CN107937439B

CN107937439B - 基因的应用及动物模型的构建方法

Info

Publication number: CN107937439B
Application number: CN201711480745.2A
Authority: CN
Inventors: 郑耀武; 李丹
Original assignee: Northeast Normal University
Current assignee: Northeast Normal University
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN107937439A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因的应用及动物模型的构建方法。本发明公开了Oxtr基因可以作为治疗乳腺癌的靶基因，催产素受体OXTR过表达提供转基因小鼠乳腺癌诱导模型，可以用于乳腺癌致病机理研究，也可以用于药物筛选和药效测试。

Description

基因的应用及动物模型的构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因的应用及动物模型的构建方法。

背景技术

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，威胁着全球女性的生命健康。每年全世界有超过167万女性患乳腺癌，而其中有52.9％发生在发展中国家。实验动物模型可以复制某些人类疾病，为医学研究的重要手段之一。乳腺癌实验动物模型在乳腺癌发病机理研究、药物有效性评估等方面起着非常关键的作用，具有广阔的前景。

乳腺癌动物模型最常使用的动物包括鼠类动物、犬、猫等，均能产生自发性乳腺癌，其中移植型模型最常使用的动物则是裸鼠(Nude Mice)。Grist在1962年从非近交系小鼠中发现。由于裸鼠无胸腺，缺乏成熟的T淋巴细胞，肿瘤移植后生长良好，并能保持肿瘤细胞的原有形态及病理特性，是肿瘤研究中较为理想和常用的动物实验工具之一。乳腺癌裸鼠动物模型的建立的方法较多，从最初的自发性、诱发性模型发展到移植型、转基因型、基因敲除模型等。

G蛋白偶联受体参与重要的生物学功能，目前新上市的药物有40％是针对G蛋白偶联受体的，可以说G蛋白偶联受体是新药物研发的摇篮。人类的催产素受体OXTR属于G蛋白偶联受体家族的成员，由389个氨基酸组成，其蛋白为含有7个跨膜结构域的多肽。基因定位于染色体的3p25.3，跨度约为19kbp，含有3个内含子和4个外显子和7个跨膜结构域。第二个跨膜结构域与受体本身的活化有关，第三和第六个跨膜结构域是G蛋白的结合位点。

当催产素刺激时，催产素受体与G-蛋白相偶联，激活磷脂酶C，通过细胞内的磷酸肌醇信号系统，诱导细胞质内Ca²⁺浓度升高，导致子宫在分娩时的强烈收缩。催产素受体广泛分布于杏仁核、海马、纹状体、前扣带皮层、脑干、伏隔核、膝下皮层等脑区，其上有很多不同的结合位点，对催产素有很强的亲和力。除了脑神经组织高表达外，在小鼠体内，OXTR主要表达在子宫基层、乳腺导管肌上皮细胞中、肾小管中，在脑的前嗅觉区域、海马的CA2和CA3区域、屏状核、皮质杏仁核、下丘脑弓状核以及整个脑的皮质区域都有表达。但是，催产素受体在乳腺表达的研究未见报道。

因此，提供催产素受体在乳腺表达中的应用以及构建小鼠乳腺癌模型对治疗乳腺癌具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种基因的应用及动物模型的构建方法。本发明公开了Oxtr基因可以作为治疗乳腺癌的靶基因，催产素受体OXTR过表达提供转基因小鼠乳腺癌诱导模型，可以用于乳腺癌致病机理研究，也可以用于药物筛选和药效测试。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了oxtr基因作为预防和/或治疗乳腺癌的药物靶点的应用。

本发明还提供了oxtr基因的过表达在构建乳腺癌动物模型中的应用。

本发明还提供了oxtr基因的过表达在药物筛选或药效测试中的应用。

本发明还提供了oxtr基因的表达抑制剂在制备预防和/或治疗乳腺癌的药物中的应用。

本发明还提供了一种表达载体，含有编码oxtr基因的核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，提供的表达载体还含有β-Actin启动子和/或β-Globin内含子。

转基因从广义上理解是对生物基因组的人为修饰，包括随机的基因片段插入，基因敲除，基因定位敲入，基因定点突变等。现如今转基因技术的应用非常广泛，比如：蛋白的生产(酶，疫苗，抗体，生长因子，蛋白药，活性蛋白，特异修饰蛋白，如凝血因子)；实验中病理模型的构建，利用动物模型研究疾病的发生机理及药物药效测试；应用在器官移植上，解决器官不足，重复感染问题；以及对品种的改良(抗病，产量，营养价值提升)和疾病的治疗(治疗遗传缺陷，组织再生)。

常见的转基因技术有：受精卵细胞核(DNA显微注射，随机插入，预见性低，但多样性)，利用精子转染DNA(效率低，重复性不好)，利用转坐子进行DNA在基因组的插入(技术难度高，随机性差)，病毒感染(效率高，随机性低，可带DNA大小受限制，安全隐患)，干细胞/胚胎显微注射(常用于小鼠基因定位修饰，预见性高，大动物还不成功)，核移植/动物克隆(大动物基因定位修饰唯一途径，技术难度大，效率低)。

对于转基因载体的构建主要分为以下几步：启动子选取，cDNA选取，PolyA选用，内含子和封闭区以及典型转基因载体结构的使用。β-Actin启动基因在乳腺、卵巢和子宫这样的生殖器官高表达，而本发明涉及的催产素受体基因OXTR恰恰主要高表达这些生殖器官中，尤其是乳腺。因此本发明通过PCR扩增带有这个启动子和内含子,选择带有PolyA封闭区的载体，构建载体。从小鼠体内通过PCR得到了准确的OXTR的编码序列，然后纯化DNA片段(去除原核载体序列)后进行核显微注射，浓度为2.5-4ng/μL。

受精卵细胞核显微注射的主要操作过程如下：1)促排卵激素超排、合笼；2)分离E0.5受精卵；3)DNA显微注射；4)胚胎培养过夜；5)胚胎回移代孕鼠；6)切尾鉴定；7)传代杂交；8)表达分析。

转基因技术常见的问题为：有限的启动子信息，不完全的启动子，造成基因不表达或表达差异；DNA插入的随机性，多拷贝性，不表达，低表达，错表达等鼠系间差异，为了避免这一问题，我们可以插入减少转基因受插入位点影响的封闭区(insμlaters)序列；基因高表达可能造成的毒性，得不到表达转基因鼠系；转基因片段的大小有限制，2kb到mb，大部分2-10kb，容易注射，P1质粒(PAC)，70kb左右，黏度大，细菌人工染色体BAC，120kb左右，黏度更大，酵母人工染色体YAC，500kb-1mb大小，非常难。表达水平与拷贝数无紧密关联，多数拷贝被甲基化或转录因子浓度限制；影响转基因成功与否的其它因素：DNA的浓度(2-3ng/μL)，纯度，如嗅化乙锭、酒精和EDTA含量等。

本发明还提供了所述的表达载体在构建乳腺癌动物模型中的应用。

本发明还提供了一种乳腺癌动物模型的构建方法，其特征在于，构建所述的表达载体，转入动物体内，获得乳腺癌动物模型。

本发明还提供了所述的构建方法获得的乳腺癌动物模型在药物筛选或药效测试中的应用。

本发明还提供了一种药物筛选或药效测试的方法，如所述的构建方法获得的乳腺癌动物模型服用待测药物，根据对乳腺癌的测试效果获得该药物是否适用于治疗乳腺癌或其预防和/或治疗乳腺癌的效果。

本发明利用转基因技术进行了乳腺癌疾病模型的建立，首次利用β-actin启动子进行超表达催产素受体OXTR，得到的转基因小鼠模型(++OxtR)从两个半月起就不同程度出现乳头溢乳的现象(未怀孕产乳)，在6个月龄时开始发生乳腺癌，14个月龄时高达90％以上发生乳腺癌。我们首次发现催产素受体OXTR主要在乳腺超表达，过表达OXTR可以诱导乳腺癌发生。

本发明成功构建了催产素受体基因OXTR高表达小鼠，提高RNA适时定量分析，Western Blot分析，证明催产素受体基因OXTR在乳腺等组织高表达，不受乳腺发育过程的调节。

催产素受体OXTR过表达乳腺癌小鼠模型是比较理想的实验动物模型，是完全内源性的，小鼠容易大量繁殖，大规模进行药物筛选和药物药效测试。

移植乳腺癌细胞到裸鼠，构建乳腺癌病理模型是目前最常用的模型，裸鼠无胸腺，缺乏成熟的T淋巴细胞，本身就是免疫缺陷型小鼠，不能体现体内免疫系统的作用，再加上用药很容易出现生病或无法存活的现象。催产素受体OXTR过表达乳腺癌小鼠模型避免了使用昂贵的裸鼠，不易繁殖，容易感染等缺陷。

催产素受体OXTR过表达乳腺癌小鼠模型是由于OXTR过表达而引起乳腺癌的全新模型，对由催产素受体OXTR过表达及相关的调节通路改变引起的乳腺癌进行药物筛选和药效测试具有重要的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示G蛋白位点；

图2示转基因小鼠模型的构建方法；

图3示转基因鼠建立时间表；

图4示转基因小鼠乳腺癌动物模型制作流程；

图5示载体构建终载体图谱；

图6示载体构建成功的酶切检验图；其中，最左侧泳道为Marker，泳道1示样品1为正向连接，泳道2示样品2既有正向连接也有反向连接，泳道3示样品3反向连接，泳道4示样品4正向连接，泳道5示样品5正向连接，泳道6示样品6正向连接，泳道C示未经酶切的质粒对照；

图7示β-actin-Oxtr转基因小鼠founder鉴定结果：PCR电泳图；其中，最右侧泳道为Marker，泳道1示编号1为阴性小鼠，无转基因片段插入，泳道2示编号2为阳性founder，转基因片段已插入基因组，泳道3示编号3为阴性小鼠，无转基因片段插入，泳道4示编号4为阴性小鼠，无转基因片段插入，泳道5示编号5为阴性小鼠，无转基因片段插入，泳道6示编号6为阴性小鼠，无转基因片段插入，泳道7示编号7为阴性小鼠，无转基因片段插入，泳道8示编号8为阴性小鼠，无转基因片段插入，泳道9示编号9为阴性小鼠，无转基因片段插入，泳道N示阴性对照；

图8示小鼠founder的F1代鉴定结果：PCR电泳图；其中，泳道1示子代1为阴性小鼠，泳道2示子代2为阳性小鼠，泳道3示子代3为阳性小鼠，泳道4示子代4为阴性小鼠，泳道5示子代5为阴性小鼠，泳道6示子代6为阳性小鼠，泳道N示阴性对照；泳道M示Marker；

图9示过表达Oxtr模型构建的有效性验证图；其中，图9(A)示野生型小鼠WT和转基因小鼠TgOxtr在乳腺、卵巢和子宫中OXTR的mRNA表达量，转基因小鼠在生殖组织中OXTRmRNA水平明显高于野生型；图9(B)示野生型小鼠WT和转基因小鼠Tg Oxtr在乳腺、卵巢和子宫中OXTR的蛋白表达量，转基因小鼠在生殖组织中OXTR蛋白水平明显高于野生型；图9(C)示蛋白表达量的定量结果；

图10示乳腺癌诱导的有效性和患癌概率的统计；其中，图10(A)示转基因雌鼠患癌概率的统计，18只中有16只患癌，患癌率达88.9％；图10(B)示乳腺处长肿瘤的转基因雌鼠和肿瘤形态大小；

图11示乳腺癌肿瘤的形态结构特征，石蜡包埋切片，H&E染色；其中，图11(A)示乳腺癌肿瘤1的形态，为腺癌，腺体出现共壁，背靠背现象，细胞核异型性明显，部分腺腔内可见分泌；图11(B)示乳腺被癌细胞完全侵蚀，细胞核异型性明显。

具体实施方式

本发明公开了一种基因的应用及动物模型的构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种转基因小鼠乳腺癌动物模型的制备方法：

1、获得目的基因，通过逆转录PCR从小鼠乳腺组织总RNA扩增得到OXTR的cDNA。

2、以小鼠乳腺组织的cDNA为目的基因，以载体携带β-Actin启动子β-Globin内含子，鸡基因组屏蔽区DNA序列and polyA)，构建表达质粒(pβ-actin-Oxtr)。

3、限制性内切酶线性化β-actin-Oxtr，回收并纯化了3.5kb的β-actin-Oxtr片段。

4、受精卵DNA显微注射小鼠雄原核，将经显微注射后成活的受精卵植入假孕鼠的输卵管的壶腹部。

5、转基因品系鉴定：1)鼠尾DNA纯化；2)基因组DNA PCR；3)1％琼脂胶电泳；4)与野生鼠C57BL6合笼繁殖传代；5)通过适时定量PCR进行OXTR mRNA表达分析；6)Western Blot鉴定蛋白表达水平。最终建立转基因小鼠基因组中带有外源转基因且高表达的催产素受体OXTR的小鼠模型。出生的首代β-actin-Oxtr转基因阳性的小鼠即为Founder小鼠；由于在基因组插入位点不同，每个Founder都将被视为一个独立的品系进行繁育，对每个founder品系都进行剪尾的PCR鉴定。

得到催产素受体OXTR高表达阳性小鼠，进行大量繁殖，诱导乳腺癌。

6、药物筛选及药效测定。

本发明的有益效果：

1、和其他任何癌症一样，乳腺癌的发生也具有多样性，很多病因不清楚，给治疗带来了极大的不便。治疗和筛药不能直接用人来实验，需要多种具有针对性的动物病理模型，我们构建的催产素受体基因OXTR高表达小鼠，就是针对由于催产素受体基因OXTR高表达而引起乳腺癌的病理模型。

2、移植乳腺癌细胞到裸鼠体内，去构建乳腺癌病理模型是现在最常用的技术，裸鼠无胸腺，缺乏成熟的T淋巴细胞，本身就是免疫缺陷型小鼠，容易感染，再加上用药很容易出现死亡或是无法存活的现象。而我们利用转基因技术去诱导就恰恰解决了这一问题，并且直接锁定了基因靶点Oxtr，且这是针对新型乳腺癌药物筛选和测试首次发明的一个实验动物模型。

本发明提供的基因的应用及动物模型的构建方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1过表达载体的构建

1、PCR扩增得到β-actin启动子

以质粒作为模板，通过PCR扩增得到β-actin启动子，具体如下：

(1)PCR引物序列：

(2)反应体系

(3)PCR扩增条件：

98℃2min

4℃保存

2、对扩增出的PCR产物进行胶回收。

3、用限制性内切酶HindⅡ和ApoⅠ酶切载体框架pVector和步骤2中扩增出的β-actin启动子，胶回收3kb和1.7kb大小的片段。

4、连接

反应体系(25μl)：(试剂来自TAKARA)

T4 DNA Ligation buffer	2.5μl
		β-actin片段	1μl(75ng)
pVector	1μl(50ng)
		T4 DNA Ligase	0.5μl
ddH<sub>2</sub>O	20μl

16℃过夜连接。

5、克隆构建(转换、大提)按照分子克隆实验指南进行，将连接成功的4.7kb样品测序，得到序列正确的含有β-actin启动子的表达载体。

6、PCR扩增得到小鼠催产素受体(Oxtr)CDS区

提取野生型B6小鼠子宫组织的RNA，进行逆转录，以得到的cDNA作为模板，通过PCR扩增得到催产素受体(Oxtr)CDS区，具体如下：

(1)PCR引物序列：

(2)反应体系

PCR反应体系(50μl)：

Prime star mix	25μl
		3’引物(Oxtr)	1.5μl(10um)
5’引物(Oxtr)	1.5μl(10um)
		cDNA模板	2μl
ddH<sub>2</sub>O	20μl

(3)PCR扩增条件：

98℃2min

4℃保存

7、对扩增出的PCR产物进行胶回收。

8、用限制性内切酶ApoⅠ酶切步骤7中小鼠催产素受体(Oxtr)CDS区，胶回收1.2kb大小的片段。

9、用限制性内切酶ApoⅠ酶切步骤5中得到的含有启动子的表达载体，同时为了防止载体在连接时的自连反应，对该载体进行去磷酸化，去磷酸化酶的终浓度为0.1U/μl，胶回收4.7kb大小的片段。

9、连接

反应体系(25μl)：(试剂来自TAKARA)

T4 DNA Ligation buffer	2.5μl
		Oxtr片段	1μl(37.5ng)
含启动子的载体	1μl(50ng)
		T4 DNA Ligase	0.5μl
ddH<sub>2</sub>O	20μl

16℃过夜连接。

10、克隆构建(转换、大提)按照分子克隆实验指南进行，挑选出连接成功的5.9kb样品。

11、酶切鉴定，确保Oxtr片段的正向连接。

对连接好的步骤10得到的样品用HindⅢ进行酶切，确定好连接的方向，挑选出正向连接的，具体步骤如下：

(1)反应体系(10μl)：(试剂来自NEB)

载体β-actin-Oxtr	0.2μl(100ng)
		Buffer 2	1μl
HindⅢ(NEB)	0.2μl
		ddH<sub>2</sub>O	8.6μl

37℃酶切半小时，跑胶鉴定连接方向。

(2)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，其电泳图片如图6所示，选择所获片段长度与预期结果一致的正向连接，1、4、5、6为正向连接(预期片段5021bp+793bp)，3为反向连接(预期片段4483bp+1331bp)，2既有正向连接也有反向连接。

12、1、4、5、6号样品经测序后，序列均正确，作为后期实验使用，成功获得载体pβ-actin-Oxtr，谱图如图5所示。

13、用限制性内切酶HindⅡ和SfcⅠ酶切步骤12得到的载体pβ-actin-Oxtr将其线性化，琼脂糖凝胶电泳回收3.5kb的β-actin-Oxtr片段，并用胶回收试剂盒纯化(QIAquickGelExtraction Kit)，将回收的DNA片段溶解在显微注射液中，待注射。

实施例2转基因

1、采集受精卵

(1)选取4周性成熟的F1(DBA/2母鼠×C57BL/6公鼠)母鼠，对其进行腹腔注射5IU孕马血清促性腺激素(PMSG)，约46h后再腹腔注射5IU人绒毛膜促性腺激素(hCG)于同一小鼠内，对雌鼠进行超排。将注射过hCG的母鼠迅速与C57BL/6J鼠合笼。

(2)第2日检栓，将见栓的母鼠处死，打开小鼠腹腔，充分暴露腹腔与子宫角部，在解剖镜下，小心剪下输卵管和部分子宫角于盛放M2和透明质酸的混合液的35mm皿中。用眼科镊子撕开膨大的壶腹区的同时可看到涌出的游离的受精卵，在透明质酸酶作用下，部分成团的细胞团会别分散成单个细胞。

(3)将卵转移到M2溶液中，至少漂洗两次，再将漂洗干净的卵转移到盛有1mlM16培养基的组织培养皿中，放于37℃，CO₂浓度5％的温箱中待注射。

2、显微注射

(1)稀释待导入DNA，用注射缓冲液(injection buffer)将其稀释成终浓度为4ng/μl。

(2)安装持卵针和注射针，在超净台内向底部有凹槽的皿中加入M2溶液，覆盖上石蜡油，移入待注射的受精卵。

(3)高倍镜下，将注射针轻触持卵针，控制好基因注射液的流速。持卵管利用压控系统使持卵管内产生负压，使其末端能吸住受精卵。调节注射针与原核位于同一水平面，将注射针刺入受精卵的雄原核，观察到原核膨大后，表明注射成功，立即移除注射针。

(4)将注射过的受精卵转移至孵育箱中盛有M16溶液的培养皿中。全部的卵注射完放回孵育箱中培养过夜，第二天观察卵的发育情况。

3、输卵管移植

(1)对假孕母鼠腹腔注射适当剂量的1％的巴比妥，用剪刀在后腿髋关节和背中线之间的皮肤横向剪开一个切口，此时暴露出腹壁，找到腹壁下红色卵巢，用眼科剪在此处腹壁作约0.5cm横向切口，用钝头镊子夹住脂肪垫，轻轻往体外拉会看到子宫、卵巢和输卵管。

(2)将小鼠置于解剖镜下，使小鼠输卵管卷曲部暴露于视野中。找到输卵管的喇叭口处，在此处插入吸有二细胞受精卵的移卵管，确认所有的卵都吹入后移出移卵管。用钝头镊子将暴露于体外的卵巢、输卵管等重新轻轻送回体腔内。

(3)缝合小鼠腹壁切口和皮肤切口。并将笼子放于温度适当的加热垫上，直至小鼠苏醒。

实施例3小鼠基因型鉴定

1、用消过毒的剪刀对出生两周内的小鼠进行剪脚趾编号，将剪下的脚趾放入对应编号的1.5ml EP管中。

2、向EP管中加100μl鼠尾消化液(1ml GNTK+5μl 20mg/ml Proteinase K)。离心，12000rpm，5min。然后将其置于55℃水浴锅，消化过夜。

3、将消化好的鼠尾煮沸15min以灭活Proteinase K。离心，12000rpm，2min。离心后的上清即为PCR模板。

4、配制PCR反应体系，并选择相应的程序进行反应。之后，跑胶进行条带分析。

1、PCR引物序列：

OXTR:AATGCCCTGGCTCACAAATAC(Forward)，如SEQ ID No.5所示
	GGGACAGCTATGACTGGGAGTAG(Reverse)，如SEQ ID No.6所示
得到的片段大小为456bp。

2、反应体系

PCR反应体系(50μl)：

Mg2+free buffer	2.5μl
		Mg2+	2μl
3’引物(Oxtr)	1.2μl(10um)
		5’引物(Oxtr)	1.2μl(10um)
cDNA模板	1.5μl
		聚合酶Taq	0.25μl
ddH<sub>2</sub>O	16.75μl

3、PCR扩增条件：

94℃5min

4℃保存

利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，结果图7为打出转基因小鼠Founder的鉴定，9只鼠中有一只Founder鼠2号；结果图8为Founder的后代F1代其中一窝的鉴定结果，阳性阴性小鼠比例为1：1，说明过表达小鼠可以顺利传代(有456bp大小条带的是转基因阳性小鼠，无条带的为野生型阴性小鼠，N为阴性对照，M为marker)。

实施例4模型构建的有效性检测

分别以过表达Oxtr小鼠(Tg Oxtr)乳腺、卵巢、子宫为研究对象，以同窝的野生型小鼠作为对照，mRNA水平以18s作为内参，蛋白水平以GAPDH作为内参通过Real-time PCR和Westernbloting的方法对这些生殖组织中Oxtr进行表达量的测定，发现在这些生殖组织中无论是RNA水平(图9A)，还是蛋白水平(图9B，C)都出现明显过表达的现象，图9C是对图9B的定量1、Real-time PCR引物序列：

OXTR:GAGTTGGACCTCGGGAGTGGA(Forward)，如SEQ ID No.7所示
	TCAGAGCCAGGAACAGTATGAGACAC(Reverse)，如SEQ ID No.8所示
18s:CGCCGCTAGAGGTGAAATTC(Forward)，如SEQ ID No.9所示
	CGAACCTCCGACTTTCGTTCT(Reverse)，如SEQ ID No.10所示

2、蛋白印迹

Western blotting按照常规方法测定

一抗：OXTR兔子单克隆抗体(Abcam)

二抗：抗兔二抗(GE Healthcare)。

实施例5乳腺癌表型分析

1.统计过表达Oxtr小鼠(Tg Oxtr)在乳腺处长肿瘤的概率，发现此概率高达88.9％，长肿瘤的情况如图10(A)、图10(B)所示。

2.处死在乳腺部位长肿瘤的小鼠后，取肿瘤组织进行病理形态学分析，方法按照常规H&E步骤，结果如图11(A)、图11(B)所示，为腺癌，腺体出现共壁，背靠背现象，细胞核异形性明显，部分腺腔内可见分泌，为恶性程度很高的肿瘤症状。

综上所述：本发明构建的乳腺癌动物模型构建成功。

Oxtr CDS区(如SEQ ID No.11所示)：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 东北师范大学

<120> 基因的应用及动物模型的构建方法

<130> MP1728555

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ccaccgtcga cattgattat tgactagtta 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ccaccgaatt ctttgccaaa atgatgagac 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ccaccgaatt catggagggc acgcccgcag 30

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ccaccgaatt ctcatgccga ggatggttg 29

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

aatgccctgg ctcacaaata c 21

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

gggacagcta tgactgggag tag 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gagttggacc tcgggagtgg a 21

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

tcagagccag gaacagtatg agacac 26

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 18s

<400> 9

cgccgctaga ggtgaaattc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 18s

<400> 10

cgaacctccg actttcgttc t 21

<210> 11

<211> 1167

<212> DNA

<213> Oxtr CDS

<400> 11

atggagggca cgcccgcagc caactggagt atcgagttgg acctcgggag tggagtgcca 60

ccaggggcgg agggtaacct cacggccggg ccgccacgac gcaacgaggc cctggcgcgc 120

gtggaggtgg cggtcctgtg tctcatactg ttcctggctc tgagtggcaa cgcgtgcgtg 180

ctgctggcgc tgcgtacgac gcgccacaag cactcgcgcc tcttcttttt catgaagcac 240

ctgagcatcg ccgacctggt ggtggccgtg ttccaggttc tcccgcagct gctgtgggac 300

atcaccttcc gcttctacgg gcccgacctg ctgtgtcgtc tggtcaaata cttgcaggtg 360

gtgggcatgt tcgcctccac ctacctgctg ttgctgatgt cgctcgaccg ctgcctggcc 420

atctgccagc cgctgcgctc actgcgccgc cgaaccgacc gcctggcggt gctggcgacg 480

tggctcggct gcctggtggc cagcgtgccg caggtgcaca ttttctcgct gcgcgaagtg 540

gcggacggcg tcttcgattg ctgggcggtc ttcatccagc cctggggacc caaggcctac 600

gtcacgtgga tcacgctcgc cgtctacatt gtaccggtca tcgtgctggc cgcctgctat 660

ggtctcatca gcttcaagat ctggcagaat ctgcgactca agacggcagc cgcggcggca 720

gctgccgagg ggagtgacgc agccggtgga gctggccgtg cggcgttggc acgggtcagt 780

agtgtcaagc ttatctccaa ggccaaaatc cgcacagtga agatgacctt catcattgtt 840

ctggccttca tcgtgtgctg gacgcctttc ttcttcgtgc agatgtggag cgtctgggac 900

gtcaatgcgc ccaaagaagc ttctgccttc atcattgcca tgctcttggc cagcctcaac 960

agctgctgca acccatggat ctacatgctc ttcacgggcc atctcttcca cgaactcgtg 1020

cagcgcttcc tctgctgctc tgctcggtac ctgaagggca gccggcctgg agagacgagc 1080

attagcaaga aaagcaactc ctccaccttc gtcctgagtc gtcgcagctc gagtcagagg 1140

agctgttctc aaccatcctc ggcatga 1167

Claims

1.oxtr基因的过表达在构建乳腺癌动物模型中的应用。

2.oxtr基因的过表达载体在构建乳腺癌动物模型中的应用，所述过表达载体含有编码oxtr基因的核苷酸序列，还含有β-Actin启动子和/或β-Globin 内含子。

3.一种乳腺癌动物模型的构建方法，其特征在于，构建表达载体，转入动物体内，过表达oxtr基因，获得乳腺癌动物模型；

所述表达载体含有编码oxtr基因的核苷酸序列，还含有β-Actin启动子和/或β-Globin内含子。