CN1457634A - 一种乙型肝炎病毒基因定位整合导致肝细胞癌的小鼠模型 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肝细胞癌小鼠模型,以及构建该小鼠模型的方法,它包括以下步骤:1.将外源目的基因插入携带靶位点同源序列的适宜载体中,构建出重组的打靶载体;2.将步骤1的打靶载体转化所研究动物的ES细胞,从中获得外源基因定位整合的中靶ES细胞;3.将步骤2获得的中靶ES细胞注入所述动物的囊胚,并进行体外培养,获得含有中靶ES细胞的胚胎;4.将步骤3获得的胚胎植入所述动物的子宫中,由此产生稳定表达外源目的基因的动物子代。本发明还涉及该小鼠模型在肝细胞癌的致病机理研究、早期诊断和治疗以及在抗肝癌药物筛选中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及转基因动物模型及其构建方法。具体地,本发明利用胚胎干细胞(ES)培养技术和同源重组技术将外源目的基因定位整合到感兴趣动物基因组中,从而获得稳定表达外源目的基因的动物模型。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是全球最主要的恶性肿瘤之一,尤其是在包括中国在内的亚太地区。全世界每年发生HCC的患者超过100万人(1),5年存活率低于5%。HCC发生和发展与多种致病因素有关,尤其与乙型肝炎病毒(HBV)感染密切相关。HBV是环状部分双链的DNA病毒,全长约3.2kb。HBV复制过程中以RNA拷贝为中间体,HBV具有随机整合到宿主基因组中的能力,整合了HBV的的宿主称为携带者。携带者中都有病毒表面抗原(HBsAg)的表达,携带者呈现非症状的慢性感染。估计全世界至少有三亿五千万HBV慢性携带者(2),75%以上的HBV慢性携带者分布在亚洲和西太平洋地区(3)。其中至少约20%有不同程度的慢性肝炎和肝硬化,部分最后可演变为原发性肝癌。中国是HBV的高携带区,携带率约为10-20%。临床及流行病学研究显示,HBV慢性携带者患HCC的风险高达40-50%。临床上,肝细胞癌最好的治疗手段仍然是在肝癌早期手术切除,因此早期诊断显得至关重要。至今还没有发现易于检测的血清和肝脏分子标记物,可用于尽早检测出可能会发生HCC的携带者。进一步研究HBV导致HCC发生的病理过程及其分子机制对于此类肝癌的早期诊断具有重要的意义。
肝细胞癌的发生与发展是多因素参与的复杂变化过程,涉及到多种基因的异常表达或突变及其彼此间的相互作用。HBV病毒感染及其基因表达产物与肝细胞蛋白或核酸分子的相互作用,可干扰正常的基因表达和信号转导,并可能激发原癌基因的异常表达,或在功能上灭活肿瘤抑制基因,从而导致肝细胞的非正常生长和分化,最终导致肝细胞癌变。但HBV作用的靶分子目前并不清楚。由于HBV一般不感染培养细胞,也不感染常用的实验动物(黑猩猩是唯一敏感的实验动物),在一定程度上限制了对其致病机理的研究。转基因动物技术为研究HBV致病机理提供了新的途径。1985年,Chisari(4)和Babinet(5)等实验室利用转基因技术成功地建立了多种HBV转基因小鼠模型,对这些小鼠模型的研究极大地促进了对HBV导致肝细胞癌病理过程及其分子机制的理解,但是,由于这些转基因小鼠均采用传统的转基因技术研制,其外源基因随机整合于染色体上,常常导致表型差异并给表型分析带来一定的难度。因此,关于HBV导致HCC发生的分子机制至今仍无定论。国内有单位曾报道HBV全基因组转基因小鼠,但至今尚无转基因小鼠肝癌模型成功的报道。
80年代末以来,在基因打靶技术基础上发展起来的基因敲入(Knock-in)技术,通过同源重组技术及小鼠ES培养技术将外源基因定位地整合到小鼠基因组上,可避免传统转基因技术的盲目性。Deng(6)发现剔除小鼠p21基因后,小鼠发育正常,肝脏无异常表型。此外,人类全基因组工作框架图构建完成标志着生命科学研究进入了后基因组时代,蛋白质组学研究成为功能基因组学研究的重要手段。
发明内容
本发明涉及一种构建动物模型的方法,它包括以下步骤:
①将外源目的基因插入携带靶位点同源序列的适宜载体中,构建出重组的打靶载体;
②将步骤1的打靶载体转染所研究动物的ES细胞,从中获得外源基因定位整合的中靶ES细胞;
③将步骤2获得的中靶ES细胞注入所述动物的囊胚,并进行体外培养,获得含有中靶ES细胞的胚胎;
④将步骤3获得的胚胎植入所述动物的子宫中,由此产生稳定表达外源目的基因的动物子代。
附图说明
图1(a)-(d)显示了HBsAg定位整合转基因小鼠打靶载体构建示意图。
图2(a)-(d)显示了HBV X定位整合转基因小鼠打靶载体构建示意图。
图3HBsAg显示了定位整合转基因小鼠胚胎干细胞的Southern blot筛选示意图。
图4显示了HBsAg定位整合转基因小鼠PCR鉴定示意图。
图5显示了HBsAg定位整合转基因小鼠Southern blot鉴定示意图。
图6显示了HBsAg定位整合转基因小鼠的Northern blot分析。
图7显示了15月龄小鼠的H&E染色图。
图8显示了15月龄小鼠的PCNA检测图。
图9显示了两月龄小鼠血清甲胎蛋白的检测图。
图10(a)-(d)显示了差异表达基因的Northern blot分析结果。
图11显示了肝脏蛋白质双向电泳扫描图。
本发明的第一方面是构建转基因的打靶载体,包括以下步骤:
采用pLoxpneo(7)作为基础的打靶载体。p21基因第二外显子附近约8kb的基因组DNA片段被用作打靶载体的同源序列。将外源基因(HBsAg、HBX、HBV、HCV、HIV等病毒基因)插入到p21基因的第二外显子中。将上述元件组装成转基因的打靶载体,打靶载体含有以下构件:1〕靶位点的同源序列,靶位点可以是p21基因,也可以是其它在肝细胞中转录表达的基因座;2〕外源基因、正筛选标记基因(neo)和负筛选标记基因(tk)。外源基因可以是HBV的全基因组,也可以是HBV的单个基因,也可以是其它的致病微生物的全基因组或单个基因。正筛选标记基因可以是neo基因,也可以是其它的正筛选标记基因,如潮霉素B磷酸转移酶(hph)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)等。负筛选标记基因可以是tk基因,也可以是其它的负筛选标记基因,如单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSVtk)、白喉毒素(DT)、胸腺嘧啶激酶等。
本发明的第二方面是制备中靶的ES细胞,包括以下步骤:
将打靶载体线性化,通过电穿孔的方法,将打靶载体转染入ES细胞中。转染的ES细胞与新鲜的细胞培养基混匀,分入已长满滋养层细胞的培养皿。培养24小时后,换成含有G418、gancyclovir的ES细胞筛选培养基,此后每天更换新鲜的筛选培养基。转染7天后可以开始挑取克隆。将ES克隆变成单细胞悬液,每个ES克隆的单细胞悬液等分至两个预先接种好滋养层细胞的培养皿中,两个培养皿中克隆的位置和次序完全一样。每天换新鲜的ES细胞培养液,培养2-3天后,将其中一块培养皿冻存。将剩余一块96孔培养皿中的ES克隆经胰蛋白酶消化后转移至24孔培养皿中,用滋养层细胞培养基培养至培养基颜色变成黄色。每孔加入细胞裂解缓冲液,裂解细胞,再转移至Eppendorf管中。提取ES细胞的基因组DNA,将DNA完全溶于TE溶液中。提取基因组DNA后用EcoRI和BglII分别消化,用打靶载体5’端外侧的探针进行Southern杂交。用BglII消化,野生型的p21基因应该出现一条约8kb的阳性条带。中靶的p21基因在同源重组后删除了原有的一个BglII位点,并由neo基因引入了另一个BglII位点,导致这条阳性条带上移。如果基因组DNA用EcoRI消化后用打靶载体5’端外侧的探针杂交,野生型的p21基因应该出现一条约8kb的阳性条带,中靶的p21基因在同源重组后删除了原有的EcoRI位点,导致这条阳性条带也将上移。阳性条带位置发生改变的ES细胞即为含有外源基因的ES细胞。
本发明的第三方面是制备含有中靶ES细胞的转基因动物,具体方法如下:
挑选4-5周的C57BL/6J的不动情雌鼠,腹腔注射5IU的促性腺激素。距前次注射促性腺激素的时间不超过不超过48hr后,腹腔注射5IU的人绒膜促性腺激素,使其超数排卵,并将雌鼠转移至有种雄鼠的笼中交配。3.5天后收集雌鼠子宫中的囊胚。注射用的ES细胞应在数天前解冻,注射当天早晨换上新鲜的ES培养液,1-2小时后胰酶处理,做成单细胞悬液保存在Brinster′s BMOC-3培养液中。用注射针吸取12-15枚小而圆的ES细胞。在显微镜下,推动注射泵使ES细胞顺序进入囊胚腔,注射后的囊胚置于加了Brinster′s BMOC-3培养液液滴里培养,此为待移植的胚胎。将假孕雌鼠称重后,按剂量腹腔注射麻醉剂、解剖小鼠。在解剖显微镜下,用移卵管将胚胎缓慢吹入子宫中。将小鼠的子宫和肠系膜送回腹腔,封闭切口。
如果移植手术成功,17天后可有幼鼠出生,数天后可从毛色上判断是否获得高嵌合度的嵌合体小鼠。选择嵌合度高的嵌合体小鼠与C57BL/6J交配,在子代中可获得纯棕色的转基因小鼠。
本发明的第四方面是含有乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因的转基因小鼠的表型特征的分析,包括:
剪15天小鼠尾巴尖约0.5cm放入Eppendorf管中,加入裂解缓冲液裂解细胞,加入高浓度的盐析出蛋白质,离心收集含有DNA的上清,上清经乙醇沉淀后,析出基因组DNA,基因组DNA重新溶于TE溶液备用。
以基因组DNA作为PCR反应的模板,用引物1(5′-TCTTCTGTTTCAGCCACAGGC-3′)和引物2(5′-TGTCAGGCTGGTCTGCCTCC-3′)用于鉴定野生型和杂合型的p21等位基因。这对引物能从野生型和杂和型小鼠中扩增出大小为600bp的条带。引物3(5′-ATTTTCCAGGGATCTGACTC-3′)及位于neo基因上的引物4(5′-CCAGACTGC CTTGGGAAAAGC-3′)用于鉴定带有neo基因的中靶等位基因。引物5(5′-GGAC CCTGCACCGAACATGG-3′)和引物6(5′-GGAATAGCCCCAACGTT TGG-3′)用来鉴定HBsAg基因。从而区分出不同基因型的子代小鼠。
鼠尾基因组DNA用EcoRI和BglII分别消化,用打靶载体5’端外侧的探针a进行Southern杂交。用BglII消化,野生型的p21基因应该出现一条约8kb的阳性条带。中靶的p21基因在同源重组后删除了原有的一个BglII位点,并由neo基因引入了另一个BglII位点,导致这条阳性条带上移至9kb附近。如果基因组DNA用EcoRI消化后用探针a杂交,野生型的p21基因应该出现一条约8kb的阳性条带,中靶的p21基因在同源重组后删除了原有的EcoRI位点,突变后带有HBsAg基因的条带将上移至23kb左右的位置。
用Trizol提取小鼠组织的总RNA,取20μg总RNA进行琼脂糖甲醛变性胶电泳,通过毛细转移法将RNA转移到硝酸纤维素膜上。以HBsAg基因为探针进行Northern blot杂交,发现HBsAg基因在转基因小鼠的肝脏和脾脏中都有表达。
制备小鼠的血清和肝脏匀浆液,用一步法ELISA检测HBsAg试剂盒检测HBsAg基因的表达情况。发现HBsAg蛋白质仅存在于转基因小鼠的肝脏匀浆液中,而不分泌到血清中。
杂合子和纯合子转基因小鼠发育和生长都很正常,一年后肝脏可见淋巴细胞浸润及脂肪样病变,增殖细胞核相关抗原(PCNA)检测显示肝细胞处于高度增殖状态。十五个月杂合子小鼠开始发展成高分化的肝细胞癌,十七个月以上的75%转基因雄鼠发生高分化的肝细胞癌。细胞凋亡检测未见明显的凋亡细胞。
本发明的第五方面是该转基因小鼠作为HBV基因导致肝细胞癌模型小鼠的研究,包括:
提取不同月龄的野生型和HBV转基因纯合子小鼠的肝脏总RNA,通过Northern杂交检测可能与肝细胞癌发生有关的基因的表达情况,初步研究肝细胞癌发生的分子机制。提取不同月龄的野生型和HBV转基因纯合子小鼠的血清和肝脏的蛋白质,将制备的蛋白质用于双向电泳。对双向电泳的结果进行对比分析,对差异蛋白质通过肽质量指纹谱分析进行鉴定,以深入研究肝细胞癌发生的早期事件及其分子机制,筛选肝细胞癌诊断和治疗用靶分子。对不同月龄的HBV致肝细胞癌小鼠和野生型小鼠经过静脉注射或者腹腔注射或者口服给药。采尾静脉血对通过以上研究发现的肝细胞癌相关早期分子进行监测,评价治疗方案和药物的效果。对一年半以上小鼠的肝脏进行组织病理分析,并评价治疗药物的效果。
本发明人采用基因敲入的方法,通过同源重组和ES细胞培养技术将HBV的表面抗原基因(HBsAg)定位地引入小鼠ES细胞基因组中。通过显微注射和胚胎移植,获得了稳定表达HBV表面抗原的转基因小鼠。这种HBV表面抗原基因定位整合转基因小鼠在肝脏表达HBV表面抗原基因,杂合子和纯合子小鼠均发育正常。一年后肝脏可见淋巴细胞浸润及脂肪样病变,增殖细胞核相关抗原(PCNA)检测显示肝细胞处于高度增殖状态。十五个月杂合子小鼠开始发展成高分化的肝细胞癌(图7),十七个月以上的75%转基因雄性小鼠发生高分化的肝细胞癌。细胞凋亡检测未见明显的凋亡细胞。这种HBV基因致肝细胞癌模型小鼠可用于深入研究肝细胞癌发生的早期事件及其分子机制,可用于肝细胞癌早期诊断和治疗靶分子的筛选,并可能用于中西医药治疗肝细胞癌方案和疗效的评价。HBV基因定位整合小鼠胚胎干细胞的获得;
采用pLoxpneo(7)作为基础的打靶载体。p21基因第二外显子附近约8kb的基因组DNA片段被用作打靶载体的同源序列。neo基因和HBV基因插入到p21基因组中。用打靶载体转染小鼠胚胎干细胞,挑选G418/FIAU双抗性的克隆,通过PCR或者Southern杂交筛选按照预期设计发生同源重组的小鼠胚胎干细胞克隆。
本文中所提到的对比文献的全部内容均引入本文以供参考。
以下通过实施例进一步详细说明本发明。但是,这些实施例并不构成对本发明保护范围的任何限定。
实施例1HBV表面抗原基因定位整合打靶载体的构建
将HBV cDNA克隆pADR-1(8)用BglII和BamHI消化,分离2.2kb的全长HBsAg基因片段,并将它插入载体pLoxpneo的BamHI位点,得到载体pLoxpneo-s1。在该载体的Hpa I和Not I位点引入p21基因的基因组DNA第2外显子上游2.0kb的Xho I(补平)-Not I(来自克隆载体)片段,作为同源序列的短臂,得到载体pLoxpneo-s2。将p21基因笫2外显子下游6.0kb的Xba I-BamHI片段克隆至载体pHSG397,获得HindIII(补平)和EcoRI切点。最后将此片段经Asp718(补平)和EcoRI插入载体pLoxpneo-s2,作为同源序列的长臂(图1),得到HBV表面抗原基因定位整合打靶载体pLoxpneo-HBsAg。
实施例2HBV X基因定位整合打靶载体的构建
将HBV cDNA克隆pADR-1用XbaI和BamHI消化,分离1.15kb的HBX基因的5′端及X基因的5′侧翼片段,并将它插入载体pLoxpneo,得到载体pLoxpneo-X1。将HBV cDNA克隆pADR-1用BglII和BamHI消化,分离0.58kb的HBX基因的3′端,插入载体pLoxpneo-X1,得到含有完整的HBX基因及其5′侧翼片段的载体pLoxpneo-X2。在该载体的Xho I和Not I位点引入p21基因的基因组DNA第2外显子上游2.0kb的Xho I-Not I片段,作为同源序列的短臂,得到载体pLoxpneo-X3。将p21基因第2外显子下游6.0kb的Xba I-BglII片段克隆至载体pHSG397,获得HindIII(补平)和EcoRI切点。最后将此片段经Asp718(补平)和EcoRI插入载体pLoxpneo-X3,作为同源序列的长臂(图2),得到HBX基因定位整合打靶载体pLoxpneo-HBX。
实施例3HBV表面抗原基因定位整合小鼠胚胎干细胞的获得1)用原代小鼠胚胎成纤维细胞(primary mouse embryonic fibroblast)制备饲养层1、将怀孕14d的母鼠处死,打开腹腔,取出带有胚胎的子宫。在PBS中将胚胎从子宫中解剖出来,放入无菌的100mm培养皿中。2、去除卵黄囊、羊膜和胎盘,将胚胎在新鲜的PBS中洗两次。3、用一对镊子将胎盘的头及内脏去除,用消毒剪刀将胎鼠剪成小的碎片(1-3mm3),加入PBS洗至液体基本无色。4、将胎鼠碎片转移至含PBS的15ml离心管,1000rpm,离心2min。5、弃上清,加入5ml 0.25%胰蛋白酶,37℃,处理30min,加入含10%胎牛血清的DMEM培养基,用吸管反复吹打。6、1000rpm,离心2min。7、弃上清,加入饲养层细胞培养基并将细胞转移到150mm培养皿中置于含5% CO2的细胞培养箱中37℃培养2-3天,通常第三天胚胎成纤维细胞已长满培养皿。8、将胚胎成纤维细胞从1个培养皿转移至3个培养皿,三天后可将细胞用含10%DMSO的培养层细胞培养基冻存。这种细胞即是原始小鼠胚胎成纤维细胞。2)原始小鼠胚胎成纤维细胞的处理
原始小鼠胚胎成纤维细胞用作饲养层细胞之前,必须用丝裂霉素C(Mitomycin C)处理使它们停止生长,这样它们既能支持ES细胞的生长又不会长过培养的ES细胞。1、取1管原始小鼠胚胎成纤维细胞在40℃水浴快速解冻,将细胞转移至有2ml培养基的离心管中,1000rpm,离心2min。2、弃上清,加入新鲜的饲养层细胞培养基,并转移至2个100mm的培养皿中,置于37℃的CO2培养箱中培养。3、3天后,将细胞用胰蛋白酶消化并转移至6个150mm培养皿中,37℃培养3天。4、将细胞从6个15mm培养皿转移至12个150mm培养皿中,37℃培养3-4天。5、将细胞从12个150mm培养皿中转移至40个150mm培养皿中,37℃培养3-4天。6、取3瓶丝裂霉素C(2mg),每瓶加入3.3ml PBS,合在一起总共10ml,每个培养皿中加入0.25ml,使丝裂霉素C的终浓度为10μg/ml,37℃继续培养2-3hr。7、弃去培养基,用PBS洗一次,每个培养皿中,加入3ml 0.25%胰蛋白酶。处理10min后,加入5ml饲养层细胞培养基终止反应。8、将细胞收集入50ml离心管,1000rpm,离心2min。9、加入冻存培养基(15% FCS,10% DMSO,75% DMEM),总共40ml,用吸管反复吹打混匀细胞,迅速分成40小管冻存于-80℃备用。这样制备的饲养层成纤维细胞每管解冻后通常可以铺满3-4个90mm培养皿。准备600ml饲养层细胞培养基可参考以下配方:
500ml DMEM
6ml L-谷氨酰胺
6ml 非必需氨基酸溶液(10mM)
6ml 青链霉素溶液(5,000unit青霉素,5mg链霉素/100ml)
4μl 巯基乙醇
90ml 胎牛血清用一次性过滤瓶过滤,置于4℃冻箱中备用。在此培养基中添加1000u/mlLIF即可用于ES细胞的培养。3)HBV表面抗原定位整合打靶载体通过电穿孔法转染ES细胞1、复苏的ES细胞传代后的第2天(36hr)进行转染实验。2、转染2hr前,换新鲜的培养基。3、吸弃培养基,用PBS漂洗培养皿2次4、每100mm培养皿加1.5ml 0.25%胰酶,37℃,5min。5、加3.5ml ES细胞培养基,用吸管反复抽吸,20次。用血球计数板测定细胞总数,通常每个打靶载体每次转染约需2×107个细胞。6、1000rpm,2min离心ES细胞悬液。吸弃上清,将细胞重悬于10mlPBS中。7、重新离心,1000rpm,2min。将细胞重悬于PBS中,使细胞密度达到2×107/ml。8、将45μg线性化的实施例1构建的打靶载体DNA与1ml细胞混匀装入电穿孔槽中,室温放置5min。9、在基因脉冲仪中电击(600V,25μF),室温放置1min。10、将电穿孔槽中的细胞与7ml新鲜的ES细胞培养基混匀,分入4个已长满滋养层细胞的培养皿中(100mm)。11、将40μl未转染的细胞铺于一个100mm培养皿中作为对照。12、24小时后,换成G418(280μg/ml)gancyclovir(2μM)ES细胞筛选培养基,此后每天更换新鲜的筛选培养基。13、通常转染7天后可以开始挑取克隆。4)阳性ES克隆的挑取1、转染后的ES细胞在药物筛选培养基中培养7-8天后,弃培养基,用PBS洗一次,再换上10ml PBS。2、将200μl自动移液器调整至20μl,用枪头在显微镜下挑选抗性ES克隆。3、转移每一个克隆到一个空的96孔板中。通常每一个100mm培养皿能挑取30-50个克隆。4、每个96孔培养皿的孔中加50μl 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液,37℃作用3-5min。5、每孔加入100μl ES细胞培养基。将100μl八通道自动移液器调整至80μl,用枪头反复吹吸,使ES克隆变成单细胞悬液。将每个ES克隆的单细胞悬液等分至两个预先接种好滋养层细胞的96孔培养皿中。两个培养皿中克隆的位置和次序完全一样。6、每天换新鲜的ES细胞培养液,培养2-3天后,将其中一块96孔培养皿冻存。7、将剩余一块96孔培养皿中的ES克隆经胰蛋白酶消化后转移至24孔培养皿中,用滋养层细胞培养基培养至培养基颜色变成黄色。5)阳性ES克隆的冻存1、吸弃培养基,加入100μl PBS。2、吸弃PBS,加入50μl用PBS稀释的0.125%胰蛋白酶-EDTA溶液,37℃作用3-5min。3、加入100μl冻存培养基(15% DMSO,20%胎牛血清,65% DMEM)。4、用八通道自动移液器枪头反复吹吸,至少10次。用封口膜封好96孔培养皿,并将其封入塑料袋中,培养皿表面和塑料袋表面均做好标记。5、为了减慢冷冻速度,将培养皿放入泡沫盒中,再置于-80℃冰箱中冻存。6)ES克隆基因组DNA的制备1、用12孔或24孔培养皿培养ES细胞,对于用于制备基因组DNA的ES细胞,无需在培养基中添加LIF。2、每孔加入细胞裂解缓冲液(0.5% SDS,0.1M NaCl,0.01M EDTA,0.02MTris-Cl pH7.6,蛋白酶K,100μg/ml)400μl,室温5min,再转移至Eppendorf管中。3、50℃保温2hr。4、每管加入200μl饱和的NaCl(6M)。5、将Eppendorf管置于纸盒中剧烈晃动200次。6、将Eppendorf管置于冰上,10min。7、室温14,000rpm离心,10min。8、将上清500μl转移至干净的Eppendorf管中,每管加入0.8ml乙醇,混匀。9、14,000rpm离心,5min。弃上清。10、将Eppendorf管口朝下,室温干燥。将DNA重悬于50~100μl TE中,37℃保温至DNA完全溶解后(24-48hr)可用于PCR或Southern杂交分析。7)Southern杂交鉴定HBsAg基因定位整合小鼠胚胎干细胞
挑选G418/FIAU双抗性的克隆提取基因组DNA后用EcoRI和BglII分别消化,用打靶载体5′端外侧的探针a进行Southern杂交。用BglII消化,野生型的p21基因应该出现一条约8kb的阳性条带。中靶的p21基因在同源重组后删除了原有的一个BglII位点,并由neo基因引入了另一个BglII位点,导致这条阳性条带上移至9kb附近。如果基因组DNA用EcoRI消化后用探针a杂交,野生型的p21基因将为8kb,突变后带有HBsag基因的条带将上移至23kb左右的位置(图3)。
实施例4HBV X基因定位整合小鼠胚胎干细胞的获得具体方法同实施例3。
实施例5HBV表面抗原基因定位整合转基因小鼠的获得1)供体囊胚的制备
很多因素都可以影响囊胚的数量,如小鼠的品系、小鼠的健康状况、适应性、超数排卵(超排)和实验时所处的季节等等。在通常情况下,为了获得数量较多的囊胚或小鼠的数量有限时,对不动情鼠腹腔注射激素,使其超数排卵,简称超排。超排鼠龄随品系的不同而有所差异,但通常是3-5周龄,处在青春期间,例如C57BL/6J的雌鼠的最适时间是25天。
囊胚超排供体小鼠的准备:1、挑选4-5周(12.5-14g)的C57BL/6J的不动情雌鼠,在第一天下午2:30分腹腔注射5IU的促性腺激素(PMSG,pregnant mare serumgonadotropin,SIGMA)。2、在第三天午前,距前次注射PMSG的时间不超过不超过48hr,腹腔注射5IU的人绒膜促性腺激素(HCG,human chorionic gonadotropin,SIGMA),并将雌鼠转移至有种雄鼠的笼中交配。3、第四天9:00前检查有阴栓者为供体雌鼠,单笼放置,此天记作0.5天。同天下午2:30分再挑选24-30g左右的昆明白动情雌鼠与输精管结扎的雄鼠交配。4、第五天9:00前检查有阴栓者为受体雌鼠,单笼放置。5、第七天,即在交配后的第四天,收集供体雌鼠子宫中的囊胚。
裘胚的收集和培养:1、引颈处死供体雌鼠,70%的酒精棉球消毒腹部,在腹中线处做一横向切口。2、剪开的皮肤拉向切口的上下两侧,提起腹膜,将其剪开,充分暴露腹腔。3、将肠组织向上提到翻转的腹膜上,找到子宫。用剪刀将左右两侧子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下,然后小心剪下子宫的联体部分,置于无菌的60mm培养皿中。4、再用剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管及子宫角部分,使得两根单独的子宫是通畅的。5、用5ml的一次性注射器吸取足量的Brinster′s BMOC-3(GIBCO BRL)培养液,套上5号针头,在体视解剖镜下插入子宫腔,推动注射针栓,正反方向冲洗子宫腔。子宫在冲洗时会轻度膨胀,小鼠胚胎将迅速沉至培养皿底部。6、取一个35mm的培养皿,滴上数滴培养液,每滴约200ul,再盖上矿物油(SIGMA,M-3516)。7、在体视解剖镜下用冲卵管收集胚胎并转移至培养液滴中,置于37℃、5% CO2培养箱中培养2小时。2)囊胚的显微注射
ES细胞的显微注射应当在立体感强的相差或微分干涉显微镜(Nikon)下进行。显微操作仪(Narishige)最好放置在一抗震台上,至少要有一个低倍和一个高倍的物镜,使放大的范围达到200倍,还应有一个37℃恒温载物台。
显微注射用针的制备在将ES细胞注射到囊胚之前,首先要制备囊胚操作使用的各种针,包括转移胚胎用的移卵管(transfer pipette),显微注射时固定胚胎用的持卵管(holding pipette)以及用于将细胞注射入囊胚的注射针(injectionpipette)。
用烧针仪(Narishige,MF-900)制备显微注射用的持卵管的操作步骤如下:1、在小火焰上将一细玻璃毛细管(Nikon,G-1)拉成倾斜长度约为2-3cm的细针。2、将玻璃毛细管在烧针仪灯丝上熔化成一玻璃球。将拉制成的针固定好,并调节至与灯丝同一水平。加热灯丝,使玻璃针在直径60-90μm处接近并轻触玻璃球。3、停止加热灯丝,因冷缩的原因,针断裂,形成平口的持卵管。4、再次加热灯丝,使其靠近针的尖端,钝化针尖,其中间孔径为12-20mm。5、在距针尖1cm处,使其受热弯曲成30°角,使针尖最终进入显微操作视野的时候是水平的。
用烧针仪制备注射针的操作步骤如下:1、用拉针仪将毛细玻璃管拉成大约1cm的斜长细针。2、用烧针仪在内径约为12-15μm处使其断裂,此内径恰可容纳一个ES细胞而不会使其变形受挤压。3、在针尖略后一点的位置将针拉弯使成30°角,使其在注射视野中处于水平位。移卵管的制备大致上同持卵管的制备,不同的地方是移卵管的内径应是裘胚直径(约为110-130um)的1-1.5倍,使得囊胚易于进出。针长应约为2-3cm,以容纳培养液,气泡和一定数量的囊胚。
囊胚注射操作步骤:1、将持卵管、注射针的针管和操作平皿充满石蜡油。用显微镜的微调将其调至相同的聚焦平面。2、注射用的ES细胞应在数天前解冻,注射当天早晨换上新鲜的ES培养液,1-2小时后胰酶处理,做成单细胞悬液保存在Brinster′s BMOC-3培养液中。3、从35mm培养皿中挑选约10个形态饱满、边界清晰、囊胚腔较大的囊胚转移至安装好持卵管和注射针的注射槽内,用冲卵管吸取少量的ES细胞放入其中。4、在10倍镜下用注射针吸取12-15枚小而圆的ES细胞。5、40倍镜下用持卵管吸附囊胚的一侧,将注射针调整至对准囊胚的中心并使他们处于同一水平面。6、转动注射针的操纵杆,使注射针快速刺破囊胚的壁,进入囊胚腔,推动注射泵使ES细胞顺序进入囊胚腔,小心拔出注射针。7、将注射过的囊胚放置在操作视野的另一侧,继续下一个囊胚的注射。8、旋至10倍镜下用冲卵管吸取注射后的囊胚到大培养皿中,置于加了Brinster′s BMOC-3培养液液滴里培养,做好标记。
依此类推,按照当天的囊胚情况和受体鼠数量决定囊胚注射的个数。持卵管和注射针只有在被堵塞或易粘附的时候更换。注射几个小时后或显微注射室中培养基的pH值改变时,更换显微注射室的液滴和ES细胞。3)胚胎的子宫移植1、将受体雌鼠称重后,按剂量腹腔注射麻醉剂(Avertin)、剪去背部的毛。2、将移卵管接上一个口控管,在体视解剖镜下依次小心吸入培养液、气泡、培养液、气泡、注射后的囊胚、气泡、少量培养液。3、用75%酒精消毒受体鼠背部,在右侧靠近第一腰锥的部位做一个1cm的横向切口。向两侧拉展直至可透过腹膜看见右侧卵巢及其脂肪垫。在腹膜上用尖镊撕一个3mm的小口。4、左手夹住脂肪垫向外拉出,子宫随之可见。用小号止血钳夹住少许脂肪垫稍作固定。5、左手持尖镊夹住在子宫和输卵管接口处附近2mm远的子宫壁,右手持一个4号注射器针头和移卵管。在解剖显微镜下,针头在紧挨尖镊处避开血管扎一个小孔,将移卵管的前端小心插入小孔中。将胚胎缓慢吹入子宫中。6、子宫和肠系膜送回腹腔,封闭切口。
如果移植手术成功,17天后可有幼鼠出生,数天后可从毛色上判断是否获得高嵌合度的嵌合体小鼠。选择嵌合度高的嵌合体小鼠与C57BL/6J交配,在子代中可获得纯棕色的转基因小鼠。
实施例6HBV表面抗原基因定位整合转基因小鼠的鉴定1)小鼠基因组DNA的制备1、剪15天小鼠尾巴尖约0.5cm放入Eppendorf管中。2、每管加入鼠尾裂解缓冲液(0.5% SDS,0.1M NaCl,0.05M EDTA,0.01MTris-Cl pH8.0,蛋白酶K,200μg/ml)400μl。3、50℃保温过夜。4、每管加入200μl饱和的NaCl(6M)。5、将Eppendorf管置于纸盒中剧烈晃动200次。6、将Eppendorf管置于冰上,10min。7、室温14,000rpm离心,10min。8、将上清500μl转移至干净的Eppendorf管中,每管加入0.8ml乙醇,混匀。9、14,000rpm离心,5min。弃上清。10、将Eppendorf管口朝下,室温干燥。将DNA重悬于50~100μl TE中,37℃保温至DNA完全溶解后(24-48hr)可用于PCR或Southern杂交分析。2)PCR鉴定小鼠的基因型
引物1(5′-TCTTCTGTTTCAGCCACAGGC-3′)和引物2(5′-TGTCAGGCTGGTCTGCCTCC-3′)用于鉴定野生型和杂合型的p21等位基因。这对引物能从野生型和杂和型小鼠中扩增出大小为600bp的条带。引物3(5′-ATTTTCCAGGGATCTGA CTC-3′)及位于neo基因上的引物4(5′-CCAGACTGCCTTGGGAAAAGC-3′)用于鉴定带有neo基因的中靶等位基因。引物5(5′-GGACCCTGCACCGAACATGG-3′)和引物6(5′-GGAATAGCCCCAACGTT TGG-3′)用来鉴定HBsAg基因(图4)。3)Southern杂交鉴定HBsAg基因定位整合小鼠
提取鼠尾基因组DNA后用EcoRI和BglII分别消化,用打靶载体5′端外侧的探针a进行Southern杂交。用BglII消化,野生型的p21基因应该出现一条约8kb的阳性条带。中靶的p21基因在同源重组后删除了原有的一个BglII位点,并由neo基因引入了另一个BglII位点,导致这条阳性条带上移至9kb附近。如果基因组DNA用EcoRI消化后用探针a杂交,野生型p21基因将为8kb,突变后带有HBsAg基因的条带将上移至23kb左右的位置(图5)。4)组织总RNA的提取1、将小鼠组织(肝脏、脾、肾等)100mg放入2ml Trizol中,用匀浆器进行匀浆,于室温培养5分钟。2、加入0.4ml氯仿,盖紧瓶盖剧烈振荡15秒,放置2-3分钟。2-8℃,10000-12000g离心15分钟。3、将上层水相转移到一个新的离心管中,加入0.5ml异丙醇,混匀,室温放置10分钟,2-8℃,10000-12000g离心10分钟。4、弃上清,加入至少2ml 75%的异丙醇洗涤,2-8℃,不大于7500g离心5分钟。5、弃上清,空气干燥5-10分钟,加入无RNase的水500μl,反复抽吸使RNA溶解。6、55-60℃保温10分钟,-70℃冰箱储存备用。5)Northern杂交鉴定HBsAg基因定位整合小鼠1、将1.5g琼脂糖溶于117.2ml DEPC处理过的水中,冷却至70℃,加入3.5μl 10mg/ml的溴化乙锭(EB),30ml 5×MOPS(0.1mol/lMOPS(pH7.0),40mmol/l乙酸钠,5mmol/lEDTA(pH8.0))及2.8ml 40%甲醛溶液。2、将20μgRNA加入3倍体积的加样缓冲液(6.7ml甲酰胺,2.2ml 40%甲醛,1320μl 10×MOPS,20μl 20mg/ml溴酚蓝)中,60℃处理10分钟,冰浴迅速冷却,上样。3、120-160V电压电泳2-3小时,每半小时混合电泳两极的电泳缓冲液,溴酚蓝距加样孔8cm停止电泳。4、电泳完毕的胶在20×SSC中浸泡两次,每次15分钟。5、用20×SSC将RNA从凝胶转移到硝酸纤维素膜上,用2×SSC洗膜5分钟。6、紫外交联(1200μW/cm2)2分钟,80℃烤膜45分钟。7、采用Promega公司的Primer A Labeling System(Cat #U1100)标记探针,方法为:将待标记的DNA片段与95-100℃煮2分钟,迅速冰浴冷却,在1.5ml离心管中混合下列溶液:表1
*待标记的DNA片段为:Sph I和Spe I双切质粒pADR-1,回收550bp的片段。加无核酸酶的水至50μl,混匀。室温放置1小时。煮沸2分钟,冰浴骤冷,加EDTA至终浓度20mM,终止反应,待用。8、膜于6×SSC中浸泡5分钟。将膜置于预杂交液(6×SSC,2×Denhardt,0.1%SDS,100μg/ml的变性鲑鱼精DNA)中,65℃预杂交2小时,将标记好的探针加入预杂交液中,65℃杂交18小时以上。9、将膜置于1×SSC,0.1%SDS中室温洗20分钟,随后将膜置于0.2×SSC,0.1%SDS中,65℃洗膜3次,每次20分钟。10、膜稍事干燥,置于X光片下,-70℃曝光。10、洗片。结果如图6所示。6)ELISA鉴定HBsAg基因定位整合小鼠采用北京四环生物制品厂生产的一步法ELISA检测HBsAg试剂盒1、加样:取已包被好的酶联反应板,每板设阴性对照和阳性对照各两孔,每孔各加阴性对照或阳性对照一滴(50μl)。设空白对照1孔(不加任何试剂),其余各孔加待测样品50μl。而后各孔分别加入抗HBs-HRP一滴(50μl),置37℃保温30分钟。2、洗板:甩去各孔的液体,用经30倍稀释的洗涤液反复冲洗5次,最后拍干。3、显色:每孔各加显色液A、B各一滴,置37℃显色15分钟。4、终止:每孔加入终止液一滴,终止反应。5、结果判读:
溶液 | 体积 | 终浓度 |
5×buffer | 10μl | 1× |
dNTP(不含dCTP) | 2μl | 每种dNTP 20μM |
待标记的DNA片段 | 25ng | 500ng/ml |
[α-32p]dCTP,50μCi | 5μl | 333nM |
DNA聚合酶I(Klenow大片段) | 5个单位(1μl) | 100单位/ml |
用450nm波长校准空白孔,然后测定各孔的OD值,并按下列公式计算结果:S/N=被测血清OD值/阴性对照平均OD值,S/N≥2.1为阳性,S/N<2.1为阴性。若阴性对照OD450<0.05时,按0.05计算;OD450≥0.05时,按实际值计算。测定结果为:表2
表3
实施例7HBV X基因定位整合转基因小鼠的鉴定1)PCR鉴定小鼠的基因型。
样品 | 阳性对照1 | 阳性对照2 | 阴性对照1 | 阴性对照2 | Wt血清1 | wt肝脏匀浆液1 | Wt血清2 | wt肝脏匀浆液2 |
OD值 | 1.777 | 1.797 | 0.017 | 0.016 | 0.015 | 0.019 | 0.015 | 0.017 |
S/N | 35.54 | 35.94 | 0.34 | 0.32 | 0.30 | 0.38 | 0.30 | 0.34 |
S+/-血清1 | S+/-肝脏匀浆液1 | S+/-血清2 | S+/-肝脏匀浆液2 | S+/+血清1 | S+/+肝脏匀浆液1 | S+/+血清2 | S+/+肝脏匀浆液2 |
0.015 | 1.908 | 0.016 | 1.879 | 0.013 | 2.067 | 0.015 | 1.998 |
0.30 | 38.14 | 0.32 | 37.58 | 0.26 | 41.34 | 0.30 | 39.94 |
引物1(5′-TCTTCTGTTTCAGCCACAGGC-3′)和引物2(5′-TGTCAGGCTGGTCTGCCTCC-3′)用于鉴定野生型和杂合型的p21等位基因。这对引物能从野生型和杂和型小鼠中扩增出大小为600bp的条带。引物3(5′-ATTTTCCAGGGATCTGA CTC-3′)及位于neo基因上的引物4(5′-CCAGACTGCCTTGGGAAAAGC-3′)用于鉴定带有neo基因的中靶等位基因。引物7(5′-TCTCTGCCAAGTGTTTGCTGACGC-3′)和引物8(5′-TCGGTCGTTGACATTGCTGAGAGTC-3′)用来鉴定HBX基因。2)Southern杂交鉴定HBX基因定位整合小鼠
提取鼠尾基因组DNA后用EcoRI和BglII分别消化,用打靶载体5′端外侧的探针a进行Southern杂交。用BglII消化,野生型的p21基因应该出现一条约8kb的阳性条带。中靶的p21基因在同源重组后删除了原有的一个BglII位点,并由neo基因引入了另一个BglII位点,导致这条阳性条带上移至9kb附近。如果基因组DNA用EcoRI消化后用探针a杂交,野生型P21基因将为8kb,突变后带有HBX基因的条带将上移至23kb左右的位置。3)Northern杂交鉴定HBX基因定位整合小鼠
将HBV cDNA克隆pADR-1用BglII和BamHI消化,回收580bp片段,用作Northern杂交的探针。发现HBX基因在小鼠的肝脏及肾脏中有表达。
实施例8HBV表面抗原基因定位整合转基因小鼠的表型分析1)苏木素-伊红染色1、固定
组织于中性福尔马林缓冲液(40%甲醛100ml,水900ml,磷酸氢二钠4g,磷酸二氢钠6.5g)中固定20小时以上。2、脱水70%乙醇15分钟80%乙醇15分钟90%乙醇15分钟95%乙醇15分钟无水乙醇15分钟无水乙醇15分钟二甲苯15分钟二甲苯15分钟3、包埋
将脱过水的组织转至处理好的石蜡(石蜡熔化,于60℃放置过夜)中,透蜡2小时,中间换蜡两次。将组织转到预热的包埋框中,迅速倾入熔蜡,用温热的镊子调整组织块的位置,放上底板,并在板上倒上一些熔蜡,小心除去底板内的气泡,室温放置,使熔蜡凝固。4、切片
修整蜡块至所需大小。在轮转切片机(MICROM HM340E)上切片,调整刀身角度为10℃,连续切片,将形成的蜡带移至一旁的干净铝箔上。用手术刀片将蜡带切成所需的长短,分别移至载玻片上,再加入适量的水,使样本漂在水面上。将载玻片放在约40℃的干片器平台上,待样品展开,可将水轻轻倒掉,将载玻片收于标本盒中于37℃干燥过夜。5、苏木精-伊红染色二甲苯15分钟二甲苯15分钟无水乙醇15分钟95%乙醇5分钟70%乙醇5分钟水5分钟Harris苏木精染液(苏木素2.5g,无水乙醇25ml,钾明矾50g,氧化汞1.25g,冰醋酸20ml,水500ml)5分钟流水冲洗5-10分钟70%乙醇-盐酸(200ml70%乙醇+10滴盐酸)15-30秒70%乙醇-氨水(200ml70%乙醇+10滴氨水)1分钟水5分钟
此时可在镜下检查退色的程度,细胞质应该是灰色或透明的,若仍然是蓝色的,可重复以上的步骤。70%乙醇3分钟伊红Y染液(0.5g伊红Y,溶于5ml水的50mg焰红B,50ml水,2ml冰醋酸,390ml 95%乙醇)1分钟95%乙醇5分钟无水乙醇5分钟二甲苯5分钟二甲苯5分钟6、中性树胶封片结果如图7所示。2)免疫组化分析1、石蜡切片,常规脱蜡至水。2、3%过氧化氢室温孵育10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。3、蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)的容器中,置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92-98℃之间并持续10-15分钟,取出容器,室温冷却10-20分钟,修复抗原。PBS浸泡5分钟。4、5-10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭,室温孵育10分钟。倾去血清,滴加适当比例稀释的一抗(1%BSA-PBS稀释),37℃孵育1-2小时或4℃过夜。5、PBS冲洗,5分钟×3次。6、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(PBS稀释),37℃孵育30分钟。7、PBS冲洗,5分钟×3次。8、滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释),37℃孵育30分钟。9、PBS冲洗,5分钟×3次。10、显色剂显色。11、水充分冲洗,复染,封片。结果如图8所示。3)小鼠血清甲胎蛋白的检测
采用人血清甲胎蛋白(α-AFP)酶联定量诊断试剂盒检测小鼠血清甲胎蛋白的含量。方法为:1、取血样后分离血清,4℃保存。避免反复冻融。2、按下列比例加入样品:表4
每次实验设一空白孔,混匀,37℃温育20分钟。3、弃各孔内液体,用蒸馏水注满各孔,静置10秒甩去扣干,重复3-4次。4、每孔加显色剂A一滴(50μl),显色剂B一滴(50μl),充分混匀后置37℃显色15分钟。5、每孔加终止液一滴(50μl),用空白孔调零,于450nm波长酶标仪上测量OD值。6、以各标准品的浓度的对数为横坐标,对应OD值为纵坐标绘制标准曲线,计算出标准曲线的直线回归方程,将样品的OD值代入方程式计算样品浓度。方程式为:
孔别 | 标准孔 | 待测样品孔 |
标准品(μl) | 20 | - |
样品(μl) | - | 20 |
酶结合物(μl) | 100 | 100 |
logOD=Blog[浓度]+A两月龄小鼠的对比结果如图9所示:4)细胞凋亡检测采用Oncor公司的ApopTaq(In Situ Apoptosis Detection Kit)检测,方法为:1、石蜡切片脱蜡至水,PBS浸泡两次,每次5分钟。2、组织预处理
用PBS稀释的蛋白酶K(20μg/ml),室温处理15分钟(60μl/5cm2)。去离子水洗两次,每次两分钟。3、灭活内源性过氧化物氧化酶
用PBS稀释的3%H2O2室温处理5分钟。去离子水洗两次,每次5分钟。4、平衡样品
小心吸去多余的液体。在样品上直接加入75μl的平衡缓冲液,室温温育10秒以上。5、TdT酶掺入
小心吸去多余的液体。直接加入TdT酶工作液(77μl反应缓冲液+33μlTdT酶),37℃孵育1小时。6、终止反应
将样品放入终止缓冲液中,搅动15秒,室温继续温育10分钟。7、加入抗地高辛结合物
PBS洗三次,每次1分钟。小心吸去多余的液体。将温育至室温的抗地高辛过氧化物酶结合物覆盖样品,室温孵育30分钟。8、显色
PBS洗4次,每次2分钟。DAB显色。9、水洗终止反应
去离子水洗3次,每次1分钟,继续在去离子水中放置5分钟。10、复染
用0.5%的甲基绿(0.5g甲基绿溶于100ml 0.1M pH4.0的乙酸钠)室温复染10分钟。去离子水洗3次,前两次,每次在水中浸10次,第三次,水中浸30秒,勿搅动。在100%正丁醇中洗3次,方法同前次。11、封片
二甲苯中浸3次,每次2分钟。中性树胶封片。结果为:在15月龄转基因小鼠和野生型小鼠中均未检测到明显的细胞凋亡现象。
实施例9HBV表面抗原基因定位整合小鼠血清蛋白质组学研究1)肝脏组织蛋白质的制备1、取材;2、用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末,每1g样品加入0.5ml裂解液(5M尿素,2M硫脲,2% SB-30,2% CHAPS,1% DTT,蛋白质酶抑制剂的混合物),使用组织匀浆器匀浆30s;3、组织悬液15℃,10000g离心10分钟;4、上清液4℃,150000g超速离心45分钟;5、小心避开上层漂浮的脂质层,吸取上清,6℃ 40000g再次离心50分钟;6、吸上清,用Bradford法测量蛋白质浓度后,分装置-75℃保存。2)小鼠血清的制备分别取三个月龄野生型和转基因纯合子小鼠的血液,室温放置30分钟,3500g离心30分钟,吸取上层血清,采用PIERCE公司的BCATM-ProteinAssay Kit(Cat.No.23226)测定血清蛋白质的浓度。分装后置-75℃保存。3)血清和肝脏组织蛋白质组学分析1、等电聚焦
采用胶内再水化的方法,加含250μg蛋白质的血清或组织提取液于样品再水化液(尿素8mol/l,CHAPS 2%,痕量溴酚蓝)中,至终体积350μl,其中各加还原剂DTT至终浓度20mmol/l,IPG buffer至终浓度0.5%。将IPG干胶条(pH3-10L,18cm,Amersham Pharmacia Biotech)放于上述溶液中,进行等电聚焦,等电聚焦参数如下:表5
2、平衡
步骤 | 电压(V) | 时间(h) | Volt-hours(Vh) |
再水化 | 0 | 12 | 0 |
1 | 500 | 1 | 500 |
2 | 1000 | 1 | 1000 |
3 | 8000 | 4 | 32000 |
将等电聚焦后的IPG胶条放入10mlSDS平衡缓冲液(50mmol/l Tris-ClpH8.8,6mol/l尿素,30%甘油(V/V),2%SDS(V/V)痕量溴酚蓝)中,于摇床上振荡2次,每次10分钟,其中第一次平衡缓冲液中含DTT100mg,第二次平衡缓冲液中含碘代乙酰胺250mg。3、第二向SDS-PAGE垂直电泳
据IPG胶条的大小配制,灌制大小为200×200×1mm3,12.5%的均匀胶。将平衡好的IPG胶条移至SDS-PAGE胶的上方,用电泳缓冲液(25mmol/lTris,250mmol/l甘氨酸pH8.3,0.1%SDS)配制的含有痕量溴酚蓝的0.5%琼脂糖封闭。14-15℃,以每胶条20mA恒流40分钟,再加大至每块胶30mA恒流至溴酚蓝前沿距玻璃板下缘1mm为止。电泳完毕的胶经甲醇∶乙酸∶水(3∶3∶4)固定,用考马斯亮蓝染液(甲醇∶水∶乙酸=4.5∶4.5∶1,加0.25%考马斯亮蓝R250)染色4小时以上。用7%乙酸-10%乙醇脱色。4、双向电泳结果的处理
用Amersham Pharmacia Biotech公司的图象分析软件ImageMaster 2DElite 3.01分析电泳结果。5、差异蛋白从PAGE胶中的酶切和提取
选取2D胶上存在明显差异的蛋白斑点,用刀片沿斑点染色边缘切下蛋白点置于样品管中,用含50%乙腈(色谱级),50mM碳酸氢铵溶液脱色,胶片真空离心干燥。Boehringer公司胰蛋白酶(trypsin,modified、sequencing grade)用25mmol/L碳酸氢铵溶液配成0.01g/L溶液,加8-10μl于各样品管中,37℃保温20h。加入5%三氟乙酸(TFA,Fluka公司产品)溶液120μl于40℃保温1h,吸出上清,加入2.5%TFA,50%ACN溶液120μl于30℃保温1h,合并上清液冰冻干燥。6、差异蛋白的肽质量指纹谱(peptide mass fingerprinting,PMF)分析
冻干后用10μl 0.5%三氟乙酸溶解的肽混合物或脱盐后的提取液,取1μl点靶,另取1μl 1-腈基-4-羟基肉桂酸溶于0.1%三氟乙酸/50%乙腈的饱和溶液作基质,室温干燥。质谱仪采用Bruker公司REFLEX III基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix assisted laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS),激光波长337nm,反射检测。7.数据库检索初步鉴定蛋白质
数据库检索程序根据输入的蛋白质等电点、分子量范围及肽指纹谱数据和甚一些参数在数据库中寻找与这些参数相匹配的蛋白质。互联网上的蛋白质数据库检索程序有:ExPASy Molecular Biology Server网站提供的PeptIdent(http://www.expasy.ch/tools/peptident.html)和UCSF MassSpectrometry Facility网站提供的MS-Fit(http://prospector.ucsf.edu/htmlucsf3.0msfit.htm)。
参考文献1. Bosch FX,Munoz N.Epidemiology of hepatocel lular carcinoma.In:Bannsch P,Keppler D,eds.Liver cell carcinoma.Dordrecht:Kluwer Academic,1989;3-12.2. Zuckerman AJ.More than third of word’s population has beeninfected with hepatitis B virus[Letter].Br.Med.J 1999 318:1213.3. Gust ID.Epidemiology of hepatitis B infection in the WesternPacific and South East Asia.Gut 1996 38(suppl 2):s18-s23.4. Chisari FV,Pinkert CA,et al A trahsgenic mouse model of thechronic hepatitis B surface antigen carrier state.Science 1985230:1157-1160.5. Babinet C,Farza H,et al Specific expression of hepatitis Bsurface antigen(HBsAg)in trahsgenic mice.Science 1985230:1160-11.6. Deng CX,Zhang P,et al Mice lacking p21CIP/WAF1 undergo normaldevelopment,but are defective in G1 checkpoiht control。Cell 199582:675-684.7. Yang X,Li C,et al The tumor suppressor SMAD4/DPC4 isessential for epiblast proliferation and mesoderm induction inmice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998 95:3667-3672.8. 甘人宝等克隆的adr亚型乙型肝炎病毒(pADR-1)DNA的全顺序。中国科学(B)1986 No.1:55-65
Claims (17)
1.一种构建动物模型的方法,它包括以下步骤:
①将外源目的基因插入携带靶位点同源序列的适宜载体中,构建出重组的打靶载体;
②将步骤1的打靶载体转染所研究动物的ES细胞,从中获得外源基因定位整合的中靶ES细胞;
③将步骤2获得的中靶ES细胞注入所述动物的囊胚,并进行体外培养,获得含有中靶ES细胞的胚胎;
④将步骤3获得的胚胎植入所述动物的子宫中,由此产生稳定表达外源目的基因的动物子代。
2.权利要求1的方法,其中所述的外源目的基因包括HBV、HCV、HIV等病毒基因或其他病源微生物基因。
3.权利要求1或2的方法,其中所述的外源目的基因是乙型肝炎病毒的基因。
4.权利要求3的方法,其中所述的外源目的基因是HBsAg或HBV X基因。
5.权利要求1的方法,其中打靶载体含有外源目的基因、靶位点的同源序列以及正、负选择标记基因。
6.权利要求1的方法,其中所述的动物为小鼠。
7.权利要求6的方法,其中外源目的基因是插入到小鼠的P21基因中。
8.权利要求7的方法,其中外源目的基因是插入到小鼠的P21基因的第二外显子中。
9.一种小鼠细胞,其特征在于该细胞基因组的P21基因中插入了外源目的基因。
10.权利要求9的细胞,它为胚胎干细胞或者相同基因型的体细胞。
11.权利要求9或10的细胞,其中外源目的基因为HBV、HCV、HIV等病毒基因或其他病源微生物基因。
12.利用权利要求1的方法所获得的转基因动物。
13.一种转基因小鼠,其特征在于该小鼠的染色体中通过基因敲入的方法定位地引入了外源目的基因。
14.权利要求13的转基因小鼠,其中所述的外源目的基因是HBV、HCV、HIV等病毒基因,优选HBsAg或HBV X基因。
15.权利要求13或14的转基因小鼠,其特征在于外源目的的基因定位插入到小鼠P21基因中。
16.一种转基因小鼠,其特征在于该小鼠的P21基因中定位整合了乙肝病毒基因,外源基因稳定遗传和表达,该小鼠发育正常,并在一定时间后发生肝细胞癌。
17.权利要求13-16中任一项的转基因小鼠在肝细胞癌致病机理研究、其早期诊断和治疗、以及抗癌药物筛选中的应用。
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Cited By (6)
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100410381C (zh) * | 2004-07-08 | 2008-08-13 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 一种hcv转基因小鼠模型及其构建方法与应用 |
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WO2018161418A1 (zh) * | 2017-03-07 | 2018-09-13 | 浙江大学 | 一种利用干细胞构建的人源化乙型肝炎鼠模型及应用 |
CN106943203A (zh) * | 2017-03-17 | 2017-07-14 | 宁夏医科大学 | 一种用于睾丸输出管注射的注射针制备方法 |
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