CN103173492A - 携带外源基因的复制型hbv载体、其转染后产生的重组hbv，和相应的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种携带外源基因的复制型HBV载体及该型载体转染细胞后产生的重组HBV，以及相应的制备方法与应用，所述载体是在原有表达HBV的质粒基础上，利用分子克隆技术将HBV基因组上重叠的C基因和P基因分开，各自形成完整开放读框，其间插入蛋白翻译起始序列或蛋白酶切位点，分别引导外源基因和P基因表达；携带外源基因的复制型HBV载体瞬时转染肝癌细胞后分泌重组HBV；本发明所提供的制备HBV载体转染细胞后，所产生的重组HBV能够在表达外源基因的同时，仍保留了复制和感染能力；本发明适用于构建HBV慢性感染动物模型、构建HBV的cccDNA稳定自主复制的细胞模型，构建可示踪的HBV病毒株，用于研究HBV感染，复制，包装等环节的分子机制，筛选抗HBV新药。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程领域，涉及一种病毒载体，尤其涉及一种携带外源基因的复制型HBV载体、其转染后产生的重组HBV，和相应的制备方法与应用。
背景技术
在全球范围内，乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染者超过4亿。这一人群发生肝纤维化，肝硬化，肝细胞癌的风险大大增加。现有的抗乙肝病毒药物，包括干扰素和核苷类似物两大类。但是这两类药物疗效均不理想，且干扰素副作用较大，核苷类似物易诱导HBV发生耐药突变。研发新型抗HBV药物的一大障碍就是缺乏良好的实验研究平台。
HBV特异性感染肝细胞，并且宿主范围极窄，仅能感染人、黑猩猩和树鼩。长久以来，来源于人或树鼩的原代培养肝细胞是仅有的两种HBV感染细胞模型。最近，研究人员培养出一种人肝癌细胞来源的HepaRG细胞，这种细胞在体外诱导分化之后，能够感染HBV。但是，HBV感染的分子机制，尤其是感染早期的相关细节，一直未被阐明。通过对转染细胞的研究，以及用生物化学方法重构HBV复制过程中的关键环节，人们对HBV复制的分子机制已有了较深入的了解。这些研究成果揭示了HBV基因表达产物和HBV基因组上众多顺式作用元件之间相互作用，以及这些相互作用是如何保证短小精悍的，基因结构高度紧凑的HBV完成其自我复制全过程的。正因为如此，即使对HBV基因组进行很小的基因工程改造，都可能严重干扰HBV的复制周期。
对于HBV以外的其他多种病毒，包括严重危害人类健康的人免疫缺陷病毒（HIV）和丙型肝炎病毒（HCV）等，均可以用基因工程方法在病毒基因组上插入外源基因，如报告基因和筛选基因等，同时不干扰病毒自身的复制过程。通常这种经过改造的重组病毒经由与野生型病毒相同的方式感染宿主细胞，并且以相同的机制利用宿主细胞完成病毒复制。这些重组病毒上携带的外源基因的表达，依赖于病毒感染或病毒复制。这些外源基因的这种特性，使人们可以利用外源基因观察病毒感染的途径，快速测定病毒复制效率，探寻调控病毒感染和复制的宿主因素。更重要的是，通过外源基因的表达水平指示病毒复制水平的方法，为提供了一种快速筛选抗病毒药物的新策略，同时也可帮助分离鉴定对病毒易感的细胞。
由于HBV基因组结构和复制机制的特殊性，研发基于HBV的，既能表达外源基因，又能保留复制能力的新型载体，遇到了诸多困难。在HBV病毒颗粒中，多数HBV基因组以疏松环状DNA（RC DNA）的形式存在。少量HBV基因组以双链线性DNA（dsL DNA）形式存在。一旦感染细胞后，HBV RC DNA即转化为共价闭合环状DNA（ccc DNA），作为转录RNA的模板。如图1所示图中显示了HBV C基因，P基因，S基因，X基因的开放读框，HBV的DNA（“-”链和“+”链），增强子结构（Enh I和Enh II），转录出的基因组RNA和亚基因组RNA（genomic RNA和subgenomic RNA），以及RNA上的包装信号（ε）和poly A尾结构，从图中可以看出HBV基因组结构紧密，4种基因重叠，调控序列穿插其间。HBV基因组包含4个相互重叠的开放读框（ORF），分别是preS1/preS2/S，编码三种HBV外膜蛋白，大蛋白，中蛋白和小蛋白，这三种蛋白羧基端相同；preC/C，编码核心蛋白和对于复制非必需的前C蛋白，前C蛋白进一步剪切为分泌至细胞外的HBV e抗原（HBeAg）；X基因，编码X蛋白（HBx），发挥转录激活作用，对于感染过程至关重要；P基因，编码HBV聚合酶（Pol），是一个多结构域蛋白，包含逆转录酶活性区，RNA酶H区和蛋白-DNA相互作用区（末端蛋白区）。P基因ORF的长度约占HBV基因组的80%，与其他各个HBV的ORF重叠。HBV基因的表达需要通过4种RNA，均由HBV自身启动子调控转录，其中最重要的一条RNA是HBV前基因组RNA（pgRNA），pgRNA的长度超过HBV基因组本身，发挥双顺反子mRNA的功能，编码HBV核心蛋白，前C蛋白和P蛋白（即HBV聚合酶，Pol），同时，pgRNA还是逆转录生成HBV DNA的模板。在pgRNA上，启动子和增强子序列与ORF重叠，其他多个顺式作用元件也与ORF重叠，包括ε包装信号，以及两段直接重复序列（DR1和DR2），负责将pgRNA包装入新合成的HBV核壳，在pgRNA逆转录为RC DNA的过程中不可或缺。在这些调控区域上的任何位置插入外源序列，都将不可避免地严重破坏HBV基因组的精巧布局，并且将无可挽回地打破HBV复制的进程。
因此，先前研究人员构建的HBV载体大多为复制缺陷型HBV，必须依赖共转染的HBV辅助质粒才能恢复复制能力。这样的载体只能完成一轮HBV的复制周期，因此，这类复制缺陷型载体反而有了较好的生物安全性。但是，复制缺陷型载体不能用于研究和HBV复制有关的问题。
构建携带外源基因的HBV载体所面临的第二个障碍，在于正二十面体形的HBV核壳内部空间极其有限，仅能容纳长度有限的RNA或DNA链。常用的HBV载体构建策略是用外源基因取代HBV自身序列，以不过度增加HBV基因组的长度。HBV S基因和C基因是最常被替换的区域。已有研究人员成功地利用这种策略构建出了可以特异性的在肝脏中表达外源基因的HBV载体。将有酶活性的基质金属蛋白酶-8的截短体置入HBV基因组中，替换掉HBV S基因区，制得复制缺陷型HBV载体，然后将HBV载体装入腺病毒中，可以实现在肝纤维化大鼠的肝脏中特异的表达基质金属蛋白酶-8截短体，达到较好的治疗效果。
迄今为止，仅有一篇文献报道过所谓“复制型”HBV载体，研究人员曾将276bp的HIV的Tat基因插入HBV P基因上末端蛋白区和逆转录酶活性区之间的间隔区中。尽管间隔区对于P蛋白发挥功能无关紧要，但是该区域与编码HBV外膜大蛋白的前S1区重叠，而大蛋白在HBV感染过程中起关键作用，因此，在间隔区插入外源基因，将不可避免地破坏前S1区，使重组HBV丧失感染能力。实验表明，这种HBV载体转染细胞后，HIV的Tat基因确有表达，但是复制出的HBV的DNA量却大大降低（下降超过95%），图2所示为HBV的tat载体转染细胞后进行DNA印迹实验，以野生型HBV为阳性对照，以无关载体为阴性对照（mock）。RC：疏松环状DNA；L：双链线性DNA；ss：单链DNA。从图中可以看出，HBVtat载体转染细胞后HBV复制水平与野生型相比过低，无法作为复制型HBV载体进行应用。尽管文章中没有写明重组HBV的感染能力，但是可以想见，由于缺失了外膜大蛋白，此种重组HBV必然失去了感染能力。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种携带外源基因的复制型HBV载体、其转染后产生的重组HBV，和相应的制备方法与应用。所述载体是在原有表达野生型HBV的质粒基础上，利用分子克隆技术将HBV重叠的C基因和P基因分开，各自形成完整开放读框，其间插入蛋白翻译起始序列或蛋白酶切位点，分别引导外源基因和HBV P基因表达；以所构建的携带外源基因的HBV载体转染肝细胞或肝癌细胞，收集细胞培养上清中的病毒颗粒，即为重组HBV。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种携带外源基因的复制型HBV载体，它是在原有HBV病毒的基础上，利用分子克隆技术将HBV基因组上重叠的C基因和P基因分开，各自形成完整开放读框，其间插入蛋白翻译起始序列或蛋白酶切位点，分别引导外源基因和HBV P基因表达；
所述的外源基因的碱基对个数小于700bp，以能保持HBV的复制能力和感染能力，外源基因随着长度的增大，重组HBV的复制能力逐步下降；所述的蛋白翻译起始序列为内部核糖体进入位点的短小的碱基序列；蛋白酶切位点均为短小的碱基序列。
作为本发明的一种限定，所述的外源基因为miniSOG，绿色荧光蛋白（即hrBFD），荧光素酶等荧光基团，杀稻瘟菌素抗性基因、博来霉素抗性基因中的一种；
所述的蛋白翻译起始序列为Rbm3 IRES或多拷贝9nt Gtx IRES；
所述的蛋白酶切位点为可发生“自我剪切”的2A肽。
本发明还提供了制备上述携带外源基因的HBV载体的方法，它按照以下步骤顺序进行：
一、第1轮PCR扩增
HBV的C基因和P基因之间的重叠区由单拷贝变成双拷贝，使C、P基因分开并形成各自独立的完整开放读框，同时通过设计合理的引物，在C基因C端加上蛋白翻译起始序列（或蛋白酶切割位点），用于引导外源基因翻译，在P基因的N端加上加上蛋白翻译起始序列（或蛋白酶切割位点），用于引导P基因翻译；
其中，第1轮PCR扩增包括3个PCR扩增反应，目的分别为：
在引物上加入翻译起始序列的同时，加入Rbm3 IRES为21nt的间隔区，其序列为：
TTTATAATTTCTTCTTCCAGAA GAATTTGTTGGTAAAGCCACC ATG；
其中，带下划线的部分为22nt的Rbm3 IRES，斜体部分为间隔序列，黑体部分为蛋白翻译起始密码子；
设计配套的DNA限制性内切酶酶切位点，使3个PCR反应产物前后环环相扣，得以按照确定方向进行三片段连接；
应使PCR反应产物延伸超过HBV基因组上的EcoR I酶切位点，以利用这一位点将三片段连接产物亚克隆至HBV基因组上的对应位置；
具体而言，按照以下步骤顺序进行：
一、第一轮PCR扩增，包括3个PCR反应：
PCR反应
：以含有CMV启动子及HBV全基因组的pCH-9/3093为模板，设计合适的引物，用高保真DNA 聚合酶进行PCR扩增，产物包含HBV C/P基因重叠区和翻译起始序列（或蛋白酶切位点），上游带有Sal I酶切位点，下游为翻译起始序列（或蛋白酶切位点）和Nco I酶切位点。引物设计要点是，在引物上加入翻译起始序列的同时，应加入21nt的间隔区。
PCR反应：以含有外源基因的质粒为模板，设计引物，PCR扩增，产物为包含外源基因的DNA片段，上下游分别带有Nco I和Pst I酶切位点。
PCR反应
：以pCH-9/3093为模板，设计合适的引物，PCR扩增，产物包含HBV C/P基因重叠区和翻译起始序列（或蛋白酶切位点），上游带有Pst I酶切位点和翻译起始序列（或蛋白酶切位点），下游延伸超过HBV基因组上的EcoR I酶切位点。引物设计要点是，在引物上加入翻译起始序列的同时，应加入21nt的间隔区。
二、三片段连接
3个PCR反应产物连接为依次包含C基因C端（包括C/P重叠区），翻译起始序列或蛋白酶切位点，外源基因，翻译起始序列或蛋白酶切位点，P基因N端（包括C/P重叠区）延伸超过HBV基因组上的EcoR I酶切位点的DNA双链；
具体而言，按照以下步骤顺序进行：
包括限制性酶切酶酶切和连接两个反应。其中：
酶切反应：PCR反应
的扩增产物用Sal I和Nco I酶切，PCR反应
的扩增产物用Nco I和Pst I酶切，PCR反应
的扩增产物用Pst I酶切。
连接反应：将三个反应的酶切产物混合，用T4 DNA连接酶连接。
三、第2轮PCR，扩增三片段连接产物
具体而言，按照以下步骤顺序进行：
以上述连接反应产物为模板，设计合适的引物，PCR扩增，产物包含双拷贝的HBV C/P基因重叠区，以及C基因和P基因之间的两个翻译起始序列（或蛋白酶切位点），外源基因，上游带有Sal I酶切位点，下游延伸超过HBV基因组上的EcoR I酶切位点。
四、双酶切PCR产物，亚克隆至pCH-9/3093质粒Sal I-EcoR I位点，形成插入外源基因和翻译起始序列或蛋白酶切位点的HBV载体，使用CMV启动子，将HBV C基因和P基因完全分开，各自形成完整开放读框，C基因和P基因之间插入翻译起始序列或蛋白酶切位点引导的外源基因。
具体而言，按照以下步骤顺序进行：
上述PCR扩增产物用Sal I和EcoR I双酶切后形成黏性末端，另用Sal I和EcoR I双酶切pCH-9/3093质粒。
五、连接
上述两个酶切反应产物混合，在T4的DNA连接酶作用下环化，形成闭合环状双链DNA，即插入外源基因的HBV载体。这一载体使用CMV启动子，HBV的C基因和P基因完全分开，各自形成完整开放读框，C基因和P基因之间插入翻译起始序列或蛋白酶切位点引导的外源基因。
本发明还提供了上述携带外源基因的复制型HBV载体的应用，所述HBV载体用于构建HBV慢性感染动物模型、构建稳定自主复制HBV cccDNA的细胞模型和构建可示踪的HBV病毒株。
本发明还提供了一种携带外源基因的复制型HBV载体转染细胞后产生的重组HBV，所述重组HBV由携带外源基因的复制型HBV载体瞬时转染肝癌来源的细胞后，收集细胞培养上清中的病毒颗粒，即制得重组HBV，所述重组HBV的C基因和P基因完全分开，其间插入了可表达的外源基因，同时保留了复制和感染能力。
本发明也提供了上述携带外源基因的复制型HBV载体转染细胞后产生的重组HBV的制备方法，它按照以下步骤顺序进行：
（21）构建携带外源基因的HBV载体；
（22）利用步骤（21）中所制得的载体转染肝癌来源的细胞系，在细胞培养液中加入1%-2%的二甲基亚砜，可明显提高重组HBV的复制水平及最终产量；其中，所述的肝癌来源的细胞系为HepG2或Huh7；转染试剂为Fugene6 HD，来自Roche公司；
（23）转染后72小时和96小时各收集一次细胞培养上清，若重组HBV复制水平较高，可在转染后120小时再收集一次细胞培养上清，聚乙二醇8000（PEG8000）沉淀上清中的病毒颗粒。
本发明还提供了上述携带外源基因的重组HBV的应用，所述携带外源基因的复制型HBV载体、重组HBV用于构建HBV慢性感染动物模型、构建稳定自主复制HBV的cccDNA的细胞模型和构建可示踪的HBV病毒株。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明所提供的携带外源基因的复制型HBV载体，转染肝癌细胞后，既能表达外源基因，又保留了复制感染能力，同时表达外源基因的重组HBV，具体地：
（1）使HBV的C基因和P基因的表达完全脱钩，将原本为双顺反子的pgRNA改造为三顺反子的mRNA，增加的一个顺反子即为外源基因。进行这一系列的改造，关键是要使加长的pgRNA依然能够包装入核壳，并且能够被逆转录为HBV的DNA。这样的改造不会破坏隐藏在HBV的P基因中的preS1和preS2/S启动子，自然不会影响3种外膜蛋白的表达，也就不会影响重组HBV的感染能力。
在HBV基因组上，C基因和P基因的重叠区域共150bp。无论是在HBV DNA 上，还是在HBV RNA上，除了负责启动P蛋白翻译的序列之外，目前没有在这一重叠区域内发现任何其他顺式作用元件。其他病毒蛋白的翻译起始过程常常需要由一个内部核糖体进入位点（IRES）介导，而HBV的P蛋白的翻译起始过程比较特殊，不同于其他病毒，因为P蛋白翻译起始，需要依靠P蛋白上游一个微小ORF上的一种“终止-再启动”的机制帮助。
在C/P基因重叠区由单拷贝变成双拷贝的前提下，实现C基因和P基因表达完全脱钩，形成两个完全独立的，完整的ORF。
（2）P蛋白重新设计一个翻译起始调控序列，野生型HBV的P蛋白的翻译效率明显低于核心蛋白的翻译效率，这是因为每个HBV核壳中仅需包裹一个P蛋白分子和一条pgRNA链即可实现功能，但是却需要240个核心蛋白分子才能组装成核壳。因此，为P蛋白重构的翻译起始调控序列不能活性过高。
（3）翻译起始调控序列的长度必须非常短小。在HBV核壳组装实验中发现，在没有P蛋白的情况下，能装入核壳的RNA链的长度最长不能超过7000个核苷酸，约为野生型HBV的pgRNA两倍长度。如果考虑到pgRNA最终必须转化为双链DNA，那么核壳内所能容纳的pgRNA长度就更加有限了。
（4）构建的携带外源基因的三顺反子pgRNA上必须有适合表达外源基因的翻译起始序列，这样才能让位于HBV的C基因和P基因之间的外源基因得以顺利表达。
构建多顺反子的常用策略是采用一个2A短肽，使翻译出的肽链在2A肽处自动剪切。另外一种常用的多顺反子构建策略是采用内部核糖体进入位点（IRES），利用IRES引导翻译起始过程。应用最多的是脑心肌炎病毒IRES（EMCV IRES）。然而，EMCV的IRES长度为450个核苷酸，单单一个EMCV的IRES基本上就占据了HBV载体上可能提供的大部分外源基因插入空间，但是其他病毒的IRES的长度多数也不符合HBV载体的要求。
RNA结合模序蛋白3 (Rbm3)的RNA上带有一段短小的IRES，长度仅为22个核苷酸（22nt）。考虑使用Rbm3 IRES，以及其他短小的IRES，或类似2A肽的蛋白酶切位点，构建插入外源基因的多顺反子pgRNA，实现即表达外源基因，又表达HBV自身蛋白，同时保留HBV复制能力和感染能力。
本发明所提供的携带外源基因的HBV复制型载体转染细胞后的重组HBV，与现有技术相比所取得的技术进步，具体如下：
1．与野生型HBV相比
野生型HBV的复制与感染需要通过Southern Blotting、定量PCR、ELISA等方法。表达荧光的复制型HBV载体，可在荧光显微镜下直接观察。表达荧光素酶，可以快速定量检测，可用于快速定量评估抗HBV新药对HBV复制的抑制作用，有助于快速、高通量筛选抗HBV新药。
2.与现有的复制缺陷型重组HBV相比
复制缺陷型重组HBV虽然可以表达荧光蛋白，荧光素酶，干扰素等外源基因，但是这些插入的外源基因破坏了HBV复制所必须的基因结构，使重组HBV失去复制，包装和感染能力，不能在肝细胞内持续表达外源基因。本发明制得的所述携带外源基因的HBV载体，可以在保留HBV复制，包装，感染能力的同时，持续，高效，稳定表达外源基因。
3. 与已报道的一种“复制型”重组HBV相比
现有技术中的一种 “复制型”重组HBV，在HBV PreS1之前插入外源基因的策略，导致HBV复制能力显著下降，并且重组HBV PreS1之前插入一个276bp外源基因，导致HBV复制能力显著下降，并且重组HBV的PreS1蛋白表达受限，重组HBV将无感染能力。而本发明所制得的携带外源基因的HBV载体能够转录出HBV复制所需的各条RNA链，且不破坏HBV基因组逆转录，转录，包装所需的各个调控序列。在此基础上可保证重组HBV的高水平复制，并高效表达外源基因，同时保留重组HBV的再感染能力。
4.与其他病毒相比
目前已开发出多种病毒来源的基因工程载具，如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒等，但这些病毒无特定细胞类型亲嗜性。本发明所构建的重组HBV具有嗜肝特异性，不感染其它类型细胞。
本发明提供的上述携带外源基因的复制型HBV载体转染细胞后的重组HBV的制备方法，与现有技术相比，不同之处在于在转染HBV载体之后在培养液中加入1-2%的DMSO，所加入的DMSO能够可使细胞培养上清液中HBV产量提高5~50倍。
本发明适用于构建HBV慢性感染动物模型、构建HBV的cccDNA稳定自主复制的细胞模型，构建可示踪的HBV病毒株，用于研究HBV感染，复制，包装等环节的分子机制，筛选抗HBV新药。
本发明下面将结合说明书附图与具体实施例作进一步详细说明。
附图说明
图1为为野生型HBV的基因结构图；
图2为HBV的tat载体复制水平DNA印迹实验图；
图3本发明的复制型HBV载体改造简图；
图4为本发明的复制型HBV载体结构及转录出的RNA图；
图5为本发明实施例2的CMV启动子调控下串联双Rbm3 IRES载体结构图；
图6为本发明实施例2的CMV启动子调控下串联双Rbm3 IRES翻译起始效率的检测图；
图7为本发明实施例2的HBV的C基因启动子调控下串联双Rbm3 IRES载体结构图；
图8为本发明实施例2的HBV的C基因启动子调控下串联双Rbm3 IRES翻译起始效率的检测结果图；
图9为本发明实施例2的复制型HBV载体pCH-hrGFP转染HepG2细胞后hrGFP的表达情况图；
图10为本发明实施例2的复制型HBV载体转染HepG2细胞后HBV RNA水平图；
图11为本发明实施例2的复制型HBV载体转染HepG2细胞后HBV核心颗粒的检测图；
图12为本发明实施例2的复制型HBV载体转染HepG2细胞后HBsAg和HBeAg表达情况图；
图13为本发明实施例2的复制型HBV载体转染HepG2细胞后HBV膜蛋白表达情况图；
图14为本发明实施例2的复制型HBV载体转染HepG2细胞后内源性DNA聚合酶活性检测图；
图15为本发明实施例2的复制型HBV载体转染HepG2细胞后HBV复制水平图；
图16为本发明实施例2的复制型HBV载体转染Huh7细胞后HBV复制水平图；
图17为本发明实施例2的复制型HBV载体转染HepG2细胞后HBV DNA定量检测图；
图18为本发明实施例2的复制型HBV载体转染Huh7细胞后HBV DNA定量检测图；
图19为本发明实施例2的复制型HBV载体转染HepG2细胞后形成完整HBV病毒颗粒情况图；
图20为本发明实施例2的重组HBV感染HepaRG细胞后新合成的HBV RNA的检测图；
图21为本发明实施例2的重组HBV感染HepaRG细胞后HBsAg表达水平图；
图22为本发明实施例2的重组HBV感染HepaRG细胞后HBeAg表达水平图；
图23为本发明实施例2的重组荧光HBV感染HepaRG细胞后荧光基团表达情况图。
具体实施方式
实施例１ 携带外源基因的复制型HBV载体及其制备方法
构建pCH-BsdR和pCH-hrGFP两种插入外源基因的复制型HBV载体，两种载体均使用巨细胞病毒启动子（Cytomegalovirus，CMV）启动转录，包含HBV全基因组，分别表达杀稻瘟菌素抗性基因（BsdR）和人源化海肾绿色荧光蛋白（hrGFP）基因。
如图3所示，图左为野生型HBV载体pCH-9/3093，带有CMV启动子，原核复制起始位点（Ori），原核筛选标志氨苄青霉素抗性基因（Amp），包含1.05倍HBV基因组，全长6336 bp。该载体转染细胞后，可转录出与野生型HBV相同的基因组RNA和各种亚基因组RNA，并表达出各种HBV蛋白，完成HBV复制的全周期，并且包装出完整的，有感染能力的野生型HBV病毒颗粒。图右是本实施例所制备的携带外源基因的HBV载体，插入并有效表达外源基因后能够同时保留复制HBV能力的新型HBV载体结构简图。采用基因工程的方法，将HBV的C基因和P基因之间的重叠区域分开，并各自补全，使C基因和P基因各自形成完整的开放读框，进而在C基因和P基因之间插入两个串联的IRES和外源基因，如人源化海肾绿色荧光蛋白，hrGFP，利用两个IRES分别引导外源基因和P基因的翻译起始过程，实现HBV自身基因和外源基因的同时高效表达。
如图3中左图所示，在包含HBV全基因组的pCH-9/3093载体上，HBV的C基因C端150bp的序列与P基因N端150bp的序列重叠。在pCH-9/3093载体上复制了这一段重复序列，使C基因和P基因均成为独立的，完整的开放读框，进而在已经补全的C基因C端和P基因N端之间，插入399bp的BsdR基因或720bp的hrGFP基因，这两种外源基因的上游和下游均各自加上一段22nt的Rbm3 IRES序列。
如图4所示，上图为野生型HBV载体pCH-9/3093的结构，pCH-9/3093包含1.05倍的HBV全基因组（图中黑色粗实线所示）。在pCH-9/3093载体上，1.05倍HBV基因组是线性化的HBV序列，由3个片段连续拼接而成，它们分别是HBV第3093位核苷酸至HBV第3182位核苷酸，HBV第1位核苷酸至HBV第3182位核苷酸，HBV第1位核苷酸至HBV第84位核苷酸。在pCH-9/3093载体上，1.05倍HBV基因组之前置入了一个CMV启动子，负责启动转录，替代了HBV自身的C基因启动子的功能。转录出的RNA与野生型HBV的基因组RNA和各种亚基因组RNA相同。在这里，HBV核苷酸的编号从C基因开放读框的第1位核苷酸算起。图中标注的EcoR I 1280是根据另外一种HBV核苷酸编号系统计算出的位置。HBV各基因用彩色方框显示，分别是pC，前C基因；C，C基因；pS1/2，前S1/S2；S，S基因；X，X基因；TP，P基因末端蛋白区；spacer，P基因间隔区；RT，P基因逆转录酶区；RH，P基因RNA酶H区。在pCH-BsdR和pCH-hrGFP载体上，BsdR代表杀稻瘟菌素抗性基因；hrGFP代表人源化海肾绿色荧光蛋白。下图列出了HBV载体转录出的各种RNA，以折线表示。前基因组RNA（pgRNA）长约3.5kb，编码HBV核心蛋白，P蛋白，带有ε包装信号（负责介导pgRNA与P蛋白的结合，引发逆转录）。亚基因组RNA包括2.4kb RNA（preS1），2.1kb RNA（preS2，S），编码HBV包膜大蛋白，中蛋白和小蛋白，以及0.8kb HBx RNA，由位于P基因开放读框中的启动子启动转录。本实施例所构建的插入外源基因的HBV载体转染细胞后可转录出比野生型HBV pgRNA略长的RNA链，以及与野生型HBV亚基因组RNA完全相同的亚基因组RNA链。
上游的IRES引导外源基因翻译起始，下游的IRES引导HBV P基因翻译起始，为了提高翻译效率，将P基因第二位的氨基酸由脯氨酸突变为丙氨酸，相应的碱基由CCC突变为GCC，这样就在P基因起始密码子之后的第四位核苷酸上引入一个G，形成有利于提高翻译效率的Kozak结构，改造后的载体上HBV基因组的长度由pCH-9/3093上的3182bp增长到pCH-BsdR上的3822bp和pCH-hrGFP上的4139bp。pCH-BsdR和pCH-hrGFP两种载体不同的长度，有助于观测在不影响重组HBV复制能力的前提下，HBV载体和HBV基因组能够容忍插入多大长度的外源基因，由本实施例所构建的HBV载体转录出的RNA，如图4下方所示。
具体构建方法如下：
（A）pCH-BsdR的构建
一、第一轮PCR扩增，包括3个PCR反应：
PCR反应
：以含有CMV启动子及HBV全基因组的pCH-9/3093为模板，以引物HBV1.05-S为上游引物，22ntIRES-Core-AS为下游引物，用Phusion 高保真DNA 聚合酶(Fermentas公司产品)进行PCR扩增，产物包含HBV C/P基因重叠区和Rbm3，上游带有Sal I酶切位点，下游为Rbm3 IRES和Nco I酶切位点。
PCR反应
：以含有BsdR基因的质粒为模板，以引物BsdR-S为上游引物， BsdR-AS为下游引物，PCR扩增，产物为包含BsdR的DNA片段，上下游分别带有Nco I和Pst I酶切位点。
PCR反应
：以pCH-9/3093为模板，以引物22ntIRES-P-S为上游引物，引物HBV1549-AS为下游引物，PCR扩增，产物包含HBV C/P基因重叠区和Rbm3 IRES，上游带有Pst I酶切位点和Rbm3 IRES，下游延伸超过HBV基因组上的EcoR I酶切位点。
二、三片段连接，包括限制性内切酶酶切和连接两个反应：
酶切反应：PCR反应
的扩增产物用Sal I和Nco I酶切，PCR反应
的扩增产物用Nco I和Pst I酶切，PCR反应
的扩增产物用Pst I酶切。
连接反应：将三个反应的酶切产物混合，用T4的DNA连接酶连接。
三、第2轮PCR扩增：
以上述连接反应产物为模板，以引物HBV1.05-S为上游引物，引物HBV1549-AS为下游引物，PCR扩增，产物包含双拷贝的HBV C/P基因重叠区，以及C基因和P基因之间的两个Rbm3 IRES，外源基因BsdR，上游带有Sal I酶切位点，下游延伸超过HBV基因组上的EcoR I酶切位点。
四、双酶切：
上述PCR扩增产物用Sal I和EcoR I双酶切后形成黏性末端，另用Sal I和EcoR I双酶切pCH-9/3093质粒。
五、连接：
上述两个酶切反应产物混合，在T4的DNA连接酶作用下环化，形成闭合环状双链DNA，即pCH-BsdR质粒。
（B）pCH-hrGFP的构建
以pCH-BsdR为基础，将PCR扩增的hrGFP片段亚克隆至pCH-BsdR载体，替代pCH-BsdR载体上Nco I和Pst I酶切位点之间的序列，形成pCH-hrGFP。
其中，上述引物列表如下所示：
实施例2 携带外源基因的HBV载体的检验
一、HBV前基因组RNA上两个串联的Rbm3 IRES可有效启动蛋白质翻译
目前尚未有研究报道Rbm3 IRES在人肝细胞中的翻译起始效率，为了检验Rbm3 IRES在与HBV前基因组RNA（HBV pgRNA）类似的RNA链上引导翻译起始的能力，同时证明Rbm3 IRES是否适用于构建双顺反子和三顺反子载体，利用Rbm3 IRES构建了两个系列，共8种类型的质粒，分别转染肝癌细胞来源的HepG2和Huh7细胞，检测Rbm3 IRES引导的外源荧光基团的表达水平，以验证利用Rbm3 IRES构建复制型HBV载体并用于肝细胞的可行性，同时与使用EMCV IRES的HBV载体对照，以比较Rbm3 IRES的翻译起始效率。
如图5所示，构建了4种由22nt的Rbm3 IRES引导的双顺反子或三顺反子基因表达载体，用于转录出与HBV pgRNA结构相似的RNA链，观察Rbm3 IRES在这种RNA链上能否完成翻译起始任务，这组载体均使用CMV启动子，表达EGFP，用作报告基因。这4种载体的5’端部分与pCH-9/3093载体相同，由CMV启动子在HBV第3100位核苷酸处启动转录pgRNA。在I，II及III号载体上，用IRES和EGFP取代HBV C基因以下的部分；在IV号载体上，EGFP从HBV P基因的翻译起始位点开始替代HBV P基因，与HBV C基因的5’部分直接接续。pC，前C基因区；BsdR，杀稻瘟菌素抗性基因。
系列1的四种质粒使用活性较强的CMV启动子，包含来自pCH-9/3093的HBV C基因全部序列，C基因下游的HBV序列用EMCV IRES（I号载体）或Rbm3 IRES（II号载体）引导的EGFP序列替代，这样可以在荧光显微镜下很方便的比较两种IRES的翻译起始效率。三顺反子的载体构建方法是在Rbm3 IRES EGFP载体的基础上，在HBV C基因和EGFP的IRES之间，再插入一个Rbm3 IRES引导的399bp的BsdR序列，构成串联双Rbm3 IRES调控的三顺反子载体（III号载体）。IV号载体是将EGFP融合于HBV C基因N端区段，替代C基因的C端部分，仅保留C基因N端的135个氨基酸。这样EGFP利用HBV自身的翻译起始序列，作为Rbm3 IRES的对照。
两组8种质粒的具体构建方法如下：
共需构建两组质粒，每组包含4种类型的质粒，共计8种质粒。
第一组质粒使用巨细胞病毒（CMV）启动子启动转录，均含有HBV C基因及增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）基因，用于显微镜下快速观测荧光。第二组质粒使用HBV C基因启动子（HBV core promoter/ enhancer II）启动转录，均含有HBV C基因及海肾荧光素酶（Renilla luciferase，RLuc），用于快速定量检测质粒上插入的外源基因的表达水平。
引物名称及序列见后附列表。
（A）第一组质粒
I：pCH-EMCV IRES-EGFP
包含CMV启动子，EMCV IRES及EGFP。用于检测EMCV IRES的翻译起始效率。
步骤1，PCR扩增，包括3个PCR反应。
PCR反应
：以含有CMV启动子及HBV全基因组的pCH-3093质粒为模板，以引物CMV-S为上游引物，CoreEND-AS为下游引物，用Phusion 高保真DNA 聚合酶进行PCR扩增，产物为包含CMV启动子及HBV C基因的DNA片段，上下游分别带有Hind III和Afl II酶切位点。
PCR反应
：以含有EMCV IRES的丙型肝炎病毒复制子质粒为模板，以引物EMCV-S为上游引物，EMCV-AS为下游引物，PCR扩增，产物为包含EMCV IRES的DNA片段，上下游分别带有Afl II和Nco I酶切位点。
PCR反应
：以含有EGFP基因和polyA信号的pEGFP-N1 (Clontech公司产品)质粒为模板，以引物EGFP-S为上游引物，EGFP-PA-AS为下游引物，PCR扩增，产物为包含EGFP和polyA信号的DNA片段，上下游分别带有Nco I和Hind III酶切位点。
步骤2，三片段连接，包括限制性内切酶酶切和T4连接酶连接两个反应。
酶切反应：PCR反应
扩增产物用Hind III和Afl II酶切，PCR反应
扩增产物用Afl II和Nco I酶切，PCR反应
扩增产物用Nco I和Hind III酶切。
连接反应：将三个反应的酶切产物混合，用T4 DNA连接酶连接成为闭合环状双链DNA，即pCH-EMCV IRES-EGFP质粒。
：pCH-22nt IRES-EGFP
包含CMV启动子，Rbm3 IRES及EGFP。用于检测单个Rbm3 IRES的翻译起始效率。
步骤1，体外退火反应
根据引物序列表中的22ntIRES-S和22ntIRES-AS序列，分别合成两条DNA单链。两条单链体外退火后形成互补DNA双链，即Rbm3 IRES，两端分别带有Afl II和Nco I酶切位点的黏性末端。
步骤2，双酶切反应
Afl II和Nco I双酶切I号载体pCH-EMCV IRES-EGFP质粒，切去EMCV IRES序列，电泳后回收大片段。
步骤3，连接反应
将步骤2的酶切产物大片段与步骤1的体外退火产物混合，用T4 DNA连接酶连接成为闭合环状双链DNA，即pCH-22nt IRES-EGFP质粒。
：pCH-BsdR-22nt IRES-EGFP
为三顺反子载体，依次包含CMV启动子，Rbm3 IRES，BsdR，Rbm3 IRES及EGFP。用于检测两个串联的Rbm3 IRES的翻译起始效率。
步骤1，PCR扩增BsdR
以含有杀稻瘟菌素抗性基因（Blasticidin Resistance，BsdR）的质粒为模板，以引物BsdR-S为上游引物，BsdR-AS为下游引物，PCR扩增，产物为包含BsdR的DNA片段，产物上下游分别带有Nco I和Afl II酶切位点。
步骤2，3个双酶切反应
酶切反应
：在pCH-9/3093及其衍生载体上，原核复制起始位点Ori区域内有一个AlwN I酶切位点。取带有一个Rbm3 IRES的II号载体pCH-22nt IRES-EGFP质粒，用AlwN I和Nco I双酶切，电泳后回收小片段，产物一端为AlwN I酶切后生成的黏性末端，另一端为Nco I酶切后生成的黏性末端和Rbm3 IRES。
酶切反应
：取II号载体pCH-22nt IRES-EGFP质粒，用AlwN I和Afl II双酶切，电泳后回收大片段，产物一端为AlwN I酶切后生成的黏性末端，另一端为Afl II酶切后生成的黏性末端和Rbm3 IRES。
酶切反应：取步骤1的PCR产物，用Nco I和Afl II双酶切，产物为BsdR，上下游分别带有Nco I和Afl II酶切后形成的黏性末端。
步骤3，三片段连接
将步骤2中三个反应的酶切产物混合，用T4 DNA连接酶连接。产物即为带有串联双Rbm3 IRES，BsdR和EGFP的三顺反子载体pCH-BsdR-22nt IRES-EGFP。
：pCH-pATG-EGFP
包含CMV启动子，HBV C基因N端部分与EGFP融合。用EGFP模拟HBV P基因的表达。
步骤1，PCR扩增，包括2个PCR反应。
PCR反应
：以pCH-3093质粒为模板，以引物CMV-S为上游引物，CorePART-AS为下游引物，PCR扩增，产物为包含CMV启动子及HBV C基因N端部分序列的DNA片段， 产物上游带有Hind III酶切位点，下游5’端磷酸化，以利于平末端连接。
PCR反应
：以pEGFP-N1质粒为模板，以引物EGFP-ATG-S为上游引物，EGFP-PA-AS为下游引物，PCR扩增，产物为包含EGFP和polyA信号的DNA片段，产物上游5’ 端磷酸化，以利于平末端连接，下游带有Hind III酶切位点。
步骤2，两片段连接。包括限制性内切酶酶切和连接两个反应。
酶切反应：PCR反应
和
扩增产物分别用Hind III单酶切。
连接反应：将两个反应的酶切产物混合，用T4 DNA连接酶连接成为闭合环状双链DNA，即pCH-pATG-EGFP质粒。
（B）第二组质粒
I：pHBV-EMCV IRES-RLuc
包含HBV C基因启动子，EMCV IRES及RLuc。用于检测EMCV IRES的翻译起始效率。
步骤1，PCR扩增，包括3个PCR反应。
PCR反应
：以含有HBV全基因组（包括HBV C基因启动子）的质粒pHBV1.3为模板，以引物HBV1.3-S为上游引物，CoreEND-AS为下游引物，用Phusion 高保真DNA 聚合酶进行PCR扩增，产物为包含HBV C基因启动子及HBV C基因的DNA片段，上下游分别带有Hind III和Afl II酶切位点。
PCR反应：以含有EMCV IRES的丙型肝炎病毒复制子质粒为模板，以引物EMCV-S为上游引物，EMCV-AS为下游引物，PCR扩增，产物为包含EMCV IRES的DNA片段，上下游分别带有Afl II和Nco I酶切位点。
PCR反应
：以含有RLuc基因和polyA信号的pGL4.79 (Promega公司产品)质粒为模板，以引物RLuc-S为上游引物，RLuc-PA-AS为下游引物，PCR扩增，产物为包含RLuc和polyA信号的DNA片段，上下游分别带有Nco I和Hind III酶切位点。
步骤2，三片段连接，包括限制性内切酶酶切和T4连接酶连接两个反应。
酶切反应：PCR反应
扩增产物用Hind III和Afl II酶切，PCR反应
扩增产物用Afl II和Nco I酶切，PCR反应
扩增产物用Nco I和Hind III酶切。
连接反应：将三个反应的酶切产物混合，用T4 DNA连接酶连接成为闭合环状双链DNA，即pHBV-EMCV IRES-RLuc质粒。
：pHBV-22nt IRES-RLuc
包含HBV C基因启动子，Rbm3 IRES及RLuc。用于检测单个Rbm3 IRES的翻译起始效率。
步骤1，体外退火反应
根据引物序列表中的22ntIRES-S和22ntIRES-AS序列，分别合成两条DNA单链。两条单链体外退火后形成互补DNA双链，即Rbm3 IRES，两端分别带有Afl II和Nco I酶切位点的黏性末端。
步骤2，双酶切反应
Afl II和Nco I双酶切I号载体pHBV-EMCV IRES-RLuc质粒，切去EMCV IRES序列，电泳后回收大片段。
步骤3，连接反应
将步骤2的酶切产物大片段与步骤1的体外退火产物混合，用T4 DNA连接酶连接成为闭合环状双链DNA，即pHBV-22nt IRES-RLuc质粒。
：pHBV-BsdR-22nt IRES-RLuc
为三顺反子载体，依次包含HBV C基因启动子，Rbm3 IRES，BsdR，Rbm3 IRES及RLuc。用于检测两个串联的Rbm3 IRES的翻译起始效率。
步骤1，PCR扩增BsdR
以含有BsdR的质粒为模板，以引物BsdR-S为上游引物，BsdR-AS为下游引物，PCR扩增，产物为包含BsdR的DNA片段，产物上下游分别带有Nco I和Afl II酶切位点。
步骤2，3个双酶切反应
酶切反应
：取带有一个Rbm3 IRES的II号载体pHBV-22nt IRES-RLuc质粒，用AlwN I和Nco I双酶切，电泳后回收小片段，产物一端为AlwN I酶切后生成的黏性末端，另一端为Nco I酶切后生成的黏性末端和Rbm3 IRES。
酶切反应
：取II号载体pHBV-22nt IRES-RLuc质粒，用AlwN I和Afl II双酶切，电泳后回收大片段，产物一端为AlwN I酶切后生成的黏性末端，另一端为Afl II酶切后生成的黏性末端和Rbm3 IRES。
酶切反应
：取步骤1的PCR产物，用Nco I和Afl II双酶切，产物为BsdR，上下游分别带有Nco I和Afl II酶切后形成的黏性末端。
步骤3，三片段连接
将步骤2中三个反应的酶切产物混合，用T4 DNA连接酶连接。产物即为带有串联双Rbm3 IRES，BsdR和EGFP的三顺反子载体pHBV-BsdR-22nt IRES-RLuc。
：pHBV-pATG-RLuc
包含HBV C基因启动子，HBV C基因N端部分与RLuc融合。用RLuc模拟HBV P基因的表达。
步骤1，PCR扩增，包括2个PCR反应。
PCR反应
：以pHBV-1.3质粒为模板，以引物HBV1.3-S为上游引物，CorePART-AS为下游引物，PCR扩增，产物为包含HBV C基因启动子及HBV C基因N端部分序列的DNA片段， 产物上游带有Hind III酶切位点，下游5’端磷酸化，以利于平末端连接。
PCR反应
：以pGL4.79质粒为模板，以引物RLuc-ATG-S为上游引物，RLuc-PA-AS为下游引物，PCR扩增，产物为包含RLuc和polyA信号的DNA片段，产物上游5’ 端磷酸化，以利于平末端连接，下游带有Hind III酶切位点。
步骤2，两片段连接，包括限制性内切酶酶切和连接两个反应。
酶切反应：PCR反应
和
扩增产物分别用Hind III单酶切。
连接反应：将两个反应的酶切产物混合，用T4 DNA连接酶连接成为闭合环状双链DNA，即pHBV-pATG-RLuc质粒。
所用引物列表如下所示：
应用上述8种质粒检测Rbm3 IRES翻译起始效率的实验结果如下：
HBeAg与核心蛋白均由HBV C基因编码，因此，HBeAg定量检测常被用于快速指示HBV的C基因的表达水平。为了考察插入外源片段以后HBV自身翻译起始序列的活性是否受到影响，检测了I，II，III型载体分别转染HepG2和Huh7细胞后，细胞培养上清液中HBeAg浓度。结果显示，三种类型的载体转染后HBeAg分泌水平接近。
用图5中的4种载体分别转染HepG2细胞，4天后在荧光显微镜下观察EGFP表达情况。图像于相同条件下采集。Huh7细胞中的结果与此相似，如图6所示。
在双顺反子载体上，Rbm3 IRES的翻译起始效率明显强于EMCV IRES，如图6 中I 与 II所示，相对于双顺反子载体，在三顺反子载体上，串联的第二个Rbm3 IRES引导的EGFP表达强度下降较多，如图6 中II与III所示，但是仍明显高于HBV自身翻译起始序列引导的EGFP表达水平，如图6 中III 与IV所示，Huh7细胞中的结果与HepG2类似。
鉴于CMV启动子是一个活性很强的启动子，利用HBV C基因启动子转录出的pgRNA仅相当于CMV启动子的1/3，有必要检测使用HBV自身启动子时，利用Rbm3 IRES构建的双顺反子和三顺反子载体是否依然能够表达出足量的外源基因。为了便于定量检测，用RLuc替代了系列1载体中的EGFP。如图7所示，该组4种质粒均以含1.3倍HBV基因组的载体pHBV1.3为基础构建，在HBV 自身的C基因启动子的调控下转录出pgRNA，表达海肾荧光素酶（RLuc），用作报告基因。如图7所示，C基因启动子CP与HBV P基因RNA酶H区（RH）及HBV X基因（X）重叠。
转染新构建的RLuc HBV载体的同时，共转染萤火虫荧光素酶报告基因pGL3-Control作为内参照，共转染后测得RLuc 产生的海肾荧光素酶RLU值除以pGL3-Control产生的萤火虫荧光素酶RLU值，作为不同类型载体之间比较的依据。
图7所述的4种质粒转染HepG2和Huh7细胞后，检测细胞裂解液中的RLuc荧光素酶活性，以pGL3-control载体产生的萤火虫荧光素酶活性为内参照，检测单个Rbm3 IRES和串联双IRES的翻译起始效率。以I号载体的荧光素酶活性（RLuc/pGL3-control）为100%，其他3种载体的荧光素酶活性与之相比。重复3次实验，取均值，如图8所示，其中误差线代表标准差（SD）。
经检测发现，Rbm3 IRES产生的荧光素酶活性为EMCV IRES产生荧光素酶活性的两倍有余，如图8中I 与 II所示。三顺反子载体上Rbm3 IRES产生的荧光素酶活性仅为双顺反子的1/2，如图8中II 与 III所示，但是仍明显高于HBV自身翻译起始序列产生的荧光素酶活性，如图8中 III 与 IV所示。这一结果与带有CMV启动子EGFP载体的结果一致。这说明即使在HBV的C基因启动子驱动下，Rbm3 IRES仍有较高的翻译起始效率。同时说明在HBV的C基因和P基因之间插入了外源基因的三顺反子载体中，串联的两个Rbm3 IRES中的第二个IRES，依然有能力引导翻译起始过程。
一、复制型HBV载体转染细胞后外源基因和HBV自身基因表达水平
基于第一部分实验结果，选择了带有串联双Rbm3 IRES的载体（类型III）作为基础，构建可表达外源基因的复制型HBV载体和重组HBV。具体构建方法简述如下：
在包含HBV全基因组的pCH-9/3093载体上，HBV C基因C端150 bp的序列与P基因N端150 bp的序列重叠，如图3左所示。在pCH-9/3093载体上复制了这一序列，使C基因和P基因均成为独立的，完整的开放读框。在已经补全的C基因C端和P基因N端之间，插入399bp的BsdR基因或720bp的hrGFP基因。这两种外源基因的5’端和3’端均各自加上一段Rbm3 IRES序列，如图4所示，5’端IRES负责引导外源基因翻译起始，3’端IRES负责引导HBV P基因翻译起始，为了提高翻译效率，将P基因第二位的氨基酸由脯氨酸突变为丙氨酸，相应的碱基由CCC突变为GCC，这样就在P基因起始密码子之后的第四位核苷酸上引入一个G，形成有利于提高翻译效率的Kozak结构。经改造后，重组的HBV基因组的长度由野生型的3182 bp增长到BsdR HBV的3822bp和hrGFP HBV的4139bp。两种插入外源基因的重组HBV的不同长度，有助于观测在不影响复制HBV能力的前提下，HBV基因组能够容忍插入多大长度的外源基因，构建的HBV载体转录出的RNA，如图4下方所示。
为了证实这类新型HBV载体能够有效表达外源基因，用pCH-hrGFP载体转染HepG2细胞，在荧光显微镜下观察hrGFP表达情况。结果证实，pCH-hrGFP载体转染后，hrGFP可在细胞内高水平表达，如图9所示，用插入外源基因的HBV载体pCH-hrGFP转染HepG2细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光并成像；用pCH-BsdR转染HepG2细胞后，在杀稻瘟菌素筛选下，可形成耐受杀稻瘟菌素的稳定克隆，说明BsdR也可在细胞内高效表达。
pCH-hrGFP和pCH-BsdR载体转染HepG2细胞后，裂解细胞行RNA印迹实验（Northern blotting），结果证实pCH-hrGFP和pCH-BsdR载体转染后可转录出pgRNA和亚基因组RNA（sgRNA）。与野生型pCH-9/3093相比，pCH-hrGFP和pCH-BsdR载体转录出的pgRNA和sgRNA量并无明显减少，如图10所示。
分别用野生型HBV 载体pCH-9/3093 （1），插入外源基因的HBV载体pCH-BsdR （2）和pCH-hrGFP（3）转染HepG2细胞，提取细胞内总RNA，行RNA印迹分析，用32P标记的探针检测HBV RNA。pgRNA和sgRNAs分别表示HBV前基因组RNA和亚基因组RNA。同时以总RNA行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色显示28S和18S核糖体RNA，以验证各组RNA上样量是否均一，并检测RNA的完整性。未发现异常剪接的RNA。
可以看出，相对于pCH-9/3093转录出的pgRNA，pCH-hrGFP和pCH-BsdR载体转录出的pgRNA长度略长，这一表现符合hrGFP重组HBV和BsdR重组HBV基因组长于野生型HBV的事实。三种载体转录出的sgRNA长度基本相当，符合预期。
接着，检测了HBV自身结构蛋白的表达情况，用化学发光法在感光底片上显像，如图11所示。
分别用野生型HBV 载体pCH-9/3093 （1），插入外源基因的HBV载体pCH-BsdR （2）和pCH-hrGFP（3）转染HepG2细胞，取等量的细胞裂解液行非变性琼脂糖凝胶电泳和免疫印迹，以HBV核心颗粒特异性抗体检测完整的核心颗粒，非变性琼脂糖凝胶电泳（NAGE）免疫印迹实验，结果如图11上所示，或行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹，以HBV核心蛋白特异性抗体检测核心蛋白，SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹实验（SDS-PAGE）结果如图11下所示。结果均显示，pCH-hrGFP和pCH-BsdR载体转染后产生的HBV核心颗粒及核心蛋白量与pCH-9/3093载体转染后相似。ELISA法HBeAg定量结果进一步证实，pCH-hrGFP和pCH-BsdR载体转染后C基因表达水平与pCH-9/3093载体转染后相似。
用ELISA法检测了3种载体转染细胞后细胞培养上清液中HBsAg含量，结果同样显示pCH-hrGFP和pCH-BsdR载体转染后HBV S基因表达水平与pCH-9/3093载体转染后没有差异，如图12所示。
分别用野生型HBV 载体pCH-9/3093 （1），插入外源基因的HBV载体pCH-BsdR （2）和pCH-hrGFP（3）转染HepG2细胞，收集细胞培养上清，ELISA法检测HBsAg和HBeAg浓度，以验证构建的复制型HBV载体在表达外源基因的同时是否表达HBV自身基因。以pCH-9/3093转染组HBsAg和HBeAg定量测量值为100%，各组均与之相比。重复3次试验，取均值，其中误差线代表标准差（SD）。
插入IRES和外源基因的位置，与调控大蛋白表达的HBV前S1启动子距离较近，而HBV大蛋白对于感染的作用至关重要，因此认为有必要考察插入IRES和外源基因后HBV大蛋白的表达是否受到影响。由于ELISA无法区分3种不同分子量的HBV外膜蛋白（大蛋白，中蛋白，小蛋白），采用了SDS-PAGE免疫印迹实验（Western blotting）观察了3种载体转染细胞后HBV膜蛋白的表达情况。结果显示，pCH-hrGFP和pCH-BsdR载体转染后产生的3种HBV外膜蛋白量（包括各种糖基化的膜蛋白）与pCH-9/3093载体转染后没有差异，结果如图13所示。
分别用野生型HBV 载体pCH-9/3093 （1），插入外源基因的HBV载体pCH-BsdR （2）和pCH-hrGFP（3）转染HepG2细胞，取等量的细胞裂解液行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹，用抗体4/7B检测HBV外膜大蛋白，中蛋白和小蛋白。抗体4/7B识别小蛋白上的一段线性抗原表位，该抗原表位同样出现在大蛋白和中蛋白上，因此抗体4/7B可以同时结合大蛋白，中蛋白和小蛋白。图中标出了糖基化大蛋白（gp42），非糖基化大蛋白（p39），双糖基化中蛋白（gp36），单糖基化中蛋白（gp33），糖基化小蛋白（gp27）和非糖基化小蛋白（p24）。以α-tublin为内参照。
直接检测HBV的 P蛋白较为困难，采用了内源性聚合酶反应实验（EPR）检测3种载体转染细胞后HBV P基因的表达水平及其活性。在内源性聚合酶反应中，只要加入4种脱氧核糖核酸混合物，来源于HBV核心颗粒的P蛋白可使由HBV pgRNA逆转录而来的DNA链延长。用pCH-9/3093和pCH-BsdR转染细胞，收集细胞培养上清中的HBV颗粒，与含有dCTP（α-32P标记）及dATP，dGTP，dTTP的EPR反应液混合，HBV外壳和核壳被反应液中的NP40破坏，暴露出与HBV pgRNA结合的HBV P蛋白，在P蛋白的逆转录酶和DNA聚合酶活性作用下，α-32P标记的dCTP掺入新合成的DNA链中，经琼脂糖凝胶电泳和放射自显影，分析两种载体转染细胞后HBV P蛋白活性有无差异。结果显示，pCH-BsdR载体转染后产生HBV P蛋白活性与pCH-9/3093载体转染后非常接近，如图14所示。
分别用野生型HBV 载体pCH-9/3093（1）和插入外源基因的HBV载体pCH-BsdR（2）转染HepG2细胞，收集胞浆中的HBV颗粒，破去HBV外壳和核壳，加入32P标记的单核苷酸，行内源性多聚酶反应实验，检测插入外源基因后，HBV P蛋白表达量及活性。琼脂糖凝胶电泳分离新合成的DNA链，用放射自显影法在感光底片上成像。图中标出了疏松环状DNA（RC）和双链线性DNA（dsL）。HBV疏松环状DNA和双链线性DNA均可在图上清晰的识别出来，尽管pCH-BsdR载体转染组P蛋白催化生成的DNA量略低于pCH-9/3093载体转染组。需要指出的是，pCH-BsdR载体转染组P蛋白催化生成的DNA在电泳时的迁移速率略小于pCH-9/3093载体转染组。这与BsdR重组HBV略长于野生型HBV的事实相呼应。同时，EPR实验说明pCH-BsdR载体转染细胞后可表达出有活性的HBV P蛋白，并且证明尽管pCH-BsdR转录出的pgRNA长度略长于野生型HBV的pgRNA，pCH-BsdR转录出的pgRNA同样可以被HBV P蛋白识别，结合，并将其包装进入HBV核壳中，进而逆转录成为HBV负链DNA，并以之为模板合成HBV正链DNA。
用pCH-hrGFP转染细胞后也做了EPR实验，结果发现转染后产生的P蛋白活性较弱，后续的DNA印迹实验（Southern blotting）也发现pCH-hrGFP转染细胞后HBV复制水平也较低，如图15所示。
分别用野生型HBV 载体pCH-9/3093（1），插入外源基因的HBV载体pCH-BsdR （2）和pCH-hrGFP（3）转染HepG2细胞，4天后收集细胞裂解液和细胞培养上清，分别行DNA印迹实验，用32P标记的HBV探针检测HBV复制中间体。图中标出了疏松环状DNA（RC）和双链线性DNA（dsL）。为了使信号较弱的pCH-hrGFP转染组HBV DNA显像，给出了延长曝光时间后获得的影像（long exp）。分别量化了总HBV DNA和RC DNA的信号强度，以pCH-9/3093转染组信号强度为100%，pCH-BsdR转染组HBV DNA信号强度与之相比，计算出相对强度（% of co）。进一步用非变性琼脂糖凝胶电泳分离了HBV核心颗粒，转印至尼龙膜，用32P标记的HBV探针检测了HBV复制中间体，结果发现pCH-BsdR转染组细胞中的HBV核心颗粒内存在较多的HBV DNA（NAGE小图），这提示较长的外源基因（hrGFP，720bp）插入HBV基因组之后，可能影响了P蛋白表达，P蛋白与pgRNA的结合，或者影响了pgRNA包装进入HBV核壳的过程。
二、复制型HBV载体转染细胞后HBV复制水平
进而，用DNA印迹实验检测了3种载体转染HepG2和Huh7细胞后，细胞内和细胞培养上清液中HBV DNA复制情况，同时用荧光定量PCR法定量检测了培养上清中的HBV DNA含量，结果如图16所示。
分别用野生型HBV 载体pCH-9/3093（1），插入外源基因的HBV载体pCH-BsdR （2）和pCH-hrGFP（3）转染Huh7细胞，4天后收集细胞裂解液和细胞培养上清，分别行DNA印迹实验，用32P标记的HBV探针检测HBV复制中间体。图中标出了疏松环状DNA（RC）和双链线性DNA（dsL）。为了使信号较弱的pCH-hrGFP转染组HBV DNA显像，给出了延长曝光时间后获得的影像（long exp）。量化了总HBV DNA和RC DNA的信号强度，以pCH-9/3093转染组信号强度为100%，pCH-BsdR转染组HBV DNA信号强度与之相比，计算出相对强度（% of co）。进一步用非变性琼脂糖凝胶电泳分离了HBV核心颗粒，经转印至尼龙膜，用32P标记的HBV探针检测了HBV复制中间体。结果发现pCH-BsdR转染组细胞中的HBV核心颗粒内存在较多的HBV DNA（NAGE小图）。
在pCH-BsdR转染的HepG2和Huh7细胞中，HBV DNA的条带分布模式与pCH-9/3093转染后非常相似，唯一不同之处在于pCH-BsdR转染组HBV DNA在电泳时的迁移速率略小于pCH-9/3093转染组。其原因在于pCH-BsdR载体上插入了外源基因，导致经转录，逆转录，DNA正链合成等过程后生成的重组HBV DNA链长度略长于野生型HBV。
不同载体转染后产生的HBV DNA形成的DNA印迹（Southern blotting）图像，经计算机软件定量分析显示，在总DNA层面，pCH-BsdR转染组HBV DNA的量相当于pCH-9/3093转染组的40-45%。非变性琼脂糖凝胶电泳及计算机软件定量分析显示结果如图15，16，NAGE所示，pCH-BsdR转染组HBV核壳内包装的HBV DNA与pCH-9/3093转染组的相对比例和DNA印迹实验结果相似。在HBV复制中间体RC DNA层面，pCH-BsdR转染组HBV DNA的量与pCH-9/3093转染组相比更低，仅相当于pCH-9/3093转染组的20-25%。
如前所述，图9中pCH-hrGFP转染细胞后hrGFP表达水平较高，但是在DNA印迹实验中，pCH-hrGFP转染组细胞内HBV DNA复制中间体较少，只有通过延长曝光时间才能获得rcDNA和dsL DNA的影像，如图15，16中long exp所示。NAGE实验的结果同样显示，pCH-hrGFP转染组HBV核心颗粒内的HBV DNA也较少，如图15，16中 NAGE所示。
用与pCH-BsdR类似的方法构建了插入942bp海肾荧光素酶和插入1653bp萤火虫荧光素酶基因的HBV载体，同样方法转染HepG2细胞，DNA印迹实验未能发现HBV DNA的信号。其原因可能在于海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶基因长度超过了HBV基因组所能容纳的最大长度。
分别用野生型HBV 载体pCH-9/3093（1），插入外源基因的HBV载体pCH-BsdR （2）和pCH-hrGFP（3）转染HepG2细胞，转染后72小时至96小时，收集细胞培养上清，荧光实时定量PCR法检测细胞培养上清中的HBV DNA拷贝数。以每mL培养上清中的拷贝数为计量单位。重复3次试验，取均值，其中误差线代表标准差（SD）。
定量PCR检测细胞培养上清中HBV DNA拷贝数的结果与DNA印迹实验结果基本吻合。pCH-BsdR转染组细胞分泌出的HBV拷贝数约相当于pCH-9/3093转染组的30%，pCH-hrGFP转染组仅相当于pCH-9/3093转染组的0.5-1%，如图17所示。分别用野生型HBV 载体pCH-9/3093（1），插入外源基因的HBV载体pCH-BsdR （2）和pCH-hrGFP（3）转染Huh7细胞，转染后72小时至96小时，收集细胞培养上清，荧光实时定量PCR法检测细胞培养上清中的HBV DNA拷贝数。以每mL培养上清中的拷贝数为计量单位。重复3次试验，取均值，其中误差线代表标准差（SD），结果如图18所示。
以上实验结果证实，pCH-BsdR载体转染后能够实现HBV DNA的有效复制。同时说明，构建的这种C-P基因分开的复制型HBV载体可容纳一定长度范围内的外源基因插入。在保留HBV DNA复制能力的前提下，这个外源基因长度的上限在399bp和720bp之间。
三、复制型HBV载体转染细胞后形成完整病毒颗粒的情况
如前所述，在细胞培养上清中检测到了HBV DNA，但这并不能完全证明构建的复制型HBV载体转染细胞后能形成完整的，带有外壳的感染性病毒颗粒。因为有报道曾经指出，HBV载体转染细胞后可能分泌出大量没有外壳，仅有核壳包裹HBV DNA的亚病毒颗粒，这些没有外壳的亚病毒颗粒与完整的病毒颗粒在浮力密度方面有显著差异，利用这一点，可以将完整的病毒颗粒与不完整的亚病毒颗粒清楚地区分开来。
因此，将pCH-BsdR转染组和pCH-9/3093转染组细胞培养上清中的病毒颗粒用CsCl密度梯度离心的方法分离开来，取等量的，7-18号区带的病毒颗粒行非变性琼脂糖凝胶电泳（NAGE），然后用抗HBsAg抗体行免疫印迹实验，或者在电泳后进行DNA印迹实验。如图19的免疫印迹实验显示，pCH-BsdR转染组和pCH-9/3093转染组细胞生成的HBsAg均集中在9-12号区带，对应的浮力密度在1.16-1.22 g/cm3之间。在相同的9-12号区带上，pCH-BsdR转染组和pCH-9/3093转染组均可以发现HBV rcDNA和dsL DNA。因此，这部分实验结果可以说明，构建的pCH-BsdR载体转染后可以形成有外壳的病毒颗粒，其中包裹有携带外源基因的复制型HBV转染细胞后的重组HBV病毒的DNA。
此外，从图19中可以看到，和pCH-9/3093转染组相比，pCH-BsdR转染组HBV dsL DNA与rcDNA含量之比相对较高，这与图15和图16的HBV DNA印迹实验结果相吻合。另外一个富含HBV DNA的区域是14-16号区带之间，这一区域的浮力密度是1.27-1.33 g/cm3，免疫印迹实验显示这一区域是没有HBsAg包裹的非完整亚病毒颗粒。pCH-BsdR转染组和pCH-9/3093转染组HBV DNA和HBsAg的这种分布模式与此前文献中关于野生型HBV密度梯度离心实验结果的报道一致。
实施例3 一种携带外源基因的复制型HBV载体转染细胞后的重组HBV及其制备方法
一种携带外源基因的重组HBV，所述重组HBV为实施例2所述的HBV载体转染肝癌细胞后，于细胞培养上清中收集的重组HBV，该重组HBV既保留复制感染能力，又能表达外源基因。
本实施例还提供了制备上述携带外源基因的重组HBV的方法，它按照以下步骤顺序进行：
（21）构建携带外源基因的HBV载体；
（22）利用步骤（21）中所制得的载体转染肝癌来源的细胞系，在细胞培养液中加入1%-2%的二甲基亚砜，可明显提高重组HBV的复制水平及最终产量；其中，所述的肝癌来源的细胞系为HepG2或Huh7；转染试剂为Fugene6 HD，来自Roche公司；转染试剂为Fugene6 HD，来自Roche公司；其中加入DMSO后的HBV载体转染细胞后的重组HBV的量约为加入前的5-50倍。
（23）转染后72小时和96小时各收集一次细胞培养上清。若重组HBV复制水平较高，可在转染后120小时再收集一次细胞培养上清。聚乙二醇8000（PEG8000）沉淀上清中的病毒颗粒。
由表1的结果可知，本实施例所提供的三种载体在制备转染细胞后的重组HBV过程中加入DMSO后重组HBV的病毒定量结果约为加入前的5-50倍。
本实施例还提供了上述携带外源基因的重组HBV的应用，所述HBV载体、重组HBV用于构建HBV慢性感染动物模型、构建稳定自主复制HBV的cccDNA的细胞模型和构建可示踪的HBV病毒株。
构建的表达外源基因的复制型HBV载体能形成具备感染能力的病毒颗粒，收集复制型HBV载体转染后细胞上清液中的病毒颗粒，以之感染HepaRG细胞，HepaRG细胞是目前全世界唯一一株能感染野生型HBV的细胞系。在感染之前，需要诱导HepaRG细胞分化。
将pCH-9/3093，pCH-BsdR和pCH-hrGFP三种HBV载体转染HepG2细胞，聚乙二醇沉淀培养上清中的病毒颗粒，再将3种病毒颗粒分别与预先分化好的HepaRG细胞共孵育；调整病毒浓度，使病毒与细胞的比例维持在100:1，即MOI=100；由于pCH-hrGFP转染后细胞内HBV复制效率太低，故该组病毒颗粒在感染时设定MOI=10，并以来自HBV慢性感染患者的血清做为感染过程的阳性对照。
完整的HBV病毒颗粒中不含RNA成分，所以，如果能在HepaRG细胞中检出HBV RNA，就能证明HepaRG确实被HBV感染，并且转录出HBV RNA。分别将pCH-9/3093，pCH-BsdR和pCH-hrGFP三种载体转染HepG2细胞后获得的病毒颗粒感染HepaRG细胞，患者的血清作为感染阳性对照，8天后，经RNA印迹实验（Northern blotting）发现，pCH-9/3093和pCH-BsdR组，以及患者血清感染组细胞内可以找到HBV 基因组RNA和亚基因组RNA，pCH-hrGFP转染HepG2细胞后收获的病毒滴度较低，用此种病毒颗粒感染HepaRG细胞后，经RNA印迹实验检测到的HBV RNA条带信号明显较弱，但是还是可以检出，结果如图20所示。
分别用野生型HBV 载体pCH-9/3093（1），插入外源基因的HBV载体pCH-BsdR （2）和pCH-hrGFP（3）转染HepG2细胞，收集细胞培养上清中的HBV病毒颗粒，感染HepaRG细胞，以HBV慢性感染患者的血清作为阳性对照，设定MOI为100。由于pCH-hrGFP转染后收获的HBV病毒滴度较低，故pCH-hrGFP组设定MOI为10。感染后8天，提取HepaRG细胞内的总RNA，行RNA印迹实验，用32P标记的HBV探针检测HBV相关RNA。图中标注的3.5-4.5 kb RNA为HBV载体转染细胞后收获的病毒再感染HepaRG细胞后，细胞内新合成的pgRNA或野生型HBV直接感染HepaRG细胞后细胞内新合成的pgRNA（Serum HBV组）。2.1+2.4 kb RNA为HBV亚基因组RNA。pCH-BsdR组细胞中的HBV RNA电泳迁移速率略小于野生型HBV和患者血清产生的RNA。这与pCH-BsdR转染细胞后产生的HBV基因组略长于野生型HBV的事实相一致。
通过ELISA法定量检测HepaRG细胞感染HBV后，细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg，进一步证实了pCH-BsdR转染细胞后产生的HBV颗粒可以有效地感染HepaRG细胞，并且复制HBV，表达HBV蛋白，完成与野生型HBV相似的复制循环，如图21所示，分别用野生型HBV 载体pCH-9/3093（■）和插入外源基因的HBV载体pCH-BsdR（▲）转染HepG2细胞，PEG沉淀法收集细胞培养上清中的HBV病毒颗粒，感染HepaRG细胞，ELISA法定量检测HepaRG细胞培养上清中的HBsAg浓度。横坐标为定量检测的时间点，以感染日期为计算基准。图22为重组HBV感染HepaRG细胞后HBeAg表达水平。
由于此组HepaRG细胞中HBV RNA丰度较低，从RNA印迹图上难以确定HBV RNA片段的长度。为了单独检验pCH-hrGFP转染后收集的HBV病毒颗粒的感染能力，检测了感染后HepaRG细胞中的hrGFP荧光强度，如图23所示，HepaRG细胞感染该组病毒颗粒后4天时，就可在荧光显微镜下观察到绿色荧光。随着时间延长，尽管荧光细胞所占比例并未明显增加，但观察到荧光强度确实逐步提高，提示重组HBV发生了复制。
分别用野生型HBV 载体pCH-9/3093（■）和插入外源基因的HBV载体pCH-BsdR（▲）转染HepG2细胞，PEG沉淀法收集细胞培养上清中的HBV病毒颗粒，感染HepaRG细胞，ELISA法定量检测HepaRG细胞培养上清中的HBeAg浓度。横坐标为定量检测的时间点，以感染日期为计算基准。图中可以看出，hrGFP重组HBV的感染效率与文献报道的野生型HBV对HepaRG细胞感染率一致。
表达hrGFP的重组HBV可用于评价病毒感染的特异性，尝试用HBV免疫球蛋白（HBIG）阻断重组HBV的感染，如果HBIG可以阻断感染，说明构建的重组HBV是通过HBV病毒外膜蛋白感染细胞的；如果HBIG不能阻断感染，则说明构建的重组HBV不是通过与野生型HBV相同的机制进入HepaRG细胞的，经HBIG感染阻断实验，发现用HBIG预处理的HepaRG细胞感染hrGFP重组HBV的比例显著降低，这说明构建的重组HBV是通过与野生型HBV相同的方式（通过HBV外膜蛋白）感染HepaRG细胞的。HBIG感染阻断实验也相当于初步测试了构建的重组HBV用于抗HBV药物药效评价的可行性。
Organization Applicant
----------------------
Street :中山西路398号
City : 石家庄市
State : 河北省
Country :中国
PostalCode :
PhoneNumber :
FaxNumber :
EmailAddress :
<110> OrganizationName : 中国人民解放军白求恩国际和平医院
Application Project
-------------------
<120> Title : 携带外源基因的HBV载体、重组HBV及分泌其的细胞系、和相应的制备方法与
应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
Sequence
--------
<210> 1
<213> OrganismName : 人乙型肝炎病毒（HBV）
<400> PreSequenceString :
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aggcagccta ccccgctgtc tccacctttg agaaacactc atcctcaggc catgcagtgg 1920
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gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgttctga ctactgcctc tcccttatcg 2040
tcaatcttct cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg agaacatcac atcaggattc 2100
ctaggacccc ttctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata 2160
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gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagcta gcttgggctg 6300
cagattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 6360
tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 6420
cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 6480
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<212> Type : DNA
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SequenceName : 携带外源基因的pCH-BsdR载体
SequenceDescription :
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<210> 2
<213> OrganismName : 人乙型肝炎病毒（HBV）
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gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgttctga ctactgcctc tcccttatcg 2040
tcaatcttct cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg agaacatcac atcaggattc 2100
ctaggacccc ttctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata 2160
ccgcagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc tagggggaac taccgtgtgt 2220
cttggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac caacctcttg tcctccaact 2280
tgtcctggtt atcgctggat gtgtctgcgg cgttttatca tcttcctctt catcctgctg 2340
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cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc 2640
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ctaacaaaac aaagagatgg ggttactctc taaattttat gggttatgtc attggatgtt 2820
atgggtcctt gccacaagaa cacatcatac aaaaaatcaa agaatgtttt agaaaacttc 2880
ctattaacag gcctattgat tggaaagtat gtcaacgaat tgtgggtctt ttgggttttg 2940
ctgccccttt tacacaatgt ggttatcctg cgttgatgcc tttgtatgca tgtattcaat 3000
ctaagcaggc tttcactttc tcgccaactt acaaggcctt tctgtgtaaa caatacctga 3060
acctttaccc cgttgcccgg caacggccag gtctgtgcca agtgtttgct gacgcaaccc 3120
ccactggctg gggcttggtc atgggccatc agcgcatgcg tggaaccttt tcggctcctc 3180
tgccgatcca tactgcggaa ctcctagccg cttgttttgc tcgcagcagg tctggagcaa 3240
acattatcgg gactgataac tctgttgtcc tatcccgcaa atatacatcg tttccatggc 3300
tgctaggctg tgctgccaac tggatcctgc gcgggacgtc ctttgtttac gtcccgtcgg 3360
cgctgaatcc tgcggacgac ccttctcggg gtcgcttggg actctctcgt ccccttctcc 3420
gtctgccgtt ccgaccgacc acggggcgca cctctcttta cgcggactcc ccgtctgtgc 3480
cttctcatct gccggaccgt gtgcacttcg cttcacctct gcacgtcgca tggagaccac 3540
cgtgaacgcc caccaaatat tgcccaaggt cttacataag aggactcttg gactctcagc 3600
aatgtcaacg accgaccttg aggcatactt caaagactgt ttgtttaaag actgggagga 3660
gttgggggag gagattaggt taaaggtctt tgtactagga ggctgtaggc ataaattggt 3720
ctgcgcacca gcaccatgca actttttcac ctctgcctaa tcatctcttg ttcatgtcct 3780
actgttcaag cctccaagct gtgccttggg tggctttggg gc 3822
<212> Type : DNA
<211> Length : 3822
SequenceName : 携带外源基因的pCH-BsdR转染细胞后生成的重组HBV
SequenceDescription :
Sequence
--------
<210> 3
<213> OrganismName : 人乙型肝炎病毒（HBV）
<400> PreSequenceString :
atggacatcg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60
tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120
gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180
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cgacatcctg agccccgcct tccagtacgg caaccgcacc ttcaccaagt accccgagga 840
catcagcgac ttcttcatcc agagcttccc cgccggcttc gtgtacgagc gcaccctgcg 900
ctacgaggac ggcggcctgg tggagatccg cagcgacatc aacctgatcg aggagatgtt 960
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gaccatcacc ggcctgcagc ccagcttcga ggtggtgtac atgaacgacg gcgtgctggt 1080
gggccaggtg atcctggtgt accgcctgaa cagcggcaag ttctacagct gccacatgcg 1140
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ggagccctca ggctcagggc atactacaaa ctttgccagc aaatccgcct cctgcctcca 2160
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tcctcttcat cctgctgcta tgcctcatct tcttgttggt tcttctggac tatcaaggta 2700
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gtttgctgac gcaaccccca ctggctgggg cttggtcatg ggccatcagc gcatgcgtgg 3480
aaccttttcg gctcctctgc cgatccatac tgcggaactc ctagccgctt gttttgctcg 3540
cagcaggtct ggagcaaaca ttatcgggac tgataactct gttgtcctat cccgcaaata 3600
tacatcgttt ccatggctgc taggctgtgc tgccaactgg atcctgcgcg ggacgtcctt 3660
tgtttacgtc ccgtcggcgc tgaatcctgc ggacgaccct tctcggggtc gcttgggact 3720
ctctcgtccc cttctccgtc tgccgttccg accgaccacg gggcgcacct ctctttacgc 3780
ggactccccg tctgtgcctt ctcatctgcc ggaccgtgtg cacttcgctt cacctctgca 3840
cgtcgcatgg agaccaccgt gaacgcccac caaatattgc ccaaggtctt acataagagg 3900
actcttggac tctcagcaat gtcaacgacc gaccttgagg catacttcaa agactgtttg 3960
tttaaagact gggaggagtt gggggaggag attaggttaa aggtctttgt actaggaggc 4020
tgtaggcata aattggtctg cgcaccagca ccatgcaact ttttcacctc tgcctaatca 4080
tctcttgttc atgtcctact gttcaagcct ccaagctgtg ccttgggtgg ctttggggca 4140
tggacatcga cccttataaa gaatttggag ctactgtgga gttactctcg tttttgcctt 4200
ctgacttctt tccttcagta cgagatcccc gggcgagctc gctagcccta tagtgagtcg 4260
tattaatagc tcgaattgat ctgatcaaat tccgtgtatt ctatagtgtc acctaaatcg 4320
tatgtgtatg atacataagg ttatgtatta attgtagccg cgttctaacg acaatatgtg 4380
gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagcagg 4440
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attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa 4860
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agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac 4980
aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac 5040
tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac 5100
cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac 5160
tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact 5220
tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg 5280
tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt 5340
tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat 5400
aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta 5460
gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 5520
tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 5580
aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 5640
aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 5700
tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc 5760
gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 5820
cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 5880
acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 5940
cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag 6000
cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 6060
aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 6120
gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 6180
atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 6240
tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 6300
gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 6360
agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg 6420
cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt 6480
gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 6540
gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc 6600
caagctagct tgggctgcag attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca 6660
ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 6720
ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 6780
acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 6840
ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 6900
aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 6960
tacatctacg tattagtcat cgctattacc aggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg 7020
ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg 7080
ggagtttgtt ttggtaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc 7140
cattgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtc 7200
gacaccatgc aactttttca cctctgccta atcatctctt gttcatgtcc tactgttcaa 7260
gcctccaagc tgtgccttgg gtggctttgg ggc 7293
<212> Type : DNA
<211> Length : 7293
SequenceName : 携带外源基因的pCH-hrGFP载体
SequenceDescription :
Sequence
--------
<210> 4
<213> OrganismName : 人乙型肝炎病毒（HBV）
<400> PreSequenceString :
atggacatcg acccttataa agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct 60
tctgacttct ttccttcagt acgagatctt ctagataccg cctcagctct gtatcgggaa 120
gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcaggca agcaattctt 180
tgctgggggg aactaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaatttgga agatccagcg 240
tctagagacc tagtagtcag ttatgtcaac actaatatgg gcctaaagtt caggcaactc 300
ttgtggtttc acatttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagttataga gtatttggtg 360
tctttcggag tgtggattcg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta 420
tcaacacttc cggagactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480
ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540
tctcaatgtt aatttataat ttcttcttcc agaagaattt gttggtaaag ccaccatggt 600
gagcaagcag atcctgaaga acaccggcct gcaggagatc atgagcttca aggtgaacct 660
ggagggcgtg gtgaacaacc acgtgttcac catggagggc tgcggcaagg gcaacatcct 720
gttcggcaac cagctggtgc agatccgcgt gaccaagggc gcccccctgc ccttcgcctt 780
cgacatcctg agccccgcct tccagtacgg caaccgcacc ttcaccaagt accccgagga 840
catcagcgac ttcttcatcc agagcttccc cgccggcttc gtgtacgagc gcaccctgcg 900
ctacgaggac ggcggcctgg tggagatccg cagcgacatc aacctgatcg aggagatgtt 960
cgtgtaccgc gtggagtaca agggccgcaa cttccccaac gacggccccg tgatgaagaa 1020
gaccatcacc ggcctgcagc ccagcttcga ggtggtgtac atgaacgacg gcgtgctggt 1080
gggccaggtg atcctggtgt accgcctgaa cagcggcaag ttctacagct gccacatgcg 1140
caccctgatg aagagcaagg gcgtggtgaa ggacttcccc gagtaccact tcatccagca 1200
ccgcctggag aagacctacg tggaggacgg cggcttcgtg gagcagcacg agaccgccat 1260
cgcccagctg accagcctgg gcaagcccct gggcagcctg cacgagtggg tctagagaaa 1320
tttataattt cttcttccag aagaatttgt tggtaaagcc accatggccc tatcctatca 1380
acacttccgg agactactgt tgttagacga cgaggcaggt cccctagaag aagaactccc 1440
tcgcctcgca gacgaaggtc tcaatcgccg cgtcgcagaa gatctcaatc tcgggaatct 1500
caatgttagt attccttgga ctcataaggt ggggaacttt actgggcttt attcttctac 1560
tgtacctgtc tttaatcctc attggaaaac accatctttt cctaatatac atttacacca 1620
agacattatc aaaaaatgtg aacagtttgt aggcccactc acagttaatg agaaaagaag 1680
attgcaattg attatgcctg ccaggtttta tccaaaggtt accaaatatt taccattgga 1740
taagggtatt aaaccttatt atccagaaca tctagttaat cattacttcc aaactagaca 1800
ctatttacac actctatgga aggcgggtat attatataag agagaaacaa cacatagcgc 1860
ctcattttgt gggtcaccat attcttggga acaagatcta cagcatgggg cagaatcttt 1920
ccaccagcaa tcctctggga ttctttcccg accaccagtt ggatccagcc ttcagagcaa 1980
acaccgcaaa tccagattgg gacttcaatc ccaacaagga cacctggcca gacgccaaca 2040
aggtaggagc tggagcattc gggctgggtt tcaccccacc gcacggaggc cttttggggt 2100
ggagccctca ggctcagggc atactacaaa ctttgccagc aaatccgcct cctgcctcca 2160
ccaatcgcca gtcaggaagg cagcctaccc cgctgtctcc acctttgaga aacactcatc 2220
ctcaggccat gcagtggaat tccacaacct tccaccaaac tctgcaagat cccagagtga 2280
gaggcctgta tttccctgct ggtggctcca gttcaggaac agtaaaccct gttctgacta 2340
ctgcctctcc cttatcgtca atcttctcga ggattgggga ccctgcgctg aacatggaga 2400
acatcacatc aggattccta ggaccccttc tcgtgttaca ggcggggttt ttcttgttga 2460
caagaatcct cacaataccg cagagtctag actcgtggtg gacttctctc aattttctag 2520
ggggaactac cgtgtgtctt ggccaaaatt cgcagtcccc aacctccaat cactcaccaa 2580
cctcttgtcc tccaacttgt cctggttatc gctggatgtg tctgcggcgt tttatcatct 2640
tcctcttcat cctgctgcta tgcctcatct tcttgttggt tcttctggac tatcaaggta 2700
tgttgcccgt ttgtcctcta attccaggat cctcaacaac cagcacggga ccatgccgga 2760
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cggacggaaa ttgcacctgt attcccatcc catcatcctg ggctttcgga aaattcctat 2880
gggagtgggc ctcagcccgt ttctcctggc tcagtttact agtgccattt gttcagtggt 2940
tcgtagggct ttcccccact gtttggcttt cagttatatg gatgatgtgg tattgggggc 3000
caagtctgta cagcatcttg agtccctttt taccgctgtt accaattttc ttttgtcttt 3060
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tacatcgttt ccatggctgc taggctgtgc tgccaactgg atcctgcgcg ggacgtcctt 3660
tgtttacgtc ccgtcggcgc tgaatcctgc ggacgaccct tctcggggtc gcttgggact 3720
ctctcgtccc cttctccgtc tgccgttccg accgaccacg gggcgcacct ctctttacgc 3780
ggactccccg tctgtgcctt ctcatctgcc ggaccgtgtg cacttcgctt cacctctgca 3840
cgtcgcatgg agaccaccgt gaacgcccac caaatattgc ccaaggtctt acataagagg 3900
actcttggac tctcagcaat gtcaacgacc gaccttgagg catacttcaa agactgtttg 3960
tttaaagact gggaggagtt gggggaggag attaggttaa aggtctttgt actaggaggc 4020
tgtaggcata aattggtctg cgcaccagca ccatgcaact ttttcacctc tgcctaatca 4080
tctcttgttc atgtcctact gttcaagcct ccaagctgtg ccttgggtgg ctttggggc 4139
<212> Type : DNA
<211> Length : 4139
SequenceName : pCH-hrGFP转染细胞后生成的重组HBV
SequenceDescription :
Claims (7)
1.一种携带外源基因的复制型HBV载体，其特征在于：它是在HBV病毒的基础上，利用分子克隆技术将HBV基因组上重叠的C基因和P基因分开，各自形成完整开放读框，其间插入蛋白翻译起始序列或蛋白酶切位点，分别引导外源基因和HBV P基因表达；
所述的外源基因的碱基对个数小于700bp；所述的蛋白翻译起始序列为内部核糖体进入位点的短小的碱基序列；蛋白酶切位点均为短小的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的携带外源基因的复制型HBV载体，其特征在于：所述的外源基因为miniSOG、绿色荧光蛋白、荧光素酶等荧光基团、杀稻瘟菌素抗性基因或博来霉素抗性基因中的一种；
所述的蛋白翻译起始序列为Rbm3 IRES或多拷贝9nt Gtx IRES；
所述的蛋白酶切位点为可发生“自我剪切”的2A肽。
3.一种制备如权利要求1或2所述的携带外源基因的复制型HBV载体的方法，其特征在于它按照以下步骤顺序进行：
一、第1轮PCR扩增
包括3个PCR扩增反应，目的分别为：
HBV的C/P基因重叠区与蛋白翻译起始序列的扩增；
二、三片段连接
3个PCR反应产物连接为依次包含C基因C端（包括C/P重叠区），翻译起始序列或蛋白酶切位点，外源基因，翻译起始序列或蛋白酶切位点，P基因N端（包括C/P重叠区）延伸超过HBV基因组上的EcoR I酶切位点的DNA双链；
三、第2轮PCR，扩增三片段连接产物
四、双酶切PCR产物，亚克隆至pCH-9/3093质粒Sal I-EcoR I位点，形成插入外源基因和翻译起始序列或蛋白酶切位点的HBV载体。
4.一种如权利要求1或2所述的携带外源基因的复制型HBV载体的应用，其特征在于：所述HBV载体用于构建HBV慢性感染动物模型、构建稳定自主复制HBV cccDNA的细胞模型和构建可示踪的HBV病毒株。
5.一种如权利要求1或2所述的携带外源基因的复制型HBV载体转染细胞后产生的重组HBV，其特征在于：所述重组HBV由携带外源基因的复制型HBV载体瞬时转染肝癌来源的细胞后，收集细胞培养上清中的病毒颗粒，即制得重组HBV，所述重组HBV的C基因和P基因完全分开，其间插入了可表达的外源基因，同时保留了复制和感染能力。
6.如权利要求5所述的携带外源基因的复制型HBV载体转染细胞后产生的重组HBV的一种制备方法，其特征在于它按照以下步骤顺序进行：
（21）构建如权利要求1所述的携带外源基因的HBV载体；
（22）利用步骤（21）中所制得的载体转染肝癌来源的细胞系，在细胞培养液中加入1-2%的二甲基亚砜，可明显提高重组HBV的复制水平及最终产量；其中，所述的肝癌来源的细胞系为HepG2或Huh7；
（23）收集细胞培养上清液，聚乙二醇8000沉淀上清液中的病毒颗粒。
7.如权利要求5所述的携带外源基因的复制型HBV载体转染细胞后产生的重组HBV的应用，其特征在于：所述重组HBV用于构建HBV慢性感染动物模型、构建稳定自主复制HBV cccDNA的细胞模型和构建可示踪的HBV病毒株。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104278055A (zh) * | 2013-07-04 | 2015-01-14 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 制备hbv持续感染动物模型的试剂和方法 |
| CN105316356A (zh) * | 2015-10-14 | 2016-02-10 | 华东理工大学 | 微藻多基因共表达载体及多基因共表达微藻 |
| CN109897825A (zh) * | 2017-12-07 | 2019-06-18 | 复旦大学 | 一种简单高效产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统 |
| CN110913899A (zh) * | 2017-04-10 | 2020-03-24 | 牛津大学创新有限公司 | Hbv疫苗 |
| CN113249384A (zh) * | 2021-04-27 | 2021-08-13 | 重庆医科大学 | 可靶向编辑HBV cccDNA的特异sgRNA序列及其应用 |
| CN114231548A (zh) * | 2021-11-05 | 2022-03-25 | 贵州医科大学附属医院 | 一种pProTM质粒、其构建方法及应用 |
| CN112725292B (zh) * | 2021-01-11 | 2022-05-31 | 武汉大学 | 一种基于s基因断裂的aav-hbv重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法及应用 |
-
2013
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CHAISOMACHI S ET AL: "Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors", 《GENE THER》 * |
| HANAFUSA T ET AL: "Replication of hepatitis B virus which carries foreign DNA in vitro", 《BIOCHEM BIOPH RES CO》 * |
| LI SH ET AL: "High expression of hepatitis B virus based vector with reporter gene in hepatitis B virus infection system", 《WORLD J GASTROENTROL》 * |
| UNTERGASSER A: "Hepatitis B virus-based vectors allow the elimination of viral gene expression and the insertion of foreign promoters", 《HUM GENE THER》 * |
| YOO J ET AL: "Hepatitis B virus vector carries a foreign gene into liver cells in vitro", 《VIRUS GENES》 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104278055A (zh) * | 2013-07-04 | 2015-01-14 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 制备hbv持续感染动物模型的试剂和方法 |
| CN104278055B (zh) * | 2013-07-04 | 2019-01-25 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 制备hbv持续感染动物模型的试剂和方法 |
| CN105316356A (zh) * | 2015-10-14 | 2016-02-10 | 华东理工大学 | 微藻多基因共表达载体及多基因共表达微藻 |
| CN105316356B (zh) * | 2015-10-14 | 2019-05-28 | 华东理工大学 | 微藻多基因共表达载体及多基因共表达微藻 |
| CN110913899A (zh) * | 2017-04-10 | 2020-03-24 | 牛津大学创新有限公司 | Hbv疫苗 |
| CN110913899B (zh) * | 2017-04-10 | 2024-04-19 | 牛津大学创新有限公司 | Hbv疫苗 |
| CN109897825A (zh) * | 2017-12-07 | 2019-06-18 | 复旦大学 | 一种简单高效产生乙型肝炎病毒重组cccDNA的细胞系统 |
| CN112725292B (zh) * | 2021-01-11 | 2022-05-31 | 武汉大学 | 一种基于s基因断裂的aav-hbv重组病毒、乙肝病毒小鼠模型的建立方法及应用 |
| CN113249384A (zh) * | 2021-04-27 | 2021-08-13 | 重庆医科大学 | 可靶向编辑HBV cccDNA的特异sgRNA序列及其应用 |
| CN114231548A (zh) * | 2021-11-05 | 2022-03-25 | 贵州医科大学附属医院 | 一种pProTM质粒、其构建方法及应用 |
Also Published As
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