CN104278055A - 制备hbv持续感染动物模型的试剂和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备HBV持续感染动物模型的试剂和方法。本发明构建了可有条件地在小鼠肝脏诱导乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子(cccDNA)的构建物，并成功建立一种HBV持续感染动物模型。

Description

制备HBV持续感染动物模型的试剂和方法

技术领域

本发明属于生物技术以及病毒学领域；更具体地，本发明涉及制备HBV持续感染动物模型的试剂和方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)慢性感染仍然是世界性公共健康问题，每年约有100万人死于乙肝感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。中国是乙肝高发区，研究HBV慢性感染、发展有效的抗病毒治疗具有重大社会意义。

HBV易感宿主仅限于人和黑猩猩等灵长类动物，缺乏合适的实验动物模型一直是HBV病毒学和免疫学的研究瓶颈。小鼠是理想的实验模式动物，然而HBV并不感染小鼠。通过转基因技术，病毒抗原作为“自身”蛋白可以模拟乙肝慢性携带者体内的免疫耐受状态。基于HBV转基因小鼠的CTLs过继性输入(Adoptive transfer)能够模拟临床爆发性或急性肝炎的疾病过程，使人们对HBV急性感染的致病机制，特别是免疫系统控制病毒复制以及免疫病理有了深刻的理解。

尾静脉DNA高压注射(hydrodynamic injection)的非转基因小鼠模型近年来受到广泛的关注。Yang等(Proc Natl Acad Sci U S A99(2002)：13825-13830)应用尾静脉高压注射HBV编码质粒，由体内转染方式绕开潜在的病毒受体屏障，建立基于DNA质粒的肝细胞内病毒复制。约4-5%的小鼠肝细胞能够通过这一途径被有效转染，高效表达HBV病毒抗原；同时，病毒抗原作为“异己”成份能够激活病毒特异的宿主免疫应答，有效抑制病毒的表达并伴随肝细胞急性炎症损伤。值得注意的是，Huang等(Proc Natl Acad Sci U S A103(2006)：17862-17867)报道，应用腺相关病毒(AAV)载体构建HBV表达质粒，通过尾静脉高压注射C57BL/6小鼠，超过40%的小鼠在注射后6个月仍可检测到持续的HBsAg表达。然而需要指出，这一研究并未显示乙肝慢性病理特征，这种基于AAV载体的HBV持续性表达更类似于病毒健康携带者中的耐受状态。

共价、闭合、环状的cccDNA分子(covalently closed circularDNA)是HBV前基因组RNA复制的原始模板，虽然其含量较少，每个肝细胞内只有约5～50个拷贝，但对HBV复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。由于cccDNA难以彻底清除，药物治疗终止后易出现病毒反跳现象，病人因此需要长期甚至终身接受核苷酸类似物等抗病毒治疗。只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，是抗病毒治疗的重要目标。另一方面，低丰度的cccDNA检测存在技术难点，由于体系复杂和缺乏准确性，近年来发展的一系列PCR定量方法并不被广泛接受。

现有技术中，人们一般认为小鼠肝细胞中难以形成cccDNA，而基于HBV转基因的表达并不能够反映真实的细胞内病毒复制周期。因此，发展基于cccDNA的HBV持续感染小鼠模型具有重要的科学意义和实践价值。

发明内容

本发明的目的在于提供制备HBV持续感染动物模型的试剂和方法。

在本发明的第一方面，提供一种用于形成重组的乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子(cccDNA)的方法，所述方法包括：

(1)提供一种构建物，所述构建物包括乙型肝炎病毒基因组序列，该乙型肝炎病毒基因组序列中插入一段外源的内含子(Intron)序列，该内含子序列包括(5’→3’)5’端拼接供体序列、3’端分枝点信号序列及拼接受体序列；并且，在5’端拼接供体序列与3’端分枝点信号序列及拼接受体之间，按照5’→3’依次包括质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列，所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列两端设置位点特异性重组元件(用于条件性敲除所述位点特异性重组元件之间的基因序列)；

(2)将(1)的构建物转染肝细胞，诱导所述的位点特异性重组元件以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列，从而在肝细胞内形成重组的乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子。

在一个优选例中，所述的内含子序列：

(a)插入于乙型肝炎病毒前基因组的非转录调控区；和

(b)插入于5’AAGG3’或5’CAGG3’序列中第3位碱基与第4位碱基之间。

在另一优选例中，所述的内含子序列插入于乙型肝炎病毒基因组nt202-203之间或nt2765-2766之间(序列位点计算参照GenBank:V01460.1或SEQ ID NO:1；ayw3病毒亚型)。

在另一优选例中，所述的5’端拼接供体序列包括：人β-globin基因第一内含子序列的5’端拼接供体序列，或人β2-microglobulin基因的第二内含子序列的5’端拼接供体序列；和/或

所述的3’端分枝点信号序列及拼接受体序列是免疫球蛋白重链基因内含子的3’端分枝点信号序列及拼接受体序列；或人β2-microglobulin基因的第二内含子序列的3’端分枝点信号序列及拼接受体序列。

在另一优选例中，所述的人β-globin基因第一内含子序列的5’端拼接供体序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其片段；较佳地，所述片段具有SEQ ID NO:2中第1-45位所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的人β2-microglobulin基因的第二内含子序列的5’端拼接供体序列具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列中第1-100位所示的核苷酸序列或其片段。

在另一优选例中，所述的免疫球蛋白重链基因内含子的3’端分枝点信号序列和拼接供体序列具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或其片段。

在另一优选例中，所述的人β2-microglobulin基因的第二内含子序列的3’端分枝点信号序列和拼接供体序列具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列中第101-627位所示的核苷酸序列或其片段。

在另一优选例中，所述的质粒复制序列是pUC Ori；和/或所述的真核基因加尾信号是牛生长激素因子基因的polyA加尾信号序列(BGH)。

在另一优选例中，所述的位点特异性重组元件包括：LoxP，且应用Cre重组酶诱导LoxP以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列；或FRT，且应用FLP重组酶诱导FRT以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列。

在另一优选例中，所述的pUC Ori具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的牛生长激素因子基因的polyA加尾信号序列具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的Loxp具有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的抗性筛选基因是Amp。

在另一优选例中，所述各元件是操作性相连的。

在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。

在另一优选例中，所述的表达载体基于pCDNA3.1(invitrogen)构建，仅含有质粒复制元件(pUC ori)和抗生素筛选元件(Amp resistance)，同时设计了串联的限制性酶切位点HindIII-NcoI-PstI，用于克隆HBV单拷贝环状基因组。

在另一优选例中，步骤(2)包括：将(1)的构建物体外转染肝细胞，或施用于动物，诱导所述的位点特异性重组元件以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列，从而在肝细胞内形成重组的乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子。

在另一优选例中，所述的动物是鼠(较佳地为小鼠)，所述的施用为尾静脉高压注射。

在另一优选例中，步骤(2)中，还包括共转下调CD1d表达的抑制分子。

在另一优选例中，所述的下调CD1d表达的抑制分子是特异性干扰CD1d表达的shRNA。

在另一优选例中，所述的特异性干扰CD1d表达的shRNA中，发挥干扰作用的是正义链SEQ ID NO:8和反义链SEQ ID NO:9退火形成的片段；较佳地，其插入在pLKO.1中。

在本发明的另一方面，提供一种用于形成乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子的构建物，所述构建物包括乙型肝炎病毒基因组序列，该乙型肝炎病毒基因组序列中插入一段外源的内含子(Intron)序列，该内含子序列包括(5’→3’)5’端拼接供体序列、3’端分枝点信号序列及拼接受体序列；并且，在5’端拼接供体序列与3’端分枝点信号序列及拼接受体之间，按照5’→3’依次包括质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列，所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列两端设置位点特异性重组元件(用于条件性敲除所述位点特异性重组元件之间的基因序列)。

在本发明的另一方面，提供所述的构建物的用途，用于形成乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子；或用于制备乙型肝炎病毒持续感染的动物模型。

在本发明的另一方面，提供一种用于形成乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子的系统(如试剂盒)，所述系统包括：(a)所述的构建物；和(b)诱导所述的位点特异性重组元件以进行基因敲除的物质(如表达重组酶Cre的构建物或质粒，或表达重组酶FLP的构建物或质粒)。

在一个优选例中，所述系统还包括：下调CD1d表达的抑制分子；较佳地，所述的下调CD1d表达的抑制分子是特异性干扰CD1d表达的shRNA。

在另一优选例中，所述的特异性干扰CD1d表达的shRNA中，发挥干扰作用的是正义链SEQ ID NO:8和反义链SEQ ID NO:9退火形成的片段；较佳地，其插入在pLKO.1中。

在本发明的另一方面，提供所述的系统的用途，用于形成乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子；或用于制备乙型肝炎病毒持续感染的动物模型。

在本发明的另一方面，提供一种重组细胞(较佳地为肝细胞；如体外培养细胞)，所述细胞中转化有所述的构建物以及诱导所述的位点特异性重组元件以进行基因敲除的物质，能够形成乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、诱导重组cccDNA的分子生物学模型。

A、诱导重组cccDNA的构建物中各元件示意图以及由重组酶加工后的结构示意图；

B、表达载体在Cre重组酶加工前后的结构示意图。

图2、体外转染实验证实Cre诱导rcccDNA形成。

A、应用prcccDNA和重组酶Cre表达质粒(pCMV-Cre)体外转染HepG2细胞，细胞培养上清中检测到的HBV分泌抗原HBeAg，HBsAg和LHBsAg的量。

B、Southern杂交分析转染第4天细胞浆内病毒DNA。

C、Southern杂交分析转染第4天细胞核内的HBV复制形式。

图中，RC：松弛环状DNA中间体；CCC：共价闭合的环状DNA中间体；DSL：线性DNA中间体；SS：单链DNA中间体。

图3、rcccDNA的表观遗传学修饰。

图4、基于小鼠尾静脉高压注射rcccDNA的免疫学分析。

A、DNA尾静脉高压注射白蛋白启动子调控的Cre(Alb-Cre)转基因鼠后，肝组织免疫荧光染色分析。

B、分离小鼠肝脏细胞，DNA杂交分析细胞核抽提物中rcccDNA的形成情况。

C、DNA杂交分析尾静脉高压注射后不同时间rcccDNA的存在情况。

图5、基于尾静脉高压注射的rcccDNA的免疫学分析。

A、HBV结构抗原通过DNA免疫能够诱导功能性T细胞应答；

B、prcccDNA(8μg)尾静脉高压注射注射白蛋白启动子调控的Cre转基因小鼠，第14天诱导肝脏中不完全的T细胞应答(产生IFNγ，但仅诱导低水平的TNFα)。

C、prcccDNA尾静脉高压注射诱导肝脏中表面抗原特异性T细胞(Env353)，这群特异性细胞同时高表达共抑制分子PD-1。

D、应用不同剂量(4-16μg)的prcccDNA尾静脉高压注射小鼠，血清抗原及T细胞应答分析。

图6、基于rcccDNA尾静脉高压注射的HBsAg持续表达。

A、低剂量的prcccDNA(4μg)以及pCMV-Cre共注射小鼠，病毒抗原持续表达情况。

B、payw1.3或prcccDNA尾静脉高压注射小鼠，RNA杂交分析体内病毒复制情况。

图7、来自于人β2-microglobulin基因插入到HBV表面抗原基因区nt2765-2766，转染HepG2细胞检测是否成功拼接。

图8、通过尾静脉共注射特异性抑制小鼠CD1d的shRNA表达质粒，能够诱导HBsAg在小鼠肝脏中持续表达情况。

具体实施方式

本领域中一般认为小鼠肝细胞中难以形成cccDNA，鉴于该技术缺陷，本发明人经过广泛的研究和反复论证，构建了可条件性在动物肝细胞内诱导乙型肝炎病毒(HBV)共价、闭合、环状DNA分子(cccDNA)的构建物，从而成功建立了一种HBV持续感染动物模型。

术语

如本文所用，“元件”是指功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以在动物细胞内或动物体内诱导形成乙型肝炎病毒cccDNA。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的片段、变体或衍生物，只要这些片段、变体或衍生物基本上保留了所述“元件”的功能。

如本文所用，“Cre重组酶”是来源于大肠杆菌P1噬菌体的核苷酸重组酶，作用于称为LoxP的DNA序列。

如本文所用，“LoxP”或“LoxP1”或“LoxP2”是指一段长为34碱基的具有回文结构的DNA序列，其序列是：ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT，是Cre重组酶的作用位点。

如本文所用，所述的“操作性相连”，“可操作地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“构建物(或称构建体)”指一种已经通过人为干预，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的DNA片段的单链或者双链DNA分子。

如本文所用，所述的“动物”是非人哺乳动物。较佳地，是鼠，如小鼠。

构建物及其用途

本发明提供了一种用于条件性地在动物肝细胞内诱导HBV cccDNA的构建物，所述构建物包括乙型肝炎病毒基因组序列，该乙型肝炎病毒基因组序列中插入一段外源的内含子(Intron)序列，该内含子序列包括(5’→3’)5’端拼接供体序列、3’端分枝点信号序列及拼接受体序列；并且，在5’端拼接供体序列与3’端分枝点信号序列及拼接受体之间，按照5’→3’依次包括质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列，所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列两端设置位点特异性重组元件。所述的构建物的示意图如图1所示。

本领域技术人员均了解，病毒的编码基因多为所谓单顺反子结构，在mRNA形成过程中缺乏内含子的功能性拼接，HBV也如此。并且，HBV的基因组序列非常保守，难以在其基因组中插入外源序列来实现有效的基因操作。在本发明中，首次成功地在HBV基因组中引入外源性的内含子序列，证实能够实现病毒mRNA的有效拼接，使得基于外源性内含子进行分子操作成为可能。

绝大多数真核细胞的内含子属于第III类内含子(intron)，包括5’端拼接供体序列、3’端拼接受体序列、以及位于拼接受体位点上游的分枝点信号。内含子及其邻近外显子的交界序列具有一定的保守性，以确保精确有效的剪接：5’端交界序列的保守特征为(A/C)AG|GU(A/G)AGU，而CAG|G则是典型的3’拼接受体及外显子交界序列。

作为本发明的优选方式，HBV病毒基因组中合适的内含子插入位点避开了HBV病毒前基因组的调控区；并能满足5’>AAGG<3’或5’>CAGG<3’的保守特征(在第三、四位碱基之间插入外源性内含子)，确保外源性内含子能够实现拼接。这种四碱基的保守序列在HBV基因组中很容易发现，以HBV ayw亚型基因组(GenBank:V01460.1)为例，在nt2765-2766之间(位于病毒多聚酶基因TP结构域部分)插入来自人类β2-microglobulin基因的第二内含子序列，证实能够实现功能性的拼接。另一可能的原则是，遵从外源基因中外显子和内含子原有的交界序列特征，寻找HBV基因组中的相应插入位点，例如，本发明人在nt2723-2724之间插入人类Col5a1基因的第二内含子序列，同样证实能有有效拼接。本发明的实验结果已表明，在HBV多个位置、能够应用外源内含子策略进行基因操作。这种基因操作会非常有用，比如在本发明中制备cccDNA的构建物的方法，再比如构建可诱导表达的HBV基因组等等。

当外源性内含子重组体插入到病毒基因组中，由于5’端拼接供体序列、3’端分枝点信号和拼接受体序列的作用，使得外源插入序列在病毒基因转录后加工的过程中被剪切掉，病毒基因组仍然能够保持完整、有效的基因转录和表达。

本发明首次将普通的真核基因第III类内含子插入到病毒(HBV)基因组中，产生人工的内含子和外显子，以便基于插入内含子进行基因操作(例如，Cre/loxp重组)，由于插入的内含子序列能够被有效拼接，这些基因操作将不影响病毒基因的表达和功能。

其次，在插入的外源性内含子序列中进行基因操作，在所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列两端设置位点特异性重组元件，并确保能够耐受有效的拼接。在本发明中，以来自pCI-neo质粒的一段杂合的内含子序列，并引入LoxP序列，插入到HBV ayw亚型基因组HBV表面抗原基因区nt202-203之间，并证实能够有效拼接，并保持HBV病毒基因组的有效复制。

位点特异性重组元件(如来自Cre/loxP系统或FLP/FRT系统的重组元件)的引入使得外源基因的条件性敲除成为可能。位点特异性重组系统是本领域技术人员了解的，包括但不限于：来源于P1噬菌体的Cre-loxp系统；来自于啤酒酵母的FLP/FRT系统；来源于链霉菌噬菌体的ФC31系统。

本发明中，两个位点特异性重组元件之间引入质粒复制序列，抗性筛选基因序列，真核基因加尾信号序列。真核基因转录加尾信号的引入，使得相应的病毒基因在外源性内含子区域提前发生终止，阻碍HBV病毒基因组的有效复制。可以通过诱导所述的位点特异性重组元件以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列。这一设计使得本发明可以同时实现体外的重组质粒(含病毒基因组)扩增，以及体内的条件性(通过条件性诱导)敲除。

除非另外说明，本发明上述的各元件均是本领域技术人员已知的元件，它们的序列可以直接通过化学合成来获得，或者可以从商购的载体中克隆获得。根据本发明所公开的信息，进行了适当的变化且仍然保留其原有功能的上述各元件的变异体也包括在本发明中。例如，在严格条件下与本发明限定的序列杂交且具有相同功能的序列变异体。如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1%SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在50%，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上时才发生杂交。例如，所述序列也可为这些所限定序列的互补序列。

本发明的各元件所指向的基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

构建物中各元件之间还可包括限制性的酶切位点，这样有利于各元件的有机连接。

通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

动物模型或细胞模型的制备

在获得了所述的转基因构建物之后，可用常规方法将所述的构建物或含有所述构建物的表达载体转染细胞，如肝细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，例如显微注射、电穿孔等。

所述的构建物或含有所述构建物的表达载体也可以用于转染动物，如转染小鼠。作为本发明的优选方式，采用尾静脉高压注射的方式将构建物或含有所述构建物的表达载体转染非人哺乳动物

本发明所述的非人哺乳动物可以为鼠、羊、牛、猪、兔等。优选的是鼠，包括小鼠、大鼠或其它类型的鼠。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.材料和方法

1、小鼠

C57BL/6小鼠购自中科院上海实验动物中心。

Alb-Cre转基因小鼠(C57BL/6背景)能够在肝脏中特异性表达重组酶Cre，获自中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所。

尾静脉高压注射和DNA免疫参考在先文献Deng Q等(2009)；Hepatology50：1380-1391。

2、细胞

HepG2，huh-7购自ATCC。

3、质粒构建

(1)以来自于pCI-neo表达质粒的一段内含子插入HBV基因组构建质粒

野生型1.3拷贝HBV基因组(ayw亚型，GenBank：V01460.1，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/V01460.1)，以野生型HBV ayw亚型病毒DNA为模板PCR扩增nt1075-3182片段，酶切后置换prHBV1.3质粒(见Deng Q等(2009)；Hepatology50:1380-1391；该质粒携带在1075-3182位区间内存在缺失突变的1.3拷贝HBV基因组)中相应片段(见Deng Q等(2009)；Hepatology50：1380-1391)，获得构建的野生型payw1.3质粒。

为构建重组的prcccDNA质粒，本发明人首先基于payw1.3，在其编码的HBV表面抗原基因区nt202-203(参照GenBank：V01460.1)中间插入一段杂合内含子(chimeric Intron)序列。该段内含子来自于Promega公司商售的pCI-neo表达质粒，序列为5’>gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag<3’(SEQ ID NO:2)。进一步，把该段内含子拆分为5’端(5’Intron，88nts)和3’端(3’Intron，45nts)部分，在其中间引入限制性酶切位点Hind III和Pst I，获得的中间质粒命名为payw1.3-Intron。

同时，利用pCDNA3.1(Invitrogen)构建了仅含有质粒复制元件(pUC ori)和抗生素筛选元件(Amp resistance)的骨架质粒pBackbone。以pCDNA3.1为模板，PCR扩增nt3600-5428的DNA片段，包含质粒复制元件和氨苄抗性基因，上下游引物中分别设计NcoI-Hind III或Nco-PstI的酶切位点搭头序列。应用NcoI单酶切PCR产物，自身连接反应后转化感受态细菌，获得具有串联的限制性酶切位点HindIII-NcoI-PstI的pBackbone质粒。

由于payw1.3-Intron编码1.3拷贝的HBV基因组，对其分别应用HindIII/NcoI以及PstI/NcoI双酶切(NcoI位于重复编码的X基因区)，酶切片段分别连接到骨架质粒相应位点中，获得相应的含有单拷贝环状HBV基因组的中间质粒；进一步应用HindIII和PstI位点在质粒复制骨架两侧分别引入Loxp序列(Loxp-1和Loxp-2)，并在Loxp-2的5’端引入来自于pCDNA3.1质粒的polyA加尾信号序列BGH，最终获得外源性内含子重组的cccDNA编码质粒prCCCDNA(图1)。

pCMV-Cre获自复旦大学。

pCMV-S2S来自于法国Pasteur研究所(见Michel ML等(1995).PNAS，92(12):5307-11)。

pCMV-core表达克隆基于pCDNA3.1载体构建，在CMV启动子下表达HBV核心抗原。应用引物特异性PCR扩增HBV核心抗原编码区，设计引物分别包含限制性酶切位点搭头序列BamHI以及EcoRI，经酶切反应后连接至pCDNA3.1载体的相应位点。

(2)以来自于pCI-neo表达质粒的缩短型内含子插入HBV基因组构建质粒

操作方法：基于prcccDNA构建，应用引物特异性PCR和酶切反应，将prcccDNA中外源性内含子的5’供体序列由原来的1-88nts片段5’>gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgatagg<3’，缩短为1-45nts片段(5’>gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaa<3’)，获得的缩短型质粒命名为prCCCDNAs。与pCMV-Cre共转染体外培养肝细胞系，可有效表达HBV表面抗原，表明能够实现外源性缩短内含子的有效拼接。

(3)以来自人β2-microglobulin基因的第二内含子序列插入HBV基因组构建质粒

操作方法同前述“(1)”，不同点在于将内含子序列替换为人β2-microglobulin基因的第二内含子序列(SEQ ID NO:7)，并且插入到HBV表面抗原基因区nt2765-2766(参照GenBank：V01460.1)，获得payw1.3-Intron(β2-microglobulin)。

4、HBV DNA杂交分析、肝细胞和组织免疫荧光染色、免疫细胞染色及FACS分析

见在先文献Deng Q等(2009)；Hepatology50：1380-1391。

5、表观遗传学分析(染色体免疫沉淀分析)

表观遗传学分析(染色体免疫沉淀分析)参考文献Belloni L等，J Clin Invest.122:529-37。转染前24小时，将huh7细胞以密度为1×10⁶铺到10cm培养皿。24小时后按1：1共转pCMV-Cre和prcccDNA质粒。37℃，5%CO₂条件下培养48小时后，进行染色体免疫沉淀分析实验。简要步骤为：完全除去培养基后用PBS洗细胞1次，用胰酶将细胞消化下来后，用甲醛将细胞37℃水浴30分钟固定(甲醛终浓度为1%)。之后用终浓度为0.125M的甘氨酸37℃水浴10分钟终止交联。后向细胞悬液中加入同体积的提取液，充分混匀之后800转/分钟离心，去上清。沉淀用500ul/皿的细胞裂解液裂解细胞(0.5%NP-40，50mMTris/HCl，PH8.1，100mM NaCl，1mM EDTA，用前加入终浓度为1mM的PMSF)，4℃放置10分钟，期间每隔5分钟涡旋10秒。高速离心10分钟后，去上清，沉淀为细胞核组分。细胞核用裂解液裂解(含有1%SDS，10mM EDTA，50mM Tris/HCl PH8.1，用前加入终浓度1mM的PMSF)，4℃放置10分钟后，超声裂解细胞核。超声强度为22%，时间为超声5秒，停顿10秒，全部操作在冰上进行。超声离心后，取1/100的溶液于新的离心管中，冻入-20冰箱中，作为内参。剩余的裂解液用免疫沉淀反应缓冲液(含有0.01%SDS，1.1%TritonX100，1.2mM EDTA，16.7mM Tris/HCl，PH8.1，167mM NaCl，用前加入终浓度为1mM的PMSF)稀释10倍。用预处理好的proteinA/G的琼脂糖珠以1:100加入到裂解液中，4℃旋转培育1小时进行预处理。之后高速离心，去除琼脂糖珠，将预处理后的裂解液分成非特异性IgG对照组和特异性抗体组，分别加入2ul的IgG或者相应抗体，4℃旋转过夜培育。第二天，在裂解液中直接以1:50加入预处理好的proteinA/G琼脂糖珠。4℃旋转培育2小时。后将裂解液用4℃、2000转/分钟离心2分钟，去掉上清，琼脂糖珠为沉淀。之后加入500ul的免疫沉淀反应缓冲液加入琼脂糖珠(免疫沉淀反应缓冲液用前加入1mM的PMSF)，4℃旋转培育10分钟，重复4次。同样用洗涤缓冲液(0.25mM LiCl，0.5%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，1mM EDTA，10mM Tris/HCl，PH8.1)洗涤3-4次，最后用TE缓冲液(1mM EDTA，10mM Tris/HCl，PH8.0)洗涤3-4次。最后一次洗完之后，琼脂糖珠用500ulTE缓冲液重悬，同时取出内参样品(用TE缓冲液补齐到500ul)。之后每管加入终浓度为50ug/ml的RNaseA，37℃消化30分钟。继续加入终浓度为0.25%的SDS液和终浓度为250g/ml的蛋白酶K，45℃水浴消化过夜。第二天将用品65℃水浴至少6小时后进行DNA回收。得到的样品用于PCR检测或定量PCR检测。相关特异性PCR引物为：

cccDNA-ChIP-for：5’>gtatttccctgctggtggc<3’(SEQ ID NO:10)；

cccDNA-ChIP-rev：5’>ggtgagtgattggaggttg<3’(SEQ ID NO:11)。

6、rcccDNA特异的PCR检测方法

应用Hirt法(参考Gao W等(2007)；J Virol.81:6164-74)抽提肝组织(200mg)细胞核游离的DNA分子，140,000rpm离心后以酚氯仿纯化上清溶液，应用2.5倍体积乙醇沉淀DNA分子，溶于100μl双蒸水中；取2μl产物作为模板进行常规PCR扩增，相关特异性引物分别位于5’Intron和3’Intron位置：

cccDNA-Intron-For：5’>AATAGAAACTGGGCTTGTCG<3’(SEQ ID NO:12)，

cccDNA-Intron-Rev：5’>GAGAGAAAGGCAAAGTGGAT<3’(SEQ IDNO:13)。

II.实施例

实施例1、Cre诱导rcccDNA的分子生物学模型

HBV基因组约3.2Kb，极为紧凑，在部分区域甚至是多读码框的重叠。值得注意的是HBV基因组转录过程中具有一些隐匿的RNA拼接位点，可能的生物学意义并不清楚。本发明人在HBV野生病毒基因组(ayw3亚型)HBsAg编码框nt202-203之间插入一段杂合的内含子序列(chimeric Intron)：包含5’Intron，LoxP-1，质粒复制的基本序列pUC Ori，抗生素筛选基因(Amp(R))，真核基因加尾信号(polyA processing site)，LoxP-2，以及3’Intron。

在重组酶Cre非诱导情况下，由于真核基因加尾信号的引入，HBV上游启动子起始的转录在该段杂合内含子序列内被终止，HBV基因组因此被阻断、不能够产生病毒复制和表达HBV包膜蛋白以及聚合酶蛋白等。

在重组酶Cre诱导下，杂合内含子中的两段LoxP位点发生重组，诱导重组cccDNA(rcccDNA)产生，其中包含HBV完整环状基因组的功能性内含子序列(如：来自pCI-neo的内含子、或来自人β2-microglobulin基因)。所述内含子能够在mRNA转录中被成功剪切，因此可以模拟野生cccDNA分子(图1)。

内置人工内含子序列来自于pCI-neo质粒(Promega公司)，拆分为5’Intron(供体序列)(88nts)和3’Intron(分枝序列和受体序列)(45nts)，经证实可以用于诱导rcccDNA。

内置人工内含子序列来自于pCI-neo质粒(Promega公司)，应用5’Intron(缩短为45nt)和3’Intron(45nts)获得的prCCCDNAs，与pCMV-Cre共转染体外培养肝细胞系，可有效表达HBV表面抗原，表明能够实现外源性缩短内含子的有效拼接，同样可用于诱导rcccDNA。

内置人工内含子序列来自于人β2-microglobulin基因，插入到HBV表面抗原基因区nt2765-2766，构建的质粒转染HepG2细胞，抽提病毒mRNA、对其反转录的cDNA进行测序，表明外源性内含子可被成功拼接，如图7。

后续实施例中，如非特别说明，应用的均是来自于pCI-neo质粒的内含子构建prcccDNA，即5’Intron(88nts)和3’Intron(45nts)。

实施例2、基于重组酶Cre的rcccDNA的表达和病毒复制

基于实施例论述的策略，本发明人构建了prcccDNA(图1B)。应用prcccDNA和重组酶Cre表达质粒(pCMV-Cre)体外转染HepG2细胞。以转染payw1.3和单独转染prcccDNA的同种细胞为对照。应用常规的酶联免疫(ELISA)方法检测HBV分泌抗原的存在情况。

结果，在转染后HepG2细胞的培养上清中分别检测到HBV分泌抗原HBeAg，HBsAg和LHBsAg(图2A)。而在单独转染prcccDNA的细胞培养液中HBsAg和LHBsAg均为阴性。这一实验证实，内置LoxP杂合内含子在HBV基因组能够被有效转录拼接。

进一步，本发明人应用上述体外转染实验检测prcccDNA相关的病毒复制。细胞转染第4天抽提细胞浆内病毒DNA，应用HBV特异性探针进行DNA杂交分析(Southern)。如图2B(上图)所示，Cre能够成功诱导基于prcccDNA转染的HBV复制DNA中间体，这一结果与普通1.3拷贝HBV编码质粒(payw1.3)转染实验相一致。转染细胞总RNA的杂交分析(Northern)显示Cre诱导的3.5kb和2.1/2.4kb完整的病毒转录本，如图2B(下图)所示。

同样，本发明人应用DNA体外转染实验对细胞核内的HBV复制形式进行分析。如图2C(上图)所示，Cre诱导prcccDNA发生重组，在野生cccDNA电泳迁移位置(泳道7，7’)显示特异性rcccDNA条带。该rcccDNA能够耐受85℃高温处理，并在EcoRI或HindIII单酶切处理后线性化(与野生HBV DSL中间位置一致，图2C下图)。

这一结果进一步证实，Cre诱导的rcccDNA具有与野生cccDNA一致的分子生物学特征。

实施例3、rcccDNA的表观遗传学修饰

cccDNA作为HBV感染细胞内的微小染色体，其表位遗传学分析是近年来HBV研究领域的热点。本发明人通过对细胞核抽提物抗体特异性的染色体免疫沉淀(ChIP)分析，证实rcccDNA具有与野生HBV cccDNA相似的表观遗传学修饰，能够特异性结合HBV core蛋白、X蛋白，宿主乙酰化组蛋白3(AcH3)，组蛋白4(H4)及其乙酰化形式(AcH4)，并结合HDAC。

如图3所示，应用特异性引物PCR可区分不同长度的rcccDNA和wtcccDNA，显示两者都显著结合乙酰化的H3、H4组蛋白。

实施例4、小鼠尾静脉高压注射的rcccDNA的表达和病毒复制

本发明人进一步应用DNA尾静脉高压注射策略，在体内水平对rcccDNA的表达和病毒复制进行验证。肝组织免疫荧光染色分析显示(图4A)，应用prcccDNA(8μg)和pCMV-Cre共同尾静脉高压注射C57BL/6小鼠，能够诱导HBV病毒抗原的高效表达。这种体内DNA转染策略通常导致约4-8%的阳性感染细胞。

应用prcccDNA尾静脉高压注射Alb-Cre转基因小鼠(肝细胞内特异性表达Cre重组酶)，通过Southern杂交能够检测到小鼠肝脏细胞中显著的病毒复制，由细胞核抽提物中同样观察到rcccDNA的形成(注射后第3天，图4B)。基于尾静脉高压注射的rcccDNA在注射后第7天消失，显示rcccDNA在肝脏的代谢动力学特征(图4C，上图)。

另一方面，考虑到常规Southern杂交过程相对复杂，本发明人基于rcccDNA杂合内含子的拼接发展了rcccDNA特异的PCR检测方法，能够准确鉴定和定量rcccDNA，并特异性区分prcccDNA质粒以及HBV DNA复制中间体的污染。设计引物分别位于rcccDNA内置的杂合内含子的5’Intron和3’Intron中，可以rcccDNA为模板特异性扩增约143bp的DNA产物(图4C，下图)。HBV复制中间体中由于内含子序列被有效拼接，因此不能作为模板扩增这一片段；同样，未经过Cre有效重组的prcccDNA质粒也不能扩增143bp目标产物。

慢性乙型肝炎实际反映了机体不充分的抗病毒免疫效应，以及这一效应对肝组织持续的病理损伤。本发明人因此对基于小鼠尾静脉高压注射rcccDNA的T细胞应答特征进行分析。应用编码HBV抗原的DNA表达质粒(如编码外膜蛋白的pCMV-S2S，或编码病毒核心抗原的pCMV-Core)肌肉注射C57BL/6小鼠，能够诱导显著的抗原特异性T细胞应答(脾细胞IFNγ和TNFα染色，图5A)，表明HBV病毒抗原具有显著的免疫原性。应用尾静脉高压注射prcccDNA(8μg，Alb-Cre小鼠)同样可以激活肝脏中显著的T细胞应答，然而，尽管特异性肽段刺激IFNγ产生但仅产生很少量的TNFα，提示基于prcccDNA的尾静脉高压注射仅诱导不完全的T细胞应答(图5B)。应用五聚体(pentamer)染色的分析提示，prcccDNA尾静脉高压注射诱导肝脏中表面抗原特异性T细胞(Env353)，然而这群特异性细胞同时高表达共抑制分子PD-1(图5C)，上述实验结果与肝脏作为免疫耐受器官的特征，以及cccDNA可能作为病毒持续感染标志的特征非常一致。

本发明人进一步应用不同剂量(4-16μg)的prcccDNA尾静脉高压注射小鼠，尽管都显示显著的病毒抗原血症，但较低剂量的prcccDNA注射并不诱导显著的(IFNγ⁺)T细胞应答(图5D)。

实施例5、rcccDNA尾静脉高压注射C57BL/6小鼠诱导HBV的持续性感染

由以上实验结果提示，rcccDNA诱导不完全功能的T细胞免疫应答，因此可能作为rcccDNA诱导HBV持续感染的理论依据。本发明人因此应用低剂量的prcccDNA(4μg)以及pCMV-Cre(4μg)共注射C57BL/6小鼠，以诱导HBV的持续性感染。如图6A所示，尾静脉高压注射prcccDNA/pCMV-Cre诱导HBsAg抗原血症>63天。同时，伴随病毒抗原持续表达，小鼠血清转氨酶水平也表现持续轻度增加。

有意义的是，应用普通1.3拷贝HBV编码质粒(payw1.3)的尾静脉高压注射，抗原持续表达通常限制在14天内。本发明人因此对基于尾静脉高压注射的payw1.3和prcccDNA(共注射pCMV-Cre)的体内病毒复制进行分析，显示环状单拷贝的rcccDNA的复制显著弱于线性1.3拷贝的HBV基因组(payw1.3)(图6B，1/3×pawy1.3转染细胞抽提DNA vs1×prcccDNA转染细胞抽提DNA)。

实施例6、抑制小鼠CD1d的表达对于肝脏内HBsAg持续表达的作用

CD1d是人类白细胞表面的抗原分子，它可以将脂质抗原递呈给天然杀伤T细胞(NKT)使其激活。近年来的研究表明，HBV感染能够显著激活NKT细胞，并进一步调控特异性CD8+T细胞应答(见Zeissig S等，2012；NatureMedicine)。因此，本发明人设计小鼠CD1d基因特异性的shRNA，通过尾静脉高压注射(共注射的方法)，在HBV感染细胞(in situ)抑制CD1d的表达，下调HBV特异性免疫应答，促进病毒持续性感染。

实验方法：

选择3-4周龄的C57/B6雄性老鼠作为实验对象，购于斯莱克公司。具体实验路线如下：

1、对这些老鼠尾静脉高压注射1.5mL含有共12ug的质粒(4μgprCCCDNA，4μg pCMV-Cre，以及4μg pLKO.1-shCD1d)的生理盐水缓冲液，注射在5秒钟内完成。pLKO.1-shCD1d编码小鼠CD1d特异性shRNA参照Sigma网站上已经验证过的序列顺序，正义链是5’-CCGGCGTCTTCATAGTACTGATCATCTCGAGATGATCAGTACTATGAAGACGTTTTTG-3’(SEQ ID NO:8)，反义链是5’-AATTCAAAAACGTCTTCATAGTACTGATCATCTCGAGATGATCAGTACTATGAAGACG-3’(SEQ IDNO:9)。合成DNA单链片段经95℃变性、退火后，克隆到相应的pLKO.1(Sigma)载体AgeI和EcoRI位点之间。

2、分别在注射后的每个星期采血，收集血清，保存于-20℃。

3、对血清HBV表面抗原(Abbott公司荧光定量分析)和血清谷丙转氨酶进行分析。

结果如图8，通过尾静脉共注射特异性抑制小鼠CD1d的shRNA表达质粒，能够诱导HBV在小鼠肝脏中的长期表达，显示HBsAg持续表达至少大于23周。

总结

总结以上研究内容，首先，本发明人在体外和体内水平建立了rcccDNA的分子生物学模型；其次，基于rcccDNA发展了HBV持续性感染的小鼠实验模型。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (17)

1.一种用于形成重组的乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供一种构建物，所述构建物包括乙型肝炎病毒基因组序列，该乙型肝炎病毒基因组序列中插入一段外源的内含子序列，该内含子序列包括5’端拼接供体序列、3’端分枝点信号序列及拼接受体序列；并且，在5’端拼接供体序列与3’端分枝点信号序列及拼接受体之间，按照5’→3’依次包括质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列，所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列两端设置位点特异性重组元件；

(2)将(1)的构建物转染肝细胞，诱导所述的位点特异性重组元件以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列，从而在肝细胞内形成重组的乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的内含子序列：

(a)插入于乙型肝炎病毒前基因组的非转录调控区；和

(b)插入于5’AAGG3’或5’CAGG3’序列中第3位碱基与第4位碱基之间。

3.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的5’端拼接供体序列包括：人β-globin基因第一内含子序列的5’端拼接供体序列，或人β2-microglobulin基因的第二内含子序列的5’端拼接供体序列；和/或

所述的3’端分枝点信号序列及拼接受体序列是免疫球蛋白重链基因内含子的3’端分枝点信号序列及拼接受体序列；或人β2-microglobulin基因的第二内含子序列的3’端分枝点信号序列及拼接受体序列。

4.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的质粒复制序列是pUCOri；和/或

所述的真核基因加尾信号是牛生长激素因子基因的polyA加尾信号序列。

5.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的位点特异性重组元件包括：

LoxP，且应用Cre重组酶诱导LoxP以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列；或

FRT，且应用FLP重组酶诱导FRT以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的构建物是表达载体。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：将(1)的构建物体外转染肝细胞，或施用于动物，诱导所述的位点特异性重组元件以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列，从而在肝细胞内形成重组的乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的动物是鼠，所述的施用为尾静脉高压注射。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，还包括共转下调CD1d表达的抑制分子。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的下调CD1d表达的抑制分子是特异性干扰CD1d表达的shRNA。

11.一种用于形成乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子的构建物，其特征在于，所述构建物包括乙型肝炎病毒基因组序列，该乙型肝炎病毒基因组序列中插入一段外源的内含子序列，该内含子序列包括5’端拼接供体序列、3’端分枝点信号序列及拼接受体序列；并且，在5’端拼接供体序列与3’端分枝点信号序列及拼接受体之间，按照5’→3’依次包括质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列，所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列两端设置位点特异性重组元件。

12.如权利要求11所述的构建物，其特征在于，所述的内含子序列：(a)插入于乙型肝炎病毒前基因组的非转录调控区；和(b)插入于5’AAGG3’或5’CAGG3’序列中第3位碱基与第4位碱基之间；和/或

所述的内含子序列插入于乙型肝炎病毒基因组nt202-203之间或nt2765-2766之间；和/或

所述的5’端拼接供体序列包括：人β-globin基因第一内含子序列的5’端拼接供体序列，或人β2-microglobulin基因的第二内含子序列的5’端拼接供体序列；和/或

所述的3’端分枝点信号序列及拼接受体序列是免疫球蛋白重链基因内含子的3’端分枝点信号序列及拼接受体序列；或人β2-microglobulin基因的第二内含子序列的3’端分枝点信号序列及拼接受体序列；和/或

所述的质粒复制序列是pUC Ori；和/或

所述的真核基因加尾信号是牛生长激素因子基因的polyA加尾信号序列；和/或

所述的位点特异性重组元件包括：LoxP，且应用Cre重组酶诱导LoxP以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列；或FRT，且应用FLP重组酶诱导FRT以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列。

13.权利要求11或12所述的构建物的用途，其特征在于，用于形成乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子；或用于制备乙型肝炎病毒持续感染的动物模型。

14.一种用于形成乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子的系统(如试剂盒)，其特征在于，所述系统包括：

(a)权利要求11或12所述的构建物；和

(b)诱导所述的位点特异性重组元件以进行基因敲除的物质。

15.如权利要求14所述的系统，其特征在于，所述系统还包括：下调CD1d表达的抑制分子；较佳地，所述的下调CD1d表达的抑制分子是特异性干扰CD1d表达的shRNA。

16.权利要求14所述的系统的用途，其特征在于，用于形成乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子；或用于制备乙型肝炎病毒持续感染的动物模型。

17.一种重组细胞，其特征在于，所述细胞中转化有权利要求11或12所述的构建物以及诱导所述的位点特异性重组元件以进行基因敲除的物质，能够形成乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子。