CN114354951A - 叶酸和维生素b12联合检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
叶酸和维生素b12联合检测试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种叶酸和维生素B12联合检测试剂盒，包括检测卡、标准曲线对照表、样本处理液，所述检测卡包括卡壳、设置在卡壳中的测试条，所述测试条包括底板、依次粘附在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫；所述结合垫上包被有量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的维生素B12抗体的混合物，所述硝酸纤维素膜采用纳米微球标记叶酸抗原和维生素B12抗原的方式实现两种蛋白的同时检测；所述标准曲线对照表设置在条形码或SD卡上，条形码印在卡壳的表面。还公开了一种叶酸和维生素B12联合检测试剂盒的制备方法。本发明灵敏度高、准确性好、方便快捷、成本低，能够对样本中的叶酸和维生素B12成分进行同时检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种叶酸和维生素B12联合检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
叶酸是一种水溶性B族维生素，是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的化合物。叶酸对人体的重要营养作用早在1948年即已得到证实，人类(或其他动物)如缺乏叶酸可引起巨幼红细胞性贫血以及白细胞减少症，还会导致身体无力、易怒、没胃口以及精神病症状。此外，研究还发现，叶酸对孕妇尤其重要。孕妇缺乏叶酸，可使先兆子痫、胎盘剥离的发生率增高，患有巨幼红细胞贫血的孕妇易出现胎儿宫内发育迟缓、早产及新生儿低出生体重。怀孕早期缺乏叶酸，还易引起胎儿神经管畸形(如脊柱裂、无脑畸形等)。
维生素B12又叫钴胺素，是一种含有3价钴的多环系化合物，4个还原的吡咯环连在一起变成为1个咕啉大环(与卟啉相似)，是维生素B12分子的核心。自然界中的维生素B12都是微生物合成的，高等动植物不能制造维生素B12。维生素B12的主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血，防止大脑神经受到破坏。
维生素B12可提高叶酸利用率，与叶酸一起合成甲硫氨酸(由高半胱氨酸合成)和胆碱，产生嘌呤和嘧啶的过程中合成氰钴胺申基先驱物质如甲基钴胺和辅酶B12，参与许多重要化合物的甲基化过程。维生素B12缺乏时，从甲基四氢叶酸上转移甲基基团的活动减少，使叶酸变成不能利用的形式，导致叶酸缺乏症。维生素B12和叶酸缺乏的临床表现基本相似，都可引起巨幼红细胞性贫血、白细胞和血小板减少，以及消化道症状如食欲减退、腹胀、腹泻及舌炎等。
叶酸和维生素B12是蛋氨酸合成的反应途径中的组成部分，两者中任何一种的缺失都将影响该途径并导致相似的临床症状。此外该普通的代谢途径还将引起这样的结果，即维生素B12的无效会破坏叶酸进入红细胞，这将会导致即便叶酸的摄入正常也会引起红细胞内叶酸浓度的下降。由于上述原因，在临床工作中一般应同时检测两种维生素。因此开发一种可体外对人体叶酸和维生素B12联合检测的试剂盒，在临床诊断中有助于有效查找分析妊娠期女性贫血的原因，评估病情，以有效控制和预防贫血，提高胎儿的发育。
目前将硝酸纤维素膜(NC膜)作为反应载体的侧向层析类检测试剂，其包被蛋白的方式是直接将蛋白吸附在NC膜上，所得到的蛋白量相对有限，且蛋白在NC膜上的排布是无序的，因此亟需提供一种新型的叶酸和维生素B12联合检测试剂盒来解决上述问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、准确性好、方便快捷、成本低的叶酸和维生素B12联合检测试剂盒及其制备方法，能够对样本中的叶酸和维生素B12成分进行同时检测。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种叶酸和维生素B12联合检测试剂盒，包括检测卡、标准曲线对照表、样本处理液，所述检测卡包括卡壳、设置在卡壳中的测试条，所述测试条包括底板、依次粘附在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫；
所述结合垫上包被有量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的维生素B12抗体的混合物，所述硝酸纤维素膜采用纳米微球标记叶酸抗原和维生素B12抗原的方式实现两种蛋白的同时检测；所述标准曲线对照表设置在条形码或SD卡上，条形码印在卡壳的表面。
在本发明一个较佳实施例中，所述硝酸纤维素膜上依次设置有T1检测线、T2检测线、质控线，T1检测线上包被有纳米微球-叶酸抗原、T2检测线上包被有纳米微球-维生素B12抗原，质控线上包被有纳米微球-兔抗鼠IgG。
进一步的，所述T1检测线和T2检测线、T2检测线和质控线之间的间隔不小于4mm。
更进一步的，所述纳米微球为粒径100nm—200nm、无荧光的带有功能团的微球。
在本发明一个较佳实施例中，所述量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的维生素B12抗体的混合物的质量比为4：3。
进一步的，所述量子点为不同粒径的硒化镉或硫化锌量子点。
在本发明一个较佳实施例中，所述样品垫与结合垫为玻璃纤维膜。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种叶酸和维生素B12联合检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备结合垫：
首先制备叶酸单克隆抗体量子点标记液和维生素B12单克隆抗体量子点标记液，于4℃，12000g-17000g下高速离心纯化，弃去上清，得到沉淀1和沉淀2；然后将复溶后的沉淀1和沉淀2按照比例1：1-1：5混合，最后将上述混合液按照5-20μl/cm的参数直接喷涂于玻璃纤维膜上，完全干燥后得到量子点结合垫；
(2)硝酸纤维素膜包被：
首先分别制备纳米微球-叶酸标记液、纳米微球-维生素B12标记液、纳米微球-兔抗鼠IgG标记液，分别于4℃，12000g-17000g下高速离心纯化，弃去上清，得到沉淀，用含有缓冲液和糖类物质的保存液将沉淀复溶至0.5ml；其次将硝酸纤维素膜粘贴在底板上，并对贴膜后的底板进行抗体包被，T1线包被纳米微球-叶酸，T2线包被纳米微球-维生素B12，C线包被纳米微球-兔抗鼠IgG，C、T线按照包被量为1μl/cm进行划线，烘干后，得到包被的划线胶板；
(3)制备样品垫：
配制10-100mM的Tris-Hcl缓冲液，pH为8.0-9.0，其中PVP的质量分数为0.1％-1％、Tween20的质量分数为0.1％-2％、酪蛋白钠的质量分数为0.05％-0.5％，用上述缓冲液浸泡玻璃纤维膜，烘干后即为样品垫；
(4)组装：
将处理过的吸水垫、结合垫及样品垫依次粘贴在包被完成的硝酸纤维素膜及胶板上，然后斩切成试剂条；
(5)试剂盒包装：
将试剂条装入卡壳中与干燥剂一起放入铝箔袋，用热封机密封铝箔袋。
在本发明一个较佳实施例中，在步骤(2)中，纳米微球-叶酸标记液的制备方法包括以下步骤：
取纳米微球0.1-0.5mg，依次加入20mg/ml的EDC和30mg/ml的NHS，快速混匀后25-37℃反应10-30min，15000rpm离心20min弃上清，用10-50mM MES缓冲液重悬至所需体积，超声辅助混匀，得到活化的微球；
取活化后的微球，加入50-400μg的叶酸，迅速混匀25-37℃反应2-3h，再加入10μl封闭剂，搅拌均匀，37℃反应15-60min，得到纳米微球-叶酸标记液。
在本发明一个较佳实施例中，在步骤(2)中，T1线包被纳米微球-叶酸的浓度为0.1-1.2mg/ml，T2线包被纳米微球-维生素B12的浓度为0.2-1.5mg/ml，C线包被纳米微球-兔抗鼠IgG的浓度为0.1-1.5mg/ml。
本发明的有益效果是：本发明提供一种灵敏度高、准确性好、方便快捷、成本低的叶酸和维生素B12联合检测试剂盒及其制备方法，能够对样本中的叶酸和维生素B12成分进行同时检测，创新硝酸纤维素膜的蛋白包被技术，采用先将纳米微球标记蛋白，然后将复合物包被在硝酸纤维素膜上，可以降低蛋白间的位阻，使包被的蛋白量更多，由于利用了功能团进行蛋白共价标记，其蛋白相对更有序，更利于结合，实现高灵敏度、高精确度检测。
附图说明
图1是所述检测卡的结构示意图；
图2是所述试条的结构示意图；
图3是利用本发明所述检测试剂盒与罗氏测定试剂盒对叶酸样本进行符合性测试的结果示意图；
图4是利用本发明所述检测试剂盒与罗氏测定试剂盒对维生素B12样本进行符合性测试的结果示意图。
附图中各部件的标记如下：1、检测卡，11、卡壳，111、加样孔，112、观测口，12、测试条，121、底板，122、样品垫，123、结合垫，124、硝酸纤维素膜，125、吸收垫。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
请参阅图1和图2，本发明实施例包括：
一种叶酸和维生素B12联合检测试剂盒，包括检测卡1、标准曲线对照表、样本处理液。所述样本处理液的主要成分为Tris缓冲液，所述检测卡1包括卡壳11、设置在卡壳11中的测试条12，结合图2，所述测试条12包括底板121、依次粘附在底板121上的样品垫122、结合垫123、硝酸纤维素膜124、吸收垫125，本示例中，所述底板121的材质为PVC，所述样品垫122与结合垫123为玻璃纤维膜。所述吸收垫125提供吸力，吸收反应后的液体，使层析流畅。所述结合垫123上包被有量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的维生素B12抗体的混合物，所述硝酸纤维素膜124采用纳米微球标记叶酸抗原和维生素B12抗原的方式实现两种蛋白的同时检测。
优选的，所述量子点为不同粒径的硒化镉或硫化锌量子点，所述量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的维生素B12抗体的混合物的质量比为4：3。
具体的，所述硝酸纤维素膜124上依次设置有T1检测线、T2检测线、质控线，T1检测线上包被有纳米微球-叶酸抗原、T2检测线上包被有纳米微球-维生素B12抗原，质控线上包被有纳米微球-兔抗鼠IgG。所述T1检测线和T2检测线、T2检测线和质控线之间的间隔不小于4mm，便于划线，检测效果好。
所述纳米微球为粒径100nm—200nm、无荧光的带有功能团的微球。纳米微球具有无荧光单分散性能，其材质可以是聚苯乙烯微球、磁性微球、聚甲基丙烯酯甲酯微球、二氧化硅微球。本发明通过先将纳米微球标记蛋白(叶酸抗原、维生素B12)再吸附到硝酸纤维素膜上，这样可以降低蛋白间的位阻，使包被的蛋白量更多，同时利用了纳米微球的功能团进行蛋白共价标记，例如纳米微球中的羧基、甲苯磺酰基均与蛋白中的氨基进行结合，其蛋白相对更有序，更利于结合，实现高灵敏度、高精确度检测。
结合图1，所述卡壳11包括相互卡接的上卡壳、下卡壳，上卡壳上开有位于样品垫122上部的加样孔111、位于硝酸纤维素膜124上部的观测口112，硝酸纤维素膜124上的T2检测线、T1检测线、质控线C位于观测口112的中部，下卡壳的内表面设置有用于放置测试条12的卡槽。卡壳11不仅保护了试条，避免其受损污染，还起到固定的作用，使得试条不易滑动，影响测定。上下卡壳能够将测试条12固定且微微试压，结合垫123上的标记抗体和样品稀释液能够同步运行，保证液体流速均一，进一步降低CV系数，提高精密度，同时操作方便，放平直接加样即可快速测试，对操作人员无硬性技术要求。另外该卡壳11与检测设备能够配套使用，卡壳11插入该检测设备相应的通道，使得自动稳定送样检测，进一步提高检测结果的准确性，蛋白含量测定值更加精确。
所述标准曲线对照表设置在条形码或SD卡上，条形码印在卡壳11的表面，条形码或SD卡与检测设备配套使用，为导入该批次试剂盒标准曲线的作用，测出的信号值要根据标准曲线才能计算出标记蛋白浓度。
该检测试剂盒的检测原理采用竞争免疫层析法。在硝酸纤维素膜(NC膜)的检测线区分别包被叶酸和维生素B12的偶联物，在质控线处包被抗鼠的多抗，结合垫上固定量子点标记的叶酸和维生素B12的单克隆抗体混合物。在检测卡1的加样孔111加样后，样本中游离的叶酸和维生素B12可与结合垫上的量子点标记的叶酸和维生素B12单克隆抗体发生结合形成免疫复合物，经过检测线时，未结合的量子点标记物与NC膜包被的叶酸和维生素B12抗原结合而形成荧光条带，剩余的量子点标记物会被包被有抗鼠的多抗C线捕获，形成量子点荧光条带。由于样本中的叶酸和维生素B12抗原与检测线处的叶酸和维生素B12抗原存在竞争关系，因此检测线的荧光强度与样本中的含量呈现一定的负相关。仪器通过已拟定的标准曲线自动计算叶酸和维生素B12的浓度值。
本发明示例中还提供一种叶酸和维生素B12联合检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)结合垫的制备
取清洗好的量子点溶液10-1000ul，依次加入EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，EDC和NHS浓度分别配制成20mg/ml和30mg/ml，快速混匀后25-37℃反应10-30min，15000rpm离心20min弃上清，用10-50mM MES缓冲液重悬至所需体积，超声辅助混匀，得到活化的量子点溶液。取活化后的量子点溶液，加入10-40μg的叶酸单克隆抗体，迅速混匀25-37℃反应2-3h，再加入10μl封闭剂(可选用10mM-50mM的甘氨酸或质量分数为5％-30％BSA溶液)，搅拌均匀，37℃反应15-60min，得到叶酸单克隆抗体量子点标记液，于4℃，12000g-17000g下高速离心纯化，弃去上清，得到沉淀1；另取活化后的量子点溶液，加入10-50μg的维生素B12单克隆抗体，迅速混匀，25-37℃反应2-3h，再加入5μl封闭剂(可选用10mM-50mM的甘氨酸或质量分数为1％-5％酪蛋白钠溶液)，搅拌均匀，25-37℃反应15-60min，得到维生素B12单克隆抗体量子点标记液，于4℃，12000g-17000g下高速离心纯化，弃去上清，得到沉淀2；用含有PBS缓冲液(或者Tris缓冲液和硼酸缓冲液)、BSA、和糖类物质的保存液将上述沉淀1和沉淀2复溶至0.5-2ml。
将复溶后的沉淀1和沉淀2按照一定比例(1：1-1：5)混合，使用喷金仪将上述混合液按照5-20μl/cm的参数进行喷涂，直接喷涂于的玻璃纤维膜上，完全干燥后得到量子点结合垫。
(2)硝酸纤维素膜包被
2.1纳米微球标记叶酸
取纳米微球0.1-0.5mg，依次加入EDC和NHS(EDC和NHS浓度分别配制成20mg/ml和30mg/ml)，快速混匀后25-37℃反应10-30min，15000rpm离心20min弃上清，用10-50mM MES缓冲液重悬至所需体积，超声辅助混匀，得到活化的微球。取活化后的微球，加入50-400μg的叶酸，迅速混匀25-37℃反应2-3h，再加入10μl封闭剂(可选用10mM-50mM的甘氨酸或质量分数为5％-30％BSA溶液)，搅拌均匀，37℃反应15-60min，得到纳米微球-叶酸标记液，于4℃，12000g-17000g下高速离心纯化，弃去上清，得到沉淀，用含有PBS缓冲液(或者Tris缓冲液和硼酸缓冲液)和糖类物质的保存液将沉淀复溶至0.5ml。
2.2纳米微球标记维生素B12
取纳米微球0.1-0.5mg，依次加入EDC和NHS(EDC和NHS浓度分别配制成20mg/ml和30mg/ml)，快速混匀后25-37℃反应10-30min，15000rpm离心20min弃上清，用10-50mM MES缓冲液重悬至所需体积，超声辅助混匀，得到活化的微球。取活化后的微球，加入50-400μg的维生素B12，迅速混匀25-37℃反应2-3h，再加入10μl封闭剂(可选用10mM-50mM的甘氨酸或质量分数为5％-30％BSA溶液)，搅拌均匀，37℃反应15-60min，得到纳米微球-维生素B12标记液，于4℃，12000g-17000g下高速离心纯化，弃去上清，得到沉淀，用含有PBS缓冲液(或者Tris缓冲液和硼酸缓冲液)和糖类物质的保存液将沉淀复溶至0.5ml。
2.3纳米微球标记兔抗鼠IgG
取纳米微球0.1-0.5mg，依次加入EDC和NHS(EDC和NHS浓度分别配制成10mg/ml和20mg/ml)，快速混匀后25-37℃反应10-30min，15000rpm离心20min弃上清，用10-50mM MES缓冲液重悬至所需体积，超声辅助混匀，得到活化的微球。取活化后的微球，加入50-800μg的兔抗鼠IgG，迅速混匀25-37℃反应2-8h，再加入10μl封闭剂(可选用10mM-50mM的甘氨酸或质量分数为5％-30％BSA溶液)，搅拌均匀，37℃反应15-60min，得到纳米微球-兔抗鼠IgG标记液，于4℃，12000g-17000g下高速离心纯化，弃去上清，得到沉淀，用含有PBS缓冲液(或者Tris缓冲液和硼酸缓冲液)和糖类物质的保存液将沉淀复溶至0.5ml。
2.4将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，并对贴膜后的底板进行抗体包被。
T1线包被纳米微球-叶酸，浓度为0.1-1.2mg/ml，T2线包被纳米微球-维生素B12，浓度为0.2-1.5mg/ml，C线包被纳米微球-兔抗鼠IgG，浓度为0.1-1.5mg/ml。C、T线按照包被量为1μl/cm进行划线，烘干后，得到包被的划线胶板。
(3)样品垫制备
配制10-100mM的Tris-Hcl缓冲液，pH为8.0-9.0，其中PVP的质量分数为0.1％-1％、Tween20的质量分数为0.1％-2％、酪蛋白钠的质量分数为0.05％-0.5％，用上述缓冲液浸泡玻璃纤维膜，烘干后即为样品垫。
(4)组装
将处理过的吸收垫、结合垫及样品垫依次粘贴在包被完成的硝酸纤维素膜PVC胶板上，然后斩切成试剂条；
(5)试剂盒包装
将试剂条装入卡壳中与干燥剂一起放入铝箔袋，用热封机密封铝箔袋。
下面结合实施例说明该联合检测试剂盒的灵敏度、精密性等性能。
实施例1：
(a)结合垫制备：
取50ul硫化镉量子点溶液，依次加入pH 5.5 10mM MES 1ml，EDC 20mg和NHS30mg，快速混匀后于37℃反应20min；加入10μg的叶酸单克隆抗体，迅速混匀后于28℃反应2h，再加入10μl质量分数为10％BSA溶液，搅拌均匀，37℃反应20min，得到叶酸单克隆抗体量子点标记液，于4℃，15000g下离心纯化，弃去上清，得到沉淀1；取50ul量子点溶液，依次加入pH 5.5 10mM MES 1ml，EDC 20mg和NHS 30mg，快速混匀后于37℃反应15min，加入10μg的维生素B12单克隆抗体，，迅速混匀后于28℃反应2h，再加入10μl质量分数为1％酪蛋白钠溶液，搅拌均匀，37℃反应20min，得到叶酸单克隆抗体量子点标记液，于4℃，15000g下离心纯化，弃去上清，得到沉淀2；用pH为7.6 20mM PBS缓冲液含1％BSA、5％蔗糖的保存液将上述沉淀1和沉淀2复溶至0.5ml。
将复溶后的沉淀1和沉淀2按照比例1：2混合，使用喷金仪将上述混合液按照5-20μl/cm的参数进行喷涂，直接喷涂于的玻璃纤维膜上，完全干燥后得到量子点结合垫。
(b)NC膜包被：
纳米微球标记叶酸
取羧基聚苯乙烯微球0.5mg，依次加入pH 5.5 10mM MES 1ml，EDC 20mg和NHS30mg，快速混匀后于37℃反应15min。加入500μg的叶酸，迅速混匀于28℃反应3h，再加入10μl 20％BSA溶液，搅拌均匀，28℃反应60min，得到纳米微球-叶酸标记液，于4℃，16000g下高速离心纯化，弃去上清，得到沉淀，用pH为7.4 20mM PBS缓冲液含2％蔗糖的保存液复溶至0.5ml。
纳米微球标记维生素B12
取羧基聚苯乙烯微球0.5mg，依次加入pH 5.5 10mM MES 1ml，EDC 20mg和NHS30mg，快速混匀后于37℃反应15min。加入500μg的维生素B12，迅速混匀于28℃反应3h，再加入10μl 20％BSA溶液，搅拌均匀，28℃反应60min，得到纳米微球-维生素B12标记液，于4℃，16000g下高速离心纯化，弃去上清，得到沉淀，用pH为7.420mM PBS缓冲液含2％蔗糖的保存液复溶至0.5ml。
纳米微球标记兔抗鼠IgG
取羧基聚苯乙烯微球1mg，依次加入pH 5.5 5mM MES 1ml，EDC 10mg和NHS 20mg，快速混匀后于37℃反应20min。加入500μg的兔抗鼠IgG，迅速混匀于28℃反应5h，再加入10μl 50mM的甘氨酸溶液，搅拌均匀，28℃反应60min，得到纳米微球-兔抗鼠IgG标记液，于4℃，16000g下高速离心纯化，弃去上清，得到沉淀，用pH为7.8 20mM PBS缓冲液含2％蔗糖的保存液复溶至0.5ml。
将NC膜粘贴在PVC底板上，并对贴膜后的底板进行抗体包被。
T1线包被纳米微球-叶酸，浓度为0.1mg/ml，T2线包被纳米微球-维生素B12，浓度为0.2mg/ml，C线包被纳米微球-兔抗鼠IgG，浓度为0.6mg/ml。C、T线按照包被量为1μl/cm在NC膜上进行划线，烘干后，得到包被的划线胶板。
(c)样品垫制备
配制20mM的Tris-Hcl缓冲液，pH为8.0，其中PVP的质量分数为0.1％、Tween20的质量分数为0.1％％、酪蛋白钠的质量分数为0.1％，用上述缓冲液浸泡玻璃纤维膜，烘干后即为样品垫。
(d)组装
将吸水纸、处理过的结合垫及样品垫依次粘贴在包被完成的NC膜PVC胶板上，然后斩切成4mm的试剂条；
对比例1：
与实施例1不同的地方在于，直接用pH为7.4 20mM PBS缓冲液含2％蔗糖的保存液稀释叶酸至0.1mg/ml，稀释维生素B12至0.2mg，用pH为7.8 20mM PBS缓冲液含2％蔗糖的保存液稀释兔抗鼠IgG至0.6mg/ml，按照包被量为1μl/cm在NC膜上进行划线，烘干后，得到包被的划线胶板。其他工序与实施例1相同。
实施例2：
本实施例与实施例1不同的地方在于，采用的硫化镉量子点制备叶酸抗体、维生素B12抗体标记的过程中，加入抗体后反应时间为4小时，其他同实例1。
实施例3：
本实施例与实施例1不同的地方在于，NC膜制备采用聚苯乙烯微球标记叶酸、维生素B12和兔抗鼠IgG的过程中加入叶酸、维生素B12和兔抗鼠IgG的量为250ug，其他工序与实施例1相同。
实施例4：性能试验
灵敏度检测
将叶酸校准品稀释250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8125ng/ml、3.90625ng/ml，
将维生素B12校准品稀释1500pg/ml、750pg/ml、375pg/ml、187.5pg/ml、93.75pg/ml、46.875pg/ml、23.4375pg/ml，
用移液器取80ul待检测样品垂直缓慢加入检测卡的加样口，15分钟后用量子点荧光检测仪进行测试，测试结果如下表。
表1
表2
结果显示：相比对比例，实施例1的信噪比更高，灵敏度更好。
精密性检测
取浓度分别为100pg/ml和1000pg/ml的VB12样品以及10ng/ml和100ng/ml叶酸样品，采用不同时间制备得到的3个批次的测定试剂盒，每次重复检测三次，然后计算本发明实施例1试剂盒的批内和批间差。
结果显示：叶酸以及维生素B12测试的批内和批间差小于10％，表示该试剂盒的精密度良好。
临床样本符合性测试
取150例叶酸和维生素B12样本分别用本发明的检测试剂盒以及罗氏测定试剂盒进行测试。结果如下表，其相关性分别为0.9668和0.946，相关性非常好。
测试结果如图3和图4所示，R2(相关性程度)良好。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (10)
1.一种叶酸和维生素B12联合检测试剂盒，其特征在于，包括检测卡、标准曲线对照表、样本处理液，所述检测卡包括卡壳、设置在卡壳中的测试条，所述测试条包括底板、依次粘附在底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫；
所述结合垫上包被有量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的维生素B12抗体的混合物，所述硝酸纤维素膜采用纳米微球标记叶酸抗原和维生素B12抗原的方式实现两种蛋白的同时检测；所述标准曲线对照表设置在条形码或SD卡上，条形码印在卡壳的表面。
2.根据权利要求1所述的叶酸和维生素B12联合检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上依次设置有T1检测线、T2检测线、质控线，T1检测线上包被有纳米微球-叶酸抗原、T2检测线上包被有纳米微球-维生素B12抗原，质控线上包被有纳米微球-兔抗鼠IgG。
3.根据权利要求2所述的叶酸和维生素B12联合检测试剂盒，其特征在于，所述T1检测线和T2检测线、T2检测线和质控线之间的间隔不小于4mm。
4.根据权利要求1或2所述的叶酸和维生素B12联合检测试剂盒，其特征在于，所述纳米微球为粒径100nm—200nm、无荧光的带有功能团的微球。
5.根据权利要求1所述的叶酸和维生素B12联合检测试剂盒，其特征在于，所述量子点标记的叶酸抗体和量子点标记的维生素B12抗体的混合物的质量比为4：3。
6.根据权利要求1或5所述的叶酸和维生素B12联合检测试剂盒，其特征在于，所述量子点为不同粒径的硒化镉或硫化锌量子点。
7.根据权利要求1所述的叶酸和维生素B12联合检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫与结合垫为玻璃纤维膜。
8.一种叶酸和维生素B12联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备结合垫：
首先制备叶酸单克隆抗体量子点标记液和维生素B12单克隆抗体量子点标记液，于4℃，12000g-17000g下高速离心纯化，弃去上清，得到沉淀1和沉淀2；然后将复溶后的沉淀1和沉淀2按照比例1：1-1：5混合，最后将上述混合液按照5-20μl/cm的参数直接喷涂于玻璃纤维膜上，完全干燥后得到量子点结合垫；
(2)硝酸纤维素膜包被：
首先分别制备纳米微球-叶酸标记液、纳米微球-维生素B12标记液、纳米微球-兔抗鼠IgG标记液，分别于4℃，12000g-17000g下高速离心纯化，弃去上清，得到沉淀，用含有缓冲液和糖类物质的保存液将沉淀复溶至0.5ml；其次将硝酸纤维素膜粘贴在底板上，并对贴膜后的底板进行抗体包被，T1线包被纳米微球-叶酸，T2线包被纳米微球-维生素B12，C线包被纳米微球-兔抗鼠IgG，C、T线按照包被量为1μl/cm进行划线，烘干后，得到包被的划线胶板；
(3)制备样品垫：
配制10-100mM的Tris-Hcl缓冲液，pH为8.0-9.0，其中PVP的质量分数为0.1％-1％、Tween20的质量分数为0.1％-2％、酪蛋白钠的质量分数为0.05％-0.5％，用上述缓冲液浸泡玻璃纤维膜，烘干后即为样品垫；
(4)组装：
将处理过的吸水垫、结合垫及样品垫依次粘贴在包被完成的硝酸纤维素膜及胶板上，然后斩切成试剂条；
(5)试剂盒包装：
将试剂条装入卡壳中与干燥剂一起放入铝箔袋，用热封机密封铝箔袋。
9.根据权利要求8所述的叶酸和维生素B12联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，纳米微球-叶酸标记液的制备方法包括以下步骤：
取纳米微球0.1-0.5mg，依次加入20mg/ml的EDC和30mg/ml的NHS，快速混匀后25-37℃反应10-30min，15000rpm离心20min弃上清，用10-50mM MES缓冲液重悬至所需体积，超声辅助混匀，得到活化的微球；
取活化后的微球，加入50-400μg的叶酸，迅速混匀25-37℃反应2-3h，再加入10μl封闭剂，搅拌均匀，37℃反应15-60min，得到纳米微球-叶酸标记液。
10.根据权利要求8所述的叶酸和维生素B12联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，T1线包被纳米微球-叶酸的浓度为0.1-1.2mg/ml，T2线包被纳米微球-维生素B12的浓度为0.2-1.5mg/ml，C线包被纳米微球-兔抗鼠IgG的浓度为0.1-1.5mg/ml。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105445449A (zh) * | 2015-04-04 | 2016-03-30 | 吉林双正医疗科技有限公司 | 唾液尿酸快速半定量检测装置及其制备方法 |
| CN108761103A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-11-06 | 宁波奥丞生物科技有限公司 | 一种检测叶酸的免疫荧光法试剂盒 |
| CN110346578A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-10-18 | 安徽惠邦生物工程有限公司 | 用于胰岛素样生长因子结合蛋白-1和胎儿纤维连接蛋白含量的联合定量检测系统 |
| CN111638363A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-09-08 | 吉林省格瑞斯特生物技术有限公司 | 3-脱氧果糖快速定量荧光检测装置及其制备方法 |
| CN214409004U (zh) * | 2021-06-02 | 2021-10-15 | 北京易斯威特生物科技股份有限公司 | 一种孕期营养因子联合检测试剂盒 |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105445449A (zh) * | 2015-04-04 | 2016-03-30 | 吉林双正医疗科技有限公司 | 唾液尿酸快速半定量检测装置及其制备方法 |
| CN108761103A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-11-06 | 宁波奥丞生物科技有限公司 | 一种检测叶酸的免疫荧光法试剂盒 |
| CN110346578A (zh) * | 2019-06-06 | 2019-10-18 | 安徽惠邦生物工程有限公司 | 用于胰岛素样生长因子结合蛋白-1和胎儿纤维连接蛋白含量的联合定量检测系统 |
| CN111638363A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-09-08 | 吉林省格瑞斯特生物技术有限公司 | 3-脱氧果糖快速定量荧光检测装置及其制备方法 |
| CN214409004U (zh) * | 2021-06-02 | 2021-10-15 | 北京易斯威特生物科技股份有限公司 | 一种孕期营养因子联合检测试剂盒 |
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