72A1、AMMO1、VRC01)，命名为“Primary antibody(一抗)，”置于37℃温箱反应30min；将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μL 1000倍稀释后的HRP标记抗体(6H2、AMMO1)，命名为“Secondary antibody”(二抗)，置于37℃温箱反应30min；完成HRP标记抗体反应步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μL，置于37℃温箱反应15min。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。抗体的竞争率计算公式为：竞争率％＝[OD_{(-Primary/+Secondary)}－OD_{(+Primary/+Secondary)}]/OD_{(-Primary/+Secondary)}x100，OD_{(-Primary/+Secondary)}表示单纯二抗的反应值，OD_{(+Primary/+Secondary)}表示预先加入一抗孵育后再加入二抗孵育的反应值；结果如图5所示：表明6H2识别表位不同于已报道的gLgH中和抗体AMMO1。

实施例7抗EB病毒gLgH蛋白6H2单克隆抗体在病毒感染模型的中和能力

(1)EBV的上皮细胞中和模型：采用10％FBS DMEM培养基将HNE1细胞按照160μL体积，5000细胞每孔标准铺板到96孔板中，置于37℃培养箱培养24小时，待细胞贴壁后，以DMEM无血清培养基稀释单抗(6H2、AMMO1、10C3)，从100μg/mL为起始浓度开始2倍梯度稀释，共稀释12个梯度；吸取20μL不同浓度的稀释抗体(对照组加入等量DMEM无血清培养基)与20μL AKATA细胞生产的EBV病毒悬液(制备方法参照文献：Development of a robust,higherthroughput green fluorescent protein(GFP)-based Epstein-Barr Virus(EBV)micro-neutralization assay)充分混合，37℃孵育3小时，得到混合液；将抗体与病毒的混合液加入铺有HNE1细胞的96孔板中，置于37℃培养箱中培养，48小时后，消化96孔板中的HNE1细胞，使用BD公司的流式细胞仪LSRFortessaX-20检测表达GFP绿色荧光蛋白的HNE1细胞比例，与感染对照组相比抗体处理组的GFP阳性细胞数量减少比例，计算抗体在上皮细胞感染模型的抑制率(％)，结果如图6所示：单抗6H2、AMMO1在上皮细胞感染模型的IC50分别为0.1084μg/mL，0.0828μg/mL，对照抗体10C3则无中和效果。

上述结果表明：单克隆抗体6H2在上皮细胞和B细胞感染模型中均有较强中和活性。

实施例8抗EB病毒gLgH蛋白6H2单克隆抗体在细胞融合模型的阻断能力分析

(1)将293T接种到10cm细胞培养板中，待细胞汇合率达到60～80％时进行转染。

(2)A板：使用PEI为转染试剂，分别准备2.5μg的携带全长gB、gH、gL基因以及T7RNA poly merase的真核表达质粒(分别为pCAGGS-gB(gB的登录号：BAU51603.1；载体：pCAGGS)、pCAGGS-gH(gH的登录号：BAU51590.1；载体：pCAGGS)、pCAGGS-gL(gL的登录号：BAU51568.1，载体：pCAGGS)、pCAGSS-T7(T7的登录号：CP053597.1，载体：pCAGGS)，具体构建方法参考文献：Fusion of epithelial cells by Epstein–Barr virus proteins istriggered by binding of viral glycoproteins gHgL to integrinsαvβ6orαvβ8)并进行转染。

(3)B板：使用PEI为转染试剂，在293T细胞中转染10μg含T7启动子控制的Luciferase基因的真核表达质粒(pCAGSS-T7-luc(Luciferase的登录号：M15077.1，载体：pCAGGS)具体构建方法参考文献：Fusion of epithelial cells by Epstein–Barr virusproteins is triggered by binding of viral glycoproteins gHgL to integrinsαvβ6orαvβ8)。

(4)转染24小时后，消化A板的293T细胞，并按照每组2x10⁵个细胞的比例分装到EP管中，分别加入200μL0.5、0.1、0.02、0.004μg/μL的抗体(6H2、AMMO1以及IgG(阴性对照组)，空白对照组加入等量的PBS)，置于37℃培养箱孵育30min后转移到24孔板中。

(5)将B板细胞提前消化，在上述24孔板每孔中加入2x10⁵个细胞，37℃培养24小时。

(6)取Promega公司的Dual-Glo Luciferase Assay System试剂盒中的萤火虫荧光素酶底物100μL加入24孔板中，室温裂解20min，每孔取80μL的细胞裂解上清进行化学发光定量检测。

计算出与未处理的空白对照组相比，抗体处理组的化学发光读值减少的比例，计算抗体在细胞融合模型的阻断效率(％)。

结果如图7所示，单抗6H2、AMMO1对细胞膜融合具有显著抑制效果，6H2在抗体用量只有0.8μg条件下，也能完全抑制膜融合(图7中Cell(Luc)表示细胞单纯转染含T7启动子控制的luciferase基因的真核表达质粒；Cell(gB)表示细胞单纯转染携带全长gB基因的真核表达质粒)。

实施例9抗EB病毒gLgH蛋白6H2单克隆抗体嵌合抗体改造及评价

构建包含鼠源单抗6H2可变区序列和人源IgG1亚型恒定区序列基因的嵌合抗体：采用Gibson装配方法将鼠源单抗6H2轻重链可变区基因构建到相应真核表达载体pTT5-hIgG1-H、pTT5-hIgG1-K，其中，pTT5-hIgG1-H包含编码人源IgG1亚型单抗重链恒定区的核酸序列，pTT5-hIgG1-K包含编码人源IgG1亚型单抗κ轻链恒定区的核酸序列，将构建成功的轻重链重组质粒按照1:1比例转染至293F细胞表达并通过Protein A柱进行纯化，将构建后的嵌合单抗命名为C6H2：C6H2的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，C6H2的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，C6H2的重链恒定区为：ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.7)，C6H2的轻链恒定区为：RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDSALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO.8)；即C6H2的重链序列如SEQ ID NO.27所示；C6H2的轻链序列如SEQ ID NO.28所示。

采用实施例1中步骤5)的方法测定嵌合单抗C6H2与gLgH蛋白的结合活性，结果如图8所示：C6H2与gLgH蛋白的EC50为26.62ng/mL，具有高结合活性；采用实施例4的方法测定嵌合单抗C6H2的平衡解离常数，结果如图9所示：单抗C6H2与gLgH蛋白保持高亲和力，平衡解离常数(K_D)达到11.5nM；采用实施例7的方法测定嵌合单抗C6H2在EB病毒感染上皮细胞的中和效果，结果如图10所示：C6H2在上皮细胞感染模型中具有高中和活性。

实施例10抗EB病毒gLgH蛋白的嵌合单抗C6H2在人源化小鼠模型中的保护效果

(1)嵌合单抗在人源化小鼠模型中的治疗流程(如图11所示)：取NSG小鼠人源化模型(由北京艾德摩生物技术有限公司构建：方法如下：取人脐带血外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)来源的CD34阳性细胞，通过尾静脉注射方式接种至预先用白消安清髓处理的4～5周龄的NSG小鼠中，经过8周时间的人源免疫系统重构，采集NSG小鼠眼眶血，鉴定其人源免疫细胞的比例，当人源CD45阳性的免疫细胞比例在10％～20％时，NSG小鼠人源化模型构建成功)后，按照每只小鼠10mg/kg的剂量在小鼠腹腔注射抗体(6H2、AMMO1、2G4(序列为专利文献(DNAANTIBODY CONSTRUTS FOR USE AGAINSTEBOLAVIRUS，US2020/0216519A1)中SEQ ID NO.1)、PBS(对照组))，每组设置8只小鼠，抗体注射后24h，通过尾静脉注射100μL的1000TD50(50％Transforming Dose)剂量的AKATA来源EB病毒(制备方法参照文献：Development of a robust,higher throughput greenfluorescent protein(GFP)-based Epstein-Barr Virus(EBV)micro-neutralizationassay)；病毒注射后每隔一周按照每只小鼠10mg/kg的剂量在小鼠腹腔注射抗体，连续注射4周。每周采集小鼠眼眶血，并监测体重。病毒注射后6～7周对NSG小鼠进行安乐死处理，并观察小鼠脾脏大小变化及是否出现癌变组织。使用EB病毒BALF5基因特异性引物(上游引物：GGTCACAATCTCCACGCTGA(SEQ ID NO.9)；下游引物：CAACGAGGCTGACCTGATCC(SEQ IDNO.10))进行实时荧光定量PCR鉴定采集的小鼠外周血中的EB病毒DNA拷贝数；使用商品化试剂盒对小鼠脾脏组织切片进行EBER原位杂交检测，鉴定脾脏细胞或者肿瘤细胞是否病毒阳性。

结果如图12所示：经C6H2和AMMO1单抗治疗后的NSG人源化小鼠的外周血中DNA拷贝数增长趋势较慢，并且保持在较低水平，使用对照抗体人源单抗2G4治疗和注射了PBS溶液的感染对照组小鼠的外周血中DNA拷贝数持续增加，在第5周，对照组的病毒拷贝数是C6H2和AMMO1治疗组小鼠的病毒拷贝数100倍以上；说明gLgH蛋白特异性的嵌合抗体C6H2具有阻断EB病毒在人源化小鼠中感染和减少病毒血症发生的效果。

不同处理后的NSG人源化小鼠体重如图13所示：经C6H2和AMMO1单抗治疗后的NSG人源化小鼠体重保持稳定，没有明显下降，使用对照抗体人源单抗2G4治疗和注射了PBS溶液的感染对照组小鼠从第4周开始体重出现明显下降。

不同处理的NSG人源化小鼠的生存率如图14所示：经C6H2和AMMO1单抗治疗后的NSG人源化小鼠直到实验终点都未发生小鼠死亡，使用人源单抗2G治疗和注射了PBS溶液的感染对照组的小鼠分别出现6只和7只小鼠死亡。

小鼠安乐死处理后，解剖获得小鼠脾脏，进行H&E染色和EBER原位杂交，结果如图15所示：2G4对照抗体和PBS处理的小鼠脾脏出现明显肿大和病变情况，同时通过RNA原位杂交方法检测到EB病毒的EBER存在，说明脾脏组织中存在病毒，而C6H2和和AMMO1两株单克隆抗体治疗后的小鼠脾脏均保持正常形态和大小，只能检测到较低水平EBER，说明脾脏中病毒含量较低。

以上结果表明C6H2能有效保护人源化小鼠免受致死剂量EB病毒感染引起的疾病发生。

实施例11抗EB病毒gLgH蛋白当克隆抗体6H2识别表位分析

(1)通过木瓜蛋白酶对6H2单抗酶切，并使用protein A柱吸附抗体可结晶段(fragment crystallizable，Fc)，在穿透液中获得抗体的抗原结合片段(fragment ofantigen binding，Fab)。

(2)参考EB病毒M81毒株全基因序列(KF373730.1)将gp42蛋白膜外区序列(对应病毒BZLF2基因aa34-aa223)的N端连接上信号肽编码序列，C端连接上便于亲和层析纯化的多聚组氨酸多肽(6×His)，将以上序列构建到合适的真核表达载体，把构建成功的重组质粒转染至293F细胞表达并进行纯化，最终获得gp42蛋白(氨基酸序列为：MVSFKQVRVPLFTAIALVIVLLLAYFLPPRVRGGGRVAAAAITWVPKPNVEVWPVDPPPPVNFNKTAEQEYGDKEVKLPHWTPTLHTFQVPQNYTKANCTYCNTREYTFSYKGCCFYFTKKKHTWNGCFQACAELYPCTYFYGPTPDILPVVTRNLNAIESLWVGVYRVGEGNWTSLDGGTFKVYQIFGSHCTYVSKFSTVPVSHHECSFLKPCLCVSQRSNS，SEQ ID NO.2)。

(3)6H2-Fab、gLgH、gp42按摩尔比1:1:1的比例混合并于37℃孵育2小时制备6H2-Fab+gLgH+gp42多元复合物，并通过冷冻电子显微镜技术(Electron cryo-microscopy，cryo-EM)解析复合物结构，并确定6H2结合表位。

结果如图16、图17所示：通过pymol软件对多个抗体复合物进行叠加，可发现单抗6H2结合表位不同于已报道的EB病毒gLgH蛋白特异性中和抗体CL40、E1D1、AMMO1的表位(其中，文献“Inhibition of EBV-mediated membrane fusion by anti-gHgL antibodies”公开了CL40的表位(5W0K)；文献“Structural basis for Epstein–Barr virus host celltropism mediated by gp42 and gHgL entry glycoproteins”公开了E1D1的表位(5T1D)；文献“An Antibody Targeting the Fusion Machinery Neutralizes Dual-TropicInfection and Defines a Site of Vulnerability on Epstein-Barr Virus”公开了AMMO1的表位(6C5V)，进一步结构分析显示单抗6H2主要识别位于gH第570位、第620位和第650位的三个loop环；以上结果表明单抗6H2识别一个全新表位。

实施例12抗EB病毒gLgH蛋白当克隆抗体6H2识别关键位点鉴定

(1)根据Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2(购自诺唯赞公司)试剂盒说明进行引物设计，并开展点突变克隆，将对应位点的氨基酸突变成丙氨酸，通过测序验证点突变克隆是否构建正确，将正确点突变克隆瞬转293F细胞进行真核表达，通过镍柱纯化获得点突变蛋白(D489A表示gH蛋白中第489位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；K490A表示gH蛋白中第490位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；S493A表示gH蛋白中第493位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；T570A表示gH蛋白中第570位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；T571A表示gH蛋白中第571位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；T572A表示gH蛋白中第572位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；L573A表示gH蛋白中第573位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；S574A表示gH蛋白中第574位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；E624A表示gH蛋白中第624位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；K625A表示gH蛋白中第625位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；E626A表示gH蛋白中第626位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；G627A表示gH蛋白中第627位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；D652A表示gH蛋白中第652位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；N653A表示gH蛋白中第653位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；L654A表示gH蛋白中第654位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；H655A表示gH蛋白中第655位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；V656A表示gH蛋白中第656位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白)。

(2)分别将点突变gLgH蛋白用pH9.6的50mM CB缓冲液(NaHCO₃/Na₂CO₃缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，终浓度为2μg/mL；在96孔酶标板每孔中加入100μL的包被液，37℃包被2小时；用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次；然后每孔加入200μL的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液溶液)，放入37℃封闭2小时；弃去封闭液；干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。

(3)单抗6H2以20mM PBS缓冲液从5μg/mL为起始浓度开始2倍梯度稀释，共稀释15个梯度；取已包被gLgH蛋白的酶标板，每孔加入100μL已稀释的抗体，置于37℃温箱反应30min；将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG反应液，置于37℃温箱反应30min；完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μL，置于37℃温箱反应15min；完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。

ELISA结果如图18所示：部分位点突变之后影响了单抗6H2与gLgH蛋白的结合能力；第573、625、627、655位氨基酸突变成丙氨酸后显著影响了6H2与gLgH蛋白的结合活性，说明gH蛋白第573位亮氨酸，第625位赖氨酸，第627位甘氨酸、第655位组氨酸为单抗6H2识别的关键位点。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究

所)

厦门大学

<120> 一种识别EB病毒gH糖蛋白的单克隆抗体及其应用

<130>

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 795

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Trp Ala Tyr Pro Cys Cys His Val Thr Gln Leu Arg Ala Gln His Leu

1 5 10 15

Leu Ala Leu Glu Asn Ile Ser Asp Ile Tyr Leu Val Ser Asn Gln Thr

20 25 30

Cys Asp Gly Phe Ser Leu Ala Ser Leu Asn Ser Pro Lys Asn Gly Ser

35 40 45

Asn Gln Leu Val Ile Ser Arg Cys Ala Asn Gly Leu Asn Val Val Ser

50 55 60

Phe Phe Ile Ser Ile Leu Lys Arg Ser Ser Ser Ala Leu Thr Ser His

65 70 75 80

Leu Arg Glu Leu Leu Thr Thr Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Ser Phe Ser

85 90 95

Val Glu Asp Leu Phe Gly Ala Asn Leu Asn Arg Tyr Ala Trp His Arg

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Ser Leu Ser Glu Val Lys Leu His Leu Asp Ile Glu Gly His Ala

130 135 140

Ser His Tyr Thr Ile Pro Trp Thr Glu Leu Met Ala Lys Val Pro Gly

145 150 155 160

Leu Ser Pro Glu Ala Leu Trp Arg Glu Ala Asn Val Thr Glu Asp Leu

165 170 175

Ala Ser Met Leu Asn Arg Tyr Lys Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Gly Thr

180 185 190

Leu Gly Ile Ala Leu Ala Glu Pro Val Asp Ile Pro Ala Val Ser Glu

195 200 205

Gly Ser Met Gln Val Asp Ala Ser Lys Val His Pro Gly Val Ile Ser

210 215 220

Gly Leu Asn Ser Pro Ala Cys Met Leu Ser Ala Pro Leu Glu Lys Gln

225 230 235 240

Leu Phe Tyr Tyr Ile Gly Thr Met Leu Pro Asn Thr Arg Pro His Ser

245 250 255

Tyr Val Phe Tyr Gln Leu Arg Cys His Leu Ser Tyr Val Ala Leu Ser

260 265 270

Ile Asn Gly Asp Lys Phe Gln Tyr Thr Gly Ala Met Thr Ser Lys Phe

275 280 285

Leu Met Gly Thr Tyr Lys Arg Val Thr Glu Lys Gly Asp Glu His Val

290 295 300

Leu Ser Leu Ile Phe Gly Lys Thr Lys Asp Leu Pro Asp Leu Arg Gly

305 310 315 320

Pro Phe Ser Tyr Pro Ser Leu Thr Ser Ala Gln Ser Gly Asp Tyr Ser

325 330 335

Leu Val Ile Val Thr Thr Phe Val His Tyr Ala Asn Phe His Asn Tyr

340 345 350

Phe Val Pro Asn Leu Lys Asp Met Phe Ser Arg Ala Val Thr Met Thr

355 360 365

Ala Ala Ser Tyr Ala Arg Tyr Val Leu Gln Lys Leu Val Leu Leu Glu

370 375 380

Met Lys Gly Gly Cys Arg Glu Pro Glu Leu Asp Thr Glu Thr Leu Thr

385 390 395 400

Thr Met Phe Glu Val Ser Val Ala Phe Phe Lys Val Gly His Ala Val

405 410 415

Gly Glu Thr Gly Asn Gly Cys Val Asp Leu Arg Trp Leu Ala Lys Ser

420 425 430

Phe Phe Glu Leu Thr Val Leu Lys Asp Ile Ile Gly Ile Cys Tyr Gly

435 440 445

Ala Thr Val Lys Gly Met Gln Ser Tyr Gly Leu Glu Arg Leu Ala Ala

450 455 460

Met Leu Met Ala Thr Val Lys Met Glu Glu Leu Gly His Leu Thr Thr

465 470 475 480

Glu Lys Gln Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Ala Thr Val Gly Tyr Pro Lys

485 490 495

Ala Gly Val Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu Leu

500 505 510

Ser Ala Tyr Asn Arg His Pro Leu Phe Gln Pro Leu His Thr Val Met

515 520 525

Arg Glu Thr Leu Phe Ile Gly Ser His Val Val Leu Arg Glu Leu Arg

530 535 540

Leu Asn Val Thr Thr Gln Gly Pro Asn Leu Ala Leu Tyr Gln Leu Leu

545 550 555 560

Ser Thr Ala Leu Cys Ser Ala Leu Glu Ile Gly Glu Val Leu Arg Gly

565 570 575

Leu Ala Leu Gly Thr Glu Ser Gly Leu Phe Ser Pro Cys Tyr Leu Ser

580 585 590

Leu Arg Phe Asp Leu Thr Arg Asp Lys Leu Leu Ser Met Ala Pro Gln

595 600 605

Glu Ala Met Leu Asp Gln Ala Ala Val Ser Asn Ala Val Asp Gly Phe

610 615 620

Leu Gly Arg Leu Ser Leu Glu Arg Glu Asp Arg Asp Ala Trp His Leu

625 630 635 640

Pro Ala Tyr Lys Cys Val Asp Arg Leu Asp Lys Val Leu Met Ile Ile

645 650 655

Pro Leu Ile Asn Val Thr Phe Ile Ile Ser Ser Asp Arg Glu Val Arg

660 665 670

Gly Ser Ala Leu Tyr Glu Ala Ser Thr Thr Tyr Leu Ser Ser Ser Leu

675 680 685

Phe Leu Ser Pro Val Ile Met Asn Lys Cys Ser Gln Gly Ala Val Ala

690 695 700

Gly Glu Pro Arg Gln Ile Pro Lys Ile Gln Asn Phe Thr Arg Thr Gln

705 710 715 720

Lys Ser Cys Ile Phe Cys Gly Phe Ala Leu Leu Ser Tyr Asp Glu Lys

725 730 735

Glu Gly Leu Glu Thr Thr Thr Tyr Ile Thr Ser Gln Glu Val Gln Asn

740 745 750

Ser Ile Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Asp Phe Asp Asn Leu His Val His

755 760 765

Tyr Leu Leu Leu Thr Thr Asn Gly Thr Val Met Glu Ile Ala Gly Leu

770 775 780

Tyr Glu Glu Arg Ala His His His His His His

785 790 795

<210> 2

<211> 223

<212> PRT

<213> Epstein-Barr Virus

<400> 2

Met Val Ser Phe Lys Gln Val Arg Val Pro Leu Phe Thr Ala Ile Ala

1 5 10 15

Leu Val Ile Val Leu Leu Leu Ala Tyr Phe Leu Pro Pro Arg Val Arg

20 25 30

Gly Gly Gly Arg Val Ala Ala Ala Ala Ile Thr Trp Val Pro Lys Pro

35 40 45

Asn Val Glu Val Trp Pro Val Asp Pro Pro Pro Pro Val Asn Phe Asn

50 55 60

Lys Thr Ala Glu Gln Glu Tyr Gly Asp Lys Glu Val Lys Leu Pro His

65 70 75 80

Trp Thr Pro Thr Leu His Thr Phe Gln Val Pro Gln Asn Tyr Thr Lys

85 90 95

Ala Asn Cys Thr Tyr Cys Asn Thr Arg Glu Tyr Thr Phe Ser Tyr Lys

100 105 110

Gly Cys Cys Phe Tyr Phe Thr Lys Lys Lys His Thr Trp Asn Gly Cys

115 120 125

Phe Gln Ala Cys Ala Glu Leu Tyr Pro Cys Thr Tyr Phe Tyr Gly Pro

130 135 140

Thr Pro Asp Ile Leu Pro Val Val Thr Arg Asn Leu Asn Ala Ile Glu

145 150 155 160

Ser Leu Trp Val Gly Val Tyr Arg Val Gly Glu Gly Asn Trp Thr Ser

165 170 175

Leu Asp Gly Gly Thr Phe Lys Val Tyr Gln Ile Phe Gly Ser His Cys

180 185 190

Thr Tyr Val Ser Lys Phe Ser Thr Val Pro Val Ser His His Glu Cys

195 200 205

Ser Phe Leu Lys Pro Cys Leu Cys Val Ser Gln Arg Ser Asn Ser

210 215 220

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccaagctta ctggatggtg ggaagatgga 30

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n =i

<400> 4

cccaagcttc cagggrccar kggataracn grtgg 35

<210> 5

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Val Ser Lys Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Asp Val Trp Gly Ala

100 105 110

Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Phe Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210> 8

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Ser Ala Leu Gln

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> Epstein-Barr Virus

<400> 11

Met Gln Leu Leu Cys Val Phe Cys Leu Val Leu Leu Trp Glu Val Gly

1 5 10 15

Ala Ala Ser Leu Ser Glu Val Lys Leu His Leu Asp Ile Glu Gly His

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Ala Ser His Tyr Thr Ile Pro Trp Thr Glu Leu Met Ala Lys Val Pro

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Gly Leu Ser Pro Glu Ala Leu Trp Arg Glu Ala Asn Val Thr Glu Asp

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Leu Ala Ser Met Leu Asn Arg Tyr Lys Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Gly

65 70 75 80

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100 105 110

Ser Gly Leu Asn Ser Pro Ala Cys Met Leu Ser Ala Pro Leu Glu Lys

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Gln Leu Phe Tyr Tyr Ile Gly Thr Met Leu Pro Asn Thr Arg Pro His

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Ser Tyr Val Phe Tyr Gln Leu Arg Cys His Leu Ser Tyr Val Ala Leu

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Ser Ile Asn Gly Asp Lys Phe Gln Tyr Thr Gly Ala Met Thr Ser Lys

165 170 175

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180 185 190

Val Leu Ser Leu Ile Phe Gly Lys Thr Lys Asp Leu Pro Asp Leu Arg

195 200 205

Gly Pro Phe Ser Tyr Pro Ser Leu Thr Ser Ala Gln Ser Gly Asp Tyr

210 215 220

Ser Leu Val Ile Val Thr Thr Phe Val His Tyr Ala Asn Phe His Asn

225 230 235 240

Tyr Phe Val Pro Asn Leu Lys Asp Met Phe Ser Arg Ala Val Thr Met

245 250 255

Thr Ala Ala Ser Tyr Ala Arg Tyr Val Leu Gln Lys Leu Val Leu Leu

260 265 270

Glu Met Lys Gly Gly Cys Arg Glu Pro Glu Leu Asp Thr Glu Thr Leu

275 280 285

Thr Thr Met Phe Glu Val Ser Val Ala Phe Phe Lys Val Gly His Ala

290 295 300

Val Gly Glu Thr Gly Asn Gly Cys Val Asp Leu Arg Trp Leu Ala Lys

305 310 315 320

Ser Phe Phe Glu Leu Thr Val Leu Lys Asp Ile Ile Gly Ile Cys Tyr

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Gly Ala Thr Val Lys Gly Met Gln Ser Tyr Gly Leu Glu Arg Leu Ala

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Ala Met Leu Met Ala Thr Val Lys Met Glu Glu Leu Gly His Leu Thr

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Thr Glu Lys Gln Glu Tyr Ala Leu Arg Leu Ala Thr Val Gly Tyr Pro

370 375 380

Lys Ala Gly Val Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu

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Leu Ser Ala Tyr Asn Arg His Pro Leu Phe Gln Pro Leu His Thr Val

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Met Arg Glu Thr Leu Phe Ile Gly Ser His Val Val Leu Arg Glu Leu

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Ser Leu Arg Phe Asp Leu Thr Arg Asp Lys Leu Leu Ser Met Ala Pro

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530 535 540

Ile Pro Leu Ile Asn Val Thr Phe Ile Ile Ser Ser Asp Arg Glu Val

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Leu Phe Leu Ser Pro Val Ile Met Asn Lys Cys Ser Gln Gly Ala Val

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Asn Ser Ile Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Asp Phe Asp Asn Leu His Val

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His Tyr Leu Leu Leu Thr Thr Asn Gly Thr Val Met Glu Ile Ala Gly

660 665 670

Leu Tyr Glu Glu Arg Ala His Val Val Leu Ala Ile Ile Leu Tyr Phe

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Ile Ala Phe Ala Leu Gly Ile Phe Leu Val His Lys Ile Val Met Phe

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Phe Leu

705

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile

1 5

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Ala Arg Ser Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Asp Val

1 5 10

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr

1 5 10

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<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

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Trp Ala Ser

1

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Pro Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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<211> 114

<212> PRT

<213> Epstein-Barr Virus

<400> 19

Trp Ala Tyr Pro Cys Cys His Val Thr Gln Leu Arg Ala Gln His Leu

1 5 10 15

Leu Ala Leu Glu Asn Ile Ser Asp Ile Tyr Leu Val Ser Asn Gln Thr

20 25 30

Cys Asp Gly Phe Ser Leu Ala Ser Leu Asn Ser Pro Lys Asn Gly Ser

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Asn Gln Leu Val Ile Ser Arg Cys Ala Asn Gly Leu Asn Val Val Ser

50 55 60

Phe Phe Ile Ser Ile Leu Lys Arg Ser Ser Ser Ala Leu Thr Ser His

65 70 75 80

Leu Arg Glu Leu Leu Thr Thr Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Ser Phe Ser

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Val Glu Asp Leu Phe Gly Ala Asn Leu Asn Arg Tyr Ala Trp His Arg

100 105 110

Gly Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

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His His His His His His

1 5

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<211> 38

<212> DNA

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<400> 21

actagtcgac atggattttg ggctgatttt ttttattg 38

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n =i

<400> 22

cccaagcttc cagggrccar kggataracn grtgg 35

<210> 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> n =i

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(34)

<223> n=i

<400> 23

actagtcgac atgakgthcy cngctcagyt yctnrg 36

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cccaagctta ctggatggtg ggaagatgga 30

<210> 25

<211> 6493

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gtacatttat attggctcat gtccaatatg accgccatgt tgacattgat tattgactag 60

ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 120

tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 180

gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 240

ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 300

tccgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 360

gaccttacgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 420

ggtgatgcgg ttttggcagt acaccaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 480

tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 540

ctttccaaaa tgtcgtaata accccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 600

gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcctca ctctcttccg 660

catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc 720

tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtactccg ccaccgaggg 780

acctgagcga gtccgcatcg accggatcgg aaaacctctc gagaaaggcg tctaaccagt 840

cacagtcgca aggtaggctg agcaccgtgg cgggcggcag cgggtggcgg tcggggttgt 900

ttctggcgga ggtgctgctg atgatgtaat taaagtaggc ggtcttgaga cggcggatgg 960

tcgaggtgag gtgtggcagg cttgagatcc agctgttggg gtgagtactc cctctcaaaa 1020

gcgggcatta cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa acgaggagga tttgatattc 1080

acctggcccg atctggccat acacttgagt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc 1140

acaggtgtcc actcccaggt ccaagtttaa acggatctct agcgaattcc ctctagaggg 1200

cccgtttctg ctagcaagct tatgcagttg ctctgtgttt tttgcctggt gttgctatgg 1260

gaggtggggg ctgccagcct tagcgaggtt aagctgcacc tggacataga ggggcatgct 1320

tcgcattaca ccatcccatg gaccgaactg atggcaaagg tcccaggcct tagcccagag 1380

gcgctgtgga gagaggcaaa tgtcaccgaa gatttggcgt ctatgcttaa ccgctacaag 1440

ttaatttaca agacgtctgg tacccttggt attgcgctgg ccgagcctgt cgatatccct 1500

gctgtctctg aaggatccat gcaagtggat gcatctaagg tccatcccgg agtcattagc 1560

ggcctgaatt cccctgcctg catgcttagt gccccccttg agaagcagct cttctactat 1620

attggcacca tgctgcccaa cacgcggcca cacagctatg tcttttatca gctgcgctgt 1680

cacttgtctt atgtggccct gtccatcaac ggggacaagt ttcagtacac gggggccatg 1740

acttctaaat ttctgatggg cacctacaag cgagtgaccg agaagggaga tgagcatgtg 1800

ttgagcctga tctttggcaa gacgaaggac ctgccggatc tgagggggcc ttttagttac 1860

ccatccttaa ccagtgccca aagcggggac tattccctgg tgattgttac aacctttgtg 1920

cattatgcca actttcacaa ctactttgta cccaacctga aggatatgtt ttcccgagcc 1980

gtcaccatga cagccgccag ctacgctcgc tacgttctcc agaaactggt cctgctggag 2040

atgaagggag gctgccggga gccagaactg gacacggaaa cgctgactac catgtttgag 2100

gtttctgtgg ccttctttaa ggtgggtcat gccgtgggtg agactggcaa tggctgcgtg 2160

gacctccgct ggttggccaa gagcttcttt gagctgactg tcctgaaaga catcatcggc 2220

atatgttatg gggccacggt caagggcatg caatcctacg ggctggagcg cttggccgcc 2280

atgctgatgg ccacggtcaa gatggaggag cttggtcacc tgacgactga gaaacaggag 2340

tacgcgctga ggttagccac cgtcggctac cccaaggccg gggtttacag tggcctcatt 2400

ggaggcgcca catctgtgct tctctcggcc tacaaccgcc accccctttt ccagcccctg 2460

cataccgtga tgagagagac cctgtttatc ggcagccacg tggtgctacg cgagttgcgg 2520

ctgaacgtga ctacccaggg gcccaacctt gccctatacc aactgctgtc caccgccctg 2580

tgctcggccc tagagattgg ggaggttttg cgggggctag ccctggggac ggagagcggg 2640

ctcttctcac cgtgctacct cagcctacga tttgacctca cacgagacaa gctgctgagc 2700

atggcccccc aggaggcaat gctggaccag gcggccgttt caaatgctgt ggatgggttt 2760

cttgggcgtc tctctttgga gcgagaagac agggatgcgt ggcatctccc cgcctacaaa 2820

tgcgtggaca ggctcgacaa agttctgatg attatcccgc tcatcaacgt gacattcata 2880

atctctagtg accgtgaggt ccgaggctcg gcgctatacg aggccagcac cacctatctc 2940

agcagctctc tctttctctc ccccgttata atgaataaat gttcgcaggg tgctgtggct 3000

ggggagcccc gccagattcc aaagatccag aattttacca ggacgcagaa atcctgcatt 3060

ttttgtggct ttgccctgct cagttatgat gaaaaggaag gcctggaaac tacaacctac 3120

atcacctccc aggaagtcca aaactccatc ttgagctcca actactttga ttttgacaac 3180

ctccacgttc actatctgct gctgaccacc aacgggactg tcatggaaat tgcgggcctg 3240

tatgaagaaa gagcacacgt tgttttggca ataatcctgt actttattgc ttttgctctg 3300

ggtatctttc tggttcacaa gattgttatg tttttccttt agggatcccc cgacctcgac 3360

ctctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct 3420

ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa tcatttggtc gagatccctc ggagatctct 3480

agctagagga tcgatccccg ccccggacga actaaacctg actacgacat ctctgcccct 3540

tcttcgcggg gcagtgcatg taatcccttc agttggttgg tacaacttgc caactgaacc 3600

ctaaacgggt agcatatgct tcccgggtag tagtatatac tatccagact aaccctaatt 3660

caatagcata tgttacccaa cgggaagcat atgctatcga attagggtta gtaaaagggt 3720

cctaaggaac agcgatgtag gtgggcgggc caagataggg gcgcgattgc tgcgatctgg 3780

aggacaaatt acacacactt gcgcctgagc gccaagcaca gggttgttgg tcctcatatt 3840

cacgaggtcg ctgagagcac ggtgggctaa tgttgccatg ggtagcatat actacccaaa 3900

tatctggata gcatatgcta tcctaatcta tatctgggta gcataggcta tcctaatcta 3960

tatctgggta gcatatgcta tcctaatcta tatctgggta gtatatgcta tcctaattta 4020

tatctgggta gcataggcta tcctaatcta tatctgggta gcatatgcta tcctaatcta 4080

tatctgggta gtatatgcta tcctaatctg tatccgggta gcatatgcta tcctaataga 4140

gattagggta gtatatgcta tcctaattta tatctgggta gcatatacta cccaaatatc 4200

tggatagcat atgctatcct aatctatatc tgggtagcat atgctatcct aatctatatc 4260

tgggtagcat aggctatcct aatctatatc tgggtagcat atgctatcct aatctatatc 4320

tgggtagtat atgctatcct aatttatatc tgggtagcat aggctatcct aatctatatc 4380

tgggtagcat atgctatcct aatctatatc tgggtagtat atgctatcct aatctgtatc 4440

cgggtagcat atgctatcct catgataagc tgtcaaacat gagaattaat tcttgaagac 4500

gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 4560

agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 4620

aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4680

attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 4740

cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 4800

aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 4860

ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 4920

gtggcgcggt attatcccgt gttgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 4980

attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 5040

tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 5100

tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 5160

atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 5220

agcgtgacac cacgatgcct gcagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 5280

aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 5340

caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 5400

ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 5460

gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 5520

tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 5580

atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 5640

tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5700

accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 5760

gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 5820

caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 5880

tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 5940

ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 6000

tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 6060

gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 6120

tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 6180

gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 6240

gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 6300

ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 6360

ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta 6420

ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 6480

tgagcgagga agc 6493

<210> 26

<211> 4786

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gtacatttat attggctcat gtccaatatg accgccatgt tgacattgat tattgactag 60

ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt 120

tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac 180

gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg 240

ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 300

tccgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat 360

gaccttacgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat 420

ggtgatgcgg ttttggcagt acaccaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt 480

tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga 540

ctttccaaaa tgtcgtaata accccgcccc gttgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg 600

gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcctca ctctcttccg 660

catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc 720

tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtactccg ccaccgaggg 780

acctgagcga gtccgcatcg accggatcgg aaaacctctc gagaaaggcg tctaaccagt 840

cacagtcgca aggtaggctg agcaccgtgg cgggcggcag cgggtggcgg tcggggttgt 900

ttctggcgga ggtgctgctg atgatgtaat taaagtaggc ggtcttgaga cggcggatgg 960

tcgaggtgag gtgtggcagg cttgagatcc agctgttggg gtgagtactc cctctcaaaa 1020

gcgggcatta cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa acgaggagga tttgatattc 1080

acctggcccg atctggccat acacttgagt gacaatgaca tccactttgc ctttctctcc 1140

acaggtgtcc actcccaggt ccaagtttaa acggatctct agcgaattcc ctctagaggg 1200

cccgtttctg ctagcaagct tatgcgtgct gttggtgtat ttctggccat ctgtcttgtc 1260

accattttcg tcctcccaac atggggcaat tgggcatacc catgttgtca cgtcactcag 1320

ctccgcgctc aacaccttct cgcgttggaa aacattagcg acatttacct ggtgagcaat 1380

cagacatgcg acggctttag cctggcctcc ttaaattcac ctaagaatgg gagcaaccag 1440

ctggtcatca gccgctgcgc aaacggactc aacgtggtct ccttctttat ctccatcctg 1500

aagcgaagca gctccgccct cacgggccat ctccgtgagt tgttaaccac cctggagact 1560

ctttacggtt cattctcagt ggaagacctg tttggtgcca acttaaacag atacgcatgg 1620

catcgcgggg gctagggatc ccccgacctc gacctctggc taataaagga aatttatttt 1680

cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat atgggagggc 1740

aaatcatttg gtcgagatcc ctcggagatc tctagctaga ggatcgatcc ccgccccgga 1800

cgaactaaac ctgactacga catctctgcc ccttcttcgc ggggcagtgc atgtaatccc 1860

ttcagttggt tggtacaact tgccaactga accctaaacg ggtagcatat gcttcccggg 1920

tagtagtata tactatccag actaacccta attcaatagc atatgttacc caacgggaag 1980

catatgctat cgaattaggg ttagtaaaag ggtcctaagg aacagcgatg taggtgggcg 2040

ggccaagata ggggcgcgat tgctgcgatc tggaggacaa attacacaca cttgcgcctg 2100

agcgccaagc acagggttgt tggtcctcat attcacgagg tcgctgagag cacggtgggc 2160

taatgttgcc atgggtagca tatactaccc aaatatctgg atagcatatg ctatcctaat 2220

ctatatctgg gtagcatagg ctatcctaat ctatatctgg gtagcatatg ctatcctaat 2280

ctatatctgg gtagtatatg ctatcctaat ttatatctgg gtagcatagg ctatcctaat 2340

ctatatctgg gtagcatatg ctatcctaat ctatatctgg gtagtatatg ctatcctaat 2400

ctgtatccgg gtagcatatg ctatcctaat agagattagg gtagtatatg ctatcctaat 2460

ttatatctgg gtagcatata ctacccaaat atctggatag catatgctat cctaatctat 2520

atctgggtag catatgctat cctaatctat atctgggtag cataggctat cctaatctat 2580

atctgggtag catatgctat cctaatctat atctgggtag tatatgctat cctaatttat 2640

atctgggtag cataggctat cctaatctat atctgggtag catatgctat cctaatctat 2700

atctgggtag tatatgctat cctaatctgt atccgggtag catatgctat cctcatgata 2760

agctgtcaaa catgagaatt aattcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt 2820

tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa 2880

atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 2940

tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 3000

aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 3060

acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 3120

acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 3180

ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg 3240

ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 3300

caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 3360

ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 3420

aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 3480

aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgcagcaa 3540

tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 3600

aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 3660

cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 3720

ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 3780

gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 3840

agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 3900

atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 3960

cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 4020

cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 4080

cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 4140

tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 4200

tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 4260

ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 4320

aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 4380

cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 4440

ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 4500

agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 4560

ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 4620

acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 4680

cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 4740

gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagc 4786

<210> 27

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 27

Glu Val Lys Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Val Ser Lys Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Asp Val Trp Gly Ala

100 105 110

Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 28

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 28

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Phe Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asn Leu Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Ser Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims (10)

1.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述单克隆抗体或其抗原结合片段与gH蛋白的第573、625、627、655位氨基酸特异性结合；

所述gH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：

所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3；

所述重链可变区CDR1的氨基酸序列为：GFDFSRYW(SEQ ID NO:12)；

所述重链可变区CDR2的氨基酸序列为：INPDSSTI(SEQ ID NO:13)；

所述重链可变区CDR3的氨基酸序列为：ARSPYYYGSSYDV(SEQ ID NO:14)；

所述轻链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3；

所述轻链可变区CDR1的氨基酸序列为：QSLLNSRTRKNY(SEQ ID NO:15)；

所述轻链可变区CDR2的氨基酸序列为：WAS(SEQ ID NO:16)；

所述轻链可变区CDR3的氨基酸序列为：KQSYNLPT(SEQ ID NO:17)。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.编码权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

5.一种载体，包含权利要求4所述的核酸分子。

6.一种宿主细胞，包含权利要求5所述的载体。

7.一种偶联物，其特征在于：所述偶联物包含权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段及偶联部分；所述偶联部分为可检测的标记。

8.权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或权利要求7所述的偶联物在制备产品中的应用；

优选地，所述产品包括试剂盒、药物；

优选地，所述试剂盒用于检测：

a)gHgL在样品中的存在或水平；或

b)EB病毒；

优选地，所述药物用于治疗和/或预防EB病毒感染所引起的疾病。

9.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或权利要求7所述的偶联物。

10.一种药物，其特征在于：所述药物包含权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或权利要求7所述的偶联物；

优选地，所述药物还包含药学上可接受的载体。

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