CN106893740A - 一种条件性过表达aqp4转基因小鼠的模型制作方法 - Google Patents
一种条件性过表达aqp4转基因小鼠的模型制作方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106893740A CN106893740A CN201710086794.1A CN201710086794A CN106893740A CN 106893740 A CN106893740 A CN 106893740A CN 201710086794 A CN201710086794 A CN 201710086794A CN 106893740 A CN106893740 A CN 106893740A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aqp4
- mouse
- overexpression
- conditionity
- carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010036280 Aquaporin 4 Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 102000012002 Aquaporin 4 Human genes 0.000 title claims abstract description 31
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 title claims abstract description 14
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims abstract description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 229930195503 Fortimicin Natural products 0.000 claims abstract description 4
- BIDUPMYXGFNAEJ-APGVDKLISA-N astromicin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](N(C)C(=O)CN)[C@@H](OC)[C@@H](O)[C@H](N)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](N)CC[C@@H]([C@H](C)N)O1 BIDUPMYXGFNAEJ-APGVDKLISA-N 0.000 claims abstract description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 16
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 6
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 5
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N Adenosine Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- 239000012212 insulator Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 abstract description 3
- 101150073415 Aqp4 gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 abstract 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 abstract 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 abstract 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 101150057182 GFAP gene Proteins 0.000 description 8
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 102000010637 Aquaporins Human genes 0.000 description 5
- 108010063290 Aquaporins Proteins 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 4
- 101150071538 AQP gene Proteins 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 2
- 102000034573 Channels Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100163074 Mus musculus Aqp4 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 102000016560 Aquaglyceroporins Human genes 0.000 description 1
- 108010092667 Aquaglyceroporins Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000033040 Somatoform disorder pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 206010063036 Spinal cord oedema Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000005909 ethyl alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000009740 moulding (composite fabrication) Methods 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 208000008795 neuromyelitis optica Diseases 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035778 pathophysiological process Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032895 transmembrane transport Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000007279 water homeostasis Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种条件性过表达AQP4转基因小鼠的模型制作方法。(1)插入基因片段的启动序列为胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动序列，可保证该基因片段的表达局限在神经系统中的星形胶质细胞内；(2)所转基因片段含有强力霉素诱导表达系统，在上述特定的组织内，rtTA3G在特异启动子驱动下表达，此时rtTA3G的构象不能结合到pTRE3G启动子上；当加入强力霉素后，改变rtTA3G的构象，使其结合到pTRE3G启动子上，启动Aqp4的表达，以实现时间和空间上的诱导表达。由本发明所制备的条件性过表达小鼠在实际应用中有助于研究AQP4蛋白在脑内水平衡、星形胶质细胞功能、代谢废物清除、物质转运以及神经精神类疾病发病等方面的作用机制以及靶向AQP4药物的临床前药效评价，提供有效的模式动物。
Description
技术领域
本发明涉及转基因技术领域，具体涉及建立一种脑内条件性过表达水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)蛋白生物模型的方法。
背景技术
模型小鼠是研究疾病发病机制、治疗策略必不可少的工具，目前建立模型小鼠的主要方法是转基因技术。
水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一组参与跨膜水转运的四聚体结构膜通道蛋白家族，目前已经从哺乳动物组织中分离得到了13种AQPs(AQP0--AQPl2)。根据其一级结构及转运功能的不同，将其分成3类：水特异性通道蛋白、水甘油通道蛋白以及超水通道蛋白。
AQP4属于水特异性通道蛋白。aqp4基因定位于18q11.2和q12.I之间，由4个外显子和3个内含子组成，外显子分别编码127，55，27，92位氨基酸序列。AQP4蛋白由4个相对分子质量约30 000的单体组成，每个单体具有各自独立的水通透性，其单体结构包括6个跨膜区域和5个环(A、B、C、D、E环)。其中B、D环及羧基、氨基末端均在胞内，A、C、E环位于胞外。整个分子呈对称镜像结构，且B、E环显著疏水，参与调解水通道活性。在B、E环上各自拥有一个由天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸组成的序列，该序列为AQPs家族成员共有的特征性结构。
AQP4是分布于中枢神经系统的主要水通道蛋白，特异性分布于星形胶质细胞足突和室管膜，参与中枢神经系统内水分子的跨膜转运，是脑脊液的生成吸收、渗透压的调节、脑水肿的形成及清除等病理生理过程的分子基础。近来研究表明，AQP4调控星形胶质细胞的系列生理功能，如介导水快速转运、维持细胞外液离子平衡、影响神元活动和突触重塑、参与成年的神经发生等。此外AQP4还可能参与了脑中风、视神经脊髓炎、阿尔茨海默病等多种神经系统疾病的病理进程。
发明内容
技术问题：本发明的目的在于提供一种条件性过表达AQP4转基因小鼠的模型制作方法，通过转基因技术建立AQP4条件性过表达小鼠模型，以获得一种可稳定遗传、对其中枢神经系统内AQP4蛋白表达时间可控的小鼠模型。该模型将可用于研究该蛋白在体功能分析、疾病发病机制探讨、药物新靶点发现及临床前药效评价等研究，具有十分重要的科学意义和临床价值。
技术方案：本发明的一种条件性过表达AQP4转基因小鼠的模型制作方法，包括以下步骤：
第1步：hGFAP-mAQP4(hGFAP代表人源性的胶质纤维酸性蛋白基因启动子，mAQP4代表鼠源性的水通道蛋白4基因)转基因载体构建；
第2步：转基因载体原核显微注射；
第3步：品系基因鉴定，最终建立小鼠基因组中带有外源AQP4基因的遗传性小鼠突变模型。
第1步中所述的转基因载体的构建方法是:合成5'UTR-Aqp4CDS-3'untranslatedand polyA sequence(5’非编码区-Aqp4基因编码区-3’非编码区以及多聚腺嘌呤核糖核苷酸结尾序列)，连接到pTRE3G(四环素依赖诱导表达载体)，然后将以上序列片段酶切下来连接到pInsulator(绝缘子载体)，合成人源GFAP(胶质纤维酸性蛋白)启动子序列，与CMV(增强子)融合后连接到rtTA3G-polyA(四环素依赖诱导表达载体-多聚腺嘌呤核糖核苷酸结尾序列表达载体)上，再将片段酶切下来，连接到上一步构建好的载体中，完成整个载体的构建。
第2步所述的转基因载体原核显微注射是：将外源线性转基因载体注射到C57BL/6(品系名称)小鼠受精卵细胞核内；外源性基因会随机插入到小鼠基因组中，最终构建的hGFAP-mAQP4转基因小鼠能够在摄入强力霉素后过表达AQP4(水通道蛋白4)蛋白，便于进行后续的蛋白印迹实验。
第3步所述的基因鉴定是：出生的首代hGFAP-mAQP4转基因阳性的小鼠即为首建鼠；每只首建鼠都将被视为一个独立的品系进行繁育，对每只首建鼠品系都进行剪尾基因鉴定。
有益效果：本发明提供可条件性诱导过表达AQP4蛋白的模型小鼠，实现了通过人为时间点调控，对不同月龄小鼠进行条件诱导增加其脑内AQP4蛋白表达水平，观察其小鼠在基础状态以及神经精神疾病模型状态下星形胶质细胞生物学特性和功能产生何种影响。该模型的建立，有助于研究中枢神经系统疾病发病机制、药物新靶点发现及临床前药效评价等。
附图说明
图1.转基因小鼠制作流程。
图2.hGFAP-mAqp4转基因小鼠载体构建策略。其中pTRE3G是启动子，Aqp4是待表达的序列，后跟3'UTR和polyA序列，CMV为增强子，gfap promoter为人胶质纤维酸性蛋白启动子，rtTA3G是表达四环素作用位点序列，polyA为终止信号。前后两个蛋白是独立表达，但是方向相反。
图3.载体构建终载体图谱。
图4.hGFAP-mAqp4转基因小鼠鉴定结果：PCR电泳图。
具体实施方式
本发明所述转基因小鼠模型的具体构建过程如下：
1.获得目的基因：将pTRE3G(启动子),mouse Aqp4CDS,3’-untranslated andpoly-A Sequences,polyA,rtTA3G(启动子),Kozak,Human Gfap promoter,CMV Enhancer片段通过SLIC反应连接到pMD18-T上，再通过限制性内切酶的作用将目的片段连接到pInsulator vector上，纯化线性DNA片段。
2.制备显微注射用的DNA溶液。
3.应用显微注射的方法将线性化的目的基因片段注入到小鼠受精卵的原核中，使其与小鼠基因组整合，随着细胞不断分裂，每个细胞将携带该片段。
4.将经显微注射后成活的受精卵植入假孕鼠的输卵管的壶腹部，产生F0代转基因小鼠，该小鼠基因组中整合有外源性表达序列。
5.品系基因鉴定，最终建立小鼠基因组中带有外源基因的小鼠模型，出生的首代hGFAP-mAQP4转基因阳性的小鼠即为Founder小鼠；每个Founder都将被视为一个独立的品系进行繁育，对每个founder品系都进行剪尾的PCR鉴定。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
第1步：hGFAP-mAQP4转基因载体构建
一、高效克隆in-Fusion HD Cloning Kits简介
和传统的几种克隆方式相比较，比如：TA克隆；限制性酶切克隆；平滑末端克隆。传统克隆，有如下缺点：连接效率低；耗时较长；需要特定限制性酶切位点。
in-Fusion HD Cloning Kits是一款简便高效的克隆试剂盒，能够将单个或者多个DNA片段快速定向克隆到任意载体中。In-Fusion克隆技术的基础是Clontech的In-Fusion专利酶，此酶通过识别DNA片段和线性化载体末端15bp同源序列将DNA片段和线性化载体高效精确地融合在一起。15bp同源序列是通过扩增目的片段所设计的引物来获得的。升级后的In-Fusion HD Kits的克隆效率高于之前的In-Fusion Kits，尤其表现在长片段、短核苷酸片段和多重片段克隆上。克隆任意片段到您选择的任意载体中的任意位置；可有效克隆的片段大小范围非常宽泛；通过单次反应将多重DNA片段克隆到任意载体中；无需进行限制性酶切处理、磷酸化处理或者连接反应；最终的重组载体不附加任何冗余或者不需要的碱基序列。
二、hGFAP-mAQP4转基因载体构建
1.引物设计
使用infusion网站
(http://bioinfo.clontech.com/infusion/convertPcrPrimersInit.do)设计对应的引物。所有的PCR扩增反应都是用Q5(M0492S,NEB,USA)高保真酶扩增，确保没有碱基突变。每一个PCR片段都测序，以保证没有碱基突变。
2.克隆小鼠AQP4基因
在http://www.informatics.jax.org/查询小鼠AQP4基因MGI(107387)，NCBI(NM_009700.3)。AQP4只有一个转录本MGI(ENSMUST00000079081.6)；NIBI(NP_033830.2)，该转录本有5个exon,4个intron,有323aa，片段大小是5082bp。以小鼠(C57/Bl6)基因组cDNA为模板，设计引物扩增，PCR法扩增AQP4片段。同时以小鼠基因组文库为模板，PCR法扩增AQP4片段的5’UTR和3’UTR。PCR法扩增AQP4片段的3’UTR，并在长链引物后面添加polyA序列。
使用infusion试剂盒将上述三段5’UTR区域，小鼠(C57/Bl6)基因组cDNA，3’UTR-polyA区域先连接在pTRE载体上。并测序验证，确保序列不存在碱基突变。此处使用到的infusion引物：
5’UTR-AQP4-F:acttcctaccctcgtaaagtcgacggaaggcatgagtga
AQP4-R:agtgctgtcctctagtcatacggaagacaatacctctcccg
AQP4-3’UTR-F:ctagaggacagcactgaaggcagaagagactccctagac
AQP4-3’UTR-R:gactagagcttgcggaacccttattaggttctgacagt
3.克隆pTRE3G的DNA序列
以pTRE3G常规质粒为模板，PCR法扩增pTRE3G片段。
此处使用到的infusion引物：
pTRE3G-F:tctagcgagatcgatgcggccgcgagttt
pTRE3G-R:tcactcatgccttccgtcgactttacgagggtaggaa
4.克隆rtTA3G的DNA序列；human Gfap promoter的DNA序列；CMV Enhancer分别以rtTA3G，human Gfap promoter，CMV Enhancer常规质粒骨架为模板，PCR法克隆每个片段，将三个片段连接在一起。
此处使用到的infusion引物：
CMV-Kozak-human Gfap promoter-F:ggtggcggccctgctctggctctgctcgctcctgggatg
human Gfap promoter-R:ctcccacctccctctctgtgctgggactcacagag
rtTA3G-F:tcagcgagctctagttacccggggagcat
rtTA3G-R:agcagggccgccaccatgtctagactggacaagagcaaagtc
5.连接pIns-mAqp4-rtTA3G-hGFAP-CMVe TG final
将(第3步骤)pTRE3G，(第2步骤)AQP4基因，(第4步骤)rtTA3G的DNA序列；humanGfap promoter的DNA序列；CMV Enhancer序列组合连接在一起，构建在pTRE载体上。
第2步：转基因载体原核显微注射
将外源线性hGFAP-mAQP4转基因载体注射到C57BL6/j小鼠受精卵细胞核内；外源的hGFAP-mAQP4基因会随机插入到小鼠基因组中，最终构建的转基因小鼠能够在神经系统内星型胶质细胞上过表达AQP4蛋白，便于进行后续的蛋白印迹分析实验。
第3步：品系基因鉴定
1.剪尾并抽取121只小鼠基因组DNA：幼仔出生16天左右进行编号剪脚趾；将所剪小鼠尾尖样本加EB(裂解液)55μl(裂解液100:1加入蛋白酶K)，55℃裂解过夜；第二日将样本取出，12000r/min，离心1min；将样本取出，加入700μl酚/氯仿(1:1配制)，混匀；12000r/min，离心5min.取上清至1.5mlEP管，加2倍体积无水乙醇。轻轻混匀，会有絮状沉淀出现；12000r/min，离心5min.弃上清；加700μl 70％冰乙醇，混匀，12000r/min，离心5min；弃上清，12000r/min，离心1min；超净台晾干，加入80μl EB缓冲液/ddH2O，60℃溶解0.5h。
2.PCR鉴定：以小鼠基因组DNA为模板，进行PCR扩增鉴定。采用特定引物及体系扩增(如下表所示)，电泳跑胶，鉴定结果显示#111、#122、#165为阳性鼠(说明书附图4)。至此，hGFAP-mAQP4转基因小鼠模型构建成功。
3.该小鼠鉴定的PCR反应体系以及所用引物信息如下：
PCR反应体系
PCR引物信息
PCR反应条件
构建载体序列表
Claims (4)
1.一种条件性过表达AQP4转基因小鼠的模型制作方法，其特征在于该制作方法包括以下步骤：
第1步：hGFAP-mAQP4转基因载体构建；
第2步：转基因载体原核显微注射；
第3步；品系基因鉴定，最终建立小鼠基因组中带有外源AQP4基因的遗传性小鼠突变模型。
2.根据权利要求1所述的一种条件性过表达AQP4转基因小鼠的模型制作方法，其特征在于第1步所述的转基因载体的构建方法是:合成5'UTR-Aqp4CDS-3'untranslated andpolyA sequence，连接到四环素依赖诱导表达载体pTRE3G，然后将以上序列片段酶切下来连接到绝缘子载体pInsulator，合成人源胶质纤维酸性蛋白GFAP启动子序列，与增强子CMV融合后连接到四环素依赖诱导表达载体-多聚腺嘌呤核糖核苷酸结尾序列表达载体rtTA3G-polyA上，再将片段酶切下来，连接到上一步构建好的载体中，完成整个载体的构建。
3.根据权利要求1所述的一种条件性过表达AQP4转基因小鼠的模型制作方法，其特征在于第2步所述的转基因载体原核显微注射是：将外源线性转基因载体注射到C57BL/6小鼠受精卵细胞核内；外源性基因会随机插入到小鼠基因组中，最终构建的hGFAP-mAQP4转基因小鼠能够在摄入强力霉素后过表达AQP4蛋白，便于进行后续的蛋白印迹实验。
4.根据权利要求1所述的一种条件性过表达AQP4转基因小鼠的模型制作方法，其特征在于第3步所述的基因鉴定是：出生的首代hGFAP-mAQP4转基因阳性的小鼠即为首建鼠；每只首建鼠都将被视为一个独立的品系进行繁育，对每只首建鼠品系都进行剪尾基因鉴定。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710086794.1A CN106893740A (zh) | 2017-02-17 | 2017-02-17 | 一种条件性过表达aqp4转基因小鼠的模型制作方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710086794.1A CN106893740A (zh) | 2017-02-17 | 2017-02-17 | 一种条件性过表达aqp4转基因小鼠的模型制作方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106893740A true CN106893740A (zh) | 2017-06-27 |
Family
ID=59184086
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710086794.1A Pending CN106893740A (zh) | 2017-02-17 | 2017-02-17 | 一种条件性过表达aqp4转基因小鼠的模型制作方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106893740A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107937439A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-04-20 | 东北师范大学 | 基因的应用及动物模型的构建方法 |
| CN110495425A (zh) * | 2019-09-24 | 2019-11-26 | 夏蒲 | 一种条件性过表达cd98转基因小鼠的模型制作方法 |
| CN116819072A (zh) * | 2023-08-28 | 2023-09-29 | 迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司 | 一种用于抗aqp4自身抗体检测的抗原蛋白组合物及化学发光检测试剂盒 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104278056A (zh) * | 2013-07-09 | 2015-01-14 | 天津医科大学 | 一种高表达snd1-flag转基因小鼠模型的制备方法 |
-
2017
- 2017-02-17 CN CN201710086794.1A patent/CN106893740A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104278056A (zh) * | 2013-07-09 | 2015-01-14 | 天津医科大学 | 一种高表达snd1-flag转基因小鼠模型的制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 任淑婷等: "四环素诱导性人肝细胞生长因子真核表达载体的构建与鉴定", 《南方医科大学学报》 * |
| 张力等: "四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白转基因斑马鱼模型建立", 《中国实验动物学报》 * |
| 杨宝学: "转基因小鼠模型的建立和应用", 《百度文库》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107937439A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-04-20 | 东北师范大学 | 基因的应用及动物模型的构建方法 |
| CN107937439B (zh) * | 2017-12-29 | 2020-07-03 | 东北师范大学 | 基因的应用及动物模型的构建方法 |
| CN110495425A (zh) * | 2019-09-24 | 2019-11-26 | 夏蒲 | 一种条件性过表达cd98转基因小鼠的模型制作方法 |
| CN116819072A (zh) * | 2023-08-28 | 2023-09-29 | 迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司 | 一种用于抗aqp4自身抗体检测的抗原蛋白组合物及化学发光检测试剂盒 |
| CN116819072B (zh) * | 2023-08-28 | 2023-11-17 | 迪亚莱博（张家港）生物科技有限公司 | 一种用于抗aqp4自身抗体检测的抗原蛋白组合物及化学发光检测试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106047930B (zh) | 一种PS1基因条件性敲除flox大鼠的制备方法 | |
| Katter et al. | Transposon-mediated transgenesis, transgenic rescue, and tissue-specific gene expression in rodents and rabbits | |
| WO2008013067A1 (fr) | Vecteur de chromosome artificiel humain (cah), et substance pharmaceutique à base de cellules humaines contenant un vecteur de chromosome artificiel humain (cah) | |
| CN106893740A (zh) | 一种条件性过表达aqp4转基因小鼠的模型制作方法 | |
| CN109266648A (zh) | 用于在体基因治疗的基因编辑组合物或试剂盒 | |
| CN111304258A (zh) | Ndufs2基因条件性点突变小鼠模型及其构建方法和应用 | |
| Qian et al. | High-efficiency production of human serum albumin in the posterior silk glands of transgenic silkworms, Bombyx mori L | |
| CN112899311A (zh) | 一种rs1-ko小鼠模型的构建方法及其应用 | |
| CN109097393A (zh) | 人tctp基因全身敲减的动物模型、其制备方法及应用 | |
| CN110177878A (zh) | 转基因动物和生物生产方法 | |
| CN101948860A (zh) | 受四环素诱导表达系统调控uPA表达的载体及其应用 | |
| CN110495425A (zh) | 一种条件性过表达cd98转基因小鼠的模型制作方法 | |
| CN112280800B (zh) | 一种构建体及其在制备动物衰老细胞示踪和衰老细胞清除药物中的应用 | |
| CN110218743B (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9技术的牛磺酸转运体基因敲除大鼠模型的构建方法 | |
| CN109280674B (zh) | 一种筛选抗体的非人模式动物的构建方法及其应用 | |
| CN105734062B (zh) | 皮肤特异表达绵羊Wnt10b基因的表达盒、载体及应用 | |
| RU2757121C1 (ru) | Технология получения мышей с гуманизированным участком Gnao1 в области однонуклеотидного полиморфизма rs587777057 для тестирования РНК-терапии для GNAO1 c.607 G>A пациентов | |
| CN114592011B (zh) | 一种ptdss2条件性基因敲除小鼠模型的构建方法 | |
| Liu et al. | Electroporation-based Easi-CRISPR yields biallelic insertions of EGFP-HiBiT cassette in immortalized chicken oviduct epithelial cells | |
| Schmouth et al. | Non-coding-regulatory regions of human brain genes delineated by bacterial artificial chromosome knock-in mice | |
| CN114606270B (zh) | 一种Mia3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法 | |
| US20230234906A1 (en) | Use of 2-pentanone and specific receptor thereof in manufacture of products regulating cell functions | |
| CN115125268B (zh) | 一种条件性诱导神经干细胞增殖的墨西哥钝口螈动物模型的构建方法及其应用 | |
| AU2006235186A1 (en) | Promoter for the expression of foreign genes in neuronal cells | |
| CN114107401B (zh) | 一种转基因非人动物的构建方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170627 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |