JP2010200756A - B型肝炎ウイルス遺伝子の標的を狙った組み込みによる肝細胞癌を誘発するためのマウス・モデル - Google Patents
B型肝炎ウイルス遺伝子の標的を狙った組み込みによる肝細胞癌を誘発するためのマウス・モデル Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】本発明は、肝細胞癌のマウス・モデル、及び以下のステップ:
a) 着目の外来性遺伝子を、標的部位に相同的な配列を担持する好適なベクター内に挿入して、組換えターゲッティング・ベクターを構築し;
b) ステップa)からのターゲッティング・ベクターを使って研究される動物のES細胞にトランスフェクトし、そして上記外来性遺伝子を特定の部位に組み込まれている標的ES細胞をスクリーニングし;
c) ステップb)から得られた標的ES細胞を、上記動物の胞胚内に注入し、そして標的ES細胞を含む胚が発生するように上記胞胚を試験管内で培養し、そして
d) ステップc)から生じた胚を、上記動物の子宮に移植し、それによって外来性遺伝子を安定して発現する子孫を生み出す、
を含む動物モデルの構築方法を提供する。
【選択図】なし
Description
本発明は、トランスジェニック動物モデル及びそのようなモデルを構築する方法に関する。特に、本発明は、外来性遺伝子が安定的に発現される動物モデルを生み出すために、胚性幹(ES)細胞培養及び相同組換えにより着目の外来性遺伝子を動物ゲノムに組み込む方法、並びに上記方法によって得られた動物モデルに関する。
肝細胞癌(HCC)は、世界規模の主な悪性腫瘍の1つであって、中国を含むアジア及び太平洋地域に特に分布する。100万人以上の人が毎年HCCに変わり(1)、その5年間の生存率は、5%未満である。多数の病因的要素、特にB型肝炎ウイルス(HBV)感染は、HCCの発生及び進行に関係している。HBVは、DNAウイルスに属し、それは環状の、不完全な2本鎖DNAを含み、そしてRNA中間体を介して複製し、完全長約3.2 kbを持つ。HBVは、宿主ゲノム内に無作為に組み込まれることができて、HBVが組み込まれた宿主は、保菌者と呼ばれる。
本発明は、動物モデルを構築する方法に関し、以下のステップ:
a) 着目の外来性遺伝子を、標的部位に一致した配列を担持する好適なベクター内に挿入して、組換えターゲッティング・ベクターを構築し;
b) ステップa)からの上記ターゲッティング・ベクターを使って研究されるべき動物のES細胞に形質移入し、そして上記外来性遺伝子が特定の部位に組み込まれている標的ES細胞をスクリーニングし;
c) ステップb)から得られた標的ES細胞を上記動物の胞胚に注入し、そして標的ES細胞を含む胚を生じるように試験管内で上記胞胚を培養し;そして
d) ステップc)から生じた胚を上記動物の子宮に移植し、それによって外来性遺伝子を安定して発現する子孫を作り上げる、
を含む。
第3の側面において、本発明は、標的ES細胞を含むトランスジェニック動物の製造方法に関し、それは以下の通り説明される:
15日齢のマウスから尾の先端の約0.5cmの部分を切断し、エッペンドルフ管に移し、そこに溶解緩衝液を添加し、細胞溶解液を作製し、次に、高度に濃縮した塩を添加し、タンパク質を沈澱させた。DNAを含む上清を、遠心分離によって回収し、そしてエタノールによって沈澱させた後に、ゲノムDNAを得ることができた。このDNAを後の使用のためにTE溶液中に再溶解した。
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これらの実施例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈されない。
HBsAg遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するターゲッティング・ベクターの構築
HBV cDNAを含むpADR-1(8)を、BglIIとBamHIにより消化した。完全長のHBsAg遺伝子を含む2.2 kbの断片を単離し、ベクターpLoxpneoのBamHI部位に挿入して、ベクターpLoxpneo-s1を得た。相同配列の短い腕としての、p21遺伝子座の第2エクソンの上流の、2.0 kbのXhoI(埋め込み)-NotI(クローン・ベクターから)断片を、pLoxpneo-s1のHpaI部位とNotI部位の間に挿入して、ベクターpLoxpneo-s2を得た。p21遺伝子座の第2エクソンの下流の、6.0 kbのXbaI-BglII断片を、ベクターpHSG397にクローンし、HindIII(埋め込み)及びEcoRI部位を作り出した。最後に、相同配列の長い腕としての断片を、ベクターpLoxpneo-s2のAsp718I(埋め込み)とEcoRI部位の間に挿入して(図1)、HBsAg遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するターゲッティング・ベクターpLoxpneo-HBsAgを産生した。
HBV X遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するターゲッティング・ベクターの構築
HBV cDNAを含むpADR-1を、XbaIとBamHIにより消化した。HBX遺伝子5'末端及びX遺伝子5'の側方に位置する部分を含む1.15 kbの断片を単離し、ベクターpLoxpneoに挿入して、ベクターpLoxpneo-X1を得た。HBV cDNAを含むpADR-1を、BglIIとBamHIで消化した。HBX遺伝子の3'末端を含む0.58 kbの断片を単離し、ベクターpLoxpneo-X1に挿入して、全HBX遺伝子及びその5'末端の側方に位置する部分を含むベクターpLoxpneo-X2を得た。相同配列の短い腕としての、p21遺伝子座の第2エクソンの上流の、2.0 kbのXhoI-NotI断片を、前記ベクターのXhoI部位とNotI部位の間に挿入して、ベクターpLoxpneo-X3を得た。p21遺伝子座の第2エクソンの下流の、6.0 kbのXbaI-BglII断片を、ベクターpHSG397にクローンし、HindIII(埋め込み)及びEcoRI部位を作り出した。最後に、相同配列の長い腕としての断片を、ベクターpLoxpneo-X3のAsp718I(埋め込み)とEcoRI部位の間に挿入して(図2)、HBX遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するターゲッティング・ベクターpLoxpneo-HBXを産生した。
HBsAg遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するマウス胚性幹細胞の産生
1) フィーダー細胞であるマウス初期胚線維芽細胞の準備
1.妊娠後14日目のマウスを屠殺し、腹腔を開き、胚と一緒に子宮を取り出した。PBS中で胚を子宮から切取り、次に、無菌の100 mmペトリ皿に置いた。
2.卵黄嚢、羊膜、及び胎盤を取り除き、そして胚を新しいPBSで2回洗浄した。
3.胚の頭部及び内臓を複数の鉗子によって取り除き、マウス胎仔を、無菌のはさみにより小片(l〜3 mm3)にカットし、次にPBSが実質的に無色透明になるまでPBSで洗浄した。
5.上清を捨て、そして5 mlの0.25%トリプシンを残渣に添加し、37℃で30分間処理し、次に10%のウシ胎仔血清を補ったDMEM培地を添加し、ピペットによる吸い上げと吐き出しを繰返した。
6.管を2分間1000rpmで遠心分離した。
7.上清を捨てた。フィーダー細胞培地を加えた後、細胞を150 mmペトリ皿に移し、5%のCO2雰囲気のインキュベーター中、37℃で2〜3日間培養した。通常、胚性線維芽細胞は3日でペトリ皿を覆う。
マウス初期胚性線維芽細胞は、それらが培養されたES細胞を超えて増殖することなくES細胞の成長を支援することができるように、それらの成長を止めるためにそれらをフィーダー細胞として使用する前にマイトマイシンCで処理する必要がある。
2.上清を捨てた。フィーダー細胞培地を加えた後、細胞を2つの100 mmペトリ皿に移し、5%のCO2雰囲気のインキュベーター中、37℃でインキュベートした。
3.3日後に、細胞をトリプシン処理し、次に、6つの150 mmペトリ皿に移し、37℃で3日間インキュベートした。
5.細胞を12の150 mmペトリ皿から40の150 mmペトリ皿に移し、37℃で3〜4日間インキュベートした。
6.3.3 mlのPBSをマイトマイシンC(2mg)のバイアルに加えて、マイトマイシンCの3つのバイアルを合計10 mlにまとめた。各々のペトリ皿に10 μg/mlの終濃度まで0.25 mlのマイトマイシンCを添加し、そして37℃で2〜3時間インキュベートした。
8.全てのペトリ皿からの細胞を50 ml遠沈管中に集めた。これらの管を2分間1000rpmで遠心分離した。
500 ml DMEM
6 ml L-グルタミン
6 ml非必須アミノ酸溶液(10 mM)
6 mlペニシリン及びストレプトマイシン溶液
(5,000 ユニットのペニシリン、5 mgのストレプトマイシン/100 ml)
4 μlメルカプトエタノール
90 mlウシ胎仔血清
2.トランスフェクトの2時間前に培地を新しい培地に変えた。
3.培地は捨て、次にペトリ皿をPBSで2回洗浄した。
4.1.5 mlの0.25%トリプシンを各々の100 mmペトリ皿に37℃で5分間加えておいた。
6.ES細胞懸濁を2分間1000rpmで遠心分離し、上清を捨てた。細胞を10 mlのPBS中に再懸濁した。
7.細胞懸濁液を2分間1000rpmで再度遠心分離し、そして細胞を、細胞密度が2×107細胞/ml超なるようにPBS中に再懸濁した。
9.Gene Pulsor(600 V、25 μF)を放電させた。上記キュベットを取り除き、そして1分間室温に置いた。
10.電気穿孔法キュベット中の細胞を、7 mlの新しいES細胞培地と混合し、そしてフィーダー細胞で覆われた4つのペトリ皿(100 mm)に分配した。
12.24時間後、ES細胞をスクリーニングするために、G418(280 μg/ml)及びガンシクロビル(2 μM)を含む選択培地に培地を交換し、以後、毎日新しい選択培地に交換した。
13.個々のクローンを、トランスフェクト後7日目から通常は選別した。
1.7-8日の間選択培地中で培養し、そして培地を捨てた後に、トランスフェクトしたES細胞を1回PBSで洗い、そして10 mlのPBSに変えた。
2.200 μlマイクロピペッタを20 μlに合わせ、そして顕微鏡下でそのチップを使って陽性ESクローンを選択した。
4.50 μlの0.25%トリプシン-EDTA溶液を各々のウェルに加え、37℃で3〜5分間反応させた。
1.前記培地を捨て、そして100 μlのPBSを添加した。
2.PBSを捨てた後で、PBSで薄めた0.125%のトリプシン-EDTA溶液50 μlを加えて、37℃で3〜5分間反応させた。
4.8チャネルのマイクロピペッタを用いて、細胞を少なくとも10回ピペットにより吸い上げ、そして吐き出した。96ウェル・プレートを封着膜により封じて、ビニール袋で閉じて、そして上記プレートと上記ビニール袋の表面に印をつけた。
6) ESクローンからのゲノムDNAの製造
1.ES細胞を12ウェル・プレート又は24ウェル・プレートで培養した。ゲノムDNAを抽出するためにES細胞を使用するために、LIFを培地に加える必要はない。
4.200 μlの飽和NaCl(6 M)は加えた。
5.エッペンドルフ管をボール紙の箱に置き、200回激しく振とうした。
6.エッペンドルフ管を10分間氷上に置いた。
7.前記管を室温下、10分間14,000rpmで遠心分離した。
8.各々の管に、500 μlの上清をきれいなエッペンドルフ管に移し、続いて0.8 mlのエタノールを加えて、混ぜた。
10.各々の管をひっくり返して置き、室温で乾燥させた。DNAを50〜100 μlのTE中に再懸濁して、完全に溶けるま(24〜48時間)で37℃で静置した。DNAをPCR又はサザン・ハイブリダイゼーション分析のために使用することができる。
7) サザンブロットによるHBsAg遺伝子標的を狙った組み込みを含有するマウス胚性幹細胞の同定
HBV X遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するマウス胚性幹細胞の製造
実施例3に記載したそれと同じ方法で、HBV X遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するマウス胚性幹細胞を得れることができる。
HBsAg遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するトランスジェニック・マウスの製造
1) ドナー胞胚の製造
胞胚の数は、多くの要因、例えばマウス系統、全身的な健康状態、適応、過剰排卵する能力、及び実験する季節などに依存する。より多くの胞胚を得るためにか、又はマウスの数が限られているとき、興奮していないマウスを、一般に腹腔内にホルモンを注射し、それらにより多くの卵を排卵させる、すなわち、過剰排卵させる。過剰排卵させられるマウスは、通常、青年期にある3〜5週齢であり、そして特定の年齢は、マウスの系統により変わるかもしれない、例えば雌C57BL/6Jマウスの最も好適な年は、25日齢である。
1.興奮していない4〜5週齢の雌C57BL/6Jのマウス(12.5〜14 g)を選択し、1日目の午後2:30に、5 IUの妊馬血清性腺刺激ホルモン(PMSG、SIGMA)を腹腔内に注射した。
2.3日目の正午前、すなわち先のPMSG注射の48時間以内に、雌マウスに5 IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG、SIGMA)を腹腔内に注射して、過剰排卵させ、そして繁殖用の雄マウスの檻に移して、それらと交尾させた。
5.7日目、すなわち、交尾後4日目に、胞胚をドナー雌マウスの子宮から採集した。
1.脱臼によってドナー雌マウスを屠殺した後に、それらの腹部は70%のアルコールで殺菌した。腹部の真ん中の線で水平の切開した。
2.皮膚を切り開き、その切開の外側に引っ張り、そして腹腔を持ち上げ、そして切り開いて、十分に腹腔を露出させた。
4.卵管と子宮端を、それぞれ子宮の頭部及び子宮の尾部から取り除き、別々の遮るもののない分かれた子宮にした。
7.胚を、解剖顕微鏡下、フラッシング・ピペットを使って採集し、そして培養微小滴に移し、次に5%のCO2雰囲気のインキュベーター中で37℃で2時間インキュベートした。
ES細胞のマイクロインジェクションを、深さと堅さの効果により、位相差顕微鏡又は微分干渉顕微鏡(Nikon)を使用すべきである。耐震プラットフォーム上の、少なくとも低倍率対物レンズと200×の倍率までの高倍率対物レンズ、及びさらに37℃の定温対象ステージを備えている、極微操作装置(Narishige)がより好ましい。
ES細胞を胞胚内に注入する前に、胞胚を移すためのトランスファー・ピペット、マイクロインジェクション中の胞胚を固定するためのホールディング・ピペット、及び胞胚内に細胞を注入するインジェクション・ピペットを含む胞胚操作のための様々な種類のピペットが、必要である。
1.細いガラス毛細管(Nikon、G-1)を、小さい炎の上で約2〜3cmの長さの細い針に引き伸ばした。
4.次に12〜20 mmの中間口径をもち、針先を丸くするために、再びフィラメントを加熱し、針先をそれに近づけた。
5.針を、針先から1cm離れたところで加熱し、30°の角度で曲げた、このため針先は、顕微操作視野で水平である。
1.ガラス毛細管を、長さ約1cmの細い針に引き伸ばした。
2.前記の針を、針作成用バーナーを使って、12〜15 μmの内径で分割させた、その内径は、ES細胞を押しつぶすことなく、ちょうど1つのES細胞を保持することができる。
トランスファー・ピペットの準備は、ホールディング・ピペットのそれと類似していたが、トランスファー・ピペットの内径が胞胚のそれの1〜1.5倍(約110〜130 μm)であるというところに唯一の相違があり、よって胞胚が容易にそこを出入りできる。前記針の長さは、培地、泡、及び特定の数の胞胚を保持するために約2〜3 cmである。
1.パラフィン油で満たした後、皿、ホールディング・ピペットの針管、及びインジェクション・ピペットのそれを、顕微鏡の微調整を通して同じ焦点水平面に合わせた。
2.注入するES細胞を、注入の数日前に解凍した。培地を、注入日の朝に新しいES培地に変えた。1〜2時間後、細胞を、トリプシン処理して単細胞懸濁液を用意し、次にBrinster's BMOC-3培地に浸した。
4.10×の倍率下、インジェクション・ピペットを使って12〜15個の小さくて、丸いES細胞を吸った。
5.40×の倍率下、ホールディング・ピペットを、胞胚の一方の側面に付け、次にインジェクション・ピペットを、胞胚の中心のそれと同じ水平面に合わせた。
7.その後注入した胞胚を顕微操作視野の反対側に置き、次の胞胚の注入を続けた。
8.10×の倍率下、全ての注入した胞胚を、フラッシング・ピペットを使ってより大きな皿に吸って移し、Brinster's BMOC-3培地を加えた滴で培養して、最後に印をつけた。
1.アクセプター雌マウスを計量し、それらの体重に従って麻酔剤(アベルチン)を腹腔内注射して、背中の毛を剃った。
2.トランスファー・ピペットを、口で制御する管と接続し、次に培地、泡、培地、泡、注入された胞胚、泡、そして多少の培地を順番に吸った。
4.脂肪体を左手で固定すると、子宮を見ることができた。小サイズの止血鉗子を使って脂肪体は固定した。
前述の操作がうまくいっていれば、仔マウスが17日後に生まれて、高度のキメラ・マウスが得られている場合には、数日後にそれらの毛皮の色から推論できる。高度のキメラ・マウスをC57BL/6Jマウスと交尾させるために選択したとき、無垢の茶色の毛皮をもつトランスジェニック子孫が産まれる。
HBsAg遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するトランスジェニック・マウスの同定
1) マウス・ゲノムDNAの準備
1.尾の先端約0.5cmの部分を15日齢のマウスから切断し、次にエッペンドルフ管に移した。
2.各々の管に、400 μlの溶解緩衝液(0.5%のSDS、O.1 M NaCl、0.05 M EDTA、0.01 M Tris-Cl pH8.O、プロテアーゼK、200 μg/ml)を加え、尾の先端を溶解させた。
4.200 μlの飽和NaCl(6M)を各々の管に加えた。
5.エッペンドルフ管をボール紙の箱に置き、200回激しく振とうした。
6.エッペンドルフ管を10分間氷上に置いた。
7.前記管を室温下、10分間14,000rpmで遠心分離した。
8.各々の管について、500 μlの上清をきれいなエッペンドルフ管に移し、続いて0.8 mlのエタノールを加えて、混ぜた。
10.各々の管をひっくり返って置き、室温で乾燥させた。DNAを、50〜100 μlのTE中に再懸濁し、完全に溶けるまで(24〜48時間)37℃で静置した。このDNAをPCR又はノザン・ハイブリダイゼーションのために使用することができる。
野生型p21対立遺伝子を確認するためにプライマー1(5'-TCTTCTGTTTCAGCCACAGGC-3')及びプライマー2(5'-TGTCAGGCTGGTCTGCCTCC-3')を使用し、436bpのバンドが野生型及びヘテロ接合性マウスから増幅されうる。neo遺伝子上のプライマー3(5'-ATTTTCCAGGGATCTGACTC-3')及びプライマー4(5'-CCAGACTGCCTTGGGAAAAGC-3')を、neo遺伝子を含む標的対立遺伝子を同定するために使用した。HBsAg遺伝子を同定するためにプライマー5(5'-GGACCCTGCACCGAACATGG-3')及びプライマー6(5'-GGAATAGCCCCAACGTTTGG-3')を使用した(図4)。
抽出したマウス尾ゲノムDNAを、それぞれEcoRIとBglIIで消化し、得られた消化物を、ターゲッティング・ベクターの5'末端の外側に配置されたプローブを使ったサザンブロットに供した。BglIIによる消化に関して、野生型p21対立遺伝子にあたる約8 kbの陽性バンドが現われるべきであるが、それに対し、標的p21対立遺伝子にあたるこの陽性バンドは9 kbに移動した。後者は、相同組換えの後の本来のBglII部位の削除とneo遺伝子による他のBglII部位の導入から生じる。EcoRIによる消化に関して、野生型p21対立遺伝子にあたる約7.7 kbの陽性バンドが現われるべきであるが、それに対し、標的p21対立遺伝子にあたる変異後のHBsAg遺伝子を含む上記バンドは約22 kbに移動した(図5)。
1.2 mlのTrizolを加えた後に、100 mgのマウス組織(肝臓、脾臓、腎臓など)をホモジナイザーにより均質化し、次に5分の間室温で静置した。
2.0.4 mlのクロロホルムを加えた。管をきっちりと閉じて、15秒間激しく振とうし、そして2〜3分間静置し、次に2〜8℃で15分間10,000〜12,000gで遠心分離した。
4.上清を捨てた。次にペレットを、少なくとも2 mlの75%のエタノールの添加により洗浄し、2〜8℃で5分間わずか7500gの速度で遠心分離した。
6.このRNAを55〜60℃で10分間維持し、次に-70℃で保存した。
5) ノーザン・ハイブリダイゼーションを用いたHBsAg遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するマウスの同定
2.20 μgのRNAに、3倍量の添加液(6.7 mlのホルムアミド、2.2 mlの40%ホルムアルデヒド、1320 μlの10×MOPS、20 μlの20 mg/mlブロモフェノールブルー)を加え、60℃で10分間加熱し、そして氷水で急速に冷やし、次にサンプルを添加した。
4.このゲルを、各回につき15分間、20×SSCに2回浸した。
5.RNAを、20×SSCを使ってゲルからニトロセルロース膜に移して、次にこの膜を5分間2×SSCで洗浄した。
7.Promega社製のプライマーA標識システム(Cat. No. U1100)を使ってプローブを標識した。要するに、標識されるDNA断片を、95〜100℃で2分間ボイルし、次に、氷水により急冷した。以下の溶液を1.5 mlの遠沈管中で混ぜた:
9.前記の膜を、1×SSC、0.1%のSDS中、室温で20分間、次に0.2×SSC、0.1%のSDS中、65℃で3回、各回につき20分間洗浄した。
11.このフィルムを現像した。
結果を図6に示した。
HBsAgのためのワンステップELISAキットを北京のSihuan Biological社から購入して、そして以下のステップを使用した:
マイクロタイタープレートをコートした。各々のプレートに、2つのウェルを、それぞれ陰性対照及び陽性対照として設定し、次に1滴の対照溶液(50 μl)を各々の4つのウェルに加えた。1つのウェルを(全ての薬剤を加えない)ブランク対照として設定した。50 μlの試験サンプルを他のウェルに加えた。次に1滴の抗HBs-HRP(50 μl)を各々のウェルに加えた。前記プレートを37℃で30分間インキュベートした。
各々のウェルの液体を捨て、次にこのウェルを3倍希釈した洗浄緩衝液を使って5回洗い、そして軽くたたいて乾かした。
1滴の色素原溶液Aと1滴の色素原溶液Bを各々のウェルに加え、次にプレートを37℃で15分間インキュベートして、発色させた。
1滴の停止緩衝液を加え反応を停止させた。
5、結果の表示:
ブランク・ウェルを450nmの波長で計測して、次に各々のウェルのOD値を読み取り、結果を以下の式に従って計算した:
S/N=試験血清のOD値/陰性対照の平均のOD値、S/N≧2.1の場合、試験血清は陽性であるとみなし、S/N<2.1の場合、試験血清は陰性であるとみなした。陰性対照のOD450<0.05である場合、そのとき、0.05を前記の式に取り入れ;OD450≧0.05の場合、そのとき、実効値を前記の式に取り入れた。結果は以下の通りだった:
HBV X遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するトランスジェニック・マウスの同定
1) PCRによるマウスの遺伝子型の同定
野生型p21対立遺伝子を同定するために、プライマー1(5'-TCTTCTGTTTCAGCCACAGGC-3')及びプライマー2(5'-TGTCAGGCTGGTCTGCCTCC-31)を使用し、そして436bpのバンドが野生型及びヘテロ接合性マウスから増幅されることができた。neo遺伝子を含む標的対立遺伝子を同定するために、neo遺伝子上のプライマー3(5'-ATTTTCCAGGGATCTGACTC-3')及びプライマー4(5'-CCAGACTGCCTTGGGAAAAGC-3')を使用した。HBX遺伝子を確認するために、プライマー7(5'-TCTCTGCCAAGTGTTTGCTGACGC-3')及びプライマー8(5'-TCGGTCGTTGACATTGCTGAGAGTC-3')を使用した。
抽出したマウス尾ゲノムDNAを、それぞれEcoRI及びBglIIにより消化し、得られた消化物を、ターゲッティング・ベクターの5'末端の外側に配置されたプローブを使ったサザン・ハイブリダイゼーションに共した。BglIIによる消化に関して、野生型p21対立遺伝子にあたる約8 kbの陽性バンドが現われるべきであるが、それに対し、標的p21対立遺伝子にあたるこの陽性バンドは9 kbに移動した。後者は、相同組換えの後の本来のBglII部位の削除とneo遺伝子による他のBglII部位の導入から生じる。EcoRIによる消化に関して、野生型p21対立遺伝子にあたる約7.7 kbの陽性バンドが現われるべきであるが、それに対し、標的p21対立遺伝子にあたる変異後のHBX遺伝子を含む上記バンドは約22 kbに移動した。
HBV cDNAを含むpADR-1のBglII及びBamHI消化産物から抽出した580bp断片を、ノーザン・ハイブリダイゼーションのためのプローブとして使用した。結果は、HBX遺伝子がマウスの肝臓及び腎臓で発現されていたことを示した。
HBsAg遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するトランスジェニック・マウスの表現型分析
1) ヘマトキシリン及びエオジン染色
1、固定
組織を中性ホルムアルデヒド溶液(100 mlの40%ホルムアルデヒド、900 mlの水、4 gのリン酸2ナトリウム、6.5 gのリン酸二水素ナトリウム)中で20時間にわたり固定した。
70%エタノール15分間
80%エタノール15分間
90%エタノール15分間
95%エタノール15分間
無水のアルコール15分間
無水のアルコール15分間
キシレン15分間
キシレン15分間
乾燥した組織を、加工されたパラフィン(すなわち、融解され、そして60℃で一晩寝かせた)の中に移し、そして2時間浸した、この期間の間にパラフィンを2度交換した。次に、組織を予熱した包埋枠組み中に移し、続いて融解パラフィンを速やかに注ぎ入れ、その間に、暖めた鉗子を使って組織の位置を調節した。次に、底板を上に置き、その上にいくらかの融解パラフィンを注ぎ、そしてその中の泡を慎重に取り除いた。それを室温に置き、融解パラフィンを凝固させた。
塊状パラフィンを好適なサイズにし、刃を10°の角度に合わせた回転式ミクロトーム(MICROM HM340E)で切った。形成されワックス-チップをきれいなアルミニウム・ホイルに移し、外科用のかみそりの刃を使って好適なサイズに切り、そしてそれぞれスライドに移した。サンプルが水面に浮かぶまで、適切な量の水を加えて、次に前記スライドを、約40℃のスライド乾燥機のプラットフォーム上に置き、そしてサンプルが広がるまで慎重に水を捨てた。前記スライドを、検体ボックス中にまとめ、37℃で一晩乾燥させた。
キシレン15分間;
キシレン15分間;
無水アルコール15分間;
95%エタノール5分間;
70%エタノール5分間;
水5分間;
流水による洗浄、5〜10分間;
70%エタノール-塩酸(200 mlの70%エタノール+10滴の塩酸)15〜30秒間;
70%エタノール-水酸化アンモニウム(200 mlの70%エタノール+10滴の水酸化アンモニウム)1分;
水5分間;
70%エタノール3分間;
エオジンY染色溶液(0.5 gのエオジンY、5 mlの水中に溶解した50 mgのブリリアント・レッドB、50 mlの水、2 mlの氷酢酸、390 mlの95%エタノール)1分間;
95%エタノール5分間;
無水アルコール5分間;
キシレン5分間;
キシレン5分間;
結果を図7に示した。
2) 免疫組織化学的分析
1.パラフィン切片を用意し、規定どおりに水に対してろうを取り除いた。
2.このスライドを、3%の過酸化水素中、10分間室温でインキュベートし、内性のペルオキシダーゼを不活性化した。
6.次に、このスライドに好適な割合に希釈したビオチン標識二次抗体(PBSで希釈)を加え、37℃で30分間インキュベートした。
8.次に、このスライドに好適な割合に希釈したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(PBSで希釈)を加え、37℃で30分間インキュベートした。
10.色素原物質を使って色を発色させた。
11.このスライドを水で十分に洗い、対比染色し、封入した。
結果を図8に示した。
マウス血清中のα-フェトプロテインの含量を、ヒト血清α-フェトプロテイン(α-AFP)に対する定量的なELISAキットを使って測定した。手順は以下のとおりであった:
2.サンプルを以下の比率で加えた:
4.1滴の色素原物質A(50 μl)、1滴の色素原物質Bを添加し、そして十分に混ぜ、次に色素形成のために37℃で15分間静置した。
6.横座標として標準の異なる濃度の対数、縦座標として対応するOD値を使った、標準曲線をプロットした。プロットした標準曲線の線状回帰方程式に基づき、サンプルの濃度を、その試験したOD値によって計算することができた。前記方程式は、以下のとおりである:
logOD=Blog[濃度]+A
2ヶ月齢マウスの比較結果を図9に示した。
Oncor社製のApopTaq(In situアポトーシス検出キット)を、アポトーシス検出のために使用し、手順は以下のとおりだった:
1.パラフィン切片を水に対して脱ろう化し、各回5分間、2回PBS中に浸した。
2.組織の用意
組織を、PBSで希釈したプロテアーゼK(20 μg/ml)により室温で15分間(60 μl/5cm2)処理し、次に純水で、各回2分間、2回洗浄した。
前記組織を、PBSに希釈した3%H2O2により5分間室温で処理し、次に純水で、各回5分間、2回洗浄した。
4.サンプルの平衡化
不必要な液体を慎重に捨てた。75 μlの平衡緩衝液を直接的にサンプル上に加え、次に少なくとも10秒間室温でインキュベートした。
不必要な液体を慎重に捨てた。TdTase作用溶液(77 μlの反応緩衝液+33 μlのTdTase)を直接的に加えて、次に37℃で1時間インキュベートした。
6.反応停止
サンプルに停止緩衝液を添加し、15秒間撹拌し、次に続けて室温で10分間インキュベートした。
サンプルを、各回1分間、3回PBSにより洗浄した。不必要な液体を慎重に捨てた後に、サンプルを、室温に暖めた抗ジゴキシン・ペルオキシダーゼ複合体で覆った。次に30分間室温でインキュベートした。
8.色の発色
サンプルを、各回2分間、4回PBSで洗浄した。色素形成のためにDABを使用した。
サンプルを、各回1分間、3回純水で洗浄し、その後純水中で5分間継続した。
10.対比染色
0.5%のメチルグリーン(100 mlの0.1 M酢酸ナトリウムpH4.0中に溶かした0.5 gメチルグリーン)を10分間室温での対比染色に使用した。次にサンプルを3回純水で洗浄し、最初の2回については、それぞれ10回水に浸し、3回目は、撹拌することなく、30秒間水に浸した。最後に、前記の手順を使って、サンプルを100%のn-ブタノール中で3回洗浄した。
サンプルを、各回2分間、3回キシレンに浸し、次に中性ゴムにより封入した。
結果は、アポトーシスが15ヶ月齢のトランスジェニック・マウスでも野生型マウスでも検出されないわけではないことが明らかであることを示した。
HBsAg遺伝子の標的を狙った組み込みを含有するマウス血清プロテオミクスの調査研究
1) 肝臓組織からのタンパク質の用意
1.肝臓組織をサンプルとして摘出した;
2.液体窒素下、乳鉢を使ってサンプルは粉末化した。サンプル1gにつき0.5 mlの溶解緩衝液(5 M尿素、2 Mチオ尿素、2%のSB-30、2%のCHAPS、1%のDTT、プロテアーゼ・インヒビターの混合物)を加えた後、サンプルを組織ホモジナイザーで30秒間均質化した;
4.その上清を4℃で45分間150,000gで超遠心分離した;
5.次に、上部に浮いている脂質層を慎重に避けて、得られた上清を取り出し、再び6℃で50分間40,000gで遠心分離した;
それぞれ3ヶ月齢の野生型マウス及びトランスジェニックホモ接合性マウスからの血液を、30分間室温で静置し、次に3500gで30分間遠心分離した。上層の血清を取り出し、そしてそのタンパク質濃度をPIERCE社製のBCATM-タンパク質アッセイ・キット(Cat. No. 23226)を使って測定し、各々の血清をアリコートの状態で-75℃で保存した。
1、等電点分離法
ゲル内再水和作法を使うことによって、250 μgのタンパク質を含む血清又は組織抽出物に、350 μlの終量までサンプル再水和作用溶液(8 mol/lの尿素、2%のCHAPS、微量のブロモフェノールブルー)、そこに還元剤DTTを、20 mmol/lの終濃度まで加え、0.5%の終濃度までIPG緩衝液を加えた。IPG乾燥ゲル(pH3〜10、L,18cm、Amersham Pharmacia Biotech)を、前記溶液中に置き、以下の指標下、等電点分離法を実行した:
等電点分離法の後に、前記IPGゲルを10 mlのSDS平衡緩和液(50 mmol/lのTris-Cl pH8.8、6 mol/lの尿素、30%のグリセロール(V/V)、2%のSDS(V/V)、微量のブロモフェノールブルー)中に置き、次に振とう機により各回10分間、2回振とうする、前記の初回について、平衡緩衝液は1OO mgのDTTを含み、前記2回目について、平衡緩衝液は250 mgのヨードアセトアミドを含む。
IPGゲルのサイズに従い、200×200×1 mm3のサイズを有する1個の12.5%の同質のゲルを用意した。平衡されたIPGゲルを、SDS-PAGE上に転写し、続いて電気泳動緩衝液(25 mmol/lのTris、250 mmol/lのグリシン pH8.3、0.1%のSDS)によって用意された、微量のブロモフェノールブルーを含む0.5%のアガロースを用いて遮蔽した。14〜15℃で、まず、ゲルにつき120 mAの定電流を40分間流し、次にガラスプレートの下縁から1 mm手前までブロモフェノールブルーが移動するまで30 mAに上げた。電気泳動ゲルを、メタノール:酢酸:水(3:3:4)中で固定し、クーマシーブリリアントブルー染色溶液(メタノール:水:酢酸=4.5:4.5:1によって調整した0.25%のクーマシーブリリアントブルーR250)により4時間以上染色した。次に、7%酢酸-10%エタノールを使って脱色した。
Amersham Pharmacia Biotech社製の画像分析ソフトウェアであるImageMaster2D Elite3.01を使うことによって電気泳動結果を分析した。
2Dゲルから明らかな相違をもつタンパク質のドットを選び、次にかみそりの刃により染色された縁に沿って切り落とし、管に移し、50%のアセトニトリル(クロマトグラフィー・グレード)、50 mMの重炭酸アンモニウムを含む溶液で脱色し、遠心分離し、そして真空下で乾燥させた。8〜10 μlの0.01 g/Lトリプシン溶液を各々の管に添加し、37℃で20時間インキュベートした。前記トリプシンは、ボーリンガー社製であり、(修飾された、配列決定用グレード)、そしてその溶液は、25 mmol/Lの重炭酸アンモニウム溶液を使って用意された。120 μlの15%トリフルオロ酢酸(TFA、Fluka社)を添加し、そして40℃で1時間インキュベートした。上清を取り出し、次に120 μlの2.5%TFA、50%ACN溶液を加え、そして30℃で1時間インキュベートし、最後に合わせて、凍結乾燥した。
10 μlの0.5%トリフルオロ酢酸中にペプチド混合物を溶解し、続いて凍結乾燥した。1 μlの溶解したペプチド混合物又は脱塩抽出物を、ドットに対して得、1 μlの、0.1%のトリフルオロ酢酸/50%のアセトニトリル中に溶解されている飽和1-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸溶液をマトリックスとし、次に室温で乾燥させた。Bruker社製のREFLEX IIIマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF-MS)を使うことによって、タンパク質を337 nmのレーザー長で検出した。
タンパク質等電点、分子量及びペプチド・フィンガープリンティングの特徴の範囲、並びに他の指標の入力データに従って、それらの指標に合致するタンパク質が、データベース検索プログラムの利点を受け入れるタンパク質データベース内で検索されることができる。ウェブ上のタンパク質データベース検索プログラムは、以下の通りである:ExPASy分子生物学サーバーによって提供されたPeptIdent(http://www.expasy.ch/tools/peptident.html)、及びUCSF質量分析施設により提供されたMS-Fit(http://prospector.ucsf.edu/htmlucsi3.0msfit.htm)。
Claims (10)
- マウスモデルの構築方法であって、以下のステップ:
a) HBV X遺伝子及びHBV表面抗原(HBsAg)遺伝子から選ばれる着目の外来性遺伝子を、マウスp21遺伝子座の第2エクソンの上流配列及び下流配列に相同的な2つの配列を担持する好適なベクター内に挿入して、組換えターゲッティング・ベクターを構築し;
b) ステップa)からのターゲッティング・ベクターを使って試験されるマウスのES細胞をトランスフェクトし、そして上記外来性遺伝子がマウスp21遺伝子座の第2エクソンに組み込まれている標的とされたES細胞をスクリーニングし;
c) ステップb)から得られた標的とされたES細胞を、上記マウスの胞胚内に注入し、そして標的とされたES細胞を含む胚が発生するように上記胞胚を試験管内で培養し;そして
d) ステップc)から生じた胚を、上記動物の子宮に移植し、それによって外来性遺伝子を安定して発現する子孫を作製すること、
を含む、構築方法。 - 前記ターゲッティング・ベクターが、前記の着目の外来性遺伝子、前記のマウスp21遺伝子座の第2エクソンの上流配列及び下流配列に相同的な配列、並びに陽性及び陰性選択マーカーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲッティング・ベクターが、pLoxpneo-HBsAgである、請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲッティング・ベクターが、pLoxpneo-HBXである、請求項1に記載の方法。
- HBV X遺伝子及びHBV表面抗原(HBsAg)遺伝子から選ばれる着目の外来性遺伝子を挿入された細胞ゲノム上のマウスp21遺伝子座の第2エクソンを特徴とするマウス細胞。
- 同じ遺伝子型を有する胚性幹細胞又は体細胞である、請求項5に記載の細胞。
- 請求項1に記載の方法により得られたトランスジェニック・マウス。
- 遺伝子ノックイン法によりHBV X遺伝子及びHBV表面抗原(HBsAg)遺伝子から選ばれる着目の外来性遺伝子がマウスp21遺伝子座の第2エクソン内に部位特異的に組み込まれたそのマウスの染色体を特徴とする、トランスジェニック・マウス。
- マウスp21遺伝子座の第2エクソン内に部位特異的に挿入されたHBsAg遺伝子を特徴とするトランスジェニック・マウスであって、上記着目の外来性遺伝子が安定して受け継がれ、そして発現されて、上記マウスが正常に分化し、そして一定期間の後に肝細胞癌に罹患する、上記トランスジェニック・マウス。
- 肝細胞癌の病因、その早期診断及び治療の研究、並びに抗がん剤のスクリーニングにおける、請求項8又は9に記載のトランスジェニック・マウスの使用。
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