CN116819072B - 一种用于抗aqp4自身抗体检测的抗原蛋白组合物及化学发光检测试剂盒 - Google Patents
一种用于抗aqp4自身抗体检测的抗原蛋白组合物及化学发光检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116819072B CN116819072B CN202311083404.7A CN202311083404A CN116819072B CN 116819072 B CN116819072 B CN 116819072B CN 202311083404 A CN202311083404 A CN 202311083404A CN 116819072 B CN116819072 B CN 116819072B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reagent
- protein
- aqp
- aqp4
- autoantibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 108010036280 Aquaporin 4 Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 102000012002 Aquaporin 4 Human genes 0.000 claims abstract description 91
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 74
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 28
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 20
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 20
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 13
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 13
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 12
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 11
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 10
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 7
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 4
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 claims description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 13
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 3
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 102000010637 Aquaporins Human genes 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 4
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 210000002977 intracellular fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- WOLXSUFTTIRQOU-BVCQTOFBSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O WOLXSUFTTIRQOU-BVCQTOFBSA-N 0.000 description 2
- 206010048962 Brain oedema Diseases 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 2
- 208000003435 Optic Neuritis Diseases 0.000 description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 108010063290 Aquaporins Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003926 Myelitis Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 230000005465 channeling Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000005931 immune cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000007372 neural signaling Effects 0.000 description 1
- 230000001272 neurogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000008795 neuromyelitis optica Diseases 0.000 description 1
- 230000007604 neuronal communication Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003977 synaptic function Effects 0.000 description 1
- 208000009174 transverse myelitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明提供一种用于抗AQP4自身抗体检测的抗原蛋白组合物及化学发光检测试剂盒。本发明的抗原蛋白组合物包括特定序列的野生型AQP4蛋白和该野生型AQP4蛋白的两种特定突变方式形成的突变体蛋白。本发明以此抗原组合物作为检测抗AQP4自身抗体的抗原，更容易识别抗AQP4自身抗体，对于抗OAP多聚体中的AQP4抗体有更高的灵敏度和亲和力，进一步开发出了具有更高检测灵敏度的抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒，提高了诊断NMO患者的检出率并将诊出时间提前，对NMO患者具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断生化检测技术领域，具体涉及一种用于抗AQP4自身抗体检测的抗原蛋白组合物及化学发光检测试剂盒。
背景技术
水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP4）是一种在细胞膜上表达的水通道蛋白，它在维持水分平衡和调节细胞内外液体传输方面起着重要的作用。AQP4的特殊结构和功能使其能够形成特定的结构——巨大的水通道集群，被称为OAP（orthogonal arrays ofparticles，颗粒的正交阵列）。AQP4形成OAP的原理可以归结为以下几个方面：1. AQP4包含四个亚基：AQP4由四个相同的亚基组成，每个亚基都具有六个跨膜区域。这些亚基能够相互作用并形成四聚体，构成AQP4的基本功能单元。
亚基间的相互作用：AQP4的亚基之间通过相互作用力（如氢键、离子键等）进行相互结合，形成紧密的四聚体结构。这些亚基之间的相互作用稳定了AQP4的结构，并为OAP的形成提供了基础。
M23亚型和M1亚型：AQP4存在两种亚型，分别是M23亚型和M1亚型。M23亚型是通过两个AQP4亚基的相互作用形成的，而M1亚型则是通过三个AQP4亚基的相互作用形成的。这些亚型之间的相互配对可以促进OAP的形成。
紧密排列的排列方式：AQP4的亚基在OAP中以紧密排列的方式组织在一起，形成了具有规则结构的水通道集群。这种排列方式使得水分子能够通过AQP4通道以高效的方式传输，从而实现快速的水分平衡和细胞内外液体传输。
综上所述，AQP4形成OAP是通过AQP4亚基的相互作用和紧密排列，以及M23亚型和M1亚型的配对，形成了巨大的水通道集群。这种结构有助于提高水分子的传输效率，并在维持细胞内外液体平衡方面发挥重要作用。
此外，AQP4形成OAP在蛋白的功能方面也有重要的意义，首先是提高水传输效率，AQP4的OAP结构使得水分子能够高效地穿过细胞膜。OAP中AQP4亚基的紧密排列提供了大量的表面积，便于水的渗透，从而促进快速和选择性的水传输。其次，AQP4的OAP在调节脑内水平衡方面发挥关键作用。它们主要表达在星形胶质细胞（astrocytes）中，星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞类型。通过形成OAPs，AQP4促进了星形胶质细胞与周围血管之间的水分子传输，确保脑内水平衡的维持。这对于脑功能和预防脑水肿至关重要。再者，AQP4的OAP被认为参与多种生理过程，包括能量代谢和神经元信号传导。它们有助于维持适当的细胞外间隙容积，这对于脑内营养物质和废物产物的高效交换非常重要。此外，据推测AQP4的OAP可能参与神经递质和代谢物的清除，影响神经元通讯和突触功能。最后，AQP4的OAP与多种神经疾病的发病机制有关。在脑水肿、创伤性脑损伤和某些神经系统疾病等疾病中，观察到AQP4表达的变化或AQP4的OAP破坏。这些改变可以影响水传输，促进这些病理情况的发展。
基于以上影响， AQP4涉及多种神经性自身免疫性疾病的发病机制，在患者血液中多发现抗AQP4自身抗体。尤其是OAP的形成与神经脊髓视神经炎（neuromyelitis optica，NMO）之间存在密切联系。NMO是一种免疫介导性疾病，其特征是视神经和脊髓的炎症和损伤。在NMO中，存在针对水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP4）的自身免疫反应，AQP4主要表达在中枢神经系统的星形胶质细胞中。部分NMO患者产生被称为NMO-IgG或抗AQP4抗体的自身抗体。这些自身抗体结合到AQP4上，导致AQP4表达的星形胶质细胞的破坏，并随后损伤视神经和脊髓。抗AQP4抗体与AQP4的相互作用在NMO的发病机制中起着关键作用。研究表明，抗AQP4抗体与AQP4的结合触发了OAP的形成。这些抗体的结合诱导AQP4分子的交联，导致AQP4在星形胶质细胞膜上聚集成OAP。在存在抗AQP4抗体的情况下，OAP的形成有助于免疫反应的放大和补体介导的炎症的激活。OAP作为免疫复合物沉积和免疫细胞招募的平台，导致星形胶质细胞的破坏和血脑屏障的破坏。由于OAP的形成和抗AQP4抗体介导的免疫反应导致AQP4功能的破坏，进而导致NMO的特征性临床表现，如视神经炎（视神经的炎症）和横贯性脊髓炎（脊髓的炎症）。OAP的形成与NMO中的自身免疫反应相关，其中抗AQP4抗体在针对AQP4和触发OAP的形成中起关键作用。
基于OAP对于NMO诊断的重要性，提高试剂盒检测抗AQP4自身抗体的灵敏度将有助于提高阳性样本检出率，对诊断NMO患者有着巨大的帮助。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够提高抗AQP4自身抗体检测灵敏度的抗原蛋白组合物。
本发明的另一目的是提供检测灵敏度更高的抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种用于抗AQP4自身抗体检测的抗原蛋白组合物，所述抗原蛋白组合物包括野生型AQP4蛋白、第一突变型AQP4蛋白和第二突变型AQP4蛋白，所述野生型AQP4蛋白的序列如SEQ ID No.1所示，所述第一突变型AQP4蛋白的序列如SEQ ID No.2所示，所述第二突变型AQP4蛋白的序列如SEQ ID No.3所示。
优选地，所述野生型AQP4蛋白、所述第一突变型AQP4蛋白和所述第二突变型AQP4蛋白的摩尔比为（0.8~1.2）：（0.8~1.2）：1。
根据一些具体且优选的实施方式，所述野生型AQP4蛋白、所述第一突变型AQP4蛋白和所述第二突变型AQP4蛋白的摩尔比为1：1：1。
优选地，所述野生型AQP4蛋白、所述第一突变型AQP4蛋白和所述第二突变型AQP4蛋白分别为重组蛋白。
本发明还提供一种抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒，其包括R1试剂、R2试剂、R3试剂和R4试剂，所述R1试剂为链霉亲和素标记的磁珠溶液，所述R2试剂为生物素标记的抗原蛋白溶液，所述R3试剂为偶联了碱性磷酸酶的抗人IgG多克隆抗体溶液，所述R4试剂为化学发光底物溶液，其中R2试剂中的抗原蛋白为上述抗原蛋白组合物。
优选地，所述R2试剂中，标记抗原蛋白的生物素为N-羟基琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-生物素。
优选地，所述R2试剂由生物素标记的抗原蛋白和pH值为7.2~7.6的磷酸缓冲液混合制备得到，所述生物素标记的抗原蛋白在所述R2试剂中的含量为0.1~10µg/mL。
优选地，所述R1试剂由链霉亲和素标记的磁珠和含有100~250mM 氯化钠的pH值为7.2~7.6的Tris缓冲液混合制备得到。
优选地，所述链霉亲和素标记的磁珠在所述R1试剂中的含量为0.1~10mg/mL。
优选地，所述链霉亲和素标记的磁珠的平均粒径为0.5~5µm。
根据一些具体且优选的实施方式，所述链霉亲和素标记的磁珠的平均粒径为1µm。
优选地，所述R3试剂由偶联了碱性磷酸酶的抗人IgG多克隆抗体和含有100~250mM氯化钠的pH值为7.2~7.6的Tris缓冲液混合制备得到。
优选地，所述R3试剂中的抗人IgG多克隆抗体为羊抗人IgG多克隆抗体、兔抗人IgG多克隆抗体或鸡抗人IgG多克隆抗体。
优选地，所述R4试剂中的发光底物为腺苷5'-磷酸硫酸盐。
优选地，所述R4试剂由发光底物与含有100~200mM 氯化钠和0.5~2mM氯化镁的pH值为7.2~7.6的Tris缓冲液混合制备得到。
优选地，所述化学发光检测试剂盒还包括清洗液，所述清洗液为含有0.01wt%~0.1wt%曲阿通的pH为7.2~7.6的磷酸缓冲液。
优选地，所述抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒还包括质控品。
根据一些具体实施方式，所述质控品包括高浓度抗AQP4自身抗体和低浓度抗AQP4自身抗体。高浓度抗AQP4自身抗体的浓度范围为30~800U/mL，低浓度抗AQP4自身抗体的浓度范围为1~10U/mL。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明以野生型AQP4蛋白和两种特定突变型AQP4蛋白的组合作为检测抗AQP4自身抗体的抗原，更容易识别抗AQP4自身抗体，对于抗OAP多聚体中的AQP4抗体有更高的灵敏度和亲和力，进一步开发出了具有更高检测灵敏度的抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒，提高了诊断NMO患者的检出率并将诊出时间提前，对NMO患者具有重要的意义。
具体实施方式
四聚体化是AQP4蛋白形成四聚体的过程，而AQP4蛋白的某些突变可能会影响AQP4形成四聚体的倾向。本申请发明人尝试将突变型AQP4蛋白引入抗AQP4自身抗体的检验以期提高抗AQP4自身抗体检测灵敏度，进而有助于提高阳性样本检出率。本申请发明人经过大量的研究和实验验证，最终确定以特定序列的野生型AQP4蛋白和其两种特定突变方式形成的突变体蛋白混合作为抗原组合物，使用该抗原组合物制备化学发光检测试剂盒，经验证抗AQP4自身抗体检测灵敏度显著提高。
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
以下实施例和对比例中，原料、试剂的信息如下：
偶联了链霉亲和素的磁珠（Sera-Mag™，思拓凡Cytiva）；N-羟基琥珀酰亚胺酯-十二聚乙二醇-生物素（EZ-Link NHS-PEG12-Biotin，赛默飞世尔Thermo Fisher，A35389）；G-25分子筛层析柱（PD spinTrap™ G25，思拓凡Cytiva）；偶联了碱性磷酸酶的羊抗人IgG多克隆抗体（默克Sigma）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC，赛默飞世尔ThermoFisher ）；带有羧酸的磁珠溶液中（10%w/v，MS160，JSR株式会社）；抗AQP4自身抗体阳性校准品；野生型AQP4蛋白、AQP4突变体1蛋白和AQP4突变体2蛋白均为自制重组蛋白。
野生型AQP4蛋白的序列如下：
MVAFKGVWTQAFWKAVTAEFLAMLIFVLLSLGSTINWGGTEKPLPVDMVLISLCFGLSIATMVQCFGHISGGHINPAVTVAMVCTRKISIAKSVFYIAAQCLGAIIGAGILYLVTPPSVVGGLGVTMVHGNLTAGHGLLVELIITFQLVFTIFASCDSKRTDVTGSIALAIGFSVAIGHLFAINYTGASMNPARSFGPAVIMGNWENHWIYWVGPIIGAVLAGGLYEYVFCPDVEFKRRFKEAFSKAAQQTKGSYMEVEDNRSQVETDDLILKPGVVHVIDVDRGEEKKGKDQSGEVLSSV（SEQ ID No.1）。
AQP4突变体1蛋白的序列如下：
MVAFKGVWTQAFWKAVTAEFLAMLIFVLLSLGSTINWGGTEKPLPVDMVLISLCFGLSIATMVQCFGHISGGHINPAVTVAMVCTRKISIAKSVFYIAAQCLGAIIGAGILYLVTPPSVVGGLGVTMVHGNLTAGHGLLVELIITFQLVFTIFASCDSKRTDVTGSIALAIGFSVAIGHLFAINYTGASMNPARSFGPAVIMGNWENHWIYWVGPRIGAVLAGGLYEYVFCPDVEFKRRFKEAFSKAAQQTKGSYMEVEDNRSQVETDDLILKPGVVHVIDVDRGEEKKGKDQSGEVLSSV（SEQ ID No.2）。
AQP4突变体2蛋白的序列如下：
MVAFKGVWTQAFWKAVTAEFLAMLIFVLLSLGSTINWGGTEKPLPVDMVLISLCFGLSIATMVQCFGHISGGHINPAVTVAMVCTRKISIAKSVFYIAAQCLGAIIGAGILYLVTPPSVVGGLGVTMVHGNLTAGHGLLVELIITFQLVFTIFASCDSKRTDVTGSIALAIGFSVAIGHLFAINYTGASMNPARSFGPAVIMGSWENHWIYWVGPRIGAVLAGGLYEYVFCPDVEFKRRFKEAFSKAAQQTKGSYMEVEDNRSQVETDDLILKPGVVHVIDVDRGEEKKGKDQSGEVLSSV（SEQ ID No.3）。
实施例1
本实施例提供一种抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒（试剂盒规格：100人份/试剂盒），包括R1试剂、R2试剂、R3试剂、R4试剂、清洗液和质控品，制备方法如下：
R1试剂：
1.5mL浓度为10mg/mL偶联了链霉亲和素的磁珠在含有150mM 氯化钠的pH为7.4的20mM Tris缓冲液中稀释到1mg/mL的浓度，R1试剂总体积为15mL。
R2试剂：
将0.33mg AQP4野生型蛋白，0.33mg AQP4突变体1蛋白，0.33mg AQP4突变体2蛋白混合。在蛋白混合液中加入95µg EZ-Link NHS-PEG12-Biotin，反应总体积为200µL，不足的溶液体积使用pH为7.4的PBS缓冲液补足，在室温颠倒孵育1小时后，将反应液加入使用pH为7.4的PBS缓冲液平衡过的G-25分子筛层析柱，当液体完全进入分子筛后，通过8000rpm离心5分钟除去流窜液，在柱内加入100µL pH为7.4的PBS缓冲液且当PBS缓冲液完全进入G-25分子筛层析柱后，再将G-25分子筛层析柱10000rpm离心10分钟，解离得到偶联了生物素的AQP4蛋白混合液。使用pH为7.4的PBS缓冲液将偶联了生物素的AQP4蛋白混合液稀释到浓度为1µg/mL作为试剂盒中的R2试剂，总体积为10mL。
R3试剂：
将0.3µL偶联了碱性磷酸酶的羊抗人IgG多克隆抗体稀释在15mL含有150mM氯化钠的pH为7.4的20mM Tris缓冲液中，此稀释溶液作为R3试剂，总体积为15mL。
R4试剂：
称量0.085g腺苷5'-磷酸硫酸盐并溶解在10mL含有150mM氯化钠和1mM氯化镁的pH值为7.4的20mM Tris缓冲液中，配置得到的溶液作为R4试剂，总体积为10mL。
清洗液：
配置含有0.05wt%曲阿通的pH为7.4的PBS缓冲液作为清洗液，总体积为10mL。
质控品：
质控品1：浓度为5U/mL的抗AQP4自身抗体，质控品2：浓度为35U/mL的抗AQP4自身抗体。
对比例1
本对比例提供一种抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒（试剂盒规格：100人份/试剂盒），包括R1试剂、R2试剂、R3试剂、R4试剂、清洗液和质控品。本对比例的抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒与实施例1的区别仅在于R2试剂。本对比例中，R2试剂仅使用AQP4野生型蛋白，R2试剂的制备方法基本同实施例1的R2试剂，区别仅在于将0.33mg AQP4野生型蛋白，0.33mg AQP4突变体1蛋白和0.33mg AQP4突变体2蛋白换成1mg AQP4野生型蛋白。
对比例2
本对比例提供一种抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒（试剂盒规格：100人份/试剂盒），包括R1试剂、R2试剂、R3试剂和质控品，制备方法如下：
R1试剂：
将3.3mgAQP4野生型蛋白，3.3mgAQP4突变体1蛋白，3.3mgAQP4突变体2蛋白混合。在蛋白混合液中加入1mM 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺，随后与10mL带有羧酸的磁珠溶液混合，在室温颠倒孵育1小时后，使用磁铁收集磁珠，弃上清溶液，使用10mL pH值为7.4的PBS缓冲液清洗磁珠，再次用磁铁收集磁珠后，弃上清磷酸缓冲液PBS，将磁珠重悬于10mL含有150mM氯化钠的pH值为7.4的20mM Tris缓冲液中。此10mL包被AQP4蛋白混合液的磁珠溶液作为R1试剂。
R2试剂：
将0.3µL偶联了碱性磷酸酶的羊抗人IgG多克隆抗体稀释在15mL含有150mM氯化钠的pH为7.4的20mM Tris缓冲液中，此稀释溶液作为R2试剂，总体积为15mL。
R3试剂：
称量0.085g腺苷5’-磷酸硫酸盐并溶解在10mL含有150mM氯化钠和1mM氯化镁的pH值为7.4的20mM Tris缓冲液中，配置得到的溶液作为R3试剂，总体积为10mL。
质控品：
质控品1：浓度为5U/mL的抗AQP4自身抗体，质控品2：浓度为35U/mL的抗AQP4自身抗体。
性能测试：
实施例1和对比例1的抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒的使用方法如下：
将50µL R2试剂和100µL R1试剂置于反应杯中，37℃孵育5分钟，使用磁铁吸附反应杯中的磁珠，使用5mL清洗液清洗磁珠，将2µL待测样本稀释于18µL pH值为7.4的PBS缓冲液中然后加入反应杯中，37℃孵育10分钟，使用磁铁吸附反应杯中的磁珠，使用5mL清洗液清洗磁珠，加入100µL R3试剂，37℃孵育5分钟，使用磁铁吸附反应杯中的磁珠，使用5mL清洗液清洗磁珠，加入50µL R4试剂，37℃孵育5分钟，通过迎凯I2900化学发光检测仪检测统计10秒反应产生的内光子数作为反应信号。
对比例2的抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒的使用方法如下：
将2µL待测样本稀释于18µL pH值为7.4的PBS缓冲液中，加入装有100µL R1试剂的反应杯中，37℃孵育10分钟，使用磁铁吸附反应杯中的磁珠，使用5mL清洗液清洗磁珠，加入100µL R2试剂，37℃孵育5分钟，使用磁铁吸附反应杯中的磁珠，使用5mL清洗液清洗磁珠，加入50µL R3试剂，37℃孵育5分钟，通过迎凯I2900化学发光检测仪检测统计10秒反应产生的内光子数作为反应信号。
1. 检测线性范围
将高值抗AQP4自身抗体阳性校准品在pH值为7.4的PBS缓冲液中稀释到以下6个浓度800U/mL，200U/mL，50U/mL，20U/mL，5U/mL，1.5U/mL。采用实施例1、对比例1和对比例2的试剂盒分别对各稀释浓度样本分别进行3次重复测定，计算反应信号均值Y。以样本浓度x为自变量，以Y为因变量，使用四参数logistic方程进行拟合，采取两点校准方法。拟合方程及线性回归相关系数r见表1，r大于0.99可确定线性范围合格。
表1显示，实施例1的试剂盒的检测线性范围为1.5-800U/mL。对比例1和对比例2的线性范围无法达到1.5-800U/mL。
2.最低检出限
用pH值为7.4的PBS缓冲液作为待测样本，采用实施例1、对比例1和对比例2的抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒分别对待测样本重复测定20次，将检测的反应信号值代入表1中对应试剂盒的标准曲线中获得测定浓度，计算测定浓度的平均值（M）和标准差（SD），得出M+2SD即为最低检出限，结果见表2。
表2显示，实施例1的试剂盒的最低检出限为0.5U/mL，对比例1的试剂盒的最低检出限为2.42U/mL，对比例2的试剂盒的最低检出限为6U/mL。
3.阴阳性参考值
采用实施例1、对比例1和对比例2的抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒分别对83例定值样本进行检测，其中包含55例阳性样本及28例阴性样本，检测结果见表3。
表3显示，实施例1的试剂盒的样本检测灵敏度为96.36%（53/55），样本检测特异性为96.43%（27/28）。对比例1的试剂盒的样本检测灵敏度为74.55%（41/55），样本检测特异性为92.86%（26/28）。对比例2的试剂盒的样本检测灵敏度为92.72%（51/55），样本检测特异性为85.71%（24/28）。
4.检测重复性
采用实施例1、对比例1和对比例2的试剂盒分别重复测试定值为5U/mL的质控品1以及定值为35U/mL的质控品2各10次，试剂测试结果如表4，根据结果计算得到样本的变异系数（CV）为2.95%和1.36%，CV不大于10%则试剂盒性能符合要求。
表4显示，实施例1的试剂盒检测质控品1和质控品2的变异系数（CV）分别为2.95%和1.36%，CV不大于10%，重复性符合要求。对比例1的试剂盒检测质控品1和质控品2的变异系数分别为11.53%和10.78%，CV大于10%，重复性不符合要求。对比例2的试剂盒检测质控品1和质控品2的变异系数分别为20%和11.29%，CV大于10%，重复性不符合要求。
以上结果显示，实施例1的试剂盒更容易识别待测样本中的抗AQP4自身抗体，对于抗OAP多聚体中的AQP4抗体有更高的灵敏度和亲和力，由此实施例1的试剂盒能够提高诊断NMO患者的准确度并将诊出时间提前。
Claims (10)
1.一种用于抗AQP4自身抗体检测的抗原蛋白组合物，其特征在于，所述抗原蛋白组合物包括野生型AQP4蛋白、第一突变型AQP4蛋白和第二突变型AQP4蛋白，所述野生型AQP4蛋白的序列如SEQ ID No.1所示，所述第一突变型AQP4蛋白的序列如SEQ ID No.2所示，所述第二突变型AQP4蛋白的序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的抗原蛋白组合物，其特征在于，所述野生型AQP4蛋白、所述第一突变型AQP4蛋白和所述第二突变型AQP4蛋白的摩尔比为（0.8~1.2）：（0.8~1.2）：1。
3.根据权利要求1所述的抗原蛋白组合物，其特征在于，所述野生型AQP4蛋白、所述第一突变型AQP4蛋白和所述第二突变型AQP4蛋白分别为重组蛋白。
4.一种抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于，其包括R1试剂、R2试剂、R3试剂和R4试剂，所述R1试剂为链霉亲和素标记的磁珠溶液，所述R2试剂为生物素标记的抗原蛋白溶液，所述R3试剂为偶联了碱性磷酸酶的抗人IgG多克隆抗体溶液，所述R4试剂为化学发光底物溶液，其中R2试剂中的抗原蛋白为权利要求1至3中任一项所述的抗原蛋白组合物。
5.根据权利要求4所述的抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中，标记抗原蛋白的生物素为N-羟基琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-生物素。
6.根据权利要求4所述的抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂由生物素标记的抗原蛋白和pH值为7.2~7.6的磷酸缓冲液混合制备得到，所述生物素标记的抗原蛋白在所述R2试剂中的含量为0.1~10µg/mL。
7.根据权利要求4所述的抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂由链霉亲和素标记的磁珠和含有100~250mM 氯化钠的pH值为7.2~7.6的Tris缓冲液混合制备得到；
和/或，所述链霉亲和素标记的磁珠在所述R1试剂中的含量为0.1~10mg/mL；
和/或，所述链霉亲和素标记的磁珠的平均粒径为0.5~5µm。
8.根据权利要求4所述的抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R3试剂由偶联了碱性磷酸酶的抗人IgG多克隆抗体和含有100~250mM 氯化钠的pH值为7.2~7.6的Tris缓冲液混合制备得到；
和/或，所述R3试剂中的抗人IgG多克隆抗体为羊抗人IgG多克隆抗体、兔抗人IgG多克隆抗体或鸡抗人IgG多克隆抗体。
9.根据权利要求4所述的抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R4试剂中的发光底物为腺苷5'-磷酸硫酸盐；
和/或，所述R4试剂由发光底物与含有100~200mM 氯化钠和0.5~2mM氯化镁的pH值为7.2~7.6的Tris缓冲液混合制备得到。
10.根据权利要求4所述的抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒还包括清洗液，所述清洗液为含有0.01wt%~0.1wt%曲阿通的pH为7.2~7.6的磷酸缓冲液；和/或，所述抗AQP4自身抗体化学发光检测试剂盒还包括质控品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311083404.7A CN116819072B (zh) | 2023-08-28 | 2023-08-28 | 一种用于抗aqp4自身抗体检测的抗原蛋白组合物及化学发光检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311083404.7A CN116819072B (zh) | 2023-08-28 | 2023-08-28 | 一种用于抗aqp4自身抗体检测的抗原蛋白组合物及化学发光检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116819072A CN116819072A (zh) | 2023-09-29 |
| CN116819072B true CN116819072B (zh) | 2023-11-17 |
Family
ID=88114767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311083404.7A Active CN116819072B (zh) | 2023-08-28 | 2023-08-28 | 一种用于抗aqp4自身抗体检测的抗原蛋白组合物及化学发光检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116819072B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102858985A (zh) * | 2009-07-24 | 2013-01-02 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 基因组编辑方法 |
| CN106893740A (zh) * | 2017-02-17 | 2017-06-27 | 南京医科大学 | 一种条件性过表达aqp4转基因小鼠的模型制作方法 |
| CN108430497A (zh) * | 2015-09-19 | 2018-08-21 | 洛桑聚合联合学院 | 糖靶向治疗剂 |
| KR20180125792A (ko) * | 2017-05-16 | 2018-11-26 | 서울대학교병원 | 보체불활성화법을 이용한 항-아쿠아포린 4 항체의 개선된 검출 방법 |
| CN114106171A (zh) * | 2020-12-21 | 2022-03-01 | 天士力生物医药股份有限公司 | 抗aqp4抗体及其应用 |
-
2023
- 2023-08-28 CN CN202311083404.7A patent/CN116819072B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102858985A (zh) * | 2009-07-24 | 2013-01-02 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 基因组编辑方法 |
| CN108430497A (zh) * | 2015-09-19 | 2018-08-21 | 洛桑聚合联合学院 | 糖靶向治疗剂 |
| CN106893740A (zh) * | 2017-02-17 | 2017-06-27 | 南京医科大学 | 一种条件性过表达aqp4转基因小鼠的模型制作方法 |
| KR20180125792A (ko) * | 2017-05-16 | 2018-11-26 | 서울대학교병원 | 보체불활성화법을 이용한 항-아쿠아포린 4 항체의 개선된 검출 방법 |
| CN114106171A (zh) * | 2020-12-21 | 2022-03-01 | 天士力生物医药股份有限公司 | 抗aqp4抗体及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| AQP4基因多态性与视神经脊髓炎遗传易感性的相关研究;王青松;王浩;戴庆箐;徐竹;楚兰;;中风与神经疾病杂志(第12期);全文 * |
| 水通道蛋白4在慢性高眼压模型大鼠视网膜的表达;王英爽;高殿文;沙倩;聂庆珠;归东梅;;国际眼科杂志(第10期);全文 * |
| 视神经脊髓炎中抗水通道蛋白4抗体检测进展;吴晓莉;何静杰;刘丽旭;张通;;神经损伤与功能重建(第01期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116819072A (zh) | 2023-09-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108362688B (zh) | 一种25羟基维生素d磁微粒化学发光检测试剂盒 | |
| KR101669918B1 (ko) | 사람 체액 중의 시스타틴 ｃ의 측정방법 | |
| CN108593641B (zh) | 一种定量检测全血样品中待测物质的试剂盒及方法 | |
| CN108362895B (zh) | 叶酸检测试剂盒及其制备方法 | |
| JP2016536587A (ja) | 中和抗体を検出するための競合リガンド結合アッセイ | |
| CN111812336A (zh) | 用于检测冠状病毒抗体的检测试剂盒及其制备方法 | |
| EP1724582B1 (en) | Measurement value lowering inhibitor for immunoassay method and immunoassay method using the same | |
| KR102433648B1 (ko) | 항인간 헤모글로빈 모노클로날 항체 또는 항체 키트, 항인간 헤모글로빈 모노클로날 항체 고정화 불용성 담체 입자, 및 이들을 이용한 측정 시약 또는 측정 방법 | |
| CN116819072B (zh) | 一种用于抗aqp4自身抗体检测的抗原蛋白组合物及化学发光检测试剂盒 | |
| CN112485418B (zh) | 一种用于人体维生素b12含量检测的释放剂及其应用 | |
| CN111175505B (zh) | 一种p53自身抗体检测试剂盒及其应用 | |
| CN1404577A (zh) | 免疫分析试剂和分析方法 | |
| JP2016031250A (ja) | 標的タンパク質の測定試薬および該試薬を用いた測定方法 | |
| EP2309265B1 (en) | Method of assaying complex and kit to be used therefor | |
| CN113166235A (zh) | 抗体偶联物 | |
| CN114791500A (zh) | 一种乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒及其应用 | |
| CN112180102B (zh) | 花生过敏原特异性IgE定量检测试剂、试剂盒及其应用 | |
| US20110159477A1 (en) | Products and analytical method | |
| CN107976539B (zh) | 一种降低酶联免疫法包被后本底的方法 | |
| CN113391068A (zh) | 用于bace1的磁微粒化学发光免疫检测试剂盒 | |
| JP2023127452A (ja) | 抗ｐｅｇ抗体結合材料および抗ｐｅｇ抗体の検出方法 | |
| Enayati et al. | Development of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on covalent immobilization of antibody on plate for measurement of digoxin | |
| RU2231366C2 (ru) | Иммунодиагностикум на основе полистирольного латекса | |
| CN114047236A (zh) | 一种检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用 | |
| CN113933497A (zh) | I型胶原氨基端延长肽磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |