CN1298844C - Msh5被删除的小鼠及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种动物，例如转基因小鼠，其中的MSH5基因被错表达。这种动物可用于筛选对多种疾病的治疗法。还描述了用于鉴定避孕剂的方法。

Description

MSH5被删除的小鼠及其用途
政府资助
在此描述的工作受国立卫生研究院的资助。美国政府对本发明具有某些权利。
发明领域
本发明是关于一种其MutS同源物5(MSH5)基因被错表达的动物和使用这种动物或其细胞的方法，例如用于评价生育力治疗的方法。
发明背景
MutS同源物5(MSH5)是已知包含在DNA错配修复中的蛋白质家族的一种(Modrich，P.和Lahue(1996)生物化学年评65，101-133；Kolodner，R.(1996)基因演变10，1433-1442)。MSH2，MLH1和MSH6的种系突变可导致遗传性非息肉结肠癌(HNPCC)或Lynch综合征(Leach，F.S.等(1993)细胞75，1215-1225；Bronner，C.E.等(1994)自然368，258-261；Papadopoulos，N.等(1994)科学263，1625-1629；Akiyama，Y.等(1997)癌症研究57，3920-3923；Miyaki，M.等(1997)自然遗传17，271-272)。小鼠中Msh2、Mlh1和Pms2的失活将导致诱发肠癌和其它癌的遗传性倾向(de Wind N.等(1995)，细胞82，321-330；Reitmair，A.H.等(1995)自然遗传，11，64-70)。对酵母菌的早期研究揭示了包括MSH5在内的这些蛋白质的某些在减数分裂中的作用(Hollingsworth，N.M.等(1995)基因和发育9，1728-1739；Ross-Macdonald，P.和Roeder，G.S.(1994)细胞79，1069-1080)。在小鼠中针对基因的研究证实了MLH1和PMS2在哺乳动物减数分裂中的作用(Baker，S.M.等(1995)细胞82，309-320；Edelmann，W.等(1996)细胞85，1125-1134；Baker，S.M.等自然遗传13，336-342)。
发明概述
本发明至少部分地是根据产生了对于在MutS同源物5(MSH5)基因无效突变是纯合的动物，以及观察到这些动物是不育的。因此，本发明以其中编码MutS同源物5(MSH5)蛋白的基因被错表达的非人动物为特征。
在优选的实施方案中，动物优选地是转基因哺乳动物，例如非人灵长目动物或猪，例如小型猪、猴、山羊或啮齿动物如大鼠，但优选地是小鼠。
在优选的实施方案中，与野生型动物相比较，编码MSH5蛋白的基因其表达减弱了。例如，与野生型动物相比较MSH5蛋白的水平可被抑制至少50％、60％-70％、80％、90％或100％。
在优选的实施方案中，编码MSH5蛋白的基因错表达是由于MSH5基因损坏而引起的。例如MSH5基因可由于失去编码全部或部分此蛋白的DNA而被损坏。
在优选的实施方案中，这种动物可以是对错表达的MSH5基因杂合的或纯合的，例如它可以是对MSH5转基因杂合的或纯合的转基因动物。
在优选的实施方案中，这种动物是带有MSH5基因转基因损坏的转基因小鼠，优选地是带有使此基因产物失活的插入或缺失。
另一方面，本发明以一种核酸分子为特征，当它被导入动物或细胞时将导致MSH5基因在此动物或细胞中错表达。在优选的实施方案中，此核酸分子包含一个MSH5核苷酸序列，此核苷酸序列含有例如插入或缺失的损坏，优选地是插入一个标记序列。例如该核酸分子可以是显示在图1中的靶向构建体。
另一方面，本发明以一种评价生殖能力治疗的方法为特征。此方法包括：对MSH5错表达的动物如转基因小鼠，或来自它的细胞给予这种治疗并测定这种治疗对生殖能力指标的作用，例如精子计数，睾丸大小，或卵母细胞的形态，从而评价对生殖能力的治疗作用。可以在体内或体外实施此方法。
在优选的实施方案中，该动物或细胞是在此所述的动物或细胞。在另一些优选的实施方案中，该方法是使用其MSH5基因的表达被抑制的转基因小鼠。还有一些优选的实施方案中，该方法是使用来自其MSH5基因的表达被抑制的转基因小鼠的细胞。
另一方面，本发明以一种用于鉴定调节MSH5活性的化合物的方法为特征。该方法包括使MSH5与待测化合物接触，并测定此待测化合物对MSH5活性的作用，从而发现一种调节MSH5活性的化合物。在优选的实施方案中，MSH5的活性是被抑制。
另一方面，本发明以一种用于调节MSH5活性的方法为特征。此方法包括使MSH5或表达MSH5的细胞与一种化合物接触，此化合物能以足够调节MSH5活性的量(例如足够的浓度)结合于MSH5。在优选的实施方案中，MSH5的活性是被抑制，例如此方法可用于避孕。
另一方面，本发明以一种检定受检者的方法为特征，用于检定受检者是否患有生殖能力疾病或障碍或者处于发生这种疾病的危险中。此方法包括从该受检者采集样品；使此样品与对MSH5选择性杂交的核酸探针或引物接触，并测定样品中是否存在异常的MSH5表达或活性，从而检定受检者是否患有生育能力疾病或障碍，或者处于发生这种疾病的危险中。
另一方面，本发明以一种分离的细胞或者纯化的细胞制备物为特征，它们是来自MSH5错表达动物，例如在此所述的MSH5错表达动物。在优选的实施方案中，该细胞是其编码MSH5蛋白的基因被错表达的转基因细胞。此优选的转基因细胞可以是卵母细胞或精母细胞。
在优选的实施方案中，该细胞对于此转基因突变基因是杂合的或纯合的。
本发明的其它特征和优点将显示在下面的详述和权利要求中。
附图简述
图1是产生Msh5无效突变小鼠的示意图。图1A描述该基因靶向策略。图1B是用Nsil消化的小鼠尾部DNA的DNA印迹分析图。对来自杂合体交配的606个子代作DNA分析表明产生了184只Msh5+/+小鼠、275只Msh5+/-小鼠和147只Msh5-/-小鼠，证实了这种突变等位基因的孟德尔传递方式。图1C是使用不同的探针的来自Msh5+/+和Msh5-/-小鼠睾丸RNA的RNA印迹分析图。图1D是使用抗-MSH5抗体的来自雄性小鼠睾丸蛋白质的蛋白质印迹分析图。
图2显示在Msh5-/-雄性动物精子发生的损伤。图2A显示在来自8天-29天龄的野生型雄性动物和在成年的野生型和Msh5-/-雄性动物的试验中，Msh5(上框内)和肌动蛋白(下框内)的mRNA表达。图2B-E是来自野生型(B，D)和Msh5-/-(C，E)雄性动物的成熟睾丸H-E染色切片的光学显微镜相片，显示在Msh5缺乏的雄性动物丧失了偶线期后的精母细胞。Le：间质细胞，S：Sertoli足细胞，A：A型精原细胞，B：B型精原细胞，PL：细线前期精母细胞，L：细线期精母细胞，Z：偶线期精母细胞，P：粗线期精母细胞，RS：球形精子细胞，ES：长形精子细胞，SP：精子。图2F，G是在来自29天龄雄性动物野生型(F)和Msh5-/-(G)睾丸的切片上，使用抗-GCNA1抗体对胚细胞的免疫定位图(红色免疫活性蛋白对浅蓝色复染)，显示在野生型动物睾丸中有大量的精母细胞、精子细胞和精子，以在MSH5-缺乏的睾丸中有几个GCNA1阳性细胞。(对于B和C标尺＝100μm，对于D-G标尺＝25μm)。
图3显示Msh5-/-雄性动物在发育过程中逐渐排空胚细胞。图3A、B、E、F、I、J是使用抗GCNA1抗体，对来自野生型(A，E，I)和Msh5-/-(B，F，J)雄性动物睾丸的胚细胞免疫定位图，显示在Msh5缺乏的小鼠从出生后17天向后胚细胞迅速排空，相比之下在Msh5+/+雄性动物的精细管内生精子细胞的密度和种类不断增加。图3C，D，G，H，K，L是来自野生型(C，G，K)和Msh5-/-雄性动物(D，H，L)睾丸切片的TUNFL染色图，显示在相同时间范围内与野生型雄性动物输精管中非常低的凋亡水平相比较，在Msh5-/-雄性动物从出生后17天起往后持续的凋亡过程。(标尺＝100μm)。
图4显示在Msh5精母细胞内染色体联会之前减数分裂的损伤。图4A-C是来自野生型(A)和Msh5-/-(B，C)睾丸的银染色精母细胞染色体图形，显示在没有MSH5时配对完全失败(B)或某些部分的配对(C)。图4C中箭头指示表现出部分配对的染色体。注意这些染色体中的许多看来是不均匀的配对。
图5显示Msh5-/-雄性动物卵母细胞丧失和随后的卵巢退化。图5A，B显示来自出生后3天野生型(A)和Msh5-/-(B)雌性动物的卵巢，显示以GCNA1染色的卵母细胞。图5C显示来自出生后25天Msh5-/-雌性动物完整的卵巢(H-E染色)，只包含3个滤泡和退化的组织。图5D，E是来自成年的野生型(D)和Msh5-/-雌性动物(E)的H-E染色卵巢切片图形，显示不存在Msh5时卵母细胞和卵巢结构的完全丧失。B：卵巢囊，OV：输卵管。所有的标尺＝200μm。图5F是在出生后25天和成熟期野生型和Msh5-/-卵巢中ZP3和肌动蛋白的表达图谱。
图6显示Msh5-/-雌性动物卵子发生的损伤导致滤泡发生失败。图6A-D显示来自e18野生型(A，B)和Msh5-/-(C，D)胚胎的卵巢，显示出以抗-GCNA1(A，C)染色的卵原细胞或对减数分裂染色体细节的H-E定位(C，D)。图6E-H显示来自出生后3天的野生型(E，F)和Msh5-/-(G，H)雌性动物的卵巢中卵母细胞的GCNA1定位。箭头▲指示粗线期卵母细胞(细胞核的斑点状红色染色对比粗线期前卵母细胞的浓密红色染色)，↑指示最早期原始滤泡的外形。图6I，J显示来自出生后6天野生型(I，J)动物卵巢中卵母细胞的GCNA1定位(处于减数分裂停滞的卵母细胞被过度染色)。↑指示原始滤泡，O：卵母细胞。对于A，C，E，G和I标尺＝100μm，对于B，D，F，H和J标尺＝25μm。
详述
本发明至少部分地是根据产生了对于在MutS同源物5(MSH5)基团无效突变是结合的动物，以及观察到这些动物是不育的。因此，本发明以其中编码MutS同源物5(MSH5)蛋白的基因被错表达的非人动物为特征。在优选的实施方案中，动物优选地是转基因动物。
在此所用的“转基因动物“包括非人的哺乳动物，例如猪、猴、山羊或啮齿动物例如小鼠，其中动物的一种或几种细胞，而优选地是基本上全部细胞包含转基因。是通过例如微注射、转染或感染如用重组病毒感染导入进该细胞的前体而直接或间接地将转基因导入该细胞中。术语基因操作包括导入重组DNA分子。这种分子可能在染色体中被整合，或者它可能是染色体外复制的DNA。
在此使用的名词“啮齿动物”指的是啮齿目系统发育等级中所有成员。
在此使用的名词“错表达”包括基因表达的非野生型模式。在此所使用的表达包括转录、转录后例如mRNA稳定性阶段，以及翻译和翻译后阶段。错表达包括：以非野生型的水平表达，即超量表达或低表达。在基因被表达的时间或阶段方面不同于野生型的表达模式，例如在预定的发育期间或阶段增强或减弱的表达(与野生型相比较)；预定的细胞类型或组织类型中在减弱的表达方面(与野生型相比较)不同于野生型的表达模式；在被表达多肽的剪接大小、氨基酸序列、转换后的修饰、或生物活性方面不同于野生型的表达模式；在环境刺激或细胞外刺激对基因表达的作用方面不同于野生型的表达模式，例如在刺激强度增加或减弱时增强或减弱的表达模式(与野生型相比较)。错表达包括来自转基因核酸的任何一种表达。错表达包括基因或转基因的缺乏或非一表达，例如由于此基因或其控制序列全部或部分缺失可诱发这种错表达。
在此使用的名词“敲除”(“knockout”)意指动物或其细胞中转基因的插入损坏了此动物或其细胞中的内源性基因。这种损坏可以基本上除去此动物或细胞内的MSH5。
在优选的实施方案中，编码MSH5蛋白的基因错表达是由于MSH5基因损坏而引起的。例如MSH5基因可由于失去编码全部或部分此蛋白的DNA而被损坏。
在优选的实施方案中，这种动物可以是对错表达的MSH5基因杂合的或纯合的，例如它可以是对MSH5转基因杂合的或纯合的转基因动物。
在优选的实施方案中，该动物是带有MSH5基因转基因损坏的转基因小鼠，优选地是带有使此基因产物失活的插入或缺失。
另一方面，本发明以一种核酸分子为特征，当它被导入动物或细胞时将导致MSH5基因在此动物或细胞内错表达。在优选的实施方案中，此核酸分子包含一个MSH5核苷酸序列，此核苷酸序列含有例如插入或缺失的损坏，优选地是插入标记序列。野生型MSH5的核苷酸序列对本领域是已知的，并被描述在例如Winand，N.J.等(1998)基因组53，69-80中，此文献的内容在此被引入作为参考。例如该核酸分子可以是图1中所显示的靶向构建体。
在此使用的名词“标记序列”意指有如下用途的核酸分子：(a)被用作核酸构建体的一部分(例如靶向构建体)以便损坏待研究基因(例如MSH5基因)的表达，以及(b)被用于鉴定已将此靶向构建体掺入基因组的细胞。例如此标记序列可以是编码一种蛋白质的序列，此蛋白质使细胞具有一种可检测的特性，例如抗菌素抗性基因如新霉素抗性基因，或者可以是编码一种在此细胞中通常未发现的可测定酶的序列，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、虫荧光素酶和β-半乳糖苷酶等。
在此使用的“基因损坏”意指基因序列的改变，例如编码区的改变。损坏包括：插入、缺失、点突变和重排如倒位。这种损坏可发生在天然MSH5DNA序列的区域(例如一个或几个外显子)和/或此基因的启动子区域内，以致同此基因的野生型或天然存在的序列相比较减弱或阻碍了此基因在细胞内的表达。借助于经典的随机突变法或定点诱变法可诱发这种“损坏”。通过转基因可导入损坏。整个基因缺失是一种损坏。优选的损坏是在杂合体中MSH5的水平降低至野生型的大约50％或者在纯合体中基本上消除了MSH5。
另一方面，本发明以一种评价生育能力治疗的方法为特征。此方法包括：对MSH5错表达的动物或它的细胞给予这种治疗；测定这种治疗对生育能力指标的作用，从而评价对生育能力的治疗作用。可以在体内或体外实施此方法。如在此使用的名词“生育能力指标”包括与生育能力有关的任何一种参数，例如精子计数、睾丸大小或卵母细胞的形态。
在此使用的“对动物或细胞给予治疗”意指对动物或细胞分发、递送或施用一种治疗。对于治疗药剂名词“给予”意指使动物接触或对动物分发、递送或施用治疗药剂，通过任何适合的途径以便将治疗药剂递送至动物体内所希望的部位，包括通过非经肠道或口服途径给药，肌内注射、皮下/皮内注射、静脉内注射、口颊给药、透皮给药和通过鼻内或呼吸道途径给药。
在优选的实施方案中，该动物或细胞是在此所述的动物或细胞。在另一些优选的实施方案中，该方法是使用其MSH5基因的表达被抑制的转基因小鼠。还有一些优选的实施方案中，该方法是使用来自其MSH5基因的表达被抑制的转基因小鼠的细胞。
另一方面，本发明以一种用于鉴定调节MSH5活性的化合物的方法为特征。该方法包括使MSH5与待测化合物接触并测定此待测化合物对MSH5活性的作用，从而发现调节MSH5活性的化合物。在优选的实施方案中MSH5的活性是被抑制。
在此所使用的名词“化合物”包括任何作用剂，例如肽、肽类似物、小分子或其它药剂，它可结合于MSH5蛋白，对例如MSH5的表达或MSH5的活性具有刺激或抑制作用，或者对例如MSH5底物的表达或活性具有刺激或抑制作用。
另一方面，本发明以一种用于调节MSH5活性的方法为特征。此方法包括使MSH5或表达MSH5的细胞与一种结合MSH5的化合物接触，该化合物的量足以调节MSH5活性。在优选的实施方案中，MSH5的活性是被抑制，例如在避孕时。
在此使用的名词“避孕”包括阻止受精，优选地是不损害生育能力。
另一方面，本发明以一种检定受检者的方法为特征，用于检定受检者是否患有生育能力疾病或障碍或者处于发生这种疾病的危险中。此方法包括从该受检者采集样品；使此样品与对MSH5选择性杂交的核酸探针或引物接触，并测定样品中是否存在异常的MSH5表达或活性，从而检定受检者是否患有生育能力疾病或障碍，或者处于发生这种疾病的危险中。
在此使用的名词“生育能力疾病或障碍”包括影响受精的任何一种病症或状态。生育能力疾病包括配子即卵细胞和精子发育异常的状态以及不能将胎儿携带至终点的状态。这种生育能力障碍的实例包括低精子计数、习惯性流产和异常排卵。
另一方面，本发明以一种分离的细胞或者纯化的细胞制备物为特征，它们是来自MSH5错表达动物，例如在此所述的MSH5错表达动物。在优选的实施方案中，该细胞是其编码MSH5蛋白的基因被错表达的转基因细胞。此优选的转基因细胞是卵母细胞或精母细胞。
在优选实施方案中，该细胞对于此转基因突变基因是杂合的或纯合的。
在此使用的名词“转基因细胞”意指含有转基因的细胞。
在此使用的“纯化的制备物”是按数量或重量含有至少10％、较优选的是50％，更优选的是90％受检细胞的制备物。
下面的部分将对本发明作进一步详细的描述。
制备MSH5靶向构建体
用特定的在选定位置消化的限制性酶消化将用于产生其靶向构建体的MSH5核苷酸序列，以致可将编码一个标记基因的新DNA序列插入此MSH5核苷酸序列内的适当位置。插入此标记基因应该使它可用来阻止该天然基因的表达。位置取决于多种因素，如序列中将被切割的限制性位点，以及是否将中断外显子序列或启动子序列，或者二者都中断(即精确的插入位置对抑制MSH5基因表达是必不可少的)。在某些情况下，理想的是精确地除去将被抑制基因的一个或几个外显子的一部分或者甚至全部，以致当此标记基因被插入靶向构建体时保持类似于原来基因组序列的靶向构建体长度。在这些情况下，用适当的限制性内切核酸酶切割此基因组DNA，以致可除去适当大小的片段。
该标记序列可以是可察觉和/或可检测的任何一种核苷酸序列。例如该标记基因可以是一种抗菌素抗性基因或者是在基因组中它的表达量被检测的其它基因。该标记基因可以被连接于它自己的启动子或者连接于在被插入的细胞中仍有活性的任何来源的另一强启动子；或者使用MSH5基因的启动子它可以被转录。该标记基因还可以具有附着于此基因3′末端的聚腺苷酸(ploy A)序列；此序列用来终止该基因转录。例如，此标记序列可以是一种蛋白质，这种蛋白质(a)赋予对抗菌素或其它毒素的抗性，例如原核生物宿主细胞对氨苄青霉素、四环素或卡那霉素的抗性，以及哺乳动物细胞对新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性，(b)补充细胞的营养缺陷；或(c)供给从复合培养基中得不到的关键性营养物。
在用适合的限制性酶酶切消化MSH5 DNA序列之后，应用本领域技术人员已知的和在Sambrook等分子克隆实验手册、第二版、冷泉港实验室出版社编辑：1989(将此文献的内容引入作为参考)中描述的方法将此标记基因序列连接进入MSH5 DNA序列。
优选地，将被连接的DNA片段的末端是相容的：是通过产生在相容性末端的酶限制性内切所有的片段，或者通过在连接之前平切此末端来实现这一点。可用本领域已知的方法进行平切，例如通过使用Klenow片段(DNA聚合酶I)填满粘性末端。
连接的靶向构建体可被直接插入胚胎干细胞，或者还可以在插入之前先将它安放进入适当的载体用于扩增。优选的载体是那些可在细菌细胞内迅速扩增的载体，例如pBluescript II SK载体(Stratagene，San Diego，CA)或pGEM7(Promega Corp.，Madison.WI)。
转基因小鼠的构建
转染胚胎干细胞
可以用小鼠胚胎干细胞(ES细胞)产生转基因(例如敲除型)MSH5小鼠。任何能够整合进入并成为发育中的胚胎种系的一部分，以致形成靶向构建体的种系传递的ES细胞系适合用于此目的。例如，可用于产生ES细胞的小鼠株是129J株。优选的ES细胞系是鼠细胞D3系(美国典型培养物保藏中心目录号CRL 1934)。用本领域已知的方法可培养此细胞并制备用于DNA插入，在如下文献中描述了这些方法：Robertson，畸胎癌和胚胎干细胞：一种实用技术，E.J.Robertson编著，IRL出版社，Washington，D.C.1987，Bradley等发育生物学的当今话题，20：357-371，1986以及Hogan等操作小鼠胚胎：实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港N.Y.1986，这些文献的内容均被引入作为参考。
可借助于本领域已知的方法将此敲除构建体导入ES细胞中，例如Sambrook等所述的方法。适合的方法包括电穿孔法，微注射法和磷酸钙处理法。
将被导入ES细胞的靶向构建体优选地是线性的。通过使用只选择性地在载体序列内而不在MSH5基因序列内切割的适当限制性内切核酸酶消化可实现线性化。
在导入靶向构建体之后，筛选出存在此构建体的细胞。可应用多种方法筛选这种细胞。当标记基因是一种抗菌素抗性基因时，可在有致死浓度的抗菌素存在下培养此细胞。推测那些残活的细胞已整合了该敲除构建体。还可以对ES细胞基因组DNA应用DNA印迹分析法。如果此标记基因是一种编码其活性可被检测的酶(如β-半乳糖苷酶)基因，则可以在适当的条件下对细胞加入此酶底物，并可分析酶活性。
为了鉴定那些带有适当靶向构建体整合的细胞，可应用标准的方法从ES细胞中提取出此DNA。然后用一种或几种探针通过DNA印迹分析探测此DNA，这些探针被设计成可按特殊的模式对用特定限制性酶消化的基因组DNA杂交。另一方面或者补充地，可用几种探针通过PCR扩增此基因组DNA，这些探针被特异性地设计成可扩增特定大小和序列的DNA片段，以致只有那些在适当位置含有靶向构建体的细胞能产生适当大小的DNA片段。
胚胎的注射/植入
例如在如下文献中叙述了对胚胎的操作和微注射程序：操作小鼠胚胎，冷泉港实验室出版社，冷泉港N.Y.1986(此文献的内容被收入作为参考)。类似的方法被用于产生其它的转基因动物。在一个示范性实施方案中，是从6周龄的雌性小鼠收集受精卵，此小鼠已先用怀孕母马血清(PMS)处理，48小时后再用人绒毛膜促性腺激素处理使之过度排卵。将准备好的雌性动物与雄性动物放在一起，第二天早晨检查阴道栓。按动情期选择假怀孕雌性动物，将这种动物与证明是无菌输精管切除的雄性动物放在一起用作接受者。收集受精卵，除去丘细胞。而且还可收集胚细胞。从与雄性小鼠配对的雌性小鼠中回收原核胚。用孕母马血清(PMS)处理雌性小鼠诱发滤泡生长，并用人绒毛膜促性腺激素(hCG)处理诱发排卵。胚胎回收在Dulbecco氏改进的磷酸缓冲盐水(DPBS)中，维持在以10％胎牛血清补充的Dulbecco改进的必需培养基(DMEM)中。
可使用配有显微镜的标准显微操作器进行MSH5靶向构建体的微注射。例如，进行微注射时通常是将胚胎固定在油下的100μl DPBS液滴中。将DNA液微注射进入雄性原核中。通过原核膨胀监视注射的成功。应用类似的技术可将重组ES细胞注射进入胚细胞中。注射之后立即将胚胎转移至接受者雌性小鼠，例如与输精管切除的雄性小鼠配对的成熟雌性小鼠的体内。按照一般的程序，先将接受者雌鼠麻醉，作腰倒切开暴露出输卵管，然后将胚胎转移进入输卵管的壶腹区。缝合体壁并用伤口夹封闭皮肤。
筛选是否存在靶向构建体
可通过标准的程序在出生之后对转基因(例如敲除的)动物进行鉴定。应用DNA印迹分析法和/或PCR可筛选来自尾部组织的DNA是否存在靶向构建体。然后如果认为似乎是嵌合体的子代在它们的种系中携带有该靶向构建体，则可使它们相互杂交以便产生纯合的敲除动物(Knockout animals)。如果不清楚是否子代将会具有种系传递，可让它们与亲代或其它品系杂交并筛选其子代的杂合性。通过DNA印迹分析和/或DNA的PCR扩增对此杂合体进行鉴定。
然后可使此杂合体相互杂交以便产生纯合的转基因子代。通过对来自如下小鼠的等价量基因组DNA作DNA印迹分析可对纯合体进行鉴定：这种杂交产生的小鼠，已知是杂合体的小鼠，以及野生型小鼠。可如上面所述设计筛选这些DNA印迹的探针。
鉴定和描述此敲除子代特征的其它方法是本领域已知的。例如RNA印迹分析可用于探测其mRNA是否存在编码转录物的被敲除基因、标记基因或者这二种基因。此外，蛋白质印迹分析法可被用于检测这些子代的多种组织中此被敲除基因的表达水平，是通过在这种基因被表达的部位，用针对由此敲除基因所编码蛋白质(例如MSH5蛋白)的抗体或者针对标记基因产物的抗体探测这些蛋白质印迹来进行检测。最后，使用适合的抗体还可对来自子代的多种细胞作原位分析(如固定的和用抗体标记的细胞)和/或FACS(荧光激活细胞分类)分析以便寻找是否存在靶向构建体基因产物。
其它的转基因动物
用于本发明方法的转基因动物可以是哺乳动物、鸟类、爬行动物或两栖动物。适合在此所述用途的哺乳动物包括：反刍动物、有蹄动物、驯养的哺乳动物和乳牛。优选的动物包括：山羊、绵羊、骆驼、母牛、猪、马、牛、美洲驼、鹅和火鸡。预处理和使用这些动物的方法是本领域已知的。产生转基因猪的程序可见如下文献：White和Yannoutsos，补体研究的当今话题：64届免疫学讨论会，pp 88-94；美国专利号5,523,226；美国专利号5,573,933；PCT申请WO 93/25071和PCT申请W095/04744。产生转基因大鼠的程序可见如下文献：Bader和Ganten，临床及实验药理学和生理学，增刊3：S81-S87，1996。产生转基因牛的程序可见如下文献：转基因动物技术手册，1994。Carl A.Pinkert编著、学术出版公司，产生转基因绵羊的程序可见如下文献：转基因动物技术手册，1994，Carl A.Pinkert编著、学术出版公司。
MSH5转基因小鼠的用途
可将MSH5错表达动物如小鼠或其细胞用于对MSH5-相关的障碍例如生殖能力障碍筛选治疗法。可在一定的剂量范围内对动物或细胞给予此候选的治疗法。可在不同的时间点测定治疗效果，评价对此障碍的治疗作用。
通过测定治疗法对生殖能力指标的作用可评价这些治疗法。这些参数包括精子计数，睾丸大小或卵母细胞形态。例如对生殖能力疾病的治疗包括对动物卵巢退化的治疗，从而发现适合于给予人类对象的治疗法。
本发明的方法可被用于研究从MSH5被消除的动物得到的细胞，以便阐明在细胞过程如减数分裂中MSH5的功能机制。例如，可从MSH5错表达动物分离出细胞，用于鉴定在MSH5下游以MSH5途径或以单独途径起作用的作用剂。
候选的治疗法：
应用在此所述的方法评价的候选的治疗法可包括：(a)对MSH5错表达动物或细胞给予治疗剂(例如药物、化学物质、抗体、蛋白质、核酸或其它物质)；(b)对MSH5错表达动物给予饮食规范；(c)对MSH5错表达动物或细胞给予电离辐射处理。还可以对MSH5错表达动物或细胞给予上述治疗法的任何组合形式。可在用于评价候选治疗法的障碍或状态发作之前、同时和/或发作之后给予这种治疗法。可通过口服、非经肠道给药或局部给药对MSH5错表达动物给予治疗剂。
预言性/诊断测定法
本发明还适合于预言性医学领域，其中诊断性和预测性检测法被用于预测性(预言性)目的，从而对个体进行预防性治疗。因此，本发明的一个方面是关于诊断性检测法，用于根据生物样品(例如血液、血清、细胞、组织)测定MSH5蛋白和/或核酸表达以及MSH5的活性，从而确定某个体是否患有与MSH5异常表达或异常活性有关的疾病或障碍例如不育，或者正处于发生这种障碍的危险中。本发明还提供了预测性(或预言性)检测法，用于确定某个体是否处于发生与MSH5蛋白、核酸表达或MSH5活性有关障碍的危险中。例如，可以从生物样品中检测MSH5基因中的突变。这种检测法可被用于预测性或预言性目的，从而在以MSH5蛋白、核酸表达或MSH5活性为特征的或者与此有关的障碍发作之前对个体作预防性治疗。
筛选试验法
本发明提供了一种方法(在此也被称为“筛选试验法“)，用于鉴定可结合于MSH5蛋白，对例如MSH5表达或MSH5活性具有刺激或抑制作用，或者对例如MSH5基质的表达或者活性具有刺激或抑制作用的调节剂，即候选或待测的化合物或者作用剂(例如肽、肽相似物，小分子或其它药物)。
在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选作为MSH5蛋白或多肽或者其生物活性部分基质的候选或待测化合物的试验法。在另一实施方案中，本发明提供了用于筛选可结合于MSH5蛋白或多肽或者其生物活性部分，或者可调节其活性的候选或待测化合物的试验法。应用本领域已知的组合文库法中多种方法的任何一种都可以获得本发明的待测化合物，这些方法包括：生物学文库，可空间寻址的平行固相或液相文库，需要去卷曲的合成文库法，“一珠一化合物”文库法以及应用亲和层析选择的合成文库法。生物学文库法局限于肽文库，而其它四种方法可用于肽、非肽寡聚体或化合物的小分子文库(Lam，K.S.(1997)抗癌药物设计，12：145)。
治疗方法
本发明的另一方面是关于为治疗目的调节MSH5表达或者其活性的方法。因此，在示范性实施方案中本发明的调节法包括使细胞与MSH5或者与调节MSH5蛋白一种或几种活性的作用剂接触。调节MSH5蛋白活性的作用剂可以是核酸或蛋白质，天然存在的MSH5蛋白靶分子、MSH5抗体、MSH5激动剂或拮抗剂、MSH5激动剂或拮抗剂的肽类似物、或者其它小分子。在一个实施方案中，该作用剂刺激一种或几种MSH5活性。这种刺激性作用剂的例子包括活性MSH5蛋白和已被导入细胞的编码MSH5的核酸分子。在另一实施方案中该作用剂抑制一种或几种MSH5活性。这种抑制性作用剂的例子包括反义MSH5核酸分子、抗-MSH5抗体和MSH5抑制剂。这些调节方法可在体外进行(例如通过与作用剂一起培养细胞)，或者按另一种方式可在体内进行(例如通过对试验者给予此作用剂)。这样，本发明提供了几种方法，用于治疗患有以MSH5蛋白或核酸分子异常表面或异常活性为特征疾病或障碍，例如生殖能力障碍的个体。在一个实施方案中，该方法包括给予作用剂(例如通过上述筛选试验法发现的作用剂)，或者给予调节(例如上调或下调)MSH5表达或活性的作用剂组合物。在另一实施方案中，该方法包括给予MSH5蛋白或核酸分子，作为治疗法抵消降低的或异常的MSH5表达或活性。
在MSH5被异常地下调和/或在增加MSH5活性很可能具有有益作用的情况下，理想的是刺激MSH5的活性。同样地，在MSH5被异常地上调和/或在降低MSH5活性很可能具有有益作用的情况下，理想的是抑制MSH5的活性。
将通过下面的实施例对本发明作进一步说明，不应把这些实施例看作是一种限制。此申请全篇中引证的所有文献、专利和公开专利申请的内容在此均被引入作为参考。
                    实施例
材料和方法
小鼠Msh5 cDNA克隆
使用BALB/c基因组DNA(Clontech)以及基于人cDNA序列的引物GTGCTGTGGAATTCAGGATAC(有义，SEQ ID NO：1)和CCAGAACTCTCTGGAGAAGC(反义，SEQ ID NO：2)，通过PCR获得了小鼠Msh5基因的起始区段。使用优热cDNA PCR试剂盒以及基因-特异性引物CTCCACTATCCACTTCATGCCAGATGC(有义，SEQ ID NO：3)和GCTGGGGAGGACACTGGAAGGACTCTCA(反义，基于人3′-未翻译的cDNA序列，SEQ ID NO：4)，通过RT-PCR克隆了小鼠Msh5编码序列的其余部分。
从通过基因组系统Inc.筛选的P1小鼠胚胎干细胞基因组文库克隆了小鼠Msh5基因组基因座，产生了三个克隆11051、11052和11053。
构建pMsh5ex18靶向载体
通过筛选小鼠基因组Charon 35，129/01a噬菌体文库获得了含有外显子18的基因组Msh5片段。将含有外显子18的3.8kb HindIII片段亚克隆进入pBluescript SK+/-，并且使用BgIII/AatII接头将2.0kb BgIII PGKhygro盒克隆进入在外显子18中密码子528的AatII位点。形成的基因靶向克隆被称为pMsh5ex18。
电穿孔胚胎干细胞
使靶向载体pMsh5ex18(50μg)电穿孔进入WW6 ES细胞(在Ioffe，E.等(1995)美国国家科学院学报92，7357-7361中描述的)，分离出潮霉素抗性集落，并使用正向引物A 5′-AGCTGGAGAACCTGGACTCTC-3′(SEQ ID NO：5)和反向引物B 5′-TGGAAGGATTGGAGCTACGG-3′(SEQ ID NO：6)通过PCR进行筛选。借助于对此靶向过程特异性的1.5kb PCR片段对阳性ES细胞集落进行鉴定。鉴定出6个阳性细胞系MSH5-1，MSH5-33、MSH5-41、MSH5-52、MSH5-58和MSH5-109，并且通过对高分子量DNA作NsiI酶切消化以及使用定向不包含在此靶向载体中的外显子13和14之间5′内含子区的0.8kb EcoRI/HindIII探针进行DNA印迹分析，显示出了正确的靶向过程。
RNA印迹分析
在1.0％琼脂糖甲醛凝胶上分离来自24天龄雄性小鼠的4μgpoly A RNA，然后转移至硝酸纤维素膜上并与对应于外显子3-8的Msh5探针、跨越整个小鼠Msh4 cDNA的探针以及人β-肌动蛋白探针进行杂交。
蛋白质印迹分析
为了进行蛋白质印迹分析，在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离来自23天龄雄性小鼠睾丸提取物的等量蛋白质，然后转移至Immobilon-P(Millipore)膜上。在TBS、0.1％ Tween-20、5％脱脂干牛奶、10％山羊血清(Sigma)中封闭处理此膜，并与1∶1000稀释的初级抗-MSH5抗体共温育。使用1∶30000稀释的山羊抗-小鼠IgG辣根过氧化物酶标记结合物(Sigma)，通过化学发光检测结合的蛋白质。
组织学
在e18和出生后(PP)5周之间从Msh5+/+和Msh5-/-雌性动物取出卵巢，在Bouins或4％缓冲的甲醛中固定30-60分钟，然后转移至70％乙醇。通过心脏灌注4％缓冲的甲醛固定睾丸，然后再在新鲜的固定液中固定过夜。按常规方法对所有的组织作组织学处理，作3μm或5μm的切片。
染色体
按照改进的Counce和Meyer的方法制备染色体涂片(在Counce，S.J.和Meyer，G.F.(1973)。染色体44，231-253中描述的，此文献的内容被引入作为参考)。然后按照Moens的方法将涂片在50％硝酸银中，65℃银染6小时(用于电子显微镜观察)，或者使涂片经受染色体结合蛋白的免疫荧光定位(在Spyropoulos，B.和Moens，P.B.(1994)分子生物学方法33，131-139中所述的方法，此文献的内容被引入作为参考)。
实施例1：Msh5-/-小鼠的产生和分析
为了测定MSH5对哺乳动物的作用，产生了在Msh5带有无效突变的小鼠并进行了特征鉴定。Msh5-/-小鼠能生存但不能生育。由于在前期I染色体配对受破坏，这些小鼠的减数分裂受到严重影响。这种减数分裂失败导致睾丸体积缩小并且完全丧失了卵巢结构。这些结果表明，正常的MSH5功能对减数分裂的进行和雌性动物性腺保持是必不可少的。分离出小鼠Msh5基因组克隆并用于构建基因靶向载体(见图1A)，将此载体用于从带有被修饰Msh5基因座(见图1B)的二个ES细胞系产生小鼠。按孟德尔方式传递此修饰基因座的小鼠和纯合的Msh5-/-小鼠都能生成。在24天龄小鼠的睾丸中不能检测出Msh5转录物或蛋白质(见图1D)。这些资料表明，被修饰的Msh5基因座不编码功能性MSH5蛋白。在小鼠睾丸中，出生后11天开始首次减数分裂高潮(见图1A)，13天开始前期I。在人和小鼠的性腺中Msh5被高度表达，在小鼠是与减数分裂高潮同时发生。Msh5-/-雄性动物表现出正常的性行为，但是由于完全没有附睾精子它们是不育的。对Msh5-/-成年雄性动物输精管检查揭示精子发生的严重损伤(见图2B，C)，导致睾丸体积缩小了70％。在此突变雄性动物虽然存在作为A型和B型精原细胞的Leydig间质细胞和管状Sertoli足细胞，但是没有发现正常的粗线期精母细胞(见图2D-G)。在出生后17天Msh5-/-雄性动物的输精管上皮相当密集地被塞满了，尽管根据胚细胞核抗原I(GCNA1，在Enders，G.G.和May J.J.(1994)。发育生物学，163，331-340中所述的，此文献内容被引入作为参考)定位减少和根据凋亡增加(见图3A、B、C、D)显示出胚细胞丧失的早期变象。至出生后23天，野生型小鼠的输精管含有球形精子细胞(见图3E、G)。相比之下，Msh5小鼠输精管中凋亡水平的提高导致胚细胞持续地减少(见图3F，H)，并且至成熟期几乎丧失了整个产生精子的细胞群(见图3I-L)。为了分析减数分裂过程，在光学显微镜和电子显微镜水平检测了减数分裂染色体涂片。对于23天龄的野生型小鼠涂片，银染色揭示染色体构型的范围包括在细线期、偶线期、粗线期和双线期的构型(见图4A)。但是从4只Msh5-/-雄性动物中发现588/602(97.7％)的精母细胞不含有联会的染色体(见图4B)，相比之下大于92％的野生型小鼠精母细胞(255/277)显示处于偶线期和更后期的染色体构型。Msh5-/-雄性动物中所有的精母细胞都含有单价的染色体和对应于减数分裂偶线期/粗线期阶段的凝结水平。在其余的14个细胞中，仅观察到29个部分配对的染色体，远少于预期的280对(见图4C)。这些染色体的至少一半(15/29)包含不同长度的染色体，暗示这种配对是非同源的。
还检测到已知为重组和形成联会丝复合体(SC)所需要的SYCP1、SYCP3和RAD51蛋白与染色体的结合(Moens，P.B.等(1998)分子生物学中的现代话题37，241-263；Plug，A.W.等(1996)，美国国家科学院学报93，5920-5924)。使用组合抗血清对减数分裂染色体上SYCP1和SYCP3的免疫荧光定位证明了来自野生型雄性动物精母细胞中SC的正常捕获物，并鉴定粗线期精母细胞具有20个不同凝结的双价染色体配对。在Msh5-/-精母细胞中，所有的染色体都明显地与SYCP1/SYCP3信号结合，表明已达到轴向成分形成，但未观察到凝结的双价染色体。在Msh5-/-精母细胞中，RAD51沿着单价染色体定位于分散的焦点中，这些焦点的数目和密度在大多数Msh5-/-细胞中看来比来自野生型雄性动物的细线期或偶线期染色体上的更多更密，并且象在野生型精母细胞所到的不向下倾斜，暗示缺乏向粗线期的发展。在突变小鼠未联会的染色体上存在RAD51，表示减数分裂已被启动，不存在MSH5时双链裂开仍可能继续进行。
为了测定雌性动物减数分裂中MSH5的作用，测定了Msh5-/-成年动物的卵巢功能。这种突变体不同野生型雄性动物交配，它们也没有正常的动情周期。Msh5-/-雌性动物具有正常结构的输卵管和子宫，但缺乏可辨认的卵巢(见图5D，E)。Msh5雌性动物的卵巢囊是空的，更常见的是含有具1-4个包囊的包囊结构(见图5E)。在出生后3天Msh5-/-雌性动物的卵巢含有较少的卵母细胞(见图5A，B)。至出生后25天，Msh5-/-雌性动物的卵巢缩小成1-3个滤泡的一小团，看来象是处于发育的室后阶段(post-antral stages)，此卵巢中偶尔含有几个卵母细胞，而野生型动物的卵巢具有大量的原始滤泡。通过对卵母细胞特异性蛋白Zona pellncida 3(ZP3)(在Wossarman，P.M.(1998)生物化学年评57，415-442中所述的，此文献的内容被引入作为参考)作转录物的RT-PCR测定，证实出生后25天的Msh5-/-雌性动物卵巢中存在卵母细胞。但是对于成年动物，在野生型动物卵巢中只能检测到ZP3转录物(见图5F)。因此，Msh5-/-雌性动物的卵巢在出生时具有正常的体积，但是从出生后3天之前直至成年逐渐退化成为初始状态，并伴有卵母细胞数量减少。
对野生型动物的卵巢通过RT-PCR检测了Msh5表达。在e16、e18和出生后1天雌性动物的卵巢中发现Msh5表达，并同时开始了减数分裂，这符合MSH5在卵巢的减数分裂中具有直接作用的可能性。在以后的胚胎发育过程中，纯合的突变雌性动物卵巢含有正常数量的卵母细胞(见图6A，C)。但是，H-E切片检测揭示出野生型和Msh5-/-卵巢之间染色体结构的细微差别，其特征是，与在野生型卵母细胞中易辨认的染色体(见图6B)相比较在纯合的突变卵母细胞中核内含物的丛聚(见图6D)。至出生后3天，与野生型动物卵巢相比较，Msh5-/-雌性动物卵巢中卵母细胞的数量显著地较少(见图6E，G)，并且不表现出粗线期卵母细胞的GCNA1染色特征(见图6F，H)。至出生后6天，在野生型雌性动物的整个卵巢中分布有大的原始滤泡，其中含有易辨认的卵母细胞(见图6I，J)，而在Msh5-/-雌性动物的卵巢中卵母细胞池严重地缩小了。
这些结果表明，染色体配对和/或联会需要MSH5。与MSH同染物相互作用的其它小鼠MutHLS基因Pms2和MlhI的突变由于减数分裂异常也是不育的。但是，在这些小鼠减数分裂异常的阶段是不同的。在Pms2-/-小鼠染色体配对受破坏，但是仍可看见精细胞和精子，虽然已不正常。在MlhI-/-小鼠，虽然发现有正常的配对，但是粗线期后的减数分裂阶段非常少见。这些结果暗示，这些蛋白质在减数分裂的不同阶段具有不同的作用。
在成年的Msh5-/-雌性动物因为完全丧失了卵巢结构其表型甚至比在雄性动物更引人注目。类似于Msh5-/-雄性动物，其胚细胞繁殖成生殖脊，但其卵母细胞从来没有发育超过偶线期。从e18开始卵母细胞逐渐丧失看来是起因于减数分裂的失败和导致凋亡的关卡激源，如在Msh5-/-精母细胞中看到的。这样导致到出生后6天几乎完全没有卵母细胞和卵巢开始退化，以致在成年动物卵巢通常完全不存在或者由几个大囊泡组成。退化的卵母细胞不能启动滤泡发生，表明为了此过程和维持卵巢的形态在卵母细胞和周围基质之间必定存在交流。Msh5-/-雌性动物的表型不同于在Dmc1-/-小鼠所见到的，此Dmc-/-小鼠也显示有配对/联会失败以及在早期新生动物卵母细胞丧失，但是在成年动物至少保持有初始的卵巢。这些差异暗示对MSH5的需要比对DMC1的需要稍微早些，或者对DMC1功能存在部分重复。
在雌性Msh5-/-小鼠的卵巢表型和Turner综合征病人之间存在相似性。这二种情况下，在子宫内和新生儿过程中都存在卵母细胞的迅速丧失，并随之发生卵巢退化。可能是同源染色体配对的失败，不论是在X-染色体水平(如在Turner病人)或者是遍及整个染色体群(如在Msh5-/-卵母细胞)，触发了一个凋亡性关卡，最终导致卵巢完全退化。
等同形式：
本领域的技术人员仅仅应用常规的实验就能认识到，或者能够确定在此所述的本发明特定实施方案的多种等同形式。旨在通过如下的权利要求来包括这些等同形式。
                    序列表
<110>Albert爱因斯坦医学院和Dana-Farber癌症研究所
<120>MSH5被删除的小鼠及其用途
<130>AHN-001PC
<140>
<141>
<150>60/113,487
<151>1998-12-22
<160>6
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>对人工合成序列的描述：引物
<400>1
gtgctgtgga attcaggata c                                              21
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>对人工合成序列的描述：引物
<400>2
ccagaactct ctggagaagc                                                20
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>对人工合成序列的描述：引物
<400>3
ctccactatc cacttcatgc cagatgc                                        27
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>对人工合成序列的描述：引物
<400>4
gctggggagg acactggaag gactctca                                        28
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>对人工合成序列的描述：引物
<400>5
agctggagaa cctggactct c                                               21
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>对人工合成序列的描述：引物
<400>6
tggaaggatt ggagctacgg                                                 20

Claims (14)

1.一种生产非人动物的方法，该方法包括损坏内源MSH5基因，其中所述非人动物的性腺发育异常。
2.权利要求1的方法，其中所述动物是一种转基因动物。
3.权利要求2的方法，其中所述转基因动物是小鼠。
4.权利要求1的方法，其中是通过除去编码全部或部分MSH5蛋白的DNA损坏了MSH5基因。
5.权利要求4的方法，其中所述动物对于被损坏的基因是纯合的。
6.权利要求4的方法，其中所述动物对于被损坏的基因是杂合的。
7.权利要求1的方法，其中所述动物是带有MSH5基因转基因损坏的转基因小鼠。
8.权利要求7的方法，其中所述的损坏是插入或缺失。
9.权利要求1的方法，其中所述非人动物是不育的。
10.一种用于鉴定调节MSH5活性的化合物的体外方法，包括：
a)使MSH5与待测化合物接触，以及
b)测定此待测化合物对MSH5活性的作用，从而发现一种调节MSH5活性的化合物。
11.权利要求10的方法，其中MSH5的活性是被抑制。
12.一种分离的细胞，它们来自权利要求1的方法制备的非人动物。
13.权利要求12的细胞，其中该细胞是转基因细胞。
14.权利要求13的细胞，其中该转基因细胞是小鼠细胞。
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