TWI503413B - 用於ｂ型肝炎病毒相關疾病之非人類動物疾病模式 - Google Patents

用於ｂ型肝炎病毒相關疾病之非人類動物疾病模式 Download PDF

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Description

用於B型肝炎病毒相關疾病之非人類動物疾病模式
本發明大體上係關於一種動物疾病模式，且更特定言之係關於用於B型肝炎病毒相關疾病之非人類動物模式，及其製造及使用方法。
本申請案主張2009年12月4日申請之美國臨時申請案第61/266,519號之優先權，該案以全文引用的方式併入本文中。
全世界有4億人慢性感染HBV，且HBV導致在此等患者發生包括肝硬化及肝細胞癌(HCC)之嚴重肝併發症的高發病率。在全世界，HCC為造成死亡之主要原因，且為最難以治療之癌症之一，僅有一小部分患者可經治療而治癒。
咸信HBV自身並不具有高度細胞病變，且慢性肝損傷及HCC發展係繼發於抗病毒細胞免疫反應。然而，因缺乏適宜之小動物模式而阻礙對HBV相關肝病之免疫病理機制的瞭解。黑猩猩雖然易感染HBV，但僅出現輕度肝發炎反應，且其在實驗室研究中之進一步應用因倫理及財力方面之考慮而受限。在土撥鼠、地松鼠及鴨中進行HBV相關病毒之研究雖然提高吾人對HBV病毒學之認識且促進抗病毒劑之研發，但未能使HBV免疫病理學被更好地瞭解。類似地，HBV轉殖基因小鼠雖然自染色體整合病毒基因組產生感染性HBV，但其對病毒抗原具有中樞耐受性且不發展肝病。後續系統的改進包含向免疫功能正常之小鼠注射含有全長HBV基因組之質體，引起肝中暫時或長期HBV複製，但僅僅引起有限之肝炎。將未接觸抗原之脾細胞授受性轉移至嚴重複合型免疫缺乏症背景下之HBV轉殖基因小鼠中，可產生丙胺酸轉胺酶(ALT)含量波動之慢性肝炎，但該肝病為輕度的，且可能因宿主內缺乏HBV特異性T細胞之再生而不進展為HCC。
因此，急需在免疫功能正常之動物中產生一種慢性HBV疾病模式，以幫助闡明慢性HBV疾病之因果關係。
在一態樣中，本發明係關於一種用於B型肝炎病毒相關肝病之非人類動物疾病模式，其中該動物疾病模式包含其肝細胞中之B型肝炎病毒基因組且顯示以下症狀：a)血清中有B型肝炎病毒粒子；b)血清中有B型肝炎病毒DNA；c)血清中有B型肝炎病毒(HBV)包膜蛋白及HBV e蛋白；及d)在肝中表現B型肝炎病毒(HBV)核心蛋白及HBV包膜蛋白，但其腎、心臟、肺、腦、胰、脾、胃或腸組織中不表現。
在本發明之一實施例中，B型肝炎病毒基因組係藉由包含B型肝炎病毒基因組DNA插入物之腺相關病毒載體(AAV)轉導至肝細胞中。
在本發明之另一實施例中，B型肝炎病毒基因組係藉由兩個各攜帶HBV基因組之不同片段的腺相關病毒(AAV)載體轉導至肝細胞中，在肝細胞中一起產生功能性HBV基因組。
在本發明之另一實施例中，上述用於B型肝炎病毒(HBV)相關肝病之非人類動物疾病模式另外在血清中顯示至少一種以下血清學及免疫反應：a)B型肝炎病毒包膜抗原；b)B型肝炎病毒e抗原；及c)相較於肝細胞中沒有B型肝炎病毒基因組之對照動物，肝及/或脾中B型肝炎病毒包膜特異性CD8+T細胞增加。
在本發明之另一實施例中，上述用於B型肝炎病毒(HBV)相關肝病之非人類動物疾病模式另外顯示如下慢性B型肝炎之血清學狀況：a)抗B型肝炎病毒包膜抗體呈陰性；b)抗B型肝炎病毒e抗體呈陰性；及c)抗B型肝炎病毒核心抗體呈陽性。
另外，在本發明之另一實施例中，上述用於B型肝炎病毒(HBV)相關肝病之非人類動物疾病模式另外顯示至少一種以下免疫病理反應：a)肝組織中有發炎性浸潤；b)肝組織中有有絲分裂；c)肝細胞中有嗜酸性核包涵體；d)肝細胞中有B型肝炎病毒核心蛋白之表現；e)肝細胞中有B型肝炎病毒包膜蛋白之表現；及f)相較於對照動物中沒有B型肝炎病毒基因組之肝細胞，丙胺酸轉胺酶含量增加。
在本發明之另一實施例中，B型肝炎病毒相關肝病為肝細胞癌，且動物疾病模式顯示至少一種下示之肝病理變化：a)肝腫瘤結節；b)肝組織中纖維蛋白原呈陽性；c)肝細胞變性；d)肝中有發炎性浸潤物；e)肝細胞壞死；f)肝纖維化；及g)相較於沒有B型肝炎病毒基因組之對照動物，丙胺酸轉胺酶含量增加。
在本發明之另一實施例中，上述用於B型肝炎病毒(HBV)相關肝病之非人類動物疾病模式為齧齒動物。齧齒動物可為選自BALB/c、ICR、C57BL/6及FVB品系之小鼠。
在本發明之另一實施例中，上述用於B型肝炎病毒(HBV)相關肝病之非人類動物疾病模式為免疫功能正常之動物。
在本發明之另一實施例中，上述用於B型肝炎病毒(HBV)相關肝病之非人類動物疾病模式之生殖系不包含B型肝炎病毒基因組。
在另一態樣中，本發明係關於一種用於肝細胞癌之非人類動物疾病模式，其包含在肝細胞中之一B型肝炎病毒基因組且顯示至少一種以下症狀：a)肝腫瘤結節；b)肝細胞變性；c)肝中有發炎性浸潤物；d)肝細胞之脂肪變性及壞死；e)肝纖維化；及f)相較於沒有B型肝炎病毒基因組之對照動物，丙胺酸轉胺酶含量增加。
另外，在另一態樣中，本發明係關於一種產生如上所提及之用於B型肝炎病毒相關肝病之非人類動物疾病模式的方法。該方法包含：a)獲得非人類動物；及b)向該動物投與包含以下之組合物：包含B型肝炎病毒之5'基因組DNA片段之第一腺相關病毒載體、及包含B型肝炎病毒之3'基因組DNA片段之第二腺相關病毒載體；及c)使動物發展與B型肝炎病毒相關肝病相關聯之症狀。
在本發明之一實施例中，上述投與步驟可替換為：向該動物投與包含具有B型肝炎病毒基因組DNA之腺相關病毒載體的組合物。
在本發明之另一實施例中，上述方法中之非人類動物為免疫功能正常之小鼠。
另外，在另一態樣中，本發明係關於一種篩檢有效治療B型肝炎病毒相關肝病之治療劑的方法，其包含：a)提供如上所提及之用於B型肝炎病毒相關肝病之非人類動物疾病模式；b)向該動物疾病模式投與欲測試治療效力之藥劑；及c)確定該藥劑是否有效治療B型肝炎病毒相關肝病。
在本發明之一實施例中，本發明係關於一種篩檢有效治療肝細胞癌之治療劑的方法，其包含：a)提供如上所提及之用於肝細胞癌之非人類動物疾病模式；b)向該動物疾病模式投與欲測試治療效力之化合物；及d)確定該化合物是否有效治療肝細胞癌。
 定義
在本發明之上下文中及在使用各術語之特定上下文中，本說明書中所用之術語一般具有其在此項技術中之通常含義。下文或本說明書中其他地方將討論用以描述本發明之某些術語，以向從業者提供有關本發明描述之額外指導。為方便起見，某些術語可能例如使用斜體及/或引號突出顯示。使用突出顯示對術語之範疇及含義無影響；在相同上下文中，術語之範疇及含義為相同的，無論其是否突出顯示。應瞭解，同一事情可以一種以上方式來闡述。因此，對於任一個或多個本文所討論之術語，可使用替代語言及同義詞，無論術語在本文中是否經詳細闡述或討論，其均不具有任何特殊意義。提供某些術語之同義詞。陳述一個或一個以上同義詞不排除使用其他同義詞。本說明書中任何地方之實例(包括本文所討論之任何術語之實例)的使用僅為說明性的，且決不限制本發明或任何例示術語之範疇及含義。同樣，本發明不侷限於本說明書中所提供之各個實施例。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語的含義均與一般熟習本發明所屬技術者通常瞭解之含義相同。在發生衝突之狀況下，將以本發明，包括定義為準。
如本文所用，「大約」、「約」或「大致」一般意謂既定值或範圍之20%內，較佳10%內，且更佳5%內。本文中所給之數值量為近似值，意謂若未明確闡述，則可推斷術語「大約」、「約」或「大致」。
本發明關於使用腺相關病毒(AAV)反式拼接技術將B型肝炎病毒(HBV)成功轉導至免疫功能正常之小鼠中之發現。(Lai等人，(2006)「Synthetic intron improves transduction efficiency of trans-splicing adeno-associated viral vectors」Hum Gene Ther 17 ,1036-1042；Lai等人，(2005)「Efficient in vivo gene expression by trans-splicing adeno-associated viral vectors」Nat Biotechnol 23 ,1435-1439)。此等AAV/HBV轉導之小鼠不僅展現持久性HBV DNA及蛋白質表現，且亦展現HBV特異性T細胞特別富集於肝中，從而導致肝發炎及再生且最終發展成HCC。AAV/HBV誘發之肝細胞癌(HCC)模式可適用於研究HBV慢性疾病之免疫病理機制及研發新的HCC治療策略。
基於安全性考慮，使用如上所提及之反式拼接技術，亦即使用兩個AAV載體。實際上，可使用一個AAV載體攜帶整個HBV基因組，推測其將具有更佳轉導作用。
實例
不意欲限制本發明之範疇，下文將給出根據本發明實施例之例示性儀器、裝置、方法及其相關結果。注意，為方便讀者，實例中可使用標題或副標題，該等標題或副標題決不限制本發明之範疇。另外，本文提出及揭示某些理論；然而，其無論對錯均決不限制本發明之範疇，只要根據本發明，不考慮任何特定理論或行動方案實施本發明即可。
材料與方法
構築及產生AAV載體。 將含有1.3倍長度的HBV基因組(基因型D)之質體pHBV1.3(圖1A)在核苷酸2192與2193之間的CAG/G位點裂解，且藉由PCR插入高度保守之合成內含子(Lai等人，(2006)「Synthetic intron improves transduction efficiency of trans-splicing adeno-associated viral vectors」Hum Gene Ther 17 ,1036-1042)。5'-HBV供體片段(2214 bp)及3'-HBV受體片段(1976 bp)之引子對為5'-AAAAAGCTTATGTATTCAATCTAAGCAG-3'(SEQ ID NO: 1)、5'-TTTCTCGAGTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACTTACCTGAACTGGAGCCACCAGC-3'(SEQ ID NO: 2)及5'-AAAGAATTCCTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGAACAGTAAACCCTGTTCTG-3'(SEQ ID NO: 3)、5'-TTTGTCGACTACTGAAGGAAAGAAGTCAG-3'(SEQ ID NO: 4)。供體HBV片段之反向引子含有來自人類β-球蛋白基因中第一內含子之內含子供體序列，而受體HBV片段之正向引子含有來自人類免疫球蛋白重鏈基因之內含子受體序列。將此兩個PCR產物次選殖至在兩端含有AAV血清型2之倒轉末端重複序列的pAAV-MCS載體(Stratagene)中，以產生質體pAAV5'-HBV-SD及pAAV-3'-HBV-SA。表現綠色螢光蛋白(GFP)之pAAV-GFP質體由Dr. Jin-Jer Cheng(台灣台北中央研究院)贈予。攜帶5'-HBV-SD、3'-HBV-SA或GFP編碼序列之假型AAV8載體由三重轉染法產生且由CsCl沈降來純化。對照組AAV8/GL2載體為針對螢火蟲螢光素酶轉錄物之小髮夾RNA，此AAV8/GL2已於之前文獻中提及。藉由定量PCR評定實際載體力價。值得注意的是，反式拼接技術對於攜帶病毒基因組超過5 kb之病毒，諸如C型肝炎病毒而言具有重要意義。然而，在科學上，反式拼接技術並非B型肝炎病毒研究所需。此研究中使用反式拼接技術之唯一原因在於遵循機構規定之要求。
動物。 BALB/c、C57BL/6及FVB小鼠購自國家實驗動物繁殖及研究中心(National Laboratory Animal Breeding and Research Center)(台灣，台北)。ICR小鼠購自BioLASCO(台灣，宜蘭)。C57BL/6/HBV轉殖基因小鼠譜系係藉由在C57BL/6遺傳背景下與含有1.3倍HBV基因組之ICR/HBV轉殖基因小鼠配種10代以上來獲得。所有動物均飼養在中央研究院生物醫學科學研究所(Institute of Biomedical Sciences)動物實驗室之特定無病原體環境中。所有實驗程序均遵循實驗動物照顧與使用之中央研究院IACUS及農業委員會指南(Academia Sinica IACUS and Council of Agriculture Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals)。
AAV注射 。所有小鼠在6至8週齡時均靜脈內注射指定力價之AAV/5'-HBV-SD與AAV/3'-HBV-SA(AAV/HBV)。注射AAV/GFP或AAV/GL2之小鼠用作陰性對照。血清及組織樣品在AAV注射後不同時間收集。
PCR 。對於HBV 定量，使用QuickGene-810自動化核酸分離系統(FUJIFILM,Japan)萃取血清HBV DNA，再以敏感性雜交探針為基礎之即時PCR來定量。HBV DNA之PCR引子對為5'-CTCCACCAATCGCCAGTC-3'(SEQ ID NO: 5)及5'-ATCCTCGAGAAGATTGACGATAAT-3'(SEQ ID NO: 6)。3'-Fluoscein標記供體及5'-Red640標記受體探針為5'-CATGGCCTGAGGATGAGTGTTTCT CA-3'(SEQ ID NO: 7)及5'-AGGTGGAGACAGCGGGGTAGG-3'(SEQ ID NO: 8)(LightCycler FastStart,Roche Diagnostics)。質體pHBV1.3經10倍稀釋製備(每毫升1.33×103 至1.33×109 複本)，以產生平行PCR反應物中之標準曲線。
血清學分析。 使用Elecsys Systems電致化學發光套組及Cobase分析儀(Roche Diagnostics GmbH)定量HBV之血清標記物(HBs、HBe、抗HBs、抗HBe及抗HBc)。
電子顯微法。 藉由在4℃下於287,730 g下超速離心12小時，以10%蔗糖梯度濃縮血清樣品中之粒子。將濃縮之離心塊再懸浮於50 mM Tris-150 mM NaCl(pH 7.4)緩衝液中，在經碳塗佈之柵格上用2%醋酸鈾醯負染色，且藉由透射電子顯微法使用在75 kV下操作之Tecnai G2 Spirit TWIN(FEI Company,USA)來檢查。
IFN-γ ELISPOT分析法。 在指定實驗時間點，自注射AAV/HBV及AAV/GFP之小鼠中分離脾細胞及肝內淋巴細胞(IHL)進行IFN-γ ELISPOT分析法。根據製造商說明書，使用小鼠IFN-γ ELISPOT Ready-Set-Go套組(eBioscience)。簡言之，在預塗佈抗IFN-γ捕捉抗體之MultiScreen-IP板(Millipore)上，將使用小鼠CD8a微珠(Miltenyi Biotec)自IHL及脾細胞正選擇之CD8+ T細胞(每孔4×105 至2×105 個)與經由10 μg/ml胜肽進行脈衝之EL-4細胞一起培養。此分析法中使用三個H-2Kb 限制性HBV抗原決定基，即位於包膜中之HBs190及HBs208以及HBc中之HBc93。陰性對照為OVA257胜肽(一種H2-Kb 限制性卵白蛋白抗原決定基)及無胜肽兩組，陽性對照為以4 μg/ml之刀豆球蛋白A(Concavalin A)進行刺激。依次使用針對IFN-γ之生物素標記抗體、抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶(HRP,streptavidin-horseradish peroxidase)、3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)受質使斑點在18至24小時後顯影，且使用具有軟體5.0之AID ELISPOT讀數系統(AID Gm bH)計數。
組織學及免疫組織化學。 將甲醛固定及石蠟包埋之肝組織切成5 μm切片，黏著，熱固定在玻璃載片上，且進行蘇木精-曙紅(H&E)染色以進行一般組織學檢驗、進行天狼星紅染色以進行膠原蛋白纖維分析、及進行地衣紅染色以進行反映HBs沈積之細胞質內包涵體分析。對於免疫組織化學染色，除去組織切片之石蠟，將其浸於標靶修復溶液(TRS，pH 6.1，DAKO)中，且在微波烘箱中照射(500 W)15分鐘。接著用3%過氧化氫處理組織切片以阻斷任何內源性過氧化酶，且用M.O.M.小鼠免疫球蛋白阻斷試劑(Vector Laboratories)阻斷。所用一次抗體為小鼠抗HBs(純系3E7)、兔抗HBc、兔抗纖維蛋白原、及小鼠抗PCNA(純系PC10)(均得自DAKO)。接著洗滌切片，且與相應辣根過氧化酶結合之二次抗體一起培育。徹底洗滌後，將切片浸在DAB(Sigma-Aldrich)或AEC(Sigma-Aldrich)中，且用蘇木精對比染色。對於發炎、有絲分裂及PCNA指數之定量分析，在100倍放大率下每個載片隨機拍攝22至25個影像，使用ScanScope CS數位載片掃描儀(Aperio Technologies Inc)觀察且使用ImageScope程式分析。
統計 。所有資料均由史都登氏t檢驗(Student's t test)分析顯著性。認為p 值<0.05為顯著的。
結果 藉由反式拼接AAV載體產生HBV
因為已知小鼠肝細胞支持HBV複製，所以推測小鼠HBV感染失敗係因為小鼠肝細胞上缺乏HBV受體。為繞過HBV感染之此進入步驟，使用親肝性AAV血清型8載體(AAV8)以將HBV基因組引入小鼠肝細胞中。為提高操作安全性，應用AAV反式拼接技術產生兩個獨立AAV載體，即AAV/5'-HBV-SD及AAV/3'-HBV-SA，各自攜帶大致一半側接供體或受體拼接序列之HBV基因組(圖1A)。假設共同投與此兩個載體會在在細胞內形成頭尾相接的分子間疊接作用，並使重組的HBV基因組進行轉錄與拼接，以產生功能性HBV前基因組RNA及訊息RNA(圖1B)。
向雄性BALB/c小鼠(6至8週齡)以靜脈注射方式(i .v .)共同注射等量AAV/5'-HBV-SD及AAV/3'-HBV-SA(下文表示為AAV/HBV)，各載體在每隻小鼠1010 至3×1012 之載體基因組(vg)範圍內(每次給藥5隻小鼠)，在血清中產生的HBV DNA(圖2A)具有劑量相關性，且電子顯微法顯示血清中存在感染性丹恩粒子(Dane particle)(圖2B)。相比之下，注射鹽水或注射表現綠色螢光蛋白之對照AAV8載體(AAV/GFP)(每隻小鼠之注射劑量為2×1012 vg)的小鼠，其血清中不產生可偵測之HBV DNA。肝組織之免疫組織化學分析揭示，HBV核心(HBc)及包膜(HBs)蛋白在注射AAV/HBV載體之小鼠中表現，但不在經AAV/GFP轉導之小鼠中表現；雖然在圖2C中展示1012 vg組之資料，但類似結果可在所有組中獲得。1012 vg之劑量用於所有隨後實驗中。HBV蛋白質表現可見於肝中，但未見於其他8個所檢查之器官中(圖3)，此反映HBV及AAV8載體之肝趨向性特徵。因為裂解位點位於HBV preS1/S2/S及聚合酶開放閱讀框架內(圖1A)，所以結果表明，AAV基因組之頭尾相接分子間重組發生在共轉導之肝細胞中，且致使產生完整功能性HBV基因組及蛋白質。
為檢驗遺傳背景是否影響藉由AAV介導之HBV感染產生HBV，向三個近親品系(C57BL/6[n=10]，FVB[n=10]，及BALB/c[n=15])及一個遠親品系(ICR[n=10])小鼠靜脈內注射AAV/HBV。所有用於此實驗中之小鼠均為雄性。四種不同小鼠品系之每隻小鼠在注射AAV/HBV後4週均顯著的變成HBV陽性(圖2D )。BALB/c及ICR小鼠產生之血清HBV含量(平均力價分別為每毫升6.1×105 及1.0×106 基因組複本[gc])高於C57BL/6及FVB小鼠(平均力價分別為6.6×104 及1.5×105 gc/ml)。
由AAV/HBV轉導誘發之HBV血清學及免疫反應
接著檢驗AAV/HBV轉導後之病毒學及免疫學特徵。所有隨後實驗均對C57BL/6小鼠進行，因為此小鼠品系通常用以產生具有選擇性免疫缺失之遺傳工程改造小鼠，此對於吾人正在進行之有關此動物模式之免疫病理的機制研究而言具有重要意義。向小鼠靜脈內注射AAV/HBV(n=4)或AAV/GFP(n=4)一次，接著8週後收集血清樣品，且測試HBV蛋白質及HBV特異性抗體。在經AAV/HBV轉導之小鼠中偵測到大量HBs(平均力價為2541 IU/ml)及B型肝炎病毒e抗原(HBe，平均力價為691 U/ml)，但在對照AAV/GFP中未偵測到(圖4A)。AAV/HBV轉導之小鼠之抗HBs及抗HBe抗體呈陰性，但抗HBc抗體呈陽性(圖4A)。AAV/HBV轉導之小鼠中HBV血清學標記物之此概況類似於慢性B型肝炎患者中所觀測到之情況，且在AAV/HBV轉導後維持至少16個月(參見表1)。
縮寫：ND，未測定；TMTC，過多而難以計數
因為CD8+ T淋巴細胞被認為是慢性B型肝炎感染期間病毒控制及肝損傷之主要效應細胞，所以研究AAV/HBV轉導後HBV特異性CD8+ T細胞反應之動力學。向C57BL/6小鼠(一種具有主要組織相容性複合體H-2b 單純型之小鼠品系)靜脈內注射AAV/HBV或AAV/GFP，接著在不同時間分離肝內及脾內CD8+ T淋巴細胞(每個時間點n=4)，且使用IFN-γ ELISPOT分析法分析其對三種已知H-2Kb 限制性抗原決定基(兩種位於HBs中(HBs190、HBs208)及一種位於HBc中(HBc93))的反應。在轉導後一週，AAV/HBV轉導不誘發可偵測之HBs特異性(用HBs190與HBs208之組合測試)或HBc特異性CD8+ T細胞，但在第2週，在肝中觀測到顯著數目之HBs特異性CD8+ T細胞(圖4B、4D)，而脾中較少(圖4C、4E)，且肝(圖4F)與脾(圖4G)中HBs反應性CD8+ T細胞數目隨時間而減少。在8週觀測期中，來自AAV/HBV轉導之小鼠之CD8+ T細胞對HBc93抗原決定基或無關的H2-Kb 限制性卵白蛋白抗原決定基(OVA257)無反應。對照AAV/GFP轉導不會誘發CD8+ T細胞對任何胜肽之可偵測反應。
在AAV/HBV轉導之小鼠中誘發肝細胞癌
接著研究免疫功能正常之宿主中持久性HBV表現之長期病理性後果。如上所述，向C57BL/6小鼠靜脈內注射AAV/HBV(n=6)或AAV/GFP(n=5)。在整個20週觀測期期間，AAV/HBV轉導之小鼠產生相對穩定含量之血清HBV，其中平均力價在3×104 至2×105 gc/ml之間(圖5A)。AAV/HBV轉導之小鼠中血清ALT含量正常直至第8週，但在12至20週升高(超過野生型未處理小鼠中平均ALT值之兩倍，以水平虛線展示)(圖5B)，此表明此等小鼠中肝損傷隨時間累積。相比之下，對照AAV/GFP小鼠一直顯示正常ALT含量(圖5C)。
與ALT結果一致，在AAV轉導後8週及3個月，在AAV/HBV或AAV/GFP轉導之小鼠之肝中未觀測到顯著組織學變化(資料未展示)。轉導後6個月，觀測到AAV/HBV組(圖6B、6D)中肝組織學變化(發炎性浸潤及有絲分裂)顯著高於AAV/GFP組(圖6A、6C)。半定量分析揭示，AAV/HBV轉導之小鼠之肝中以顯微鏡計數之發炎性浸潤之平均數目顯著高於AAV/GFP轉導之小鼠(17.3±5.1相對於2.7±1.5，p =0.02)，有絲分裂細胞數目亦如此(10.0±3.5相對於1.7±0.6，p =0.03)(圖6G、6H)。AAV/HBV轉導之小鼠之肝中所含之“表現細胞增殖標記物增殖細胞核抗原”(PCNA)之肝細胞數目亦顯著高於AAV/GFP轉導之小鼠(39.3±4.0相對於10.5±0.7，p =0.003，圖6E、6F、6I)。AAV/HBV轉導之小鼠中，通常會觀測到嗜酸性核包涵體，其將核仁推向一邊，且導致核增大(圖7A)。免疫組織化學分析顯示，此等細胞對HBc呈正染色(圖7B)。如免疫組織化學及地衣紅染色所示，較少數目之肝細胞亦表現細胞質HBs(圖7C、D)。此等資料表明，AAV/HBV小鼠中持久性HBV表現會引起肝損傷，促進隨後的肝細胞再生。
為研究免疫功能正常小鼠中持久性HBV表現是否會導致HCC發展，向C57BL/6小鼠(n=12)靜脈內注射AAV/HBV，且在注射後12至16個月移除其肝進行宏觀及組織病理學分析。為評估抗HBV免疫對HCC發展之作用，向C57BL/6/HBV轉殖基因小鼠(n=13)(對HBV具有中樞免疫耐受性)靜脈內注射相同量之對照AAV8載體(AAV/GL2)(其編碼標靶螢光素酶轉錄物之小髮夾RNA)；此等HBV轉殖基因小鼠在血清中產生高力價之HBV DNA(圖8A)及蛋白質(HBs及HBe，圖8B)，且在肝及腎中對HBc呈正染色(圖8C)。
所有AAV/HBV轉導之小鼠(12隻中12隻，100%)在AAV/HBV轉導後12個月至16個月之間均形成宏觀可見之肝腫瘤結節(表1)。圖9A展示多個血管形成良好之腫瘤的實例(小鼠IF1123，AAV/HBV轉導後13個月)。顯微鏡檢查顯示，此等腫瘤具有獨特「結節套結節」外觀(圖9B)，其中於良好分化之HCC(T2區)內形成特徵為假腺至厚小樑圖案之不良或中度分化之HCC(T1區，圖9C)。其他大腫瘤(直徑>10 mm)亦診斷為中度至良好分化之HCC，特徵為假腺圖案(圖9D)、增加之細胞結構及核異型(圖9E)、缺乏肝門通道(圖9F)、及偶爾可見非典型肝細胞經肝門侵襲(圖9G)。有時在腫瘤區域中觀測到圓形雙染性細胞質包涵體(圖9H)，且其對纖維蛋白原呈現強陽性免疫反應(圖9H底部插圖)，類似於在一些人類HCC中發現之灰體結構。經由相鄰非腫瘤肝組織可見伴有多個肝細胞局灶性壞死之肝門及實質發炎性浸潤物(圖10A、10B)。顯著脂肪變性為非腫瘤區域中之常見特徵(圖10C)，有時其會顯示輕度至中度肝纖維化(圖10D)。免疫組織化學分析揭示周圍正常肝仍顯示HBs及HBc(圖11A、11C)，但有趣的是腫瘤組織中喪失此等HBV蛋白質表現(圖11B、11D)。相比之下，在13至19.5個月之觀測期期間中，AAV/GL2轉導之C57BL/6 HBV轉殖基因小鼠均未(13隻中0隻)形成可偵測之肝結節(表1)，且其肝不顯示明顯組織學變化(IF1226，AAV/GL2轉導後16個月，圖12A、12B)或僅顯示輕度不規則脂肪變性(IF1421，AAV/GL2轉導後15個月，圖12D、12E)。此時，此等轉殖基因小鼠仍顯示血清中有大量HBs及HBe(表1)且肝中有大量HBc(圖12C、12F)。大部分此等AAV/GL2轉導之HBV轉殖基因小鼠的血清ALT含量在正常範圍內，平均力價為55±26，而類似年齡且載有HCC之AAV/HBV轉導之小鼠中ALT含量顯著升高，平均力價為265±93(表1)。
討論
HCC為全世界癌症死亡率之第三大主要原因，且慢性HBV感染為發展此癌症之主要風險因素之一。雖然尚未完全瞭解HBV感染導致肝癌發生之分子機制，但有跡象表明，演化為HCC可能與HBV蛋白質之轉錄活性或HBV DNA整合之直接作用以及免疫介導之肝發炎、損傷及再生之間接作用相關。在轉殖基因小鼠研究中，雖然HBV大包膜蛋白或X蛋白使用人工強啟動子過度表現及累積可導致HCC發展，但此等轉殖基因動物中表現之病毒蛋白含量遠超過其為自然感染者，因此不能代表HCC之真實原因。含有整個HBV基因組，但在病毒自身啟動子及強化子之控制下產生病毒蛋白及HBV病毒粒子的轉殖基因小鼠在若干先前研究中未顯現病理變化或肝腫瘤發展。含有整個HBV基因組之轉殖基因小鼠可能因對HBV具有免疫耐受性而缺乏肝損傷及缺乏HCC發展，因為HBV特異性T細胞之授受性轉移會誘發此等轉殖基因小鼠中HCC之高發病率。Nakamoto等人，(1998)「Immune pathogenesis of hepatocellular carcinoma」J Exp Med 188 ,341-350。
臨床及實驗證據表明，慢性HBV感染中之肝細胞損傷主要由抗病毒免疫反應引起。就此而言，吾人之AAV/HBV轉導模式優於先前轉殖基因小鼠模式，因為吾人之模式可在免疫功能正常之宿主之肝中確立HBV病毒粒子的產生及HBV蛋白質的表現，其更接近地模擬自然HBV感染，而先前的動物模式則為自出生起即對HBV具有中樞免疫耐受性。實際上，吾人之資料顯示，AAV/HBV轉導誘發抗HBc抗體及產生大量HBs特異性IFN-γ之CD8+ T淋巴細胞(圖4B至4G)，該等抗體及CD8+ T淋巴細胞優先存在於標靶器官中，肝中數目為脾中數目之2至4倍。然而，即使肝中HBV特異性T細胞區域化(圖4B至4G)，此等T細胞亦不能自AAV/HBV轉導之肝細胞中清除HBV，其顯示HBV病毒粒子(圖2A、2B及4A)及HBV蛋白質(HBs、HBc及HBe)(圖2C及4A，表1)持久性表現1年以上，此為類似於慢性HBV患者中之研究結果的特徵。資料顯示，相較於HBV DNA免疫所誘發(資料未展示)，AAV/HBV轉導所誘發之細胞免疫反應相對微弱(圖4B至4G)，且可能由持久性存在HBV蛋白質而使細胞免疫反應受損，此由以下研究結果支持：HBs特異性T細胞數目在AAV轉導後兩週達到其峰值之後隨時間迅速減少(圖4F、4G)且從未偵測到針對其他HBV蛋白質(HBc)之T細胞。初步資料顯示，此等小鼠中肝CD8+ T細胞中抑制受體程式死亡1(PD-1)之表現增加且伴有肝組織中其配位體PD-L1之表現增加(資料未展示)，據此認為PD-1/PD-L1相互作用可能在損傷此等HBV特異性T細胞之功能(亦在慢性HBV患者中觀測到之現象)中起作用。吾人提出，此等功能上受損之HBV特異性T細胞雖然無法自肝中完全清除HBV，但會引發肝損傷及肝再生，從而導致進行性肝病。AAV/HBV轉導之小鼠中ALT含量(圖5B)及進行有絲分裂及表現PCNA之肝細胞數目高於AAV/GFP轉導之小鼠(圖6)支持此假設。
顯著地，在AAV/HBV轉導後12個月至16個月之間，所有小鼠均形成肝腫瘤結節(12隻中12隻)，顯現肝細胞病變(12隻中2隻)或HCC(12隻中10隻)之病理特徵(圖9及表1)。相鄰非腫瘤肝組織亦為組織學異常的，常顯示發炎性浸潤物、脂肪變性及局灶性壞死(圖10)。有時亦觀測到輕度至中度肝纖維化。相比之下，相同C57BL/6背景下經相同量之對照AAV/GL2載體處理之HBV轉殖基因小鼠均未(13隻中0隻)在肝中形成腫瘤結節(表1)，在顯微鏡分析下其仍為組織學正常的或僅顯示輕度脂肪變性(圖12)。HBV轉殖基因小鼠穩定產生之HBV病毒粒子及蛋白質含量(圖8及表1)遠高於AAV/HBV轉導之野生型小鼠反駁了病毒自身對肝癌發生具有直接作用之說。已發現AAV載體以非特異性方式整合至宿主細胞染色體中，偏好位置為轉錄活躍基因及DNA斷裂位點。據報導AAV介導之基因療法會增加肝腫瘤形成之風險且此與含有多個小核仁RNA之Rian基因及含有多個微RNA之Mirg基因的AAV插入及過度表現相關聯。然而，吾人之結果(表1)及其他研究(包括695隻小鼠之大規模研究)之結果未顯示在AAV處理之小鼠中肝腫瘤或其他腫瘤類型發展之風險有任何增加。亦未偵測到AAV/HBV誘發之腫瘤中Rian及Mirg基因之表現增加(結果未公開)，從而反駁了在吾人之HCC模式中此兩個基因在肝癌發生中起作用之說。相反，吾人之資料支持抗HBV免疫細胞之間接致癌作用存在於AAV/HBV轉導之小鼠中，但不存在於C57BL/6 HBV轉殖基因小鼠中，經由誘發復發性肝損傷及再生，最終導致關鍵之遺傳學變化及HCC發展。目前藉由一組具有選擇性免疫缺乏之小鼠譜系之AAV/HBV轉導，研究哪一免疫效應子造成HBV相關之肝癌發生。
相較於在涉及致癌蛋白質過度表現或腫瘤抑制劑對生殖系之破環的遺傳工程改造小鼠中確立的HCC模式，小鼠中AAV/HBV轉導之HCC模式具有易操作及再現已知在人類HBV相關之HCC發展中為關鍵之免疫效應子的優點。(Newell等人，(2008)「Experimental models of hepatocellular carcinoma」J Hepatol 48 ,858-879；Keng等人，(2009)「A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma」Nat Biotechnol 27 ,264-274)。咸信AAV/HBV誘發之HCC模式更可能反映出在人類HCC中調節異常之分子路徑的異質性。由於用於此研究中之近親小鼠的遺傳背景具同質性且有機會在腫瘤形成前及腫瘤形成階段中對一系列肝病變取樣，所以在AAV/HBV轉導之小鼠中發展之HCC將極大地簡化對引起癌症之突變之鑑別，為研發新穎治療介入提供機會。另外，預期類似反式拼接AAV技術可應用於產生其他病毒性疾病小鼠模式，包括慢性C型肝炎病毒感染。
本發明之例示性實施例之以上描述僅出於說明及描述之目的而呈現，且不欲為詳盡的或不欲限制本發明為所揭示之確切形式。根據以上教示，可進行許多修改及變化。
選擇且描述該等實施例及實例以說明本發明之原理及其實際應用，以便熟習此項技術者能夠在作出適於所涵蓋之特定用途的各種修改下使用本發明及各種實施例。在不偏離本發明之精神及範疇下替代性實施例為熟習本發明所屬技術者顯而易知。因此，本發明之範疇由隨附申請專利範圍界定，而非以上描述及其中所述之例示性實施例界定。
在本發明之描述中引用及討論一些參考文獻，其可包括專利、專利申請案及各種公開案。該等參考文獻之引用及/或討論僅為闡明本發明之描述而提供且不認可任何該等參考文獻為本文所述之本發明的「先前技術」。本說明書中引用及討論之所有參考文獻均以全文引用的方式併入本文中，且其併入程度如同各參考文獻以引用的方式個別地併入一般。
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圖1展示使用反式拼接AAV載體對小鼠肝細胞進行HBV轉導。圖1A為反式拼接AAV載體之示意圖。AAV/5'-HBV-SD含有1.3倍HBV基因組之5'半部及拼接供體(SD)序列，而AAV/3'-HBV-SA依次含有拼接受體(SA)序列及1.3倍HBV基因組之3'半部。亦展示1.3倍HBV基因組及HBV開放閱讀框架。HBV基因組上之裂解位點由箭形指示。En為強化子；pA為聚腺苷酸化信號。圖1B展示自然HBV感染與AAV/HBV轉導之比較。在人類肝細胞之自然HBV感染(左圖)中，HBV病毒粒子結合於表面受體(身分目前未知)，從而導致衣殼脫殼且輸送至核。部分雙股HBV基因組修復且轉化為共價閉合環狀DNA(cccDNA)分子，該cccDNA分子用作產生3.5 kb前基因組RNA及其他病毒mRNA之轉錄模板。病毒mRNA在細胞質中轉譯產生核心蛋白、表面蛋白、聚合酶蛋白及X蛋白，接著組裝且產生新的HBV病毒粒子，接著該等HBV病毒粒子釋放以引發新的感染。對於小鼠肝細胞之AAV/HBV轉導(右圖)，兩個攜帶HBV基因組之5'半部或3'半部之AAV載體經由受體(層黏連蛋白受體)介導之內飲作用進入細胞且可能經由涉及內體之過程輸送至核。一旦位於核中，全長HBV基因組即可藉由AAV反向末端重複序列介導之頭尾相接分子間重組以串聯體DNA重新構成。在移除相應初級轉錄物之接合序列後產生功能性HBV前基因組RNA及mRNA。HBV蛋白及病毒粒子之產生預計與自然HBV感染中相同，但此等HBV病毒粒子不感染小鼠肝細胞。
圖2展示向小鼠共同注射(co-injection)反式拼接AAV載體可產生HBV病毒粒子及蛋白質。向BALB/c小鼠(n=5)靜脈內注射鹽水、AAV/GFP(每隻小鼠2×1012 vg)或等劑量AAV/5'-HBV-SD與AAV/3'-HBV-SA(各自為每隻小鼠1010 與3×1012 vg之間)。圖2A展示血清HBV力價，其係藉由在AAV注射後一週進行即時PCR(偵測極限為每毫升5×103 病毒基因體)來量測。值表示為平均值±s.d.。圖2B展示電子顯微鏡分析，其揭示接收AAV/5'-HBV-SD與AAV/3'-HBV-SA之(各載體為每隻小鼠1012 vg)小鼠的血清中存在感染性HBV丹恩粒子。此AAV劑量用於所有隨後實驗中且表示為AAV/HBV轉導。定標尺為100 nm。圖2C展示接收對HBc及HBs進行免疫組織化學染色之AAV/GFP或AAV/HBV之小鼠肝之代表性切片。定標尺為100 μm。(圖2D)接收AAV/HBV之C57BL/6(n=10)、FVB(n=10)、BALB/c(n=15)及ICR(n=10)小鼠中平均及個別血清HBV力價：偵測極限為5×103 gc/ml，且所有對照均呈陰性。
圖3展示圖2A之AAV/HBV轉導之BALB/c小鼠的肝中有HBc表現(圖3A)，但心(圖3B)、肺(圖3C)、腦(圖3D)、胰(圖3E)、腎(圖3F)、脾(圖3G)、胃(圖3H)及腸(圖3I)中無HBc表現。定標尺為200 μm。
圖4展示由AAV/HBV轉導誘發之HBV血清學及免疫反應。向C57BL/6小鼠(H2b 單純型)靜脈內注射如上所述之AAV/HBV或AAV/GFP。圖4A中，在AAV注射後8週收集血清樣品(每組n=4)，且藉由ELISA量測HBV蛋白質及抗HBV抗體之量。圖4B至4G中，在不同時間犧牲小鼠(每個時間點n=4)，且自肝(圖4B、4D、4F)及脾(圖4C、4E、4G)中分離CD8+ T淋巴細胞進行IFN-γ ELISPOT分析法。將CD8+ T細胞與經以HBs190及HBs208或對照OVA胜肽進行脈衝之標靶細胞(EL4，H-2b )一起培養18至24小時，接著進行IFN-γ分析。其他對照物為無胜肽(陰性)及刀豆球蛋白A刺激(陽性)。呈現肝內(圖4B、4D)及脾(圖4C、4E)淋巴細胞第2週斑點之代表性照片(圖4B及4C)以及定量結果之概述(平均值±s.d.)(圖4D及圖4E)。呈現肝內(圖4F)及脾(圖4G)淋巴細胞在AAV轉導後第1週至第8週之IFN-γ ELISPOT結果的動力學。實驗進行三次，結果類似。
圖5展示AAV/HBV轉導後血清HBV力價及丙胺酸轉胺酶(ALT)活性之動力學。如上所述向C57BL/6小鼠注射AAV/HBV(n=6)或AAV/GFP(n=5)，接著量測個別個體隨時間推移之平均血清HBV力價(平均值±s.d.)(圖5A)及ALT值(圖5B、5C)。虛線表示野生型未處理之C57BL/6小鼠(n=6)中平均ALT值之兩倍。
圖6展示AAV/HBV轉導後之組織學變化。在AAV轉導後6個月犧牲圖4之小鼠，且移除其肝進行組織病理學分析。圖6A至6D為用蘇木精及曙紅染色之經石蠟包埋之肝切片。圖6A、6B為來自AAV/GFP轉導(圖6A)及AAV/HBV轉導(圖6B)之小鼠之代表性肝切片的顯微照片。在(圖6C)及(圖6D)中分別展示來自(圖6A)及(圖6B)之所選區域的高倍率影像。分別以箭頭及箭形標記發炎性浸潤及有絲分裂細胞。圖6E及6F為免疫組織化學染色之顯微照片，其展示AAV/HBV轉導之小鼠(圖6F)中比AAV/GFP轉導之小鼠(圖6E)中PCNA陽性細胞多。PCNA陽性核染成暗紅色(箭頭)。圖6G至6I展示在100倍放大下總共22個影像之發炎性浸潤(圖6G)及有絲分裂細胞(圖6H)以及在100倍放大下總共25個影像之PCNA陽性細胞(圖6I)的標記指數之定量分析結果。結果呈現為平均值±s.d.。定標尺為1 mm(圖6A、6B)。定標尺為100 μm(圖6C至6F)。
圖7展示AAV/HBV轉導後肝中持久性HBs及HBc表現。圖7A中，H&E染色展示，來自AAV/HBV轉導後6個月時代表性C57BL/6小鼠之肝切片顯示嗜酸性核內包涵體，此嗜酸性核內包涵體會引起核增大(箭形)。免疫組織化學染色展示肝細胞中HBc之核表現(圖7B)及HBs之細胞質表現(箭形)(圖7C)。圖7D中，細胞質HBs之『毛玻璃』外觀由地衣紅染色證實(箭形)。定標尺為200 μm(圖7A至7C)。定標尺為100 μm(圖7D)。
圖8展示C57BL/6/HBV轉殖基因小鼠中之HBV基因表現。藉由即時PCR分析8週齡C57/BL/6/HBV轉殖基因小鼠(n=10)及野生型C57/BL/6小鼠(n=6)之血清HBV DNA(圖8A)，且藉由ELISA分析HBV蛋白質(HBs及HBe)(圖8B)。圖8C展示藉由免疫組織化學染色偵測之肝(左圖)及腎(右圖)中的HBc表現。定標尺為200 μm。
圖9展示經AAV/HBV轉導之小鼠發展肝細胞癌(HCC)。野生型C57BL/6小鼠經AAV/HBV轉導且在12至16個月後處死(詳情參見表1)。將各小鼠之肝拍照，接著製備成石蠟切片供組織學分析。圖9A至9C展示來自一隻代表性小鼠(IF1123，HBV轉導後13個月)之肝腫瘤的大體外觀(圖9A)及組織學特徵(圖9B至9C)。腫瘤顯示獨特「結節套結節」外觀(圖9B)，其中於良好分化之HCC(T2)內產生具有厚小樑圖案之中度至不良分化之HCC(T1)。箭形指示腫瘤邊界。圖9D至9H展示肝病變之其他組織學特徵，包括肝板之假腺圖案(圖9D)、增加之細胞結構及核異型(圖9E，箭形)、腫瘤病變中缺乏肝門通道(圖9F)、非典型肝細胞經肝門侵襲(圖9G，箭形)及細胞質內灰體(圖9H)。圖9H中，較高放大倍率下之插圖展示灰體之H&E染色(頂圖)及纖維蛋白原免疫染色(底圖)。定標尺為1 cm(圖9A)。定標尺為1 mm(圖9B、9F、9H)。定標尺為100 μm(圖9C至9E、9G、插圖9H)。
圖10展示AAV/HBV轉導之小鼠中相鄰非腫瘤肝組織的組織學變化。圖10A至10C展示來自一隻患有HCC之代表性AAV/HBV轉導之小鼠的非腫瘤肝組織之H&E染色。切片展示有局灶性壞死及嗜酸性體散佈在整個切片上之肝門(圖10A)及實質(圖10B)單核細胞浸潤。通常觀測到明顯的脂肪變性(圖10C)。圖10D中，天狼星紅染色揭示實質中及腫瘤結節周圍存在橋接纖維化。
圖11展示AAV/HBV誘發之HCC中喪失HBV蛋白質表現。來自一隻具有HCC之代表性AAV/HBV轉導之小鼠(IF1121)的肝切片之免疫組織化學染色展示，HBs(圖11A、11B)及HBc(圖11C、11D)在相鄰非腫瘤組織中表現(圖11A、11C)，而不在腫瘤中表現(圖11B、11D)。HBs表現位於細胞質中，而HBcAg主要於核中發現，而且在接近中央靜脈之幾個肝細胞之細胞質中亦發現HBcAg。定標尺為200 μm。
圖12展示C57BL/6/HBV轉殖基因小鼠中無顯著組織學變化。在AAV轉導後13個月與19.5個月之間，犧牲AAV/GL2轉導之C57BL/6/HBV轉殖基因小鼠(參見表1)。代表性H&E染色肝切片展示在小葉結構中無明顯的異常(圖12A、12B，IF1226)或僅有輕度不規則脂肪變性(圖12D、12E，IF1421)。免疫組織化學染色揭示對HBc呈正染色(圖12C、12F)。
(無元件符號說明)

Claims (18)

  1. 一種篩檢有效治療B型肝炎病毒相關肝病之治療劑的方法，其包含：(a)向用於B型肝炎病毒相關肝病之非人類動物疾病模式投與欲測試治療效力之藥劑，其中該非人類動物疾病模式係由下列方法獲得：(1)獲得非人類動物；(2)向該動物投與包含以下之組合物：包含B型肝炎病毒之5'基因組DNA片段之第一腺相關病毒載體、及包含該B型肝炎病毒之3'基因組DNA片段之第二腺相關病毒載體；及(3)使該動物發展與該B型肝炎病毒相關肝病相關聯之症狀；其中該非人類動物疾病模式包含在其肝細胞中之B型肝炎病毒基因組且顯示以下症狀：(1)血清中有B型肝炎病毒粒子；(2)該血清中有B型肝炎病毒DNA；(3)該血清中有B型肝炎病毒(HBV)包膜蛋白及HBV e蛋白；及(4)在肝中表現B型肝炎病毒(HBV)核心蛋白及HBV包膜蛋白，但在其腎、心臟、肺、腦、胰、脾、胃或腸組織中不表現；及(b)確定該藥劑是否有效治療該B型肝炎病毒相關肝病。
  2. 如請求項1之方法，其中該投與步驟替換為：向該動物投與包含具有B型肝炎病毒基因組DNA之腺相關病毒載體的組合物。
  3. 如請求項1之方法，其中該非人類動物為免疫功能正常之小鼠。
  4. 如請求項1之方法，其中該B型肝炎病毒基因組係藉由包含B型肝炎病毒基因組DNA插入物之腺相關病毒載體(AAV)轉導至該等肝細胞中。
  5. 如請求項1之方法，其中該B型肝炎病毒基因組係藉由兩個各攜帶該HBV基因組之不同片段的腺相關病毒(AAV)載體轉導至該等肝細胞中，一起在該等肝細胞中產生功能性HBV基因組。
  6. 如請求項1之方法，其中該非人類動物疾病模式的血清中另外顯示至少一種以下血清學及免疫反應：(a)HBV包膜抗原；(b)B型肝炎e抗原；及(c)相較於在其肝細胞中沒有該B型肝炎病毒基因組之對照動物，該肝及/或脾中B型肝炎包膜特異性CD8+ T細胞增加。
  7. 如請求項4之方法，其中該非人類動物疾病模式另外顯示如下慢性B型肝炎血清學狀況：(a)抗B型肝炎包膜抗體呈陰性；(b)抗B型肝炎e抗體呈陰性；及(c)抗B型肝炎核心抗體呈陽性。
  8. 如請求項1之方法，其中該非人類動物疾病模式另外顯示至少一種以下免疫病理反應：(a)該等肝組織中有發炎性浸潤；(b)該等肝組織中有有絲分裂；(c)該等肝細胞中有嗜酸性核包涵體；(d)該等肝細胞中有B型肝炎核心蛋白之表現；(e)該等肝細胞中有B型肝炎包膜蛋白之表現；及(f)相較於在其肝細胞中沒有該B型肝炎病毒基因組之對照動物，丙胺酸轉胺酶含量增加。
  9. 如請求項1之方法，其中該非人類動物疾病模式為選自BALB/c、ICR、C57BL/6及FVB品系之小鼠。
  10. 如請求項1之方法，其中該非人類動物疾病模式為齧齒動物。
  11. 如請求項1之方法，其中該非人類動物疾病模式為免疫功能正常。
  12. 如請求項1之方法，其該非人類動物疾病模式另外顯示一種或一種以上選自以下之肝病理症狀：(a)該等肝組織中有發炎性浸潤；(b)該等肝組織中有有絲分裂；(c)該等肝細胞中有嗜酸性核包涵體；(d)該等肝細胞中有B型肝炎核心蛋白之表現；(e)該等肝細胞中有B型肝炎包膜蛋白之表現；(f)肝細胞壞死；(g)肝腫瘤結節；及 (h)相較於在其肝細胞中沒有該B型肝炎病毒基因組之對照動物，丙胺酸轉胺酶含量增加。
  13. 如請求項1之方法，其中該B型肝炎病毒相關肝病為肝細胞癌且該非人類動物疾病模式顯示至少一種以下肝病理變化：(a)肝腫瘤結節；(b)該等肝組織中纖維蛋白原呈陽性；(c)肝細胞變性；(d)該肝中有發炎性浸潤物；(e)肝細胞壞死；(f)肝纖維化；及(g)相較於在其肝細胞中沒有該B型肝炎病毒基因組之對照動物，丙胺酸轉胺酶含量增加。
  14. 如請求項1之方法，其中該非人類動物疾病模式包含在其肝細胞中之B型肝炎病毒基因組且顯示至少一種以下症狀：(a)肝腫瘤結節；(b)肝細胞變性；(c)該肝中有發炎性浸潤物；(d)肝細胞之脂肪變性及壞死；(e)肝纖維化；及(f)相較於沒有該B型肝炎病毒基因組之對照動物，丙胺酸轉胺酶含量增加。
  15. 如請求項1之方法，其中該非人類動物疾病模式之生殖 系不包含B型肝炎病毒基因組。
  16. 一種篩檢有效治療肝細胞癌之治療劑的方法，其包含：(a)向用於B型肝炎病毒相關肝病之非人類動物疾病模式投與欲測試治療效力之化合物，其中該非人類動物疾病模式係由下列方法獲得：(1)獲得非人類動物；(2)向該動物投與包含以下之組合物：包含B型肝炎病毒之5'基因組DNA片段之第一腺相關病毒載體、及包含該B型肝炎病毒之3'基因組DNA片段之第二腺相關病毒載體；及(3)使該動物發展與該B型肝炎病毒相關肝病相關聯之症狀；其中該非人類動物疾病模式包含在其肝細胞中之B型肝炎病毒基因組且顯示以下症狀：(1)血清中有B型肝炎病毒粒子；(2)該血清中有B型肝炎病毒DNA；(3)該血清中有B型肝炎病毒(HBV)包膜蛋白及HBV e蛋白；及(4)在肝中表現B型肝炎病毒(HBV)核心蛋白及HBV包膜蛋白，但在其腎、心臟、肺、腦、胰、脾、胃或腸組織中不表現；且其該非人類動物疾病模式另外顯示一種或一種以上選自以下之肝病理症狀：(1)該等肝組織中有發炎性浸潤； (2)該等肝組織中有有絲分裂；(3)該等肝細胞中有嗜酸性核包涵體；(4)該等肝細胞中有B型肝炎核心蛋白之表現；(5)該等肝細胞中有B型肝炎包膜蛋白之表現；(6)肝細胞壞死；(7)肝腫瘤結節；及(8)相較於在其肝細胞中沒有該B型肝炎病毒基因組之對照動物，丙胺酸轉胺酶含量增加；及(b)確定該化合物是否有效治療該肝細胞癌。
  17. 一種篩檢有效治療肝細胞癌之治療劑的方法，其包含：(a)向用於B型肝炎病毒相關肝病之非人類動物疾病模式投與欲測試治療效力之化合物，其中該非人類動物疾病模式係由下列方法獲得：(1)獲得非人類動物；(2)向該動物投與包含以下之組合物：包含B型肝炎病毒之5'基因組DNA片段之第一腺相關病毒載體、及包含該B型肝炎病毒之3'基因組DNA片段之第二腺相關病毒載體；及(3)使該動物發展與該B型肝炎病毒相關肝病相關聯之症狀；其中該非人類動物疾病模式包含在其肝細胞中之B型肝炎病毒基因組且顯示以下症狀：(1)血清中有B型肝炎病毒粒子； (2)該血清中有B型肝炎病毒DNA；(3)該血清中有B型肝炎病毒(HBV)包膜蛋白及HBV e蛋白；及(4)在肝中表現B型肝炎病毒(HBV)核心蛋白及HBV包膜蛋白，但在其腎、心臟、肺、腦、胰、脾、胃或腸組織中不表現；且其中該B型肝炎病毒相關肝病為肝細胞癌且該非人類動物疾病模式顯示至少一種以下肝病理變化：(1)肝腫瘤結節；(2)該等肝組織中纖維蛋白原呈陽性；(3)肝細胞變性；(4)該肝中有發炎性浸潤物；(5)肝細胞壞死；(6)肝纖維化；及(7)相較於在其肝細胞中沒有該B型肝炎病毒基因組之對照動物，丙胺酸轉胺酶含量增加；及(b)確定該化合物是否有效治療該肝細胞癌。
  18. 一種篩檢有效治療肝細胞癌之治療劑的方法，其包含：(a)向用於B型肝炎病毒相關肝病之非人類動物疾病模式投與欲測試治療效力之化合物，其中該非人類動物疾病模式係由下列方法獲得：(1)獲得非人類動物；(2)向該動物投與包含以下之組合物：包含B型肝炎 病毒之5'基因組DNA片段之第一腺相關病毒載體、及包含該B型肝炎病毒之3'基因組DNA片段之第二腺相關病毒載體；及(3)使該動物發展與該B型肝炎病毒相關肝病相關聯之症狀；其中該非人類動物疾病模式包含在其肝細胞中之B型肝炎病毒基因組且顯示以下症狀：(1)血清中有B型肝炎病毒粒子；(2)該血清中有B型肝炎病毒DNA；(3)該血清中有B型肝炎病毒(HBV)包膜蛋白及HBV e蛋白；及(4)在肝中表現B型肝炎病毒(HBV)核心蛋白及HBV包膜蛋白，但在其腎、心臟、肺、腦、胰、脾、胃或腸組織中不表現；且其中該非人類動物疾病模式包含在其肝細胞中之B型肝炎病毒基因組且顯示至少一種以下症狀：(1)肝腫瘤結節；(2)肝細胞變性；(3)該肝中有發炎性浸潤物；(4)肝細胞之脂肪變性及壞死；(5)肝纖維化；及(6)相較於沒有該B型肝炎病毒基因組之對照動物，丙胺酸轉胺酶含量增加；及(b)確定該化合物是否有效治療該肝細胞癌。
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