CN108362895B

CN108362895B - 叶酸检测试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN108362895B
Application number: CN201810144118.XA
Authority: CN
Inventors: 张小锐; 刘希
Original assignee: Beijing Strong Biotechnologies Inc
Current assignee: Beijing Strong Biotechnologies Inc
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2038-02-12
Also published as: CN108362895A

Abstract

本发明涉及一种叶酸检测试剂盒及其制备方法。试剂盒包括第一试剂、第二试剂，可选地还包括标准品。第一试剂包含叶酸抗体和缓冲液，第二试剂包含包被结合有叶酸多聚半抗原的纳米颗粒和缓冲液。该试剂盒利用样本中的叶酸与第二试剂中的叶酸多聚半抗原竞争结合第一试剂中的叶酸抗体。样本中叶酸浓度越高，抗体与包被结合有叶酸多聚半抗原纳米颗粒反应产生浊度变化越小，由此可建立校准曲线，从而定量测定未知样本中叶酸浓度。

Description

叶酸检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本申请属于临床体外诊断及医学免疫学领域中，涉及一种免疫检测试剂，更进一步地，本申请涉及一种叶酸测定试剂盒。

背景技术

半抗原是指某些小分子物质，其单独不能诱导免疫应答，而不具备免疫原性。抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂都属于半抗原。

叶酸(Folic acid)是维生素B复合体之一，相当于蝶酰谷氨酸(pteroylglutamicacid，PGA)，是米切尔(H.K.Mitchell，1941)从菠菜叶中提取纯化的，故而命名为叶酸。叶酸有促进骨髓中幼细胞成熟的作用。人类如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，对孕妇尤其重要。

叶酸具有以下几个生物学功能：(1)作为体内生化反应中一碳单位转移酶系的辅酶，起着一碳单位传递体的作用。(2)参与嘌呤和胸腺嘧啶的合成，进一步合成DNA和RNA。(3)参与氨基酸代谢，在甘氨酸与丝氨酸、组氨酸和谷氨酸、同型半胱氨酸与蛋氨酸之间的相互转化过程中充当载体。(4)参与血红蛋白及甲基化合物如肾上腺素、胆碱、肌酸等的合成。

叶酸是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。在体内叶酸以四氢叶酸的形式起作用。四氢叶酸在体内参与嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的合成和转化。叶酸在制造核酸(核糖核酸、脱氧核糖核酸)上扮演重要的角色。叶酸帮助蛋白质的代谢，并与维生素B12共同促进红细胞的生成和成熟，是制造红血球不可缺少的物质。叶酸也作为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)及其它微生物的促进增殖因子而起作用。

叶酸对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用。人体缺少叶酸可导致红血球的异常，未成熟细胞的增加，贫血以及白血球减少。叶酸是胎儿生长发育不可缺少的营养素。孕妇缺乏叶酸有可能导致胎儿出生时出现低体重、唇腭裂、心脏缺陷等。如果在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可引起胎儿神经管发育缺陷，而导致畸形。因此，准备怀孕的女性，可在怀孕前就开始每天服用100微克到300微克叶酸。此外，叶酸还可以预防乳癌。常喝酒的女性(大约是每天一杯啤酒)会增高乳癌的发生率大约15％，但是如果能够经常地补充叶酸，这种危险就会下降45％。这个研究由哈佛大学针对88000名女性所做的长达10年的研究所发现，并且发表在新一期的美国医学会期刊中(The Journal of theAmerican Medical Association 1999；281：1632-1637)。

叶酸缺乏时，脱氧胸苷酸、嘌呤核苷酸的形式及氨基酸的互变受阻，细胞内DNA合成减少，细胞的分裂成熟发生障碍，引起巨幼红细胞性贫血。维生素B12和叶酸缺乏的临床表现基本相似，都可引起巨幼细胞性贫血、白细胞和血小板减少，以及消化道症状如食欲减退、腹胀、腹泻及舌炎等。以舌炎最为突出，舌质红、舌乳头萎缩、表面光滑，俗称“牛肉舌”，并伴有疼痛。

服用大剂量叶酸也可能产生毒性作用：(1)干扰抗惊厥药物的作用，诱发病人惊厥发作。(2)口服叶酸350mg可能影响锌的吸收，而导致锌缺乏，使胎儿发育迟缓，低出生体重儿增加。(3)掩盖维生素B12缺乏的早期表现，而导致神经系统受损害。

随着医疗专业人员和患者意识到叶酸缺乏的潜在健康风险，实验室检验量激增，需要我们提供更快、更准、更有效的检测方法，帮助医生和患者更早的得到检测结果。

目前叶酸的测定方法主要有酶联免疫法(例如CN104076154A、CN102175878A所公开的方法)、放射免疫法、液相色谱-质谱检测法以及化学发光法(例如CN102998469A所公开的方法)。酶联免疫法自动化程度不高，且受人为因素影响较大。放射免疫法存在着环境污染问题。液相色谱-质谱操作复杂，用时较长。化学发光法灵敏度虽高，但检测成本较高，需要特定化学发光仪，这些原因导致其应用范围较小。

本申请所要解决的问题是克服上述现有试剂盒所存在的缺陷，提供一种新的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒，检测血清或血浆中叶酸的含量，提高检测速度、降低操作复杂性、尽快得到可靠结果。

发明内容

根据本申请的第一方面，提供了一种叶酸检测试剂盒，其包含第一试剂，和第二试剂。第一试剂包含半抗原抗体抗体(例如叶酸抗体)和缓冲液，第二试剂包含结合有叶酸多聚半抗原的微球和缓冲液。

在一些实施方式中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液各自独立地选自：磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液(也作2-吗啉乙磺酸缓冲液)、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液和氯化铵缓冲液中的一种或更多种。

在一些实施方式中，缓冲液浓度为10-500mM，浓度优选20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、以及前述任意两个数值之间的范围，更优选20mM、30mM、40mM、50mM、以及前述任意两个数值之间的范围。缓冲液的pH值为6至8，优选7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、以及前述任意两个数值之间的范围。

在一些实施方式中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型可以相同也可以不同；第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度可以相同也可以不同。在一些优选实施方式中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型相同；且第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度不同。在一个具体实施方式中，第一试剂的缓冲液是50mM HEPES缓冲液；第二试剂的缓冲液是20mMHEPES缓冲液。本领域技术人员可以理解，随着缓冲液类型、浓度等因素，缓冲液的pH值可以有所不同。

在一些实施方式中，叶酸抗体为多克隆抗体或单克隆抗体；其中多克隆抗体源自兔、羊或鸡，单克隆抗体源自鼠、兔或羊。叶酸抗体的浓度为0.1至1％，优选0.1、0.2、0.3、0.4、0.5％(w/v)以及前述任意两个数值之间的范围。

在一些实施方式中，第一试剂还包含选自如下的一种或更多种：NaCl、防腐剂、BSA和抗坏血酸。其中，NaCl浓度为0.1至0.5M；防腐剂浓度为0.05至0.2％；BSA浓度为0.05至0.2％；抗坏血酸浓度为0.5至2％。

应当理解，尽管本申请中公开了试剂中各个组分的具体浓度，技术人员允许将试剂制备成不同的浓缩/稀释形式，因此试剂的浓缩/稀释形式仍然落入本申请的范畴。

在一些实施方式中，所述叶酸多聚半抗原为叶酸与惰性蛋白的偶联物。所述叶酸多聚半抗原以共价的方式结合至纳米微球。惰性蛋白选自：BSA、酪蛋白、钥孔血蓝蛋白或卵清蛋白。

在一些实施方式中，所述微球是由选自聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸酯中的一种或更多种聚合而成的。

在一些实施方式中，试剂包含大小两种胶乳微球，大颗粒微球直径在100-400nm之间，小颗粒微球直径在50-150nm之间。在一个具体实施方式中，所述微球是聚苯乙烯胶乳颗粒，大颗粒微球直径为300nm，小颗粒直径为80nm。

根据需要，根据本申请的叶酸检测试剂盒还包括标准品(本领域中有时也可以称为校准品)，标准品主要用于校准测量系统、评价测量程序或为待测样本赋值。因此，所述标准品包含已知浓度的叶酸，标准品的值甚至可以追溯至参考物质或者追溯至参考方法(ISO17511:2003)。本领域技术人员可以根据待测物质的浓度范围，采用本领域常用的方法自行制备适当浓度的标准品，也可以使用市售标准品(例如，叶酸纯度标准物质BW3645)、或制造商提供的工作标准品。

在一些具体实施方式中，根据本申请的叶酸检测试剂盒还包括若干不同浓度的标准品，例如但不限于2个、3个、4个、5个甚至更多浓度的标准品。

在一个实施方式中，本申请的叶酸检测试剂盒包括5个不同浓度的标准品。标准品含有叶酸(分别为，但不限于，10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml)、缓冲液，适当时还含有稳定剂(如蔗糖)、或防腐剂(如NaN₃)等。标准品可制备成液体形式、干粉或冻干粉形式。缓冲液选自：磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液和氯化铵缓冲液中的一种或更多种；缓冲液浓度为10-500mM。

在一些实施方式中，第二试剂包含20mM pH为7.0的HEPES缓冲液、0.25％结合有叶酸-惰性蛋白的纳米微球和0.1％防腐剂。在一些具体的实施方式中，第二试剂包含20mM pH为7.0的HEPES缓冲液、0.25％结合有叶酸-BSA的纳米微球和0.1％NaN₃，且纳米微球的粒径为150nm。

根据本申请的另一方面，提供了一种结合有叶酸多聚半抗原的微球的制备方法，包括步骤：

第一步骤，其包括：

1.1)将半抗原(例如叶酸)进行活化，得到活化的半抗原；

1.2)将所述活化的半抗原偶联至惰性蛋白，得到半抗原-惰性蛋白偶联物；

1.3)提供第一纳米微球，并将其偶联至所述半抗原-惰性蛋白偶联物；

1.4)对步骤1.3)得到的纳米微球进行封闭，得到低活性抗原-纳米微球，

第二步骤，其包括：

2.1)将第二纳米微球进行活化，得到活化的第二纳米微球；

2.2)将惰性蛋白偶联至所述活化的第二纳米微球，得到结合有惰性蛋白的纳米微球；

2.3)提供半抗原，并将其偶联至所述结合有惰性蛋白的纳米微球；

2.4)对步骤2.3)得到的纳米微球进行封闭，得到高活性抗原-纳米微球，

第三步骤：将所述低活性抗原-纳米微球和所述高活性抗原-纳米微球混合。

在另一些实施方式中，第一步骤和第二步骤是并行的、或者二者的顺序可互换。

在一些实施方式中，采用选自如下的试剂进行活化：4-羟乙基哌嗪乙磺酸、碳酸氢钠、碳酸钠、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和戊二醛的一种或其组合。

在一些实施方式中，在步骤1.1)中，用戊二醛将叶酸进行活化，得到活化的叶酸。优选地，戊二醛溶于20mM pH 9.0碳酸缓冲液中，浓度为0.2mg/ml。优选地，在室温(20至28摄氏度)将叶酸进行活化。所述叶酸的浓度为1mg/ml。

在具体的实施方式中，在步骤1.1)中，将溶于20mM pH 9.0碳酸缓冲液中的1mg/ml叶酸加入0.2mg/ml戊二醛中，在室温下活化2至3小时，得到活化的叶酸。

在一些实施方式中，在步骤1.2)中，将所述活化的叶酸偶联至惰性蛋白，得到叶酸-惰性蛋白偶联物。在一些实施方式中，将所述活化的叶酸偶联至BSA，得到叶酸-BSA偶联物。在一些实施方式中，将溶于20mM pH 9.0碳酸缓冲液中的7.5mg/ml BSA接触所述活化的叶酸，在室温下反应2至3小时，从而将所述活化的叶酸偶联至BSA，得到叶酸-BSA偶联物。

在一些实施方式中，在步骤1.2)后还可以包括一个终止反应的步骤。在具体的实施方式中，将乙醇胺加入得到的叶酸-BSA偶联物中，室温下反应2至3h。在一些实施方式中，在步骤1.2)后还可以包括一个纯化步骤，将步骤1.2)得到的溶液进行透析以去除未交联的反应物，从而收获叶酸-BSA偶联物。更具体地，在截留分子量14000的透析袋中对20mM碳酸缓冲液pH9.0进行透析。

在一些实施方式中，在步骤1.3)中，提供第一纳米微球，并将其偶联至所述叶酸-惰性蛋白偶联物。优选，第一纳米微球悬浮于20mM pH 7.0的HEPES溶液中，浓度为按重量计4％。优选，在10ml 2.5mg/ml的EDAC(配制于20mM pH 7.0HEPES中)中，室温下反应2至3h将第一纳米微球结合至叶酸-BSA偶联物。

在一些实施方式中，在步骤1.4)中，用含有BSA和吐温20的封闭液对步骤1.3)的产物进行封闭，从而将微球表面没有结合叶酸-BSA偶联物的部分封闭掉。优选地，用含有1％BSA和1％吐温20的封闭液将步骤1.3)得到的微球封闭2小时，此时所得到的最终产物在本申请上下文中称为“低活性抗原-纳米微球”，其实际上是表面共价结合有叶酸-BSA偶联物的纳米微球。

在一些实施方式中，在步骤1.4)之后，将得到的低活性抗原-纳米微球进行离心，并重悬于前述缓冲液中，优选20mM pH 7.0HEPES中。优选地，使低活性抗原-纳米微球的浓度为0.25％，任选地还可以加入防腐剂，例如0.1％NaN₃。

在一些实施方式中，在步骤2.1)中，将第二纳米微球进行活化，得到活化的第二纳米微球。在具体的实施方式中，采用EDAC对第二纳米微球进行活化；优选，采用2.5mg/ml的EDAC(配制于20mM pH7.0HEPES中)在室温下将按重量计4％的第二纳米微球活化20-40分钟(优选30分钟)。

在一些实施方式中，在步骤2.2)中，在室温下将1％BSA偶联至所述活化的第二纳米微球，得到结合有BSA的纳米微球。在步骤2.2)之后，还可以包括通过离心去除未交联的BSA的步骤。

在一些实施方式中，在步骤2.3)中，提供溶解于20mM pH 9.0碳酸缓冲液的1mg/ml叶酸；然后将叶酸和结合有BSA的纳米微球在2.5mg/ml EDAC中在室温反应2至3小时，从而将叶酸偶联至结合有BSA的纳米微球。在步骤2.3)之后，还包括封闭的步骤；优选地，用含有BSA和吐温20的封闭液对步骤2.3)的产物进行封闭，从而将微球表面没有被结合的部分封闭掉。优选地，用含有1％BSA和1％吐温20的封闭液将步骤2.3)得到的微球封闭2小时，此时所得到的最终产物在本申请上下文中称为“高活性抗原-纳米微球”，其实际上是表面共价结合有叶酸-BSA的纳米微球。

在一些实施方式中，在步骤2.4)之后，将得到的高活性抗原-纳米微球进行离心，并重悬于前述缓冲液中，优选20mM pH 7.0HEPES中。优选地，使高活性抗原-纳米微球的浓度为0.25％，任选地还可以加入防腐剂，例如0.1％NaN₃。

在一些实施方式中，在第三步骤中，将高活性抗原-纳米微球和低活性抗原-纳米微球进行混合，使得两者按质量比为1:6至1:1，优选1:4。第三步骤所得到的混合物在本申请的检测试剂盒中作为第二试剂。

在一些实施方式中，纳米微球为羧基修饰的微球。

根据本申请的又一方面，提供一种结合有叶酸多聚半抗原的纳米微球，其是通过本申请的制备方法获得的。

根据本申请的再一方面，提供一种检测试剂，其包含上述结合有叶酸多聚半抗原的纳米微球。在具体的实施方式中，提供一种检测试剂，其包含低活性抗原-纳米微球和高活性抗原-纳米微球。

不限于具体理论，本申请的试剂盒检测原理可以解释为：第一试剂作为样本处理液，可以将红细胞中的蛋白释放出来，提高了测定准确性；由于第一试剂还包含足够多的叶酸抗体，使受试者样本(如全血、血浆、血清)中的叶酸可以和该抗体发生特异性结合。第二试剂含有结合有叶酸多聚半抗原的纳米微球。纳米微球上的叶酸多聚半抗原是通过两种方式制备的，分别得到高活性和低活性两种抗原。将高活性抗原交联在粒径较大颗粒表面，将低活性抗原交联在粒径较小颗粒表面。两种颗粒混合可以兼顾灵敏度和线性范围。利用胶乳增强免疫比浊的方法原理，检测微球与剩余抗体反应产生的吸光度，可以推算出样本中叶酸的含量。

附图说明

图1：本申请方法和对照方法所制备的试剂之间标准曲线的比较。■本申请方法；▲对照方法1；●对照方法2；▼对照方法3。

图2：本申请试剂盒与化学发光免疫分析法的血清测值的相关性。

图3：本申请试剂盒与化学发光免疫分析法的全血测值的相关性。

具体实施方式

为了使本申请易于理解，下面结合具体实施例进一步阐述本申请。除非另有指明，％表示质量/体积。以下提供了本申请实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制。与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本申请的技术方案。

实施例

实施例1：叶酸检测试剂盒的制备

1.第一试剂:

2.第二试剂制备过程如下：

2.1低活性抗原-纳米微球制备：

1)用20mM碳酸缓冲液(pH 9.0)在室温下稀释戊二醛，至戊二醛的终浓度为0.2mg/ml；

2)用20mM碳酸缓冲液(pH 9.0)在室温下稀释4ml浓度为10mg/ml的叶酸抗原，至抗原终浓度为1mg/ml；

3)将步骤2)得到的抗原溶液缓慢滴入步骤1)获得的戊二醛溶液中，于室温不断搅拌，全部滴加完毕后，再搅拌3h；

4)将牛血清白蛋白(BSA)溶解在20mM pH9.0碳酸缓冲液中至终浓度为7.5mg/ml，迅速加入步骤3)得到的溶液中，于室温搅拌3h；

5)将2ml 20％乙醇胺加入步骤4)得到的溶液中，室温搅拌3h；

6)将步骤5)得到的溶液置于截留分子量14000的透析袋中，在20mM pH9.0碳酸缓冲液中进行透析，除去未交联的反应物，得到叶酸-BSA偶联物；

7)用20mM HEPES溶液(pH 7.0)在室温下稀释8ml 80nm按重量计10％的胶乳溶液，使胶乳浓度为按重量计4％；

8)将叶酸-BSA偶联物和胶乳混匀，室温震荡30分钟后加入用20mM HEPES溶液(pH7.0)配制的10ml 2.5mg/ml的EDAC溶液，室温反应3h，再加入5ml封闭液(含1％BSA和1％吐温20的溶液)封闭2h；

9)离心，弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7.0)稀释步骤8)得到的胶乳至0.25％，并加入0.1％防腐剂，超声分散后得低活性抗原-纳米微球。

2.2高活性抗原-纳米微球制备：

1)用20mM HEPES溶液(pH 7.0)在室温下稀释8ml 300nm按重量计10％的胶乳溶液，使胶乳浓度为按重量计4％；

2)向步骤1)的溶液中加入用20mM HEPES溶液(pH 7.0)配制的10ml 2.5mg/ml的EDAC溶液，室温震荡30分钟后，加入用20mM HEPES溶液(pH 7.0)配制的1％BSA溶液室温反应3h，离心，除去未交联的BSA，得到结合有BSA的胶乳，然后重悬于8ml 20mM HEPES溶液(pH7.0)；

3)用20mM碳酸缓冲液(pH 9.0)在室温下稀释4ml浓度为10mg/ml的叶酸抗原，至抗原终浓度为1mg/ml；

4)将步骤3)得到的抗原溶液和步骤2)得到的结合有BSA的胶乳混匀，再加入用20mM HEPES溶液(pH 7.0)配制的2.5mg/ml的EDAC溶液室温反应3h，再加入5ml封闭液(含1％BSA和1％吐温20的溶液)封闭2h；

5)离心，弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7.0)稀释步骤4)得到的胶乳至0.25％，并加入0.1％防腐剂，超声分散后得高活性抗原-纳米微球。

2.3将制得的高、低活性的抗原-胶乳试剂按体积比1：4比例混合，得到第二试剂。

3.参考标准品的制备：

3.1参考标准品的缓冲液基质成分如下：

3.2按参考标准品所需要浓度将叶酸纯品加入上述缓冲液基质中，制得10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml浓度的叶酸参考标准品。

实施例2：对照制备方法1

1.第一试剂的制备同实施例1。

2.第二试剂制备过程如下：

1)用20mM碳酸缓冲液(pH 9.0)在室温下稀释戊二醛(50％)，至戊二醛终浓度为0.2mg/ml；

4)将牛血清白蛋白(BSA)溶解在20mM pH9.0碳酸缓冲液中至终浓度7.5mg/ml，迅速加入步骤3)得到的溶液中，于室温搅拌3h；

5)将2ml 20％乙醇胺加入步骤4)得到的溶液中，室温搅拌3h；

6)将步骤5)得到的溶液置于截留分子量14000的透析袋中，在20mM碳酸缓冲液(pH9.0)中进行透析，除去未交联的叶酸，得到叶酸-BSA偶联物；

7)用20mM HEPES溶液(pH 7.0)在室温下稀释8ml 300nm按重量计10％的胶乳溶液，使胶乳浓度为4％wt；

9)离心弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7.0)稀释步骤8)得到的胶乳至0.25％，并加入0.1％防腐剂，超声分散后得即为第二试剂。

3.参考标准品的制备：

同实施例1。

实施例3：对照制备方法2

1.第一试剂的制备同实施例1。

2.第二试剂制备过程如下：

1)用20mM HEPES溶液(pH 7.0)在室温下稀释8ml 80nm按重量计10％的胶乳溶液，使胶乳浓度为4％wt；

5)离心，弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7.0)稀释步骤4)得到的胶乳至0.25％，并加入0.1％防腐剂，超声分散后得到第二试剂。

3.参考标准品的制备：

同实施例1。

实施例4：对照制备方法3

1.第一试剂的制备同实施例1。

2.第二试剂制备过程如下：

2.1大粒径纳米微球

5)将2ml 20％乙醇胺加入步骤4)得到的溶液中，室温搅拌3h；

7)用20mM HEPES溶液(pH 7.0)在室温下稀释8ml 300nm按重量计10％的胶乳溶液，使胶乳浓度为按重量计4％；

9)离心，弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7.0)稀释步骤8)得到的胶乳至0.25％，并加入0.1％防腐剂，超声分散后得大粒径纳米微球。

2.2小粒径纳米微球

1)用20mM HEPES溶液(pH 7.0)在室温下稀释8ml 80nm按重量计10％的胶乳溶液，使胶乳浓度为按重量计4％；

5)离心，弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7.0)稀释步骤4)得到的胶乳至0.25％，并加入0.1％防腐剂，超声分散后得小粒径纳米微球。

2.3将制得的大小纳米微球试剂按体积比1：4比例混合，得到第二试剂。

3.参考标准品的制备：

同实施例1。

实施例5：叶酸检测试剂盒测定步骤

表1.本申请的测定步骤

以标准品浓度为横轴，相应的△OD700为纵轴，采用非线性拟合，如spline绘制出标准曲线，见图1。

与对照方法1所制备的试剂绘制的标准曲线相比，本申请的试剂在高抗原浓度下，试剂定标吸光度变化较大，线性较好。

与对照方法2所制备的试剂绘制的标准曲线相比，本申请的试剂在低抗原浓度下，试剂定标吸光度变化较大，灵敏度较好。

与对照方法3所制备的试剂绘制的标准曲线相比，本申请的试剂在高抗原浓度下，试剂定标吸光度变化较大，线性较好。

实施例6：叶酸检测试剂的线性和最低检测限

1.线性实验：

采用本领域技术人员已知的方法，将某一高浓度叶酸样本做倍比稀释。然而，采用本申请方法所制备的试剂盒测定稀释后的浓度，测定三次求平均值，与理论浓度相比较，计算其线性偏差。

表2 高值线性偏差

表3 低值线性偏差

从表2和表3可以看出本申请试剂盒线性范围可达7ng/ml至1000ng/ml。

2.最低检测限：

采用本领域技术人员已知的方法，将空白液和同一份用生理盐水进行稀释的几个低浓度样品，重复测定15次，读取吸光度变化量。然后计算出扣除空白吸光度后的各样品的吸光度值，计算均值，标准偏差。采用99.7％的可能性来计算最低检测限。将每个样本的均值减去3倍的各自的标准偏差，然后与空白液的3倍的标准偏差比较，如果前者高于后者，我们就认定有99.7％的可能性出现的最小吸光度大于空白吸光度，能定量的报告结果。测定结果如表4。

表4.最低检测限

由表4得知，样本浓度2.01ng/ml时，CV％接近于20％，因此本申请检测试剂的最低检测限为2.01ng/ml。

实施例7：本申请的叶酸检测试剂与化学发光免疫分析法测值的相关性

1.对血清的测定

分别采用本申请的叶酸检测试剂盒与现有技术中的化学发光免疫分析法，对血清样本进行检测。所得的测定值进行比较(见图2)，并进行回归分析，获知相关性R＝0.998，y＝0.9942x+0.2824。显示出本方法与化学发光免疫分析法在血清叶酸测定方面具有良好的相关性。

2.对全血的测定

分别采用本申请的叶酸检测试剂盒与现有技术化学发光免疫分析法，对全血样本进行检测。所得的测定值进行比较(图3)，并进行回归分析，获知相关性R＝0.986，y＝0.9807x+21.928。显示出本方法与化学发光免疫分析法在全血叶酸测定方面具有良好的相关性。

以上显示和描述了本申请的基本原理、主要特征和本申请的优点。本申请不受上述实施例的限制。在不脱离本申请精神和范围的前提下本申请还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本申请范围内。

本申请的主要优点是：纳米微球上的叶酸多聚半抗原通过两种方式制备，分别制备出高活性和低活性两种抗原。将高活性抗原交联在粒径较大颗粒表面和将低活性抗原交联在粒径较小颗粒表面。大小颗粒混合可以兼顾灵敏度和线性范围。对仪器设备要求不高，没有环保和操作人员自身防护等问题。本方法简便快速、灵敏可靠，普通自动或半自动生化分析仪就可，有较大应用范围和实用价值。

Claims

1.一种结合有叶酸多聚半抗原的纳米微球的制备方法，所述方法包括步骤：

第一步骤，其包括：

1.1)对叶酸进行活化，得到活化的叶酸；

1.2)将所述活化的叶酸偶联至惰性蛋白，得到叶酸-惰性蛋白偶联物；

1.3)提供第一纳米微球，并将所述第一纳米微球偶联至所述叶酸-惰性蛋白偶联物，所述第一纳米微球的直径为80nm；

第二步骤，其包括：

2.1)对第二纳米微球进行活化，得到活化的第二纳米微球，所述第二纳米微球的直径为300nm；

2.3)提供叶酸，并将所述叶酸偶联至所述结合有惰性蛋白的纳米微球；

第三步骤：将所述高活性抗原-纳米微球和所述低活性抗原-纳米微球按照质量比1：2至1：6混合，

其中所述第一步骤和所述第二步骤的顺序是并行的、或者可互换的；

所述第一纳米微球和第二纳米微球由聚苯乙烯聚合而成。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中：

所述第一纳米微球和第二纳米微球是羧基修饰的纳米微球。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其中：

所述高活性抗原-纳米微球和所述低活性抗原-纳米微球按照质量比1：4进行混合。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述的活化是采用选自如下的试剂进行的：

4-羟乙基哌嗪乙磺酸、碳酸氢钠、碳酸钠、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺、戊二醛、或其组合。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述惰性蛋白质选自：牛血清白蛋白、酪蛋白、钥孔血蓝蛋白、卵清蛋白。