CN117580955A - 用于产生雌性刚孵化的雏鸟的鸟类及其产生方法 - Google Patents
用于产生雌性刚孵化的雏鸟的鸟类及其产生方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117580955A CN117580955A CN202280044524.3A CN202280044524A CN117580955A CN 117580955 A CN117580955 A CN 117580955A CN 202280044524 A CN202280044524 A CN 202280044524A CN 117580955 A CN117580955 A CN 117580955A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bird
- gene
- cell
- gamete
- chromosome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 67
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 169
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 143
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 101
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 96
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 67
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 61
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 55
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 49
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 47
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims description 43
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 40
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 37
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 34
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 28
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 22
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 21
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 19
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims description 17
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 15
- 101100240608 Mus musculus Nipbl gene Proteins 0.000 claims description 14
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- -1 smad7 Proteins 0.000 claims description 13
- 102100023406 Zinc finger RNA-binding protein Human genes 0.000 claims description 10
- 101710150392 Zinc finger RNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 10
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 9
- 101150104213 Kcmf1 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101150083515 RPL17 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101100413961 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) rpl1701 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101100413963 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) rpl1702 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 8
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 8
- 101150003798 rplQ gene Proteins 0.000 claims description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 7
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 7
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 7
- 101150022267 Hnrnpk gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101100220549 Mus musculus Chd1 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101100115146 Mus musculus Ctif gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101100115147 Xenopus tropicalis ctif gene Proteins 0.000 claims description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- 101100347672 Dictyostelium discoideum nacB gene Proteins 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims description 5
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 4
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 claims description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 10
- 230000012447 hatching Effects 0.000 abstract description 4
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 55
- 101150050891 Zfr gene Proteins 0.000 description 31
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 19
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 15
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 12
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 11
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 11
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 9
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 9
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 8
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 8
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 6
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 210000003765 sex chromosome Anatomy 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 238000010442 DNA editing Methods 0.000 description 5
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 5
- 230000002710 gonadal effect Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 5
- 101710143123 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Proteins 0.000 description 4
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 4
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 210000004336 spermatogonium Anatomy 0.000 description 4
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 4
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 101001013009 Homo sapiens Mesoderm induction early response protein 3 Proteins 0.000 description 3
- 101000796121 Homo sapiens Thioredoxin-like protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100025751 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Human genes 0.000 description 3
- 101700026522 SMAD7 Proteins 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004039 Caspase-9 Human genes 0.000 description 2
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 2
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 2
- 101100329224 Coprinopsis cinerea (strain Okayama-7 / 130 / ATCC MYA-4618 / FGSC 9003) cpf1 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000713904 Homo sapiens Activated RNA polymerase II transcriptional coactivator p15 Proteins 0.000 description 2
- 101000746131 Homo sapiens CBP80/20-dependent translation initiation factor Proteins 0.000 description 2
- 101000777047 Homo sapiens Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001040734 Homo sapiens Golgi phosphoprotein 3 Proteins 0.000 description 2
- 101000838964 Homo sapiens Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K Proteins 0.000 description 2
- 101000702132 Homo sapiens Protein spinster homolog 1 Proteins 0.000 description 2
- 101001130509 Homo sapiens Ras GTPase-activating protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000629319 Homo sapiens Spindlin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000976959 Homo sapiens Transcription factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000596771 Homo sapiens Transcription factor 7-like 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000772914 Homo sapiens Ubiquitin-associated protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000957921 Homo sapiens Uncharacterized protein C18orf25 Proteins 0.000 description 2
- 102100029626 Mesoderm induction early response protein 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100030608 Mothers against decapentaplegic homolog 7 Human genes 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 102100027005 Spindlin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100031373 Thioredoxin-like protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100023489 Transcription factor 4 Human genes 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 210000002593 Y chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 2
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 2
- 101150059443 cas12a gene Proteins 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000017448 oviposition Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 102100023990 60S ribosomal protein L17 Human genes 0.000 description 1
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 1
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 1
- 102100036464 Activated RNA polymerase II transcriptional coactivator p15 Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100039527 CBP80/20-dependent translation initiation factor Human genes 0.000 description 1
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 102100031235 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101100240609 Drosophila melanogaster Nipped-B gene Proteins 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100028909 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K Human genes 0.000 description 1
- 101000808789 Homo sapiens Ubiquitin-conjugating enzyme E2 R2 Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101800000283 NEDD8-like protein RUB2 Proteins 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010029782 Nuclear Cap-Binding Protein Complex Proteins 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 102100024372 Nuclear cap-binding protein subunit 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101000610549 Oryza sativa subsp. japonica Thioredoxin-like 3-3 Proteins 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 102100040383 Putative Dol-P-Glc:Glc(2)Man(9)GlcNAc(2)-PP-Dol alpha-1,2-glucosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710183766 Putative Dol-P-Glc:Glc(2)Man(9)GlcNAc(2)-PP-Dol alpha-1,2-glucosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102100031426 Ras GTPase-activating protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000018779 Replication Protein C Human genes 0.000 description 1
- 108010027647 Replication Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229910004444 SUB1 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000057208 Smad2 Human genes 0.000 description 1
- 108700032504 Smad2 Proteins 0.000 description 1
- 108050003294 Spindlin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 1
- 108010048992 Transcription Factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100030424 Ubiquitin-associated protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100038499 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 R2 Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027811 Zinc finger protein 532 Human genes 0.000 description 1
- 101710143350 Zinc finger protein 532 Proteins 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006543 gametophyte development Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N geranyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N 0.000 description 1
- 210000002980 germ line cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000057014 human C18ORF25 Human genes 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 108010025578 ribosomal protein L17 Proteins 0.000 description 1
- 101150071322 ruvC gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003566 sealing material Substances 0.000 description 1
- 230000035938 sexual maturation Effects 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0608—Germ cells
- C12N5/0611—Primordial germ cells, e.g. embryonic germ cells [EG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6879—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for sex determination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/30—Bird
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供用于生成基因修饰的雌鸟的组合物和方法,该雌鸟当与天然雄鸟杂交时,选择性地产生仅雌性的活孵化后代。
Description
技术领域
本发明涉及用于生成基因编辑的雌鸟的组合物和方法,该雌鸟当与天然雄鸟杂交时,选择性地产生雌性的而不是雄性的活孵化后代。
背景技术
在鸟类(特别是鸡)的商业群中,性别分离是肉鸡(为生产肉类而繁殖和饲养)和蛋鸡生产中的一个重要方面。性别分离允许根据繁殖系的更适当的管理和喂养,开发该繁殖系以有效地最大化最终产品(肉类或蛋类)。基本上在所有商业孵化场中,每年选择性宰杀数十亿只一天大的小鸡。因为它们没用而消灭蛋鸡品种的雄性,以及因为为肉类而培养它们不经济而将肉鸡品种的雌性终止。
在鸟类中,性别决定是经由雌性遗传,因为Z-Z性染色体对将指定雄性而Z-W性染色体对将指定雌性(Fridolfsson,A.K.等,1998).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,8147-8152)。将鸟的W染色体与人的Y染色体相比,这两种染色体保存了与祖先基因的最小同一性,这使尺寸以及由此表达的基因最小化。尽管进化的相似性,但注意到鸡的W染色体与所有经测序的Y染色体明显不同,在于它缺少任何在性别特异性器官或组织中特异性表达的基因(Bellott,D.W.等,2017.Nat.Genet.49,387–394)。
在鸡中的平行证据线引导Bellot等(2017,同上)提出鸟的性染色体拥有基因表达的关键组合,其确保了雌性的生存。更具体而言,基因组合确保了在早期阶段的正确胚胎发育。
对用于测定当胚胎在卵内时所需性别的手段和方法有一项进行中的搜寻。例如,国际(PCT)申请公开号WO 2017/094015和WO2018/216022公开了使用转基因鸟类动物的非侵入性方法,该转基因鸟类动物包含至少一种整合到至少一条性染色体Z或W中的报告基因。其中公开的转基因鸟类用于通过检测报告基因,在未孵化的鸟卵中进行胚胎的性别测定和选择。
国际(PCT)申请公开号WO 2019/092265公开了用于自动化非侵入性测定鸟卵(特别是鸡卵)的胚胎的性别的方法和装置,其允许在早期阶段胚胎性别的快速和可靠的测定,在该阶段胚胎还尚未发育出痛觉。方法基于选自T1弛豫时间、T2弛豫时间和扩散系数的与卵相关的NMR参数,以及分类模块,所述分类模块经配置用于基于所述一个或多个NMR参数或由其衍生的参数,测定相关卵的胚胎性别的预测。
尽管避免了需要选择性宰杀活刚孵化的雏鸟,卵的性别分类仍需要破坏大量的包含活胚胎的卵。因此已经进行了通过操纵繁殖亲本来设置后代性别的尝试。例如国际(PCT)申请公开号WO2018/013759公开了包含整合到常染色体的至少一个拷贝上的常染色体抑制因子盒的鸟或其细胞,所述常染色体抑制因子盒可以抑制早期发育所必需的蛋白质的表达。在一些方面,提供包含在W或Z染色体上的异位拯救盒和抑制因子盒的鸟或其细胞,所述异位拯救盒和抑制因子盒可以在子代动物中选择性地拯救胚胎发育。还公开了产生该鸟或其细胞的方法。
国际(PCT)申请公开号WO 2019/058376和WO 2020/178822公开了用于生成嵌合鸟细胞和嵌合鸟类的DNA编辑剂。该编辑剂可用于在雄鸟胚胎中产生条件致死表型。还提供了在卵内破坏雄性小鸡胚胎的方法。
美国申请公开号20140359796公开了基因修饰的家畜动物,及其制备和使用方法,该动物包含基因修饰以扰乱选择性地参与配子发生的靶基因,其中靶基因的扰乱防止动物的功能性配子的形成。
然而,对以下方法有很大需求并且具有以下方法将非常有利:用于扭曲繁殖群的刚孵化的雏鸟中的雌性:雄性性别比的可复现的和有效的方法。
发明内容
本发明回应了上述需求,本发明在一些实施方案中提供能够产性别比偏向雌性的活卵群的基因修饰的雌鸟。有利地,雌性后代是未基因修饰的。本发明进一步提供基因修饰的或基因编辑的雄鸟,其用于生成本文所述的基因修饰的雌性,以及用于产生特征为性别比偏向雌性的鸟刚孵化的雏鸟群的方法。
本发明部分基于未预期的发现,即在至少一种Z-染色体配子同源基因(gametolog)处编辑得到仅雄性遗传编辑的Z染色体的能力,而在雌性中,携带编辑的染色体的配子,在受精时不会发育成活胚胎。
不希望被任何特定理论或作用机制约束,本文公开了雄鸟的未修饰的Z染色体补偿并且使得减数分裂能够产生具有修饰的染色体Z的配子,其可以使雌配子受精以产生活胚胎。相反,在具有修饰的Z染色体的雌性中,染色体W配子同源基因不足以使得活雄性胚胎能够生成,因为其在受精前需要Z-配子同源基因的产物。有利地,本文提供的方法使得可以产生多个产卵雌性的雄性能够产生,该产卵雌性在刚孵化的雏鸟中具有扭曲的雌性:雄性性别比。本文所述的方法将一步式位点定向诱变用于本文所述的鸟类的产生,这确保最小的遗传和/或表观遗传的负面影响。在一些实施方案中本文所述的方法利用不整合任何外源基因到基因组中的系统,并且所得的鸟类被视为非转基因鸟类。
根据一方面,本发明提供具有至少一条基因修饰的染色体Z的鸟细胞,其中该基因修饰的染色体包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因。另一方面,本发明提供具有至少一条基因修饰的染色体Z的雄鸟细胞,其中基因修饰的染色体包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因,其中鸟细胞能够发育成功能性配子。
根据一些实施方案,细胞是使用至少一种人工工程化的核酸酶进行基因编辑的。
根据一些实施方案,配子同源基因是选自zfr、smad2、st8sia3、kcmf1、spin1、sub1、chd1、nipbl、hnrnpk、gfbp1、mier3、btf3、golph3、vcp、txnl1、nedd4、ctif、smad7、rpl17、znf532、hintz、c18orf25、atp5a、zswim6、rasa1、ube2r2、ubap2和tcf4的基因。每个可能代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案,基因修饰配子同源基因以降低其表达。根据一些实施方案,配子同源基因是基因修饰的以降低其活性。
根据一些实施方案,配子同源基因是减数分裂相关基因。
根据一些实施方案,基因选自zfr、smad2、spin1和nipbl。
根据一些实施方案,基因编码锌指RNA结合蛋白(ZFR)。根据某些实施方案,基因是zfr。
根据一些实施方案,细胞是原始生殖细胞(PGC)。根据一些实施方案,PGC选自性腺PGC、血液PGC和生殖新月PGC。在另一实施方案中,细胞是精原干细胞(SSC)。在其他实施方案中,细胞是精原细胞或精母细胞。在另一实施方案中,细胞是配子(例如精细胞)。
根据一些实施方案,当鸟是雄性时,细胞与基因编辑的染色体Z杂合。
根据一些实施方案,鸟是家禽。根据一些实施方案,鸟选自鸡、鹌鹑、火鸡、鹅和鸭。根据某些实施方案,鸟是鸡或鹌鹑。根据另外的实施方案,鸟是观赏鸟。
根据一些实施方案,提供包含至少一个细胞的细胞群。根据一些实施方案,细胞群包含配子。
根据一些实施方案,提供具有至少一个细胞的鸟。根据某些实施方案,鸟是非转基因鸟。
根据一些实施方案,鸟是嵌合鸟。根据某些实施方案,鸟是具有至少一个如本文所述的PGC的嵌合雄鸟。根据某些实施方案,该至少一个PGC与基因编辑的染色体Z杂合。
根据一些实施方案,鸟是雌鸟。根据一些实施方案,鸟是具有至少一个如本文所述的PGC的雌鸟。
根据另外的方面,本发明提供用于降低至少一种染色体Z-配子同源基因的表达和/或活性的位点定向诱变系统。
根据一些实施方案,位点定向诱变系统是成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)。根据其他实施方案,位点定向诱变包含锌指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)的使用。
根据另一方面,本发明提供基因编辑剂,其包含与鸟染色体Z-配子同源基因内的靶核酸序列可杂交的核苷酸序列。
根据一些实施方案,基因编辑剂是合成指导RNA(sgRNA)。
根据一些实施方案,sgRNA包含与鸟染色体Z-配子同源基因内的靶核酸序列互补的核苷酸序列。特别地,提供包含靶向序列(crRNA)的sgRNA,该靶向序列包含与鸟染色体Z-配子同源基因内的靶核酸序列特异性地可杂交(以选择性方式杂交或能够以选择性方式杂交)的15-30个连续的核苷酸。
根据一些实施方案,靶向序列(crRNA)与鸟染色体Z-配子同源基因内的靶核酸序列至少90%、至少95%或至少98%互补。
根据一些实施方案,靶向序列与鸟染色体Z-配子同源基因内的靶核酸序列完全互补。
根据一些实施方案,靶核酸序列在配子同源基因的编码区内。在其他的实施方案中,靶核酸序列在配子同源基因的非编码区内。
根据一些实施方案,Z-配子同源基因是选自zfr、smad2、st8sia3、kcmf1、spin1、sub1、chd1、nipbl、hnrnpk、gfbp1、mier3、btf3、golph3、vcp、txnl1、nedd4、ctif、smad7、rpl17、znf532、hintz、c18orf25、atp5a、zswim6、rasa1、ube2r2、ubap2和tcf4的基因。每种可能性代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案,配子同源基因是减数分裂相关基因。
根据一些实施方案,基因选自zfr、smad2、spin1和nipbl。
根据一些实施方案,基因编码锌指RNA结合蛋白(ZFR)。
根据一些实施方案,靶核酸序列在zfr的外显子3内。
根据一些实施方案,合成指导RNA包含选自GGCTAGCTACACTGTCCACC(SEQ ID NO:1)和GCGCACACAGCTACAGATTA(SEQ ID NO:2)的靶向序列。
根据一些实施方案,提供编码合成指导RNA的核酸构建体。
根据一些实施方案,提供包含至少一种如本文所述的核酸的载体。根据某些实施方案,载体是病毒载体。根据某些实施方案,病毒载体属于慢病毒或腺病毒。在特定实施方案中所述载体是慢病毒。
根据一些实施方案,鸟是家禽。根据某些实施方案,鸟是鸡或鹌鹑。
根据一方面,本发明提供工程化的、非天然存在的成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)基因编辑系统,其包含:(i)如本文所述的合成指导RNA;和(ii)RNA指导的DNA核酸内切酶。
根据一些实施方案,核酸内切酶选自胱天蛋白酶9(Cas9)、Cpf1、锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。
根据一些实施方案,CRISPR编辑系统包含编码合成指导RNA的第一核酸序列和编码RNA指导的DNA核酸内切酶的第二核酸序列。根据某些实施方案,第一核酸序列和第二核酸序列各自形成单独的分子。根据另外的实施方案,第一核酸序列和第二核酸序列包含于单一分子中。
根据一些实施方案,提供包含该至少一种工程化的非天然存在的基因编辑系统的载体。根据一些实施方案,载体是病毒载体。根据某些示例性实施方案,病毒载体属于慢病毒或腺病毒。在特定实施方案中所述载体是慢病毒。
根据一些实施方案,提供包含基因编辑系统的细胞群。
根据一些实施方案,在细胞内瞬时表达基因修饰或编辑系统。
根据一些实施方案,提供包含至少一个包含基因编辑系统的细胞的鸟(例如雄性)。根据某些实施方案,该至少一个细胞是PGC。在另一实施方案中,细胞选自性腺PGC、血液PGC和生殖新月PGC。在另一实施方案中,细胞是精原干细胞(SSC)。在其他的实施方案中,细胞是精原细胞或精母细胞。在另一实施方案中,细胞是配子(例如精细胞)。
根据另外的方面,本方面提供有具有基因修饰的染色体Z和未修饰的染色体Z的细胞的嵌合雄鸟,该基因修饰的染色体Z包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因。
根据一些实施方案,细胞是使用至少一种人工工程化的核酸酶进行基因编辑的。
根据一些实施方案,鸟不包含任何稳定地整合到其基因组中的外源性多核苷酸序列。根据某些实施方案,鸟不包含本文所述的基因修饰或基因编辑系统。根据其他实施方案,鸟包含稳定地整合到其基因组中的外源性多核苷酸序列。
根据一方面,本发明提供生成有具有基因修饰的染色体Z和未修饰的染色体Z的细胞的嵌合雄鸟的方法,该基因修饰的染色体Z包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因,该方法包括以下步骤:将如本文所述的位点定向诱变系统或基因编辑系统施用于雄鸟细胞群,从而生成基因组修饰的鸟细胞;并且将基因组修饰的鸟细胞转移至受体雄鸟胚胎,从而生成嵌合雄鸟。
根据一些实施方案,方法包括在将基因组修饰的鸟细胞转移至受体鸟之前,消除或扰乱受体鸟的内源性PGC细胞的步骤。
根据一些实施方案,方法包括将嵌合鸟饲养至性成熟,其中嵌合鸟产生来源于供体PGC的配子。
根据一方面,本发明提供生成有具有基因修饰的染色体Z和未修饰的染色体Z的细胞的嵌合雄鸟的方法,该细胞包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因,该方法包括向受体雄鸟胚胎施用如本文所述的位点定向诱变系统或基因编辑系统的步骤。
根据一些实施方案,经由选自病毒感染、转座酶系统、电穿孔、化学转化或其任何组合的途径施用位点定向诱变系统或基因编辑系统。根据示例性实施方案,病毒感染通过慢病毒或腺病毒进行。
根据另外的方面,本发明提供生成有具有基因修饰的染色体Z和未修饰的染色体Z的细胞的嵌合雄鸟的方法,该细胞包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因,该方法包括向受体雄鸟体内施用如本文所述的位点定向诱变系统或基因编辑系统的步骤。
根据一些实施方案,鸟是性成熟的雄鸟。
在各个实施方案中,可以向雄鸟的配子和/或其前体(例如SSC或其他精原细胞)直接体内施用位点定向诱变系统或基因编辑系统。根据一些实施方案,向雄鸟睾丸直接施用位点定向诱变系统或基因编辑系统(例如通过睾丸内注射)。根据一些实施方案,经由选自病毒感染、转座酶系统、电穿孔、化学转化或其任何组合的途径施用位点定向诱变系统或基因编辑系统。
根据某些实施方案,使用慢病毒施用位点定向诱变系统或基因编辑系统。
鸟、配子同源基因和位点定向诱变系统或基因编辑系统如上文所述。
根据另一方面,本发明提供生成有具有基因修饰的染色体Z和未修饰的染色体Z的细胞的嵌合雄鸟的方法,该细胞包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因,该方法包括向受体雄鸟施用如本文所述的基因修饰的PGC的步骤。
根据一些实施方案,鸟是性成熟的雄鸟。根据某些实施方案,该方法包括向鸟的睾丸施用细胞的步骤。根据某些实施方案,在基因修饰的PGC的施用之前使鸟绝育。
根据另外的方面,本发明提供包含至少一个包含基因修饰的染色体Z和未修饰的染色体Z的细胞的基因修饰的雄鸟,该基因修饰的染色体Z包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因。
根据一些实施方案,提供用于生成基因修饰的雄鸟的方法,该方法包括将如本文所述的嵌合雄鸟与具有未修饰的染色体Z的雌鸟交配,并且筛选所得的后代中基因修饰的雄性的步骤。
根据另外的方面,本发明提供能够产具有偏向的性别比的活卵群的基因修饰的雌鸟,所述鸟具有至少一种染色体Z-配子同源基因的降低的表达和/或活性。
根据一些实施方案,提供用于生成能够产具有偏向的性别比的活卵群的基因修饰的雌鸟的方法,其包含将本文所述的基因修饰的雄鸟与雌鸟杂交并且筛选后代中基因修饰的雌性的步骤。
根据另外的方面,本发明提供用于产生特征为性别比偏向雌性的鸟刚孵化的雏鸟群的方法,其包含将如本文所述的基因修饰的雌鸟与具有未修饰的Z染色体的雄鸟繁殖,从而产生基本上仅雌性的刚孵化的雏鸟群。
根据另外的方面,本发明提供具有至少一条基因修饰的染色体Z的鸟细胞,其中基因修饰的染色体包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因。
根据一些实施方案,鸟细胞能够发育成功能性配子。
要理解的是本文公开的每个方面和实施方案的任何组合都明确地涵盖于本发明的公开内容内。
由后文给出的详细描述,本发明的适用性的全部范围和进一步的实施方案将变得显而易见。然而,应当理解的是,尽管指出了本发明的优选实施方案,详细描述和具体实施例仅以说明的方式给出,因为由该详细描述,在本发明的精神和范围内的各种改变和修饰对本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
图1.用于生成根据本发明的一些实施方案的基因修饰的鸟类和未修饰的雌性后代的繁殖步骤的图示。A)ZZ*嵌合雄性的生成。B)将来自步骤A的嵌合雄性ZZ*与天然雌性WZ交配,随后筛选杂合子雄性ZZ*后代。C)将来自步骤B的杂合子雄性ZZ*与天然雌性WZ交配,随后筛选杂合子雌性WZ*后代。D)将来自步骤C的杂合子雌性WZ*与天然雄性ZZ交配并且只产生WZ后代。
图2.对使用如本文所述的gRNA/Cas9系统的体外切割进行的琼脂糖分析。对照泳道含有250ng的未消化的靶DNA序列。gRNA泳道为分别使用标记在胶上的gRNA 1(具有SEQID NO:1)或gRNA 3(具有SEQ ID NO:2)的Cas9核酸内切酶活性在250ng靶DNA序列上的产物。
图3.体内切割测定。a)实验程序的图示。拥有中间具有所需的遗传靶标“断裂”的EGFP基因的遗传构建体。如果切割了所需的遗传靶标则EGFP具有组装功能性EGFP基因的潜能。b)在共转染72h后HEK细胞的与488nm通道融合的亮视野。c)在共转染72h后DF-1细胞的与488nm通道融合的亮视野。所有细胞都用含有pEGxxFP zfr构建体的第一质粒和含有gRNA(除了对照实验,无gRNA)和Cas9核酸内切酶的第二质粒共转染。gRNA 1–包含SEQ ID NO:1的指导RNA,gRNA 3–包含SEQ ID NO:2的指导RNA。
具体实施方式
本发明提供选择性地产生孵化的雌性后代的基因编辑的鸟类。本发明进一步提供用于产生基因编辑的雌鸟的方法。本发明进一步提供有具有基因编辑的染色体Z和未修饰的染色体Z的细胞的基因编辑的雄鸟,该基因编辑的染色体Z包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因。可将基因编辑的雄鸟与雌性交配以得到基因修饰的雌鸟。
商业孵化场在肉鸡和蛋鸡的培育期间使用性别分离。为了产生蛋鸡,在孵化场中典型地选择性宰杀雄性小鸡。本发明在其实施方案中提供方法以产生基本上产仅雌性的后代的雌鸟(例如鸡)。这防止对雄性小鸡的不人道的杀害以及具有降低饲料和能源成本、节约空间和人力的经济优势。
根据本发明的方法包括Z-染色体配子同源基因的编辑,其导致仅雄性遗传编辑的Z染色体的能力。具有修饰的染色体Z的雄配子在与天然的雌性受精时会发育成活胚胎。可将本发明的实施方案的雄鸟(有具有修饰的染色体Z-配子同源基因的配子)与雌鸟交配以产生可仅孵化雌性的产卵雌性。有利地,当单一雄性(其染色体Z-配子同源基因进行了编辑)与雌性交配时,可产生多个雌性,其每个都仅产雌性。
本发明首次公开了染色体Z配子同源基因,其功能在雌性中在减数分裂后和直到受精后几天的靶定时间下降低或消除,得到不能存活雄性胚胎。不希望被任何特定理论或作用机制约束,该现象可能起因于在雌性中需要染色体Z功能性配子同源基因和染色体W功能性配子同源基因两者用于产生活胚胎的事实。在受精前雌配子需要特定的条件和表达谱,其随后用于受精以及受精后还用于胚胎在其最初几天的建立。由于Z-配子同源基因产物的缺乏,雄性胚胎存活不超过几天。因此,本发明在其实施方案中提供用于产生杂合的雄鸟的方法和手段,该雄鸟能够与雌鸟交配以产生可仅孵化雌性的产卵雌性。
本发明在一些实施方案中提供将位点定向诱变用于扰乱染色体Z-配子同源基因在原始生殖细胞(PGC)中的表达或活性的方法。在一些实施方案中将基因修饰的PGC施用于雄性胚胎以生成具有ZZ*(Z*代表具有基因修饰的配子同源基因的Z染色体)的嵌合雄性。该嵌合雄鸟与天然雌鸟杂交时使得与Z配子同源基因杂合的雄鸟(ZZ*)能够生成。然后异源的雄鸟与雌鸟繁殖用于生成具有修饰的染色体Z-配子同源基因的雌鸟(WZ*鸟类),其能够仅产活雌性后代。
在其他实施方案中,向性成熟的雄鸟的睾丸直接施用位点定向诱变,从而扰乱染色体Z-配子同源基因在精细胞和/或其前体中的表达或活性。在一些实施方案中,使用病毒载体以将位点定向诱变系统递送至鸟的睾丸。
在另外的实施方案中,可以将基因修饰的PGC施用到(移植进入)性成熟的雄鸟的睾丸。在一些实施方案中,在PGC的施用前使鸟绝育。
根据一方面,本发明提供具有至少一条基因修饰的染色体Z的鸟细胞,其中基因修饰的染色体包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因。根据另一方面,本发明提供具有至少一条基因修饰的染色体Z的雄鸟细胞,其中基因修饰的染色体包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因,鸟细胞能够发育成功能性配子。
如本文所用,关于细胞或生物体的术语“基因修饰”是指人为基因改变的细胞或包含其的生物体。基因修饰包括内源性DNA分子或基因的修饰,例如通过引入插入、改变、缺失转座元件等等到感兴趣的内源性核酸序列或基因中。另外,或备选地,基因修饰包括用整合到细胞基因组中的异源的多核苷酸来转化细胞,从而产生转基因细胞或包含其的转基因生物体。
如本文所用的术语“天然鸟”是指未根据本发明在它的性染色体中编辑或修饰的鸟。
如本文所用的术语“嵌合鸟”是指具有未编辑的细胞或未修饰的细胞,以及如本文所述的修饰的细胞或编辑的细胞(即具有基因修饰的染色体Z,其中至少一种配子同源基因具有降低的表达和/或活性)的鸟。
根据一方面,本发明提供包含至少一个包含基因修饰的染色体Z和未修饰的染色体Z的细胞的基因修饰的雄鸟,该基因修饰的染色体Z包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因。
在另一实施方案中,本发明提供基因修饰的鸟(例如雄鸟),鸟包含(基本上在其所有细胞内)基因修饰的染色体Z和未修饰的染色体Z,该基因修饰的染色体Z包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因。
在另一实施方案中,本发明提供基因修饰的鸟(例如雄鸟),其中生殖系细胞包含基因修饰的染色体Z和未修饰的染色体Z,该基因修饰的染色体Z包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因。
如本文所用的“基因修饰的鸟”一般是指其细胞中包含基因修饰的染色体Z的鸟。该术语包括如本文所述对其大部分细胞进行修饰的鸟。在其他实施方案中,如本文所述对所有鸟细胞进行修饰。
如本文所述的术语配子同源基因的“降低的表达”或“抑制的表达”可互换使用并且包括但不限于缺失或扰乱编码蛋白质的基因,以得到显著下调的表达。
如本文所述的术语配子同源基因的“降低的活性”或“抑制的活性”包括但不限于突变或翻译后修饰,其得到显著降低的或消除的蛋白质的活性。
根据一些实施方案,与未编辑的或未修饰的配子同源基因的表达或活性相比,配子同源基因的表达或活性降低了至少50%、60%、80%、80%、90%、95%或99%。根据一些实施方案,完全地消除配子同源基因的表达。根据另外的实施方案,完全地消除配子同源基因的活性。
如本文所用的术语“功能性配子”是指当与另一雄配子或雌配子组合时能够产生活胚胎的配子。
“活胚胎”是指能够发育成鸟的胚胎。
根据一些实施方案,通过使用至少一种人工工程化的核酸酶的基因编辑的技术对细胞的内源性基因进行修饰。
RNA指导的DNA核酸酶在本文用于在染色体Z-配子同源基因中引入突变以扰乱其活性和/或表达。
如本文所用的术语“基因编辑”是指在内源性基因组DNA中一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代。插入、缺失或取代在本文用于扰乱基因产物的表达和/或活性。
如本文所用的术语“配子同源基因”如本领域已知并且是指在鸟类的性染色体,特别是染色体Z和染色体W之间共享的同源基因。
根据一些实施方案,配子同源基因是选自zfr、smad2、st8sia3、kcmf1、spin1、sub1、chd1、nipbl、hnrnpk、gfbp1、mier3、btf3、golph3、vcp、txnl1、nedd4、ctif、smad7、rpl17、znf532、hintz、c18orf25、atp5a、zswim6、rasa1、ube2r2、ubap2和tcf4的基因。每种可能性都代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案,配子同源基因是选自zfr、smad2、st8sia3、kcmf1、spin1、sub1、chd1和nipbl的基因。根据一些实施方案,配子同源基因是选自hnrnpk、gfbp1、mier3、btf3、golph3、vcp、txnl1、nedd4、ctif、smad7、rpl17、znf532、hintz、c18orf25、atp5a、zswim6、rasa1、ube2r2、ubap2和tcf4的基因。每种可能性都代表本发明的单独的实施方案。
根据一些实施方案,对该至少一种配子同源基因进行基因修饰以降低其表达。根据一些实施方案,对该至少一种配子同源基因进行基因修饰以降低其活性。例如可通过错义突变或无义突变向编码区的插入进行修饰。
根据一些实施方案,配子同源基因是减数分裂相关基因。
根据一些实施方案,基因选自zfr、smad2、spin1和nipbl。根据一些实施方案,基因选自zfr、smad2和spin1。根据一些实施方案,基因选自zfr和smad2。根据一些实施方案,基因选自smad2和spin1。根据一些实施方案,基因选自smad2、spin1和nipbl。
根据一些实施方案,基因编码锌指RNA结合蛋白(ZFR)。
在包括人类、黑猩猩、狗、牛、小鼠和鸡的多种动物中zfr基因(基因ID 427424,同义词:zfr2)是保守的。该基因编码特征为它的DZF(锌指相关的结构域)结构域的RNA结合蛋白。
根据其他实施方案,配子同源基因选自smad2、st8sia3、kcmf1、spin1、sub1、chd1、nipbl、hnrnpk、gfbp1、mier3、btf3、golph3、vcp、txnl1、nedd4、ctif、smad7、rpl17、znf532、hintz、c18orf25、atp5a、zswim6、rasa1、ube2r2、ubap2和tcf4。
基因smad2编码蛋白SMAD2(例如原鸡(鸡)中基因ID:395247),也称为SMAD家族成员2(母亲对抗decapentaplegic同源物2)(Mothers against decapentaplegic homolog2),SMAD2蛋白介导转化生长因子(TGF)-β的信号。
基因st8sia3编码st8sia3蛋白(ST8α-N-乙酰基-神经氨酸(neuraminide)α-2,8-唾液酸转移酶3;例如基因ID:414796(原鸡))。
基因kcmf1编码钾通道调节因子1(例如基因ID:770239(原鸡))。
基因spin1编码SPIN1,spindlin 1蛋白(例如基因ID:395344(原鸡))。
基因sub1编码SUB1,转录调节因子(例如基因ID:427425(原鸡))。
基因chd1编码CHD1蛋白,染色质域解旋酶DNA结合蛋白1Z(例如基因ID:395783(原鸡))。
基因nipbl或LOC427439编码Nipped-B同源物样蛋白(例如基因ID:427439(原鸡))。
基因hnrnpk编码HNRNPK,异质核核糖核蛋白K(例如基因ID:427458(原鸡))。
基因mier3编码MIER3或MIER家族成员3(例如基因ID:427146(原鸡))。
基因golph3编码GOLPH3,高尔基磷蛋白3(例如基因ID:427422(原鸡))。
基因vcp编码VCP,含缬酪肽蛋白(例如基因ID:427410(原鸡))。
基因txnl1编码TXNL1,硫氧还蛋白样1蛋白(例如基因ID:426854(原鸡))。
基因ctif编码CTIF,CBP80/20依赖性翻译起始因子(例如基因ID:770140(原鸡))。
基因smad7编码SMAD7或SMAD家族成员7蛋白(基因ID:429683(例如原鸡))。
基因rpl17编码核糖体蛋白L17(例如基因ID:426845(原鸡))。
基因znf532编码锌指蛋白532(例如基因ID:100857356(原鸡))。
基因c18orf25或LOC100858742编码染色体Z开放阅读框,人C18orf25假基因(例如基因ID:100858742(原鸡))。
基因zswim6编码含锌指SWIM-型6(例如基因ID:770670(原鸡))。
基因rasa1编码RASA1,RAS p21蛋白激活因子1(例如基因ID:427327(原鸡))。
基因ube2r2编码泛素缀合酶E2 R2(例如基因ID:427021(原鸡))。
基因ubap2编码UBAP2,泛素相关蛋白2(例如基因ID:407092(原鸡))。
基因tcf4编码TCF4,转录因子4(例如基因ID:768612(原鸡))。
要理解上述原鸡(鸡)的配子同源基因作为配子同源基因的非限制性实例给出,其包括它们在如本文所公开的鸡、鹌鹑和其他鸟类中的同源物。
如本文所用的术语“减数分裂相关基因”是指编码参与减数分裂过程的产物的基因。
根据一些实施方案,细胞是原始生殖细胞(PGC)。根据一些实施方案,PGC选自性腺PGC、血液PGC和生殖新月PGC。根据另外的实施方案,细胞选自性腺PGC、血液PGC和生殖新月PGC。在另一实施方案中,细胞是精原干细胞(SSC)。在其他实施方案中,细胞是精原细胞或精母细胞。在另一实施方案中,细胞是配子(例如精细胞)。
原始生殖细胞是二倍体细胞,其是配子的前体,并且其仍必须到达性腺并且在减数分裂后在此发育成单倍体的精子和卵。可以从胚胎中获得这些细胞并且将其作为细胞培养物繁殖,而当再引入宿主鸟动物中时不丧失有助于生殖系的能力。使用传统的转染和选择技术可在培养中对PGC进行基因修饰,所述转染和选择技术包括基因靶向方法和位点特异性核酸酶方法。
根据一些实施方案,提供具有至少一个细胞的鸟。
根据一些实施方案,鸟是嵌合鸟。根据某些实施方案,鸟是具有至少一个如本文所述的PGC的嵌合雄鸟。根据某些实施方案,该至少一个PGC与基因编辑的染色体Z杂合。
根据一些实施方案,鸟是雌鸟。根据一些实施方案,鸟是具有至少一个如本文所述的PGC的雌鸟。
如本文所用的术语“鸟”是指任何鸟类,其包括但不限于鸡、鹌鹑、火鸡和鸭。优选地,鸟是家禽。
根据一些实施方案,鸟是鸡。根据某些实施方案,鸟是鹌鹑。
根据一些实施方案,提供包含该至少一个细胞的细胞群。根据某些实施方案,细胞群包含配子。
根据本发明的一些实施方案,细胞群来源于与受体鸟相同的鸟类。根据本发明的一些实施方案,细胞群来源于与受体鸟相同的品种。根据其他实施方案,细胞群来源于与受体鸟不同的鸟类或品种。
根据另外的方面,本发明提供用于降低至少一种染色体Z-配子同源基因的表达和/或活性的位点定向诱变系统。
根据本发明可以使用本领域已知的任何基因修饰、编辑或诱变方法,该方法将导致染色体Z-配子同源基因表达或活性的扰乱。
根据一些实施方案,位点定向诱变系统是成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)。
根据一些实施方案,CRISPR系统包含,或编码:(i)如本文所述的gRNA和(ii)RNA指导的DNA核酸内切酶。
根据另外的方面,本发明提供合成指导RNA,其包含与鸟染色体Z-配子同源基因内的靶核酸序列互补的核苷酸序列(本文也称为靶向核苷酸序列)。
如本文所用,“gRNA”意为指导RNA并且是短的合成RNA,其由核酸内切酶结合所必需的“支架”序列和长度约为20个核苷酸的用户定义的核苷酸“间隔基”或“靶向”序列构成,该“间隔基”或“靶向”序列定义基因组靶标。
使用修饰可稳定gRNA分子。根据一些实施方案,gRNA是合成的RNA分子。根据一些实施方案,对gRNA进行修饰。根据某些实施方案,对gRNA在5’端进行修饰。
在一些实施方案中,修饰选自2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)及其组合。
gRNA序列包括在单一嵌合转录体中的靶向同源序列(crRNA)与将crRNA连接至Cas9核酸酶的内源性细菌RNA(tracrRNA)的组合。通过crRNA序列与互补的基因组DNA之间的碱基配对将gRNA/Cas9复合物募集到靶序列上。为了Cas9的成功结合,基因组靶序列还必须含有正确的原间隔序列邻近基序(PAM)序列(紧随靶序列之后)。gRNA/Cas9复合物的结合将Cas9定位至基因组靶序列,使得Cas9可以切割DNA的两条链,这造成双链断裂。
根据一些实施方案,gRNA的靶核酸序列在配子同源基因的编码区内。
根据一些实施方案,提供编码指导RNA的核酸构建体。
根据一些实施方案,提供包含至少一种如本文所述的核酸的载体。根据某些实施方案,载体是病毒载体。根据某些实施方案,病毒载体属于慢病毒或腺病毒。
载体典型地包含用于在细胞中所需核酸的表达的调节元件。载体可以包含可操作连接以驱动gRNA和核酸内切酶的表达的启动子。启动子可为组成性或诱导性。根据一些实施方案,可操作连接以驱动gRNA和核酸内切酶的表达的启动子是组成性启动子。启动子可以但不限于属于病毒来源,例如CMV、E1A、CAG或RSV启动子,或备选地,鸟的管家启动子。根据某些示例性实施方案,gRNA启动子是鹌鹑的7SK启动子。根据一些实施方案,gRNA启动子是人的U6启动子。
CAG启动子是包含CMV启动子和鸡β-肌动蛋白启动子的强合成启动子,其经常用于驱动鸟类中高水平的基因表达。
根据一些实施方案,载体进一步包含功能性元件,例如复制起点、多克隆位点和选择标记。
优选地,编码DNA编辑系统的核酸内切酶的密码子是“优化的”密码子,即密码子是在鸟类中表达的基因中经常出现的密码子。
本发明进一步提供工程化的、非天然存在的成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)基因编辑系统,其包含:(i)如本文所述的合成指导RNA;和(ii)RNA指导的DNA核酸内切酶。
根据一些实施方案,核酸内切酶选自胱天蛋白酶9(Cas9)、Cpf1、锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。
如本文所用,“Cas9”意为非特异性CRISPR相关核酸内切酶。Cas9核酸酶有两个功能性结构域:RuvC和HNH,其每个都切割不同的DNA链。当这两个结构域都是活性的时,Cas9造成基因组DNA中的双链断裂。
Cpf1(CRISPR-Cas12a)是使用缺乏反式激活CRISPR RNA的小的指导RNA的核酸内切酶,靶向基因组的富含T的区域,并且能够生成具有交错末端的双链断裂(DSB)。
锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合结构域融合至DNA切割结构域生成的人工限制酶。可将锌指结构域工程化以靶向特定所需的DNA序列并且这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的独特序列。
转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)是限制酶,可将其工程化以切割DNA的特定序列。它们是通过将TAL效应物DNA结合结构域与DNA切割结构域(切割DNA链的核酸酶)融合来制成的。它们含有称为TALE的DNA结合蛋白。TALE为33-35个氨基酸长并且识别DNA的单一碱基对。
根据一些实施方案,CRISPR编辑系统包含编码合成指导RNA的第一核酸序列和编码RNA指导的DNA核酸内切酶的第二核酸序列。根据某些实施方案,第一核酸序列和第二核酸序列各自形成单独的分子。根据另外的实施方案,第一核酸序列和第二核酸序列包含于单一分子中。
根据一些实施方案,提供包含至少一种工程化的非天然存在的基因编辑系统的载体。根据一些实施方案,载体是病毒载体。根据某些示例性实施方案,病毒载体是慢病毒。
根据一些实施方案,本发明涉及如本文公开的核酸分子、构建体、系统或载体,其调节至少一种Z-配子同源基因的表达。
根据一些实施方案,提供包含基因编辑系统的细胞群。
根据一些实施方案,提供包含至少一个包含基因编辑系统的细胞的鸟。根据某些实施方案,该至少一个细胞是PGC。根据另外的实施方案,细胞选自性腺PGC、血液PGC和生殖新月PGC。在另一实施方案中,细胞是精原干细胞(SSC)。在其他实施方案中,细胞是精原细胞或精母细胞。在另一实施方案中,细胞是配子(例如精细胞)。
在一些实施方案中,从鸟胚胎中取出细胞并且在体外向细胞施用位点定向诱变系统。在其他实施方案中,向鸟或胚胎施用位点定向诱变系统。在某些示例性实施方案中,向性成熟的雄鸟的睾丸施用位点定向诱变系统。在其他实施方案中,在性成熟之前向孵化的小鸡施用位点定向诱变系统。
本领域已知的任何方法都可用于向细胞施用位点定向诱变系统(例如CRISPR)。
根据一些实施方案,使用病毒载体向细胞施用位点定向诱变系统。根据一些实施方案,病毒载体是腺病毒。根据某些实施方案,病毒载体是慢病毒。
根据一些实施方案,使用电穿孔、化学剂或纳米颗粒向细胞施用位点定向诱变系统。
根据一些实施方案,使用转座酶系统使染色体Z-配子同源基因突变。
转座酶系统包含转座酶和由其反向末端重复(ITR)定义的DNA元件或具有相同ITR的其他元件。转座酶系统的实例是Tol2转座子。转座酶系统使DNA片段能够插入到基因组内的预定位置,从而扰乱期望的基因。
任何位点定向诱变都可用于生成本文所述的基因修饰的鸟类。示例性的系统是成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)基因编辑系统。CRISPR系统使得能够在基因组内的精确位置切割DNA的链。
CRISPR系统使用指导RNA(gRNA)来靶向核酸内切酶以在基因组内的所需位置切割和创造特定的双链断裂。然后通过易错的非同源末端连接(NHEJ)途径修复染色体中的切割。该途径经常造成小的核苷酸插入或缺失,这可能解释了遗传扰乱和基因敲除。本文使用该系统以降低至少一种染色体Z-配子同源基因的表达和/或活性。
选择靶向序列使得它们将与细胞的配子同源基因序列特异性地杂交并且不与细胞的任何其他染色体特异性地杂交。
可使用多种公开可获得的生物信息学工具确定合适的gRNA靶序列,该生物信息学工具包括CHOPCHOP算法、Broad Institute GPP、CasOFFinder、CRISPOR、Deskgen等。
根据某些示例性实施方案,合成指导RNA包含选自GGCTAGCTACACTGTCCACC(SEQ IDNO:1)和GCGCACACAGCTACAGATTA(SEQ ID NO:2)的靶向序列。
要理解的是当本文出现本发明的核酸分子的核酸序列时,包括DNA序列和RNA序列这二者。例如,具有如SEQ ID NO:1所示的核酸序列的核酸分子的序列可以是GGCTAGCTACACTGTCCACC或者GGCUAGCUACACUGUCCACC(取决于上下文)。
如本文所述,用于使功效合格和检测正确的基因修饰的方法是本领域所熟知的,并且包括但不限于DNA测序、PCR、RT-PCR、RNA酶保护、原位杂交、引物延伸、Southern印迹、Northern印迹和斑点印迹分析。
本发明的基因编辑系统或基因修饰系统可以用于生成有具有降低的活性和/或表达的染色体Z-配子同源基因的雄鸟(例如公鸡)。可以将基因编辑的雄鸟与雌性交配,以生成能够仅产生活雌性后代的雌性鸡。
第一步为将DNA编辑系统引入鸟的原始生殖细胞中或直接引入鸟的精细胞(和/或如本文公开的其前体)中。本领域已知的任何方法都能够用于引入DNA编辑系统,该方法包括但不限于脂转染、转染、显微注射和电穿孔,以及经由病毒载体转导。
然后在本发明的实施方案中筛选细胞中有具有降低的活性和/或表达的染色体Z-配子同源基因的细胞。
为了由在体外编辑的PGC产生嵌合鸟类,在当宿主胚胎的内源性PGC正迁移至生殖脊时的阶段,将外源性编辑的细胞静脉内注射到代孕的宿主胚胎内。
在PGC仍可迁移至发育中的性腺的任何合适时间,可将原始生殖细胞在卵内施用于受体动物。在一个实施方案中,从胚胎发育的根据Eyal-Giladi&Kochav(EG&K)分期系统的约阶段IX到根据Hamburger&Hamilton分期系统的约阶段30进行施用,并且在另一实施方案中,在阶段15。对于鸡,因此施用时间是在胚胎发育的第1、2、3或4天期间:在一个实施方案中是第2天到第2.5天。典型地通过注射到任何合适的靶位点内来施用,靶位点例如由羊膜(包括胚胎)、卵黄囊等定义的区域。根据一些实施方案,注射到胚胎本身(包括胚胎体壁)内,以及在替代的实施方案中,可以采用血管内或体腔内注射到胚胎内。在其他实施方案中,向心脏内进行注射。在受体鸟在卵内先行绝育(例如通过使用白消安的化学处理或通过γ或X射线照射)的情况下可实施本公开主题的方法。如本文所用,术语“绝育”是指使得部分或完全不能产生来源于内源性PGC的配子。当从这类受体中收集供体配子时,可将它们作为具有供体和受体的配子的混合物进行收集。可直接使用该混合物,或可将混合物进一步加工以富集其中的供体配子的部分。
可通过任何合适的技术(手动地或以自动化的方式),进行原始生殖细胞的卵内施用。根据一些实施方案,通过注射进行卵内施用。卵内施用的机制不是关键,但要理解该机制不应当过度损害胚胎的组织和器官或围绕它的胚胎外膜,使得处理将不会过度减少孵化率。配备有约18到26规的针头的皮下注射器适用于该目的。可以使用具有约20-50微米直径的开口的锋利的拉制玻璃移液器。取决于发育的精确阶段和胚胎的位置,一英寸的针头将终止在小鸡上方的流体中或小鸡本身中。如需要,可用基本上细菌不可渗透的密封材料(例如蜡等等)密封卵,以防止不期望的细菌的后续进入。设想到用于鸟胚胎的高速注射系统将特别适用于实践本公开的主题。所有这些设备(如适用于实践本文所公开的方法)包含含有如本文所述的原始生殖细胞的制剂的注射器,其中将注射器定位以在卵内的适当位置注射由装置携带的卵。另外,可提供可操作连接至注射装置的密封装置用于在其注射后密封卵内的孔。根据其他实施方案,拉制玻璃微量移液器可用来将PGC引入到卵内的适当位置内-例如直接到血流中,或者到静脉或动脉或直接到心脏中。
可以允许经注射的胚胎生长至成熟。在一些实施方案中,将经注射的胚胎转移至代孕卵中。
一旦已经用修饰的PGC注射过卵,则孵育嵌合胚胎以孵化。将它饲养至性成熟,其中嵌合鸟产生来源于供体PGC的配子。
然后将来自嵌合体的配子(卵或精子)用于饲养创始鸟类(例如鸡)。本领域已知的分子生物学技术(例如PCR、Southern印迹和/或T7核酸内切酶测定)可以用于确认生殖系传递。
根据其他实施方案,在性成熟雄鸟的精原干细胞(SSC)或分化的精细胞上直接进行遗传操作(其中施用位点定向诱变)。这可通过注射或以其他方式将本文所述的位点定向诱变系统直接施用于它的睾丸内来完成。
根据另外的实施方案,将本文所述的位点定向诱变系统注射或以其他方式施用于不成熟的鸟类或小鸡的睾丸。
根据一些实施方案,将本文所述的基因修饰的PGC细胞施用于雄鸟。在一些实施方案中,将PGC细胞施用于鸟的睾丸。在一些实施方案中,鸟类是性成熟的。根据其他实施方案,鸟类是非性成熟的,或小鸡。
根据一些实施方案,在施用前使鸟类绝育。
在一些实施方案中,使用病毒载体(例如属于慢病毒)施用诱变系统。在另外的实施方案中,使用转座酶施用诱变系统。
根据一些实施方案,将慢病毒载体用于递送位点定向诱变。在一些实施方案中,位点定向诱变是CRISPR。根据一些实施方案,慢病毒包含含有针对Z-配子同源基因的靶向序列的gRNA和编码核酸内切酶的序列。根据一些实施方案,核酸内切酶是CAS9。根据某些实施方案,慢病毒载体包含可操作地连接至编码核酸内切酶的序列和/或gRNA的CAG启动子。根据某些实施方案,核酸内切酶包含核定位信号。
根据另外的方面,提供具有包含至少一种染色体Z-配子同源基因和未修饰的染色体Z的细胞的嵌合雄鸟,该染色体Z-配子同源基因具有降低的表达和/或活性。
根据一些实施方案,鸟不包含任何稳定地整合到它的基因组中的外源性多核苷酸序列。
本发明提供生成具有包含至少一种染色体Z-配子同源基因和未修饰的染色体Z的细胞的嵌合雄鸟的方法,该染色体Z-配子同源基因具有降低的表达和/或活性,该方法包括以下步骤:将如本文所述的位点定向诱变系统或基因编辑系统施用于雄鸟细胞群,从而生成经基因组编辑的鸟细胞;并且将经基因组编辑的鸟细胞转移至受体雄鸟胚胎,从而生成嵌合雄鸟。
根据一些实施方案,方法包括将嵌合鸟饲养至性成熟,其中嵌合鸟产生来源于供体的基因修饰的PGC的配子。
本发明进一步提供生成具有包含至少一种染色体Z-配子同源基因和未修饰的染色体Z的细胞的嵌合雄鸟的方法,该染色体Z-配子同源基因具有降低的表达和/或活性,该方法包括将如本文所述的位点定向诱变系统或基因编辑系统施用于受体雄鸟胚胎的步骤。
然后将嵌合鸟与雌鸟交配以生成杂合的ZZ*后代。
根据一些实施方案,提供用于生成基因编辑的雄鸟的方法,其包含将如本文所述的嵌合雄鸟与具有未修饰的染色体Z的雌鸟繁殖的步骤。根据某些实施方案,方法包括筛选所得后代中杂合的ZZ*鸟类。
根据另外的方面,本发明提供能够产具有偏向的性别比的活卵群的基因编辑的雌鸟,所述鸟具有至少一种染色体Z-配子同源基因的降低的表达和/或活性。
根据一些实施方案,提供用于生成能够产具有偏向的性别比的活卵群的基因编辑的雌鸟的方法,其包含将本文所述的基因编辑的雄鸟与雌鸟杂交,并且筛选后代中基因编辑的雌性的步骤。
根据另外的方面,本发明提供用于产生特征为性别比偏向雌性的鸟刚孵化的雏鸟群的方法,其包含将本文所述的基因编辑的雌鸟与具有未修饰的Z染色体的雄鸟繁殖,从而产生基本上仅雌性的刚孵化的雏鸟群。
根据另外的方面,本发明提供包含如本文所述的PGC细胞或位点定向诱变系统和可接受的载剂的兽医用组合物。
根据一些实施方案,配制用于给鸟类注射的兽医用组合物。
根据一些实施方案,位点定向诱变系统是CRISPR。
根据一些实施方案,组合物包含含有本文所述的位点定向诱变系统的病毒载体或转座酶。
根据一些实施方案,组合物进一步包含抗生素。
为了更完整地说明本发明的一些实施方案提出以下实施例。然而,它们决不应当被理解为限制本发明的广泛的范围。在不背离本发明的范围的情况下,本领域技术人员可以容易地设计本文所公开原理的许多变化和修饰。
实施例
实施例1:使用CRISPR系统编辑zfr基因
用于指导RNA(gRNA)选择的生物信息学分析:
聚焦在来自原鸡的Z染色体的zfr基因的第三外显子上,选择了3种gRNA。在体外测试它们的效率之前,使用CHOPCHOP算法(Labun,K.等,Nucleic Acids Res.47,W171–W174(2019))进一步分析所选的靶向序列。将外显子上游~1000bp的DNA序列、外显子本身的283bp和外显子下游~1000bp插入作为具有以下参数的CHOPCHOP分析的单一靶序列:原鸡6(galGal6)的比较基因组,使用CRISPR/Cas9,用于敲除。下述的2个gRNA靶向序列以及它们的信息位于分析报告内。
Cas9体外切割测定(Anders,C.&Jinek,M.Methods in Enzymology 546,1–20(Elsevier Inc.,2014)):
选择gRNA用于来自原鸡的Z染色体的zfr基因的靶向。在体外合成包含靶向序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的2种gRNA,并且经过使用zfr DNA靶序列的PCR产物和纯化的Cas9核酸内切酶蛋白的切割评定。在琼脂糖凝胶上分析DNA产物的切割。
体内切割测定:
利用Mashiko等的pEGxxFP构建体(RNA.Sci.Rep.3,3355(2013))进行体内测定。靶序列包含来自原鸡的Z染色体的部分zfr基因,其克隆在EGFP基因的重叠片段之间。将构建体转染至鸡成纤维细胞(DF-1)内或人胚胎肾293细胞(HEK)内并且在~72小时后观察绿色荧光。
结果:
对在Z染色体上的zfr基因内的靶区域的CHOPCHOP分析报告,得到从最好到最坏排序的192种可能的gRNA。所选的3种gRNA在报告中定位如下:排名第17的gRNA 1(具有靶向序列SEQ ID NO:1)、排名第113的gRNA 2和排名第7的gRNA 3(具有靶向序列SEQ ID NO:2)(表1)。除了gRNA排名,存在于原鸡基因组中的脱靶位点的数量也是重要的考虑。脱靶的数量越高,gRNA越不最佳。gRNA 2比gRNA 1和gRNA 3有多得多的脱靶(表1)。此外,其中一个脱靶有0个错配并与靶序列100%匹配(确认为位于W染色体的zfr基因上的脱靶)。因此,对于实际使用,gRNA2被视为差的选择。关于gRNA 1(具有靶向序列SEQ ID NO:1)和gRNA 3(具有靶向序列SEQ ID NO:2)脱靶(表2),各gRNA都具有在W染色体ZFR基因上具有1个错配的脱靶序列。另外,gRNA 1具有在1号染色体上具有3个序列错配的第二脱靶位点。总体的gRNA 1和gRNA 3错配被视为合理的结果,特别是当考虑到来自W染色体或Z染色体的zfr基因之间的同源性时。因此,将gRNA 1和gRNA 3(分别具有如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示的靶向序列)用于进一步分析。
表1.对3种所选的gRNA的CHOPCHOP排名结果。MMX意为与靶序列有X个错配的原鸡基因组脱靶的数量。
表2.根据CHOPCHOP,gRNA 1和gRNA 3的详细的脱靶
使用Cas9体外切割测定(Anders,同上)进行初步的gRNA靶向和切割测试。图2显示与768bp的未消化的靶DNA相比,使用gRNA 1或gRNA 3的靶DNA序列的消化模式。gRNA 1的切割模式显示尽管一些靶DNA仍未切割,在~300bp和~450bp的两条较小的带很明显并且与gRNA 1在靶序列上的切割预测相匹配。gRNA 3的切割模式表明它也含有一些未切割的靶DNA以及对应于~280bp和~480bp的两条较小的带,这与gRNA 3的切割预测相匹配。因此对gRNA 1和gRNA 3体外测定证明了阳性切割。
还进行了体内测定以检查所选gRNA分子的活性。体内测定尽管不对染色体本身测试切割活性,但是提供了在复杂的细胞环境中对gRNA切割潜能的更可靠的表征。使用在来自EGFP报告子的重叠区域之间含有zfr的靶序列的pEGxxFP构建体(Mashiko,同上),将pEGxxFP zfr质粒与含有gRNA(除了对照实验外)和Cas9核酸内切酶的第二质粒共转染(图3a)。在HEK293细胞(图3b)和鸡成纤维细胞(DF-1)(图3c)中进行测定,其中阳性切割的目的是在细胞内得到绿色荧光信号。
体内测定结果清楚地证明了所设计的gRNA分子的正确的活性(图3b、图3c)。在不存在gRNA的情况下,对照实验没有形成绿色荧光。因此,pEGxxFP zfr构建体是稳定的并且不会自发地进行切割和自我修复。对用pEGxxFP zfr构建体与gRNA 1或gRNA 3一起共转染的细胞观察到了清楚的绿色信号。由于对照没有得到任何背景荧光,结论是所有荧光信号都来源于gRNA在pEGxxFP zfr构建体上的切割活性和EGFP修复。从效率来看,gRNA 1似乎得到了更好的荧光,因为绿色细胞比gRNA 3的更丰富,这很好对应于通过CHOPCHOP算法预测的效率(表1)。这些结果用作进一步表明两种所选gRNA切割来自原鸡的Z染色体的ZFR基因内的靶序列的能力,并且证明gRNA 1优于gRNA 3。
实施例2:产生能够产生仅雌性的后代的基因编辑的雌鸟
将实施例1中所述的DNA编辑系统用于在原始生殖细胞(PGC)中敲除zfr的表达。然后将具有ZZ*的修饰的细胞施用于雄性鸡胚胎。在足以允许PGC细胞定植于受体鸟胚胎的性腺的条件下进行施用。将胚胎饲养至成熟。然后将嵌合鸟与常规(天然)雌性交配并且筛选子代中的杂合子ZZ*鸟类。将经鉴定的杂合ZZ*与天然雌性(‘祖母’WZ)交配,并且筛选它们的后代中的雌性WZ*(‘母亲’)。基因修饰的WZ*是能够产生仅雌性的后代的雌性产卵鸟。所得后代是未基因修饰的鸟类。
实施例3:将位点定向诱变系统注射至性成熟雄性睾丸内用于产生嵌合杂合子ZZ*鸟类
设计了包含如实施例1中所述的DNA编辑系统的慢病毒载体,其适用于在鹌鹑或公鸡中敲除zfr的表达。所设计的慢病毒载体包含具有鹌鹑的7SK启动子的gRNA支架,以及具有CAG启动子的Cas9核酸内切酶。
如下在孵化的雄性鹌鹑上进行手术程序。使用年龄在1-6周之间的雄性鹌鹑。在麻醉的情况下,将鸟体内的第一个睾丸暴露。使用注射器,将包含慢病毒载体的悬浮液在几个位置注射至睾丸内。缝合和关闭手术开口。在来自鸟的另一侧的第二个睾丸上执行相同程序。在向两个睾丸都进行慢病毒注射之后,给予雄性1-2周的恢复时间。在其他实验中,在1-26周大的公鸡上重复程序。
在恢复后,将雄性(视为G0)与雌性放在一起进行交配。将卵孵化用于扫描具有*ZZ的转基因后代(G1)。
在另外的实验中,转座酶系统用于递送定点诱变系统至鸟的睾丸中。在此情况下,注射液含有转染试剂(如lipofectamine)、用于转座酶的表达的质粒和用于所需基因组的整合(即Z-配子同源基因的扰乱)的质粒。
在另外的实验中,向雄性睾丸进行原始生殖细胞的注射。在此情况下注射液含有修饰的PGC(ZZ*)。将PGC注射至天然雄性或在该程序之前经绝育的雄性(通过例如利用辐射(UV/γ)或特定化学物质(例如白消安))。一旦经绝育,如上文所述进行手术程序以移植新的PGC。
具体实施方案的前面的描述将如此全面地揭示本发明的一般性质,使得其他人可以通过应用当前知识,在没有过度实验和不背离一般概念的情况下容易地修饰和/或改变所述具体实施方案用于各种应用,并且,因此,所述改变和修饰应当并且旨在在所公开的实施方案的等价物的含义和范围内被理解。要理解本文采用的措辞或术语是用于描述目的而不是限制目的。在不背离本发明的情况下,用于实施各种公开的功能的手段、材料和步骤可以采取多种替代形式。
<110> 本-古里安大学之内盖夫科技应用有限公司
<120> 用于产生雌性刚孵化的雏鸟的鸟类及其产生方法
<130> BGU/039 PCT
<150> 282597
<151> 2021-04-22
<160> 2
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 指导RNA
<400> 1
ggctagctac actgtccacc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 指导RNA
<400> 2
gcgcacacag ctacagatta 20
Claims (51)
1.一种具有至少一条基因修饰的染色体Z的雄鸟细胞,其中所述基因修饰的染色体包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因,所述鸟细胞能够发育成功能性配子。
2.根据权利要求1所述的细胞,其中使用至少一种人工工程化的核酸酶对所述细胞进行基因编辑。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的细胞,其中所述配子同源基因是选自zfr、smad2、st8sia3、kcmf1、spin1、sub1、chd1、nipbl、hnrnpk、gfbp1、mier3、btf3、golph3、vcp、txnl1、nedd4、ctif、smad7、rpl17、znf532、hintz、c18orf25、atp5a、zswim6、rasa1、ube2r2、ubap2和tcf4的基因。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞,其中所述配子同源基因是减数分裂相关基因。
5.根据权利要求4所述的细胞,其中所述基因选自zfr、smad2、spin1和nipbl。
6.根据权利要求5所述的细胞,其中所述基因编码锌指RNA结合蛋白(ZFR)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的细胞,其中所述细胞是原始生殖细胞(PGC)。
8.根据权利要求7所述的PGC,其中所述细胞与基因编辑的染色体Z杂合。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的细胞,其中所述鸟是家禽。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的细胞,其中所述鸟选自鸡、鹌鹑、火鸡、鹅和鸭。
11.一种包含至少一个根据权利要求1-10中任一项所述的细胞的细胞群。
12.一种具有至少一个根据权利要求1-10中任一项所述的细胞的鸟。
13.一种具有至少一个根据权利要求7所述的PGC的嵌合雄鸟。
14.一种用于降低至少一种染色体Z-配子同源基因的表达和/或活性的位点定向诱变系统。
15.一种包含靶向核苷酸序列的合成指导RNA,所述靶向核苷酸序列与鸟的染色体Z-配子同源基因内的靶核酸序列互补。
16.根据权利要求15所述的合成指导RNA,其中所述靶核酸序列在配子同源基因的编码区内的位置或非编码区内的位置。
17.根据权利要求15-16中任一项所述的合成指导RNA,其中所述Z-配子同源基因是选自zfr、smad2、st8sia3、kcmf1、spin1、sub1、chd1、nipbl、hnrnpk、gfbp1、mier3、btf3、golph3、vcp、txnl1、nedd4、ctif、smad7、rpl17、znf532、hintz、c18orf25、atp5a、zswim6、rasa1、ube2r2、ubap2和tcf4的基因。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的合成指导RNA,其中所述配子同源基因是减数分裂相关基因。
19.根据权利要求18所述的合成RNA,其中所述基因选自zfr、smad2、spin1和nipbl。
20.根据权利要求19所述的合成指导RNA,其中所述基因编码锌指RNA结合蛋白(ZFR)。
21.根据权利要求20所述的合成指导RNA,其中所述靶核酸序列在zfr的外显子3内。
22.根据权利要求21所述的合成指导RNA,其包含选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的靶向序列。
23.一种编码根据权利要求15-22中任一项所述的合成指导RNA的核酸构建体。
24.一种包含至少一种根据权利要求23所述的核酸构建体的载体。
25.根据权利要求24所述的载体,其中所述载体是病毒载体。
26.根据权利要求15-22中任一项所述的合成指导RNA,根据权利要求23所述的核酸构建体,或根据权利要求24-25中任一项所述的载体,其中所述鸟是家禽。
27.根据权利要求15-22中任一项所述的合成指导RNA,根据权利要求23所述的核酸构建体,或根据权利要求24-25中任一项所述的载体,其中所述鸟是鸡、鹌鹑、火鸡、鹅或鸭。
28.一种工程化的、非天然存在的成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)基因编辑系统,其包含:(i)根据权利要求15-22中任一项所述的合成指导RNA和(ii)RNA指导的DNA核酸内切酶。
29.根据权利要求28所述的工程化的、非天然存在的基因编辑系统,其中所述核酸内切酶是Cas9或Cpf1。
30.根据权利要求28-29中任一项所述的工程化的、非天然存在的基因编辑系统,其中所述系统包含编码合成指导RNA的第一核酸序列和编码RNA指导的DNA核酸内切酶的第二核酸序列。
31.根据权利要求30所述的工程化的、非天然存在的基因编辑系统,其中所述第一核酸序列和第二核酸序列各自形成单独的分子。
32.根据权利要求30所述的工程化的、非天然存在的基因编辑系统,其中所述第一核酸序列和第二核酸序列包含于单一分子中。
33.一种包含至少一种根据权利要求28-32中任一项所述的工程化的、非天然存在的基因编辑系统的载体。
34.根据权利要求33所述的载体,其中所述载体是病毒载体。
35.一种包含根据权利要求28-32中任一项所述的基因编辑系统的细胞群。
36.一种包含至少一个包含根据权利要求28-32中任一项所述的基因编辑系统的细胞的鸟。
37.根据权利要求36所述的鸟,其中所述至少一个细胞是PGC。
38.一种有具有基因修饰的染色体Z和未修饰的染色体Z的细胞的嵌合雄鸟,该基因修饰的染色体Z包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因。
39.根据权利要求38所述的嵌合鸟,其中使用至少一种人工工程化的核酸酶对所述细胞进行基因编辑。
40.根据权利要求38-39中任一项所述的嵌合雄鸟,其中所述鸟不包含任何稳定整合到其基因组中的外源性多核苷酸序列。
41.一种生成根据权利要求38-40中任一项所述的嵌合雄鸟的方法,该方法包括以下步骤:将根据权利要求14所述的位点定向诱变系统,或根据权利要求28-32中任一项所述的基因编辑系统施用于雄鸟细胞群,从而生成经基因组编辑的鸟细胞;并且将经基因组编辑的鸟细胞转移至受体雄鸟胚胎,从而生成嵌合雄鸟。
42.一种生成根据权利要求38-40中任一项所述的嵌合雄鸟的方法,该方法包括将根据权利要求14所述的位点定向诱变系统,或根据权利要求28-32中任一项所述的基因编辑系统施用于受体雄鸟胚胎的步骤。
43.一种生成根据权利要求38-40中任一项所述的嵌合雄鸟的方法,该方法包括将根据权利要求7所述的PGC,根据权利要求14所述的位点定向诱变系统或根据权利要求28-32中任一项所述的基因编辑系统施用于受体雄鸟睾丸的步骤。
44.根据权利要求43所述的方法,其中所述方法包括施用包含位点定向诱变系统或基因编辑系统的病毒载体。
45.根据权利要求44所述的方法,其中所述病毒载体是慢病毒载体。
46.一种包含基因修饰的染色体Z和未修饰的染色体Z的基因修饰的雄鸟,该基因修饰的染色体Z包含至少一种具有降低的表达和/或活性的染色体Z-配子同源基因。
47.根据权利要求46所述的基因修饰的雄鸟,其中所述鸟是非转基因鸟。
48.一种生成根据权利要求46所述的基因修饰的雄鸟的方法,该方法包括将根据权利要求38-40中任一项所述的嵌合雄鸟与具有未修饰的染色体Z的雌鸟繁殖,并且筛选所得后代中基因修饰的雄性。
49.一种能够产具有偏向的性别比的活卵群的基因修饰的雌鸟,所述鸟具有至少一种染色体Z-配子同源基因的降低的表达和/或活性。
50.一种生成能够产具有偏向的性别比的活卵群的基因修饰的雌鸟的方法,其包含将根据权利要求46所述的基因修饰的雄鸟与雌鸟杂交,并且筛选后代中基因修饰的雌性。
51.一种用于产生特征为性别比偏向雌性的鸟刚孵化的雏鸟群的方法,其包含将根据权利要求49所述的基因修饰的雌鸟与具有未修饰的Z染色体的雄鸟繁殖,从而产生基本上仅为雌性的刚孵化的雏鸟群。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IL282597 | 2021-04-21 | ||
IL282597A IL282597B (en) | 2021-04-22 | 2021-04-22 | Birds for creating female offspring and methods for creating them |
PCT/IL2022/050389 WO2022224244A1 (en) | 2021-04-22 | 2022-04-13 | Birds for producing female hatchling and methods of producing same |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117580955A true CN117580955A (zh) | 2024-02-20 |
Family
ID=82941172
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202280044524.3A Pending CN117580955A (zh) | 2021-04-22 | 2022-04-13 | 用于产生雌性刚孵化的雏鸟的鸟类及其产生方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4326887A1 (zh) |
KR (1) | KR20230173124A (zh) |
CN (1) | CN117580955A (zh) |
AU (1) | AU2022260837A1 (zh) |
BR (1) | BR112023021725A2 (zh) |
CA (1) | CA3217797A1 (zh) |
IL (2) | IL282597B (zh) |
MX (1) | MX2023012371A (zh) |
WO (1) | WO2022224244A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7493194B1 (ja) | 2023-05-11 | 2024-05-31 | 株式会社セツロテック | 鳥類の雌雄判別方法、鳥類、生産方法、および卵の集団 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2003251286B2 (en) * | 2002-01-23 | 2007-08-16 | The University Of Utah Research Foundation | Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases |
AU2010275432A1 (en) * | 2009-07-24 | 2012-02-02 | Sigma-Aldrich Co. Llc. | Method for genome editing |
EP2481812A1 (en) * | 2011-01-31 | 2012-08-01 | Westfälische Wilhelms-Universität Münster | Molecular sexing of avian subjects |
US20140359796A1 (en) * | 2013-05-31 | 2014-12-04 | Recombinetics, Inc. | Genetically sterile animals |
-
2021
- 2021-04-22 IL IL282597A patent/IL282597B/en unknown
-
2022
- 2022-04-13 AU AU2022260837A patent/AU2022260837A1/en active Pending
- 2022-04-13 BR BR112023021725A patent/BR112023021725A2/pt unknown
- 2022-04-13 CA CA3217797A patent/CA3217797A1/en active Pending
- 2022-04-13 WO PCT/IL2022/050389 patent/WO2022224244A1/en active Application Filing
- 2022-04-13 KR KR1020237037833A patent/KR20230173124A/ko unknown
- 2022-04-13 EP EP22791258.1A patent/EP4326887A1/en active Pending
- 2022-04-13 IL IL307841A patent/IL307841A/en unknown
- 2022-04-13 MX MX2023012371A patent/MX2023012371A/es unknown
- 2022-04-13 CN CN202280044524.3A patent/CN117580955A/zh active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL282597B (en) | 2022-08-01 |
CA3217797A1 (en) | 2022-10-27 |
AU2022260837A9 (en) | 2023-11-09 |
BR112023021725A2 (pt) | 2023-12-26 |
KR20230173124A (ko) | 2023-12-26 |
EP4326887A1 (en) | 2024-02-28 |
IL282597A (zh) | 2021-05-31 |
AU2022260837A1 (en) | 2023-10-26 |
MX2023012371A (es) | 2023-11-01 |
IL307841A (en) | 2023-12-01 |
WO2022224244A1 (en) | 2022-10-27 |
US20240130338A1 (en) | 2024-04-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220056482A1 (en) | Methods for making genetic edits | |
US20200017882A1 (en) | Engineering of humanized car t-cell and platelets by genetic complementation | |
US11542319B2 (en) | Transgenic chicken comprising an inactivated immunoglobulin gene | |
US20220136003A1 (en) | Genome-edited birds | |
US20240052304A1 (en) | Sterile avian embryos, production and uses thereof | |
CN117580955A (zh) | 用于产生雌性刚孵化的雏鸟的鸟类及其产生方法 | |
BR112020005272A2 (pt) | aves editadas por genoma | |
US20190254266A1 (en) | Engineering of Humanized Kidney by Genetic Complementation | |
US20240224962A9 (en) | Birds for producing female hatchling and methods of producing same | |
WO2024092216A2 (en) | Methods and compositions regarding modulation of poultry genes | |
EA043573B1 (ru) | Птицы с отредактированным геномом |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |