DK2403947T3 - Fremgangsmåde til oral/mucosal vaccination med rekombinant gær. - Google Patents

Fremgangsmåde til oral/mucosal vaccination med rekombinant gær. Download PDF

Info

Publication number
DK2403947T3
DK2403947T3 DK09808976.6T DK09808976T DK2403947T3 DK 2403947 T3 DK2403947 T3 DK 2403947T3 DK 09808976 T DK09808976 T DK 09808976T DK 2403947 T3 DK2403947 T3 DK 2403947T3
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
foreign
yeast
expression
recombinant
gene
Prior art date
Application number
DK09808976.6T
Other languages
English (en)
Inventor
Karin Breunig
Sven-Erik Behrens
Original Assignee
Martin Luther Univ Halle Wittenberg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42105074&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DK2403947(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Martin Luther Univ Halle Wittenberg filed Critical Martin Luther Univ Halle Wittenberg
Application granted granted Critical
Publication of DK2403947T3 publication Critical patent/DK2403947T3/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Description

J.
[0001] Bekæmpelsen af smitsomme sygdomme er stadig en af de største udfordringer inden for både human og veterinærmedicin. Situationen er særligt kompleks med virusinfektioner, der i modsætning til bakterielle infektioner generelt ikke kan bekæmpes med bredspektret medicin og forårsage stor økonomisk skade. Udviklingen af nye virkningsfulde vaccinationsstrategier mod virussygdomme er derfor af afgørende betydning.
[0002] Traditionelt anvendes der til forebyggende og også til terapeutisk vaccination mod virussygdomme, "dæmpet", dvs. ved mutagenese modificerede vira med betydeligt reduceret eller fraværende virulens ("levende vaccine") eller inaktiverede vira ("død vaccine"). I nyere tid er såkaldte "subunitvacciner" eller "subunit markørvacciner" i stigende grad blevet etableret, hvorved definerede genteknologisk fremstillede "hovedantigener" af patogenet anvendes til vaccination. Udtrykket "markørvaccine" indebærer, at vaccinerede individer klart kan differentieres fra naturligt inficerede individer ved efterfølgende diagnostisk analyse ("DIVA", "differentiate infected and vaccinated animals"). Større antigener er for eksempel proteiner fra viruskappen eller virus-capsiderne, som kan foranledige en humoral og/eller cellulær immunreaktion i værten i fravær af en komplet viruspartikel, som følge heraf kan en viral infektion bekæmpes forebyggende eller terapeutisk. En "subunitvaccination" kræver, at hovedantigenerne er karakteriseret. Fremstliingen (ekspression) og immunogen formulering af sådanne proteiner ("antigenformulering") til vaccinationsprocessen spiller en central rolle, især da virus kappeproteiner normalt ikke er vandopløselige og kun sjældent kan fremstilles rekombinant i bakterielle ekspressionssystemer. Fremgangsmåder til opnåelse af "subunitvacciner" i en oprenset form og for at sikre deres holdbahed er tilsvarende omkostningskrævende.
[0003] Gær som ekspressionssystemer til rekombinante proteiner kombinerer de økonomiske fordele ved bakterielle systemer den for højere celler typiske organisationsform. De er kompartmenteret via intracellulære membran systemer, der fundamentalt adskiller dem fra bakterielle værtssystemer og muliggør ekspression af membranforankrede virale kapsel proteiner eller endda hele viruskapsler. Derudover har beta-glucanerne, glucosepolymererne, hvorfra gærcellevæggen er bygget, en kendt immunstimulerende virkning. Det var derfor opgaven at udvikle en fremgangsmåde, hvor komplette gærceller kan anvendes til vaccination. Problemet blev løst ved hjælp af genteknologiske fremgangsmåder at indføre gener for immunogene determinanter i genomet af ikke-patogene gærarter og udtrykke dem, og disse rekombinante gærceller anvendes direkte til oral/mucosal vaccination.
Kluyveromyces lactis.
[0004] Kluyveromyces lactis tilhører de såkaldte "food grade" gærarter med GRAS-status ("generally regarded as safe"). Ligesom bagergær, der er blevet testet og bevist over årtusinder som et fødevaretilsætningsstof, anses gæren K. lactis, der ofte er repræsenteret i mejeriprodukter, som sikker af fødevareindustrien.
Oral/slimhindevaccination [0005] Vacciner/antigener kan indgives parenteralt eller oralt/mucosalt. Mens antigenerne i det første tilfælde kommer ind i blodbanen, hovedsagelig ved injektion, og omgår fordøjelseskanalen, finder optagelse i tilfælde af oral/mucosal vaccination sted via den mukosale tarmepitel efter passage gennem maven. Tarmslimhinden er permanent påtogen-eksponerede og udgør i sig selv en væsentlig barriere for optagelse af infektiva. Derudover er der et mucosale immunsystem, som er opdelt i de såkaldte "inductive sites" og "effector sites". Optagelsen af antigen finder sted i de "inductive sites" via M-celler i "Peyer's patches". MALT ("mucosa-associated lymphoid tissue") immunceller associeret med "Peyer's patches" fremkalder immunresponset. Når immunresponset er aftaget, dannes der specielle hukommelsesimmunceller i hele organismen såvel som i slimhindernes "effector sites", der som regel formidler langvarig beskyttelse mod det oprindelige anti-gen/patogen.
[0006] Fordele ved oral/mucosal vaccination. Sammenlignet med parenteral immunisering kræver oral/mucosal immunisering anvendelse af betydeligt større mængder antigen. Ved oral/mucosal vaccination er det i modsætning til parenteral vaccination imidlertid, i tillæg til det systemiske immunrespons, muligt at inducere et lokalt immunrespons ved slimhindens "effector sites". Især for patogener (såsom bovin virusdiarré-virus, BVDV, og klassisk svinepestvirus, CSFV; se også nedenfor), som (også) overføres via slimhinde, har en oral/mucosal vaccination, der har potentialet til at skabe en aktiv og langvarig immunitet. Andre vigtige fordele ved oral vaccination er god accept og økonomi. I bedste fald kan vaccinerne produceres til lave omkostninger og indgives ukompliceret med kosten.
[0007] Den orale indgivelse af gærstammer, der udtrykker virusantigener, er derfor ikke kun sikker, men kan have yderligere gavnlige og adjuvante virkninger [0008] Det var nu opgaven at udvikle et ekspressionssystem, som muliggør målrettet integration af fremmede gener i Kluyveromyces lactis' genom og følgelig muliggør den intracellulære syntese af antigener. Et andet formål var at anvende en sådan rekombinant K. lactis-stamme, som indeholder et specifikt virusantigen, til en oral/mucosalvaccine.
[0009] Ifølge opfindelsen blev der udviklet et vært/vektor-system, der via genteknologiske fremgangsmåder muliggør integration af fremmede gener målrettet K. lactis-genomets LAC4-locus, uden at der skal indføres yderligere DNA-sekvenser (eller lignende selektionsmarkører). Fremmedgen-ekspression er under styring af LAC4-promotoren og kan induceres ved doseret lactose eller galactose i dyrkningsmediet eller konstitutivt aktiveres efter slukning af regulatorgenet KIGAL80. De rekombinante gærstammer er stabile uden selektionstryk og kan dyrkes under fermenteringsbetingelser til høje densiteter. Den fremmede proteinekspression kan kvantificeres indirekte via ekspressionen af et endogent reportergen.
[0010] En række rekombinante K. lactis-vaccinestammer blev genereret. Generelt udtrykker disse stammer inducerbart betydelige mængder af et protein eller domæner af dette protein eller domæner af dette protein fusioneret til fremmede proteindomæner. De relaterede fremmede proteindomæner tjener adjuvante formål eller den målrettede kompartmentering af det udtrykte fremmede protein i gærcellen. Ud over adjuvansvirkninger er kompartmenteringen af det udtrykte fremmede protein vigtig for optimering af ekspressionen eller formulering af ekspressionsprodukterne. En rekombinant K. lactis-stamme (se udførelsesformer) blev med succes anvendt til oral/mucosal vaccination.
[0011] Formålet med opfindelsen opnås ved at tilvejebringe en rekombinant stamme af gæren Kluyveromyces lactis ifølge krav 20 og en fremgangsmåde til oral/mucosal vaccination ifølge krav 1, hvilken fremgangsmåde omfatter den rekombinante stamme ifølge opfindelsen af gæren Kluyveromyces lactis. Opfindelsen angår også anvendelsen af den rekombinante stamme af gæren Kluyveromyces lactis for fremmed protein ekspression såvel som i vaccinationen, navnlig mod BVD-virus eller CSF-virus, ifølge kravene 21 til 23.
EKSEMPLER 1. Fremstilling af K. lactis stamme VAK367-D4 (Metura3 Iac4 :: ScURA3).
[0012] Udgangsstammen VAK367 til heterolog ekspression af fremmede proteiner har følgende funktioner: Den muliggør dyrkning ved høj celledensitet, uden de intracellulære proteiner påviseligt frigives. I denne henseende adskiller denne stamme sig fra mange nært beslægtede K. /act/'s-stammer. Stammen VAK367 blev afledt ved to omgange mutagenese af stammen CBS 2359 (Centraalbureau voor Schimmelcultures http://www.fungalbiodiversitycentre.com) og er auxotrof for aminosyren methionin og nukleobasen uracil. Stammen VAK367-D4 (deponeret hos den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer Ltd (DSMZ) i Braunschweig) blev afledt af stamme VAK367 ved anvendelse af genteknologi, hvor sekvensen +358 til +1181 af L4C4-genet blev erstattet af ScURA3-genet ved hjælp af plasmidet pD4-2. Stammen VAK367-D4 muliggør nu integration af fremmede gener på LAC4-locus'et uden yderligere markører, ved at selektere på lactose-vækst. Ved anvendelse af en egnet integrationsvektor, f.eks. Klp3 (se nedenfor) erstattes disruptionskassetten ved homolog rekombination, således at et intakt L4C4-gen rekonstitueres med tab af Scl/ÆÆ3-markøren. (Fig. 1). 2. Generering af en integrationsvektor, der muliggør den inducerbare ekspression af fremmede gener.
Vektor; Klo3 (figur 2) [0013] Vektoren Klp3 er en E. coli-vektor baseret på YRp7, som ikke kan replikere autonomt i gær, fordi ARSl-sekvensen er blevet slettet. Klp3 indeholder K. lactis-sekvenser, som muliggør integration ved L4C4-locus ved homolog rekombination (opstrømsregion af LAC4 og 5'-enden af MC4-læserammen). Mellem MC4-promotoren og transkriptionsstart blev der indsat et DNA-segment indeholdende TEF1 -terminatoren og /CIGAZ_80-promotoren. Således er MC4-læserammen under styring af KIGAL80-promotoren, som er co-reguleret af transskriptionsfaktoren KIGal4 med L4C4-promotoren (Zenke et al, 1993, Molecular and Cellular Biology, 13:. 7566-7576). Denne konstruktion gør det muligt at følge induktionen af fremmed genekspression ved at måle den LAC4-kodede β-galactosidase. Klp3 muliggør integrationen af det fremmede gen mellem LAC4-promotoren og TEF1 -terminatoren via den unikke Sa/I-grænseflade. Til integration af ekspressionskassetten fordøjes Klp3 med Hpal eller EcoRl og transformeres ind i K. lactis VAK367-D4. Derved adskilles ekspressionskassetten fra E. co//-vektorgruppen, således at de resulterende stammer ikke indeholder nogen bakterielle sekvenser.
Plasmid KIp3-E2-l (9437 bp) [0014] BVDV-gensegmentet, som bl.a. indeholdt den BVDV E2 kodende region (BVDV E2 ORF) kodende, blev indsat som et Sa/I-XboI-fragment i Sa/I-stedet mellem MC4-promotor og TEF1 -terminator. Nedstrøms er KIGAL80-promotoren fusioneret til 5'-enden af LAC4-ORF’en. Restriktion af plasmidet med Hpal giver to fragmenter, hvoraf det største bærer ekspressionskassetten med BVDV E2-ORF. 3. Formulering af E2-hovedantigenerne af BVDV og CSFV.
Et hovedantigen er karakteriseret ved BVDV (bovin virus diarré virus), patogenet til bovin virus diarré og Mucosal Disease (BVD/MD), samt også ved CSFV (klassisk svinepestvirus), patogenet til klassisk svinepest (CSF). Dette er "envelope"- (viruskappe-integreret) protein E2. E2 inducerer også et massivt humoralt immunrespons, selv i fravær af en viruspartikel, dvs. dannelsen af virkningsfuldt virus-neutraliserende antistoffer. Ved genteknologisk formulering af E2 formulering kunne proteinets immunogene potentiale styrkes yderligere og kunne også generere et cellulært immunrespons (Bruschke et al., 1999; Nobiron et al., 2003). Det specifikke og eksklusive immunrespons mod enkelte, under visse omstændigheder, genteknologisk formulerede proteinområder af E2 muliggør skelnen af vaccinerede dyr fra feltvirusinficerede dyr, f.eks. ved ELISA-metode. 4. Konstruktion af en K. lactis-stamme, der udtrykker BVDV E2-proteinet [0015] Ved hjælp af teknologien ifølge opfindelsen blev K. /acf/s-stamme, VAK367-E2-1, fremstillet. Til dette formål blev plasmidet Klp3-E2-1 skåret med Hpal, og det større Hpal-fragment kodende for BVDV E2-ORF, kromosomalt integreret via homolog rekombination i udgangsstammen VAK367-D4 (DSM 23097). I VAK367-D4 (DSM 23097) ødelægges LAC4-genet ved indsættelse af URA3-genet (Iac4::URA3). Kromosomal integration af dette fragment erstattede locus lac4::URA3 og rekonstituerede det intakte MC4-gen (Figur 1). Udvælgelsen af K. lactis-ceIler indeholdende BVDV-gensekvensen blev udført ved dyrkning på lactosemedium. Tabet af URA3-genet blev bekræftet af Ura-minus-fænotypen. Sekvensen af det tilsvarende locus blev bekræftet ved DNA-sekventering. (Sekvensliste 1).
[0016] I den resulterende stamme, VAK367-E2-1, er et segment af BVDV-genomet af BVDV-stamme CP7 integreret i gærgenomet. Det tilsvarende BVDV-gensegment indeholdt området, som koder for E2-proteinet såvel som for dele af de tilstødende El- og p7-regioner.
El- og p7-regionerne indeholder signalsekvenserne, der er nødvendige til den korrekte forarbejdning af E2-proteinet (sekvensliste 2). Den korrekte forarbejdning (modning) af BVDV E2-proteinet finder sted via signalaser, som er kodet af gærcellen.
[0017] Ved hjælp af en specielt udviklet fremgangsmåde til immunfluorescensdetektion kan ekspressionen af BVDV E2 i celler fra K. lactis-stamme VAK367-E2-1 bestemmes. En ELISA-fremgangsmåde, der er specielt udviklet til BVDV E2-detektion, muliggør detektion og kvantificering af heterologt udtrykt antigen. Den analoge ELISA-metode kunne anvendes til den nøjagtige kvantificering af antistoftiteren af immuniserede dyr. Fremgangsmåder til virusneutralisering og til karakterisering af antistoffer og T-celler er blevet anvendt som rutinefremgangsmåder.
[0018] En ny qRT-PCR-metode gør det muligt at detektere og kvantificere BVDV-RNA-genomet fra serum og cellekultursupernatanter. 5. Demonstration af virkningen af K. lactis-stamme VAK367-E2-1 i orale/mucosale immuniseringsundersøgelser
Undersøgelse 1.
[0019] I dyreforsøg blev et betydeligt antal eksperimentelle mus indgivet en emulsion af naiv K. lactis under standardiserede betingelser. Der blev anvendt forskellige immuniseringsskemaer, hovedkriterierne var forskellige mængder af tilsat gær (3 - maks. 8% andel af det daglige fødeindtag) og forskellige "booster-intervaller".
Resultater: [0020] (i) En generel tolerance for K. lactis blev påvist: Oral indgivelse af gæremulsionerne forårsagede ikke nogen synlige ændringer i dyrets tilstand. (ii) Den orale indgivelse af K. lactis resulterede i et klart detekterbart humoralt immunrespons mod visse gærproteiner. Ved Western blot-metode fandt man et signifikant og specifikt antistofrespons på gærproteiner hos dyrene fodret med K. lactis sammenlignet med kontroldyr. Gærproteiner har altså i sig selv en immunogen virkning. Ud over det "proof of principle" at den orale indgivelse af K. lactis kan anvendes til at generere et immunrespons, er det blevet indikeret, at oral indgivelse af gær i kombination med et rekombinant antigen kan tilvejebringe en yderligere adjuvansvirkning.
Undersøgelse 2 [0021] I yderligere dyreforsøg med et betydeligt antal mus blev der vaccineret oralt med et optimeret immuniseringsskema (se undersøgelse 1) og med rekombinant K. lactis af stammen 367-E2-1.
Resultater: [0022] (i) Ved anvendelse af den specielle ELISA-metode var det muligt at detektere dannelsen af anti-BVDV E2-antistoffer i musene vaccineret med K. lactis-stamme 367-E2-1 sammenlignet med kontrolmus (immuniseret med naiv K. lactis). ii) I en neutraliseringstest med BVDV på bovine kulturceller kunne en neutraliserende virkning af antisera fra mus immuniseret med K. lactis-stammen 367-E2-1 igen etableres sammenlignes med serum fra kontrolmus. iii) Ved anvendelse af adjuvanser, såsom CpG-ODN og QuilA, blev en forbedring af immunresponset opnået. iv) Ved mucosal/oral immunisering med den rekombinante K. lactis stamme VAK367-E2-1 kunne en virkningsguld beskyttelse opnås. Dette blev demonstreret i challenge-forsøg med rekombinante vacciniavira, der udtrykker BVDV E2-proteinet.
Resultaterne af undersøgelserne viser, at ifølge opfindelsen ved hiælp af frembringelse af en K. lactis-stamme og varianter af denne stamme, kan fremmede gener uden yderligere selektionsmarkører specifikt integreres i disse. Det resulterende rekombinante afkom fra den pågældende K. lactis-stamme kan anvendes til ekspressionsformål til den efterfølgende biokemiske fremstilling af et heterologt protein. Cellerne fra de tilsvarende rekombinante K. lactis-stammer kan anvendes direkte til mucosal/oral eller parenteral immunisering.
Sequence Data
Molecule: Klp3, 8117 bps DNA Circular Description: Ligation of Iac4 into i-amp File Name: Klp3.cm5, dated 12 Nov 2009 Printed: 1-8117 bps (Full), format Single Strand 1 aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 61 ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 121 aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt 181 ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca 241 gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag 301 ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc 361 ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca 421 gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt 481 aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct 541 gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt 601 aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 661 caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 721 tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 781 acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga 841 gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 901 agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 961 gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 1021 ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 1081 taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 1141 agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 1201 aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 1261 ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtac ttctagtgta 1321 gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 1381 aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 1441 aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 1501 gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 1561 aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 1621 aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 1681 cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 1741 cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 1801 tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 1861 tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga 1921 ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 1981 atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa 2041 tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgctcc cggctcgtat 2101 gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta 2161 cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag ctgggtaccg ggcccgcgac 2221 ctaaccattc aaatgattca taactatctc ctagccagaa ttcgtaccca actcttggga 2281 aatcaggagg ctgatattcg ccagtaagct tcatagaagt gttcaagttt attttgttag 2341 caaagatcgt gtacttctga acagtctcaa acccatagta aaatacaact ggggatatac 2401 gagagttaac cgtgactaca gctagagaac cattagaacc tttttcgaca ctcactccat 2461 ggatgttttg cttcattaaa tcaatattgt acttcttcca gttcttaaag tccctaggtt 2521 catcattatt cgttggaggt ctccagaaag tgattgaaga accctcaaac ttgctggaaa 2581 tttccttacc cttgaccttt aggctttcaa ttttacccaa caatttgtcc aagataaaat 2641 gcaatccact ggattcaact g.agacataac gtttaccgtc gttgatcttc gcagcttttt 2701 ctgctgtctc tgtaacaaaa tcgggtacct tcaatggaag ttcagcttgg ccccaggcaa 2761 tttcatgacc tgcctttaga acaccagcat catctttcaa cacggcaaca acataagttg 2821 tatcagaagg aatagtaaca gattcttctg gctttaaaga tggaacgtcg attgtctttc 2881 ccgtgtcctt gtcgataaac aataagtggt ctgtcgtaat gaagtcgtgc ttatttgtga 2941 ttgttacaga tccgtgcgca attttaatat gaacgggttc aataaccttc ttatactcta 3001 caaggcccgg agtaggatta tgctcactgt tacacaaacc atccatgatg aacactccgt 3061 catgaacctc ttccttaaag tcaccaccat aagcataagc tttatgcaac ttaccatctg 3121 cagtactaac atcttcgaat tcaataccgt gatttgccca ttcccagata aagccacctt 3181 ggtaaaactt ctccttgtag aacaactctt gatattcttt caaagagcca ggaccgttac 3241 ccattgcatg gccgtactca cacaagatca aaggcttttc aaacttacca ttttcatcag 3301 tgtggttctt cctccacctt tccataattt caaatgttgg gtacatgaaa ctaaagatat 3361 ctgcactcaa agcgttcaag tcaccctcat aatgcacaag tctggtagga tccaattgtt 3421 taattaactt gtacatggct ttgtggtttc tgccataaca agcttcgtta cccaaggacc 3481 agataataat cgaaggatga ttgacatctc ttaggacaag ttgggaagct ctgtctaagt 3541 acgcgacctc gtactctgga ttatctgata agtaatgggc attaacatcg tagagtttat 3601 ttttagtatc tggatattca gcctccaagt tcgtatgacg attaaatggc tcttgaacac 3661 catgagtttc aagatctgcc tcgtcaatga cccagaagcc cagcttatcg aagaggtcat 3721 acaccttagg atggtttgga taatgcgagt tacgaacagc attgatgtta aacttcttca 3781 ttagaatcaa gtccctaaca acaaaatcta atggcacagc tctaccgaac cttggatggt 3841 gatcatgtct gttgacacct ctaaagagaa tgtctttgcc attaacagta atgttaccgt 3901 ccttcaactc cacttgtctg aaaccaacat ggtgcttaat agattgaatc acactgccat 3961 cagatccaat taaatccaac tggtacttgt acaaagtagg attttctgcg gtccaatgtt 4021 ctggggcctt gacgttgatc ttgaaagctg tttcttcgtt ctttttggtg gagaaggaaa 4081 taaattcttt agttgaaaaa gtcgtgttcc cattctcctc gttcaacaaa gagcttgcat 4141 cgtaaacttt agatccatct tcaggttcgt aaagtgtgaa attgatgtga tcataagaag 4201 aaccctggac atcaactttc acagaaagct ctgcatcctg atactgagag tccacaaaag "4261 ttgtagtgac cctaacgtct tcaatatggg ccttcttagg caattttagt aaagaaacgt 4321 ctctgtaaat accagagagc caccattgat cttggtcctc gatataagtg gaatcggacc 4381 acttgaaaac cttgacgacc actaagtttt cgccctcaga aacgtacttt tggatatcaa 4441 attcagcccc gttacgggac cccttattga aacccacata ttgaccatta acataaagct 4501 cgtaacaatt gtccacaccc tcaaatctca atctgtgctc gaacgactca atcgatttcg 4561 aatctaattc aaaagttcta gcataaacac cagtaggatt tacagtggga ggatttggga 4621 tgtcgattgg gatagggtac tgtacgttcg tgtaaattgg tttaccgtac ttccagtctt 4681 cctgaagttc ccaatgggat ggcacagaaa tggtgctcca tttctttgcc gtttcccagt 4741 ctaaattctt agcatccgga gcgtcaagag gtgcatcaaa caacgcaaaa gcccaaggcc 4801 cattgagaga ttcgaaaata tcctgatcat agtagtaagc cctagtaggc aatctatttt 4861 cgtgaacctt tttggggttc cttaaattct caggaataag gcaagccatg gtgccgtcct 4921 gccgagatat tgtgtacact ggatcaaata ataacacttt caaagtgact aaatcacaat 4981 tgtcccaaga tatactatag ctctctgttt aacctttata ttgtcaaaaa gggacaatga 5041 atgaaagtac aaacacaaac acaaacacaa tggaagggag tgtccagggt ggtgattcct 5101 gactgtactg attcgacgga gttttatttg atttcgttga agtggttaaa gtgaataatt 5161 cttgaattga gaggaacaaa gagtggataa aataacggaa tggagaggtc cgagcgatga 5221 ataatgtacg attcggaaga ctatgagccg gctgaacctg aggttatgga ccactaacgt 5281 cctggttgac aagagtagtc atgtaataca aacgtaaatg tgatatttaa tagaatataa 5341 gtagatatag ttaaaaagaa gaagaagaat agaaagaata agggtattag aaatttagag 5401 tcattttaaa caattgataa cttgggttaa agctcgaagt tttgttgata gtagtttttt 5461 tttttgtttt agttggtttg ttcaatagta taaggttaca gggtgcgaga caaacgttgt 5521 aacacttttc atctcccccc gctaatcacc tagtcgagag ctcgttttcg acactggatg 5581 gcggcgttag tatcgaatcg acagcagtat agcgaccagc attcacatac gattgacgca 5641 tgatattact ttctgcgcac ttaacttcgc atctgggcag atgatgtcga ggcgaaaaaa 5701 aatataaatc acgctaacat ttgattaaaa tagåacaact acaatataaa aaaactatac 5761 aaatgacaag ttcttgaaaa caagaatctt tttattgtca gtactgagtc gacggtacag 5821 cttctcgatg agtatgtgtg tttatttttt ttttattttt tttgccaaat tctgctcttt 5881 cctaaatttc aagtgttgag cttgttatcc gctcacaatt ccagcttttg tctcttcacc 5941 ttttccaact acaagcgcaa cataacaaaa gaataataat tctcctaaga aacacaagcc 6001 tcatatacct ttcgagttag ggaagaacat cttctctctg ttctcacatt gattcgagct 6061 attaaatacc tttttctcaa tcgaaatctc aagtaaaaca gcaatgaaaa cattacgtaa 6121 ctaaaggtgt tcaccactag aaatcatacc cttcacactc gacttcaagt agtgaatggt 6181 gtagcaacaa agtccaaata ccaatgtcaa ccaagtaacc gaccgcacta ctagaaaaag 6241 acgctgttgc tcggaccaca aatttccgct acacttttca caactatact gaagatacaa 6301 aaaacgtgtg tgggtatggc tggctaccag gtcgcctggt taaaccaagt caacgtgata 6361 catatgtacg ttccaacact aagcctaccc taagtttcgg ctcacaggct aggctattat 6421 taacatgcaa gacaagggag aagcaaagca aagaccaacc gaaacccacc agagcaccct 6481 gaactttgcg gtgaacagaa ttccgcaaca tatctgagga taccatgatc tcgttttcct 6541 -actccatatg ggaatcaccc actgttgtcc gtaaatatga ccaaattcct accttgattc 6601 ctcacgaata atcgcagtcc gaaaagccgt tccaaaagcc agtccacagt ccatcaattg 6661 gtatgatgat tgtttttttg ttcaaactga cacactaacg gtgtggaatg cgaagagtga 6721 gcttaccctt ctcctctttg ctagcagtac ttgcctacct acctactcta ctacgctgcc 6781 atattgtcta acattcggct ttctctattt ctacctggcc tggatggctc cgtctcgccc 6841 gcctcacaca catacattcc tccccctctc gcctgcccca taataattaa acaagttaac 6901 aaaaggcgtt acctcttccg catcctctcc aatctcatac gattcccctt tcatccgact 6961 tacccaacaa gatacaggat ctcagtgaaa gatccttcct gccctccctg tctgttgtct' 7021 actctacatg cgacttggaa ggccaaagga ctatcgcatg attattcgcc gggaacccgc 7081 gagttccctg ctcttttctt tcaaaccagg cagcaaacca ggtgaacåca ctctgatgta 7141 gtgcagtccc taagtccttt gaagattcgg ggagctagct acccacgcga atgtaacaaa 7201 agaacattta cttttgtggg gggtggaaaa gtcgattagg atcttgcagc acagaaactg 7261 cgcaggggtt tttttcatct tggagaagca actggctaaa ttcgacacaa acaaaaactg 7321 aaaaatggaa aataaaaaat gaaaaagcaa gctgaattcg aagaagggag aattccgcct 7381 tctgcaacca cactaatggt tggtagtcaa tagatacgca ttagaaggtt actattttat 7441 gagtcgatcc ccgcggtgga gctccaattc gccctatagt gagtcgtatt acgcgcgctc 7501 actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 7561 ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 7621 cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc gacgcgccct gtagcggcgc 7681 attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 7741 agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 7801 tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 7861 ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 7921 ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 7981 aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 8041 ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 8101 attaacgctt acaattt

Claims (21)

1. Fremgangsmåde til oral/mucosal vaccination, omfattende indgivelse afen genteknologisk genereret rekombinant gærstamme af gæren Kluyveromyces lactis kendeteg net ved, at denne rekombinante stamme indeholder en genomisk integreret ekspressionskassette, der er sammensat af den lactose-inducerbare L4C4-promotor, et fremmed gen, der koder for et immunogent protein, en transkriptionsterminator, og MC4-genet, som under styring af GAZ_80-promotoren fra K. lactis (KIGAL80-P) koder for β-galactosidase-enzymet, hvorved den målrettede integration af fremmede gener finder sted ved gærgenomets L4C4-locus, uden indføring af yderligere DNA-sekvenser, og ekspressionen af fremmede gener induceres doseret af lactose eller galactose eller aktiveres konstitutivt efter slukning af regulatorgenet KIGAL80.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de rekombinante K. lactis-stammer er genetisk stabile, når de dyrkes under ikke-selektive betingelser.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de rekombinante stammer af gæren Kluyveromyces lactis anvendes som ekspressionssystem og til vaccination.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at de rekombinante stammer af Kluyveromyces lactis muliggør lactose-inducerbar ekspression af fremmede gener.
5. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af de ovennævnte krav 1 til 3, k e n d e t e g-n e t ved, at det fremmede gen integreres ved den rekombinante Kluyveromyces lactis-stammes LAC4-locus.
6. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af de foregående krav, kendetegnet ved, at den rekombinante Kluyveromyces-stamme foruden det fremmede gen ikke indeholder nogen yderligere vektorsekvenser eller selektionsmarkører.
7. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af de foregående krav, kendetegnet ved, at den fremmede genekspression er konstitutiv efter slukning af KIGAL80-ger\et
8. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af de foregående krav, kendetegnet ved, at den fremmede genekspression kan kvantificeres indirekte via ekspression af et endogent reportergen.
9. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af de foregående krav, kendetegnet ved, at det fremmede gen muliggør ekspression af virale proteiner med antigene egenskaber.
10. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af de foregående krav, kendetegnet ved, at det fremmede gen muliggør ekspression af virale strukturelle proteiner.
11. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af de ovennævnte krav, kendetegnet ved, at det fremmede gen muliggør ekspression af virale strukturelle proteiner af familierne Flaviviridae, Orthomyxoviridae og Birnaviridae.
12. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af de ovennævnte krav, kendetegnet ved, at det fremmede gen muliggør ekspression af strukturelle proteiner af virus fra bovin virusdiarré (BVDV).
13. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af de ovennævnte krav, kendetegnet ved, at de rekombinante stammer af Kluyveromyces lactis-gær, der inducerbart eller kon-stitutivt udtrykker betydelige mængder af et protein, eller af domæner af dette protein, eller af domæner af dette protein fusioneret med fremmede proteindomæner.
14. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af de foregående krav, kendetegnet ved, at den biokemiske fremstilling fremmede proteiner er muliggjort.
15. Fremgangsmåde ifølge ét eller flere af de ovennævnte krav, kendetegnet ved, at der ved en vaccination ved hjælp af indgivelse af komplette gærceller af en rekom-binant stamme af gæren Kluyveromyces lactis genereres en specifik immunisering mod udtrykt fremmed protein.
16. Fremgangsmåde ifølge krav 15 kendetegnet ved, at der ved en vaccination ved hjælp af inhalering, bronkial, oral, nasal indgivelse af komplette gærceller af en rekombinant stamme af gæren Kluyveromyces lactis genereres en specifik immunisering mod udtrykt fremmed protein.
17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at biokemisk fremstillede fremmede proteiner muliggør en specifik immunisering.
18. Rekombinant stamme af gæren Kluyveromyces lactis, kendetegnet ved, at denne rekombinante stamme indeholder en genomisk integreret ekspressionskassette, der er sammensat af den lactose-inducerbare L4C4-promotor, et fremmed gen kodende for et immunogent protein, en transkriptionsterminator og det for enzymet β-galactosidase kodende L4C4-gen under styring af G/4/.SO-promotoren fra K. lactis (KIGAL80-P), hvor de fremmede gener integreres specifikt ved gærgenomets LAC4-locus uden indføring af yderligere DNA-sekvenser, og ekspressionen af fremmede gener induceres doseret af lactose eller galactose eller aktiveres konstitutivt efter slukning af regulatorgenet KIGAL80.
19. Anvendelse af den rekombinante stamme af gæren Kluyveromyces lactis ifølge krav 18 til fremmed proteinekspression.
20. Rekombinant stamme af gæren Kluyveromyces lactis ifølge krav 18 til anvendelse ved vaccination.
21. Rekombinant stamme af gæren Kluyveromyces lactis ifølge krav 18 til anvendelse ved oral/mucosal vaccination mod BVD-viruset eller CSF-viruset.
DK09808976.6T 2008-11-14 2009-11-13 Fremgangsmåde til oral/mucosal vaccination med rekombinant gær. DK2403947T3 (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102008057451A DE102008057451A1 (de) 2008-11-14 2008-11-14 Verfahren zur oralen Vakzinierung mittels rekombinanter Hefen
PCT/DE2009/001623 WO2010054649A2 (de) 2008-11-14 2009-11-13 Verfahren zur oralen/mukosalen vakzinierung mittels rekombinanter hefen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DK2403947T3 true DK2403947T3 (da) 2018-05-28

Family

ID=42105074

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK09808976.6T DK2403947T3 (da) 2008-11-14 2009-11-13 Fremgangsmåde til oral/mucosal vaccination med rekombinant gær.

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9885052B2 (da)
EP (1) EP2403947B1 (da)
JP (1) JP5930716B2 (da)
CN (1) CN102741414B (da)
DE (2) DE102008057451A1 (da)
DK (1) DK2403947T3 (da)
ES (1) ES2669018T3 (da)
PL (1) PL2403947T3 (da)
WO (1) WO2010054649A2 (da)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102011121069A1 (de) 2011-12-13 2013-06-13 Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Vakzinierung mittels rekombinanter Hefe durch Erzeugung einer protektiven humoralen Immunantwort gegen definierte Antigene
KR101876535B1 (ko) * 2012-06-14 2018-07-09 베트올 (주) 소바이러스성 설사병 바이러스의 탐지용 항체, 이를 이용한 항원 검출 방법, 및 이를 포함하는 탐지키트
DE102017012109A1 (de) 2017-12-27 2019-06-27 Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Optimiertes Wirts-/Vektorsystem zur Erzeugung protektiver mono- und multivalenter subunit-Vakzine auf Basis der Hefe Kluyveromyces lactis

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2679920A1 (fr) * 1991-08-02 1993-02-05 Rhone Poulenc Rorer Sa Levures recombinantes hautement stables pour la production de proteines recombinantes, leur preparation et leur utilisation.
US5830463A (en) * 1993-07-07 1998-11-03 University Technology Corporation Yeast-based delivery vehicles
US5541102A (en) * 1994-09-02 1996-07-30 Board Of Regents, University Of Nebraska-Lincoln Bovine cell line resistant to in vitro infection by bovine viral diarrhea virus and all other known pestiviruses
US6174667B1 (en) * 1997-09-23 2001-01-16 Cornell Research Foundation, Inc. Bovine viral diarrhea virus serum antigen capture
EP1174506A1 (en) * 2000-06-28 2002-01-23 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek C-terminal Erns peptide and analogues thereof
AU2002225681A1 (en) * 2000-11-15 2002-05-27 Globe Immune, Inc. Yeast-dentritic cell vaccines and uses thereof
RU2405568C2 (ru) * 2004-09-10 2010-12-10 Асахи Гласс Компани, Лимитед Иммуногенная композиция

Also Published As

Publication number Publication date
CN102741414B (zh) 2015-11-25
WO2010054649A3 (de) 2010-10-07
DE112009003267A5 (de) 2012-11-15
PL2403947T3 (pl) 2018-08-31
US20110293659A1 (en) 2011-12-01
CN102741414A (zh) 2012-10-17
EP2403947B1 (de) 2018-02-14
EP2403947A2 (de) 2012-01-11
JP2012508697A (ja) 2012-04-12
DE102008057451A1 (de) 2010-05-20
WO2010054649A2 (de) 2010-05-20
ES2669018T3 (es) 2018-05-23
US9885052B2 (en) 2018-02-06
JP5930716B2 (ja) 2016-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112375748B (zh) 基于水疱性口炎病毒载体的新型冠状病毒嵌合重组疫苗及其制备方法与应用
CN112941038B (zh) 基于水疱性口炎病毒载体的重组新型冠状病毒及其制备方法与应用
EP3548617A1 (en) Optimized lentiviral vector for stem cell gene therapy of hemoglobinopathies
CN106957859A (zh) 一种用于拯救麻疹病毒、重组麻疹病毒的系统以及方法
CN103173492A (zh) 携带外源基因的复制型hbv载体、其转染后产生的重组hbv，和相应的制备方法与应用
DK2403947T3 (da) Fremgangsmåde til oral/mucosal vaccination med rekombinant gær.
KR102027400B1 (ko) 정의된 항원에 대한 보호 체액성 면역 반응을 형성하는 재조합 효모를 이용한 예방 접종
CN112442515B (zh) gRNA靶点组合在构建血友病模型猪细胞系中的应用
CN107988253A (zh) 一个人miRNA作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用
CN114317584B (zh) 新型转座子突变株文库的构建系统、新型转座子突变文库和应用
CN111471635B (zh) 一种提高枯草芽孢杆菌核酸含量的方法
CN112538497B (zh) CRISPR/Cas9系统及其在构建α、β和α＆β地中海贫血模型猪细胞系中的应用
CN106978445A (zh) CRISPER‑Cas9系统介导的山羊EDAR基因敲除的方法
CN112442513B (zh) Cas9过表达载体及其构建方法和应用
CN106676135A (zh) Alb‑uPA‑teton慢病毒载体及其制备方法和应用
CN113046388A (zh) 用于构建双基因联合敲除的动脉粥样硬化猪核移植供体细胞的crispr系统及其应用
CN112522264A (zh) 一种导致先天性耳聋的CRISPR/Cas9系统及其在制备模型猪核供体细胞中的应用
CN113774047B (zh) 鱼源蛋白酶基因及其应用
CN114015689B (zh) 一种特异性抑制GOS2基因表达的shRNA序列及其应用
CN112522310B (zh) Crispr系统及其在构建lrp5基因突变的骨质疏松症克隆猪核供体细胞中的应用
CN112522292B (zh) 一种用于构建先天性黑蒙症克隆猪核供体细胞的CRISPR/Cas9系统及其应用
CN109811008A (zh) CRISPR-Cas9系统介导的小鼠FGF5基因敲除的方法
CN112608941B (zh) 用于构建mc4r基因突变的肥胖症猪核移植供体细胞的crispr系统及其应用
CN112813101B (zh) 一种构建瘦肉率高、生长快的优质猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
CN112899306B (zh) Crispr系统及其在构建gabrg2基因突变的克隆猪核供体细胞中的应用