CN111638363A - 3-脱氧果糖快速定量荧光检测装置及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种3‑脱氧果糖快速定量荧光检测装置及其制备方法，属于医疗检测领域。由固相有3‑脱氧果糖‑载体蛋白和羊抗鼠IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜、吸附有免疫荧光微球标记3‑脱氧果糖抗体的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。采用聚乙二醇丙三醇处理液对硝酸纤维素膜进行预处理，将载体蛋白‑3‑脱氧果糖先与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合再吸附到硝酸纤维素膜上，并配制合适的缓冲液和样品垫处理液，在保证免疫荧光微球释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫荧光微球的用量，节约成本，又没有增加生产操作的复杂度。检测试纸灵敏度高、特异性强、操作简便省时、实用性强。

Description

3-脱氧果糖快速定量荧光检测装置及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗检测设备领域，特别涉及3-脱氧果糖快速定量检测装置及其制备方法，利用免疫荧光层析技术以及竞争法原理定量检测全血、血清、血浆或尿液标本中3-脱氧果糖含量的检测装置及其制备方法，可实现3-脱氧果糖的快速检测，且灵敏度高、特异性强。
背景技术
我国高血糖发生率逐年升高，糖尿病患者群体逐年扩大；糖尿病并发症，比如糖尿病心血管病、糖尿病足、糖尿病肾病、糖尿病眼病等，给人类造成了极大损伤和经济负担；如何在这些并发症来临之前我们就可以及早发现，已经成为医学界关注的热点和研究的热点；本发明涉及的产品就是针对糖尿病引发的相关并发症进行早期预警和诊断的临床诊断工具。
大量文献报道，糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGE)在血管疾病的发生发展中起着重要作用。AGE的形成又称为非酶糖基化反应，是指体内蛋白质自发地与葡萄糖或其他还原单糖反应生成的稳定的共价化合物。该过程主要分为三个步骤:首先是游离氨基与糖分子中的醛基反应形成Schiff碱，然后Schiff碱发生重排产生可逆的早期糖基化产物———Amadori产物，最后Amadori产物再发生复杂的分子重排，形成不可逆的糖基化终末产物。
最近大量证据表明，体内糖基化终末产物的不断累积与其心血管疾病的发生和发展关系密切。糖基化终末产物可使蛋白质分子结构和功能性质发生改变，如糖基化终末产物可以使结缔组织的胶原蛋白发生交联而使血管和韧带变硬；使血清蛋白沉积于基底膜而增厚；糖基化终末产物修饰蛋白可被内皮细胞识别和摄取，使血管通透性增加，内皮细胞表面的抗凝物凝血调节蛋白减少，促血凝的组织因子合成增加；内皮细胞损害之后，一氧化氮产生减少而灭活增加，使血管舒张反应性降低，血管收缩而影响组织器官的血液输送。终末期肾衰患者血液中的糖基化终末产物浓度增加，糖基化终末产物修饰β2微球蛋白增加，糖基化终末产物交联戊糖苷增加，均可加重组织损毁。大量研究表明，糖基化终末产物在动脉粥样硬化、糖尿病血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、尿毒症和血管性勃起功能障碍、阿尔茨海默病等多种疾病和衰老的发生发展过程中起着重要的作用；可通过及时、动态进行检测AGE，进行相关疾病的预警、筛查和诊断。糖基化终末产物(AGE)形成过程为：首先，生物大分子(蛋白质)末端的还原性氨基与葡萄糖分子中的醛基进行缩合，从而形成可逆的席夫碱,反应迅速且高度可逆。形成的席夫碱的数量主要取决于葡萄糖的浓度,当葡萄糖被清除、浓度下降时,席夫碱将在数分钟内发生逆转。也就是说，这个阶段，血糖浓度越高的人形成的席夫碱就越多；几天之后,不稳定的席夫碱逐渐发生Amadori重排，然后就形成相对稳定的醛胺类产物,此过程发生得较为缓慢,但是因为Amadori产物能在蛋白质上积聚,并在几周之内达到平衡，这个时候，葡萄糖对蛋白质的损害就已经显现出来了，这俩过程的产物统称为早期糖基化产物；Amadori产物再经过一系列重新排列、脱水、缩合、交联产生不可逆转的高糖化终末产物，让很多蛋白质丧失掉原有的功能。
因此糖基化终末产物(AGE)的检测显然成为医学界非常重要的事情、也是医学工作者研究的热点，但不论采用什么技术方法去直接检测糖基化终末产物(AGE)，结果都不理想，无法达到临床预防和诊断的目的，直接原因就是糖基化终末产物(AGE)的结构不明且呈多样化；研究表明糖基化终末产物(AGE)形成过程中，有个中间产物3-脱氧葡糖松，它和糖基化终末产物(AGE)的浓度是一致的；而它在体内又被还原成无活性的3-脱氧果糖；所以测定人血浆和尿液中的3-脱氧果糖值就可以直接反应出体内糖基化终末产物(AGE)值。
免疫荧光层析法利用了具有独特荧光特性的3价稀土离子及其螯合物为示踪物代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质等，标记抗体或抗原，待抗原抗体反应发生后，用特定检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。此技术方法由于其低本底，高灵敏度和特异性，荧光寿命长，无放射性同位素污染等特点，自20世纪80年代Pettersson和Eskola等人首次报到后得到了迅速发展，并且广泛应用于临床疾病诊断。
在免疫荧光层析检测中，荧光抗体的淬灭及抗体包被浓度影响实验结果。蛋白质固着于硝酸纤维素膜(NC膜)作为待测样本的捕获试剂。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在膜上均一、良好的吸附对胶体金检测结果非常重要。如果NC膜上结合的蛋白量不足或者蛋白结合力不够强，就会出现相当多的问题，在检测结果的检测线上非常明显。如果膜上结合的蛋白量太低，那么在结果中检测线显色较弱而且检测灵敏度降低。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜以前发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释。在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，难以解释检测结果。
发明内容
本发明提供一种3-脱氧果糖快速定量检测装置及其制备方法，以解决不借用大型仪器就不能实现3-脱氧果糖浓度检测、和现有技术存在的荧光易淬灭和NC膜吸附蛋白量不足、结合力不强的问题。本发明制备的3-脱氧果糖快速定量检测装置，可实现3-脱氧果糖的灵敏、特异、快速检测，提高了对糖尿病症患者进行糖代谢的合理综合判定，能够快速、准确进行糖尿病早期预警及病情风险判断。由固相有纯化3-脱氧果糖-载体蛋白和羊抗兔IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜、吸附有荧光微球标记兔抗3-脱氧果糖抗体的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成。可实现3-脱氧果糖的灵敏、特异、快速检测。
本发明采取的技术方案是：3-脱氧果糖快速定量检测装置：样品垫1、免疫荧光抗体玻璃纤维膜2、免疫硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述免疫硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫荧光抗体玻璃纤维膜2搭接，所述免疫荧光抗体玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述免疫硝酸纤维素膜3上设置检测线T和质控线C，所述的检测线T上固相有3氧果糖-载体蛋白；或所述的第一检测线T线固相3脱氧果糖-载体蛋白，所述的质控线C上喷点羊抗兔IgG多克隆抗体；所述的检测线T上固相有3脱氧果糖-载体蛋白，该3-脱氧果糖-载体蛋白是指：卵清蛋白OVA、或牛血清白蛋白BSA、或血蓝蛋白KLH。
本发明3-脱氧果糖快速定量检测装置的制备方法，包括下列步骤：
(a)免疫荧光微球的制备，取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍，即1000ul，加入到EP管中，取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液EDC加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时，将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min，倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀；
(b)活化的免疫荧光微球交联标记3-脱氧果糖抗体，取1ml活化后的免疫荧光微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，大约反应30s-120s后，再到超声波上超声20-40秒，然后再反应1小时，加牛血清白蛋白BSA进行封闭1小时。将封闭好的微球进行离心，速度为10000r/min,15min，将免疫荧光微球缓冲液加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用；
(c)采用缓冲液稀释步骤(b)的免疫荧光微球交联标记抗体获得免疫荧光抗体溶液，用免疫荧光抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫荧光抗体玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理后，喷点与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合的载体蛋白-3脱氧果糖作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫荧光抗体玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
本发明步骤(b)所述的缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％。
本发明步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理是：用聚乙二醇丙三醇处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
本发明步骤(d)所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合3脱氧果糖-载体蛋白是：以油酸修饰的ZnS作为载体，取1mL载体蛋白-3脱氧果糖溶液，搅拌1小时后，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，去离子水各洗2遍。
本发明步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇和多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸(SIGMA,150KD～300KD)、PEG20000混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明步骤(d)所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备方法：取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中。水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间。待反应结束，降温至50℃，取出产物。用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
本发明步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂(烷基酚聚氧乙烯醚)组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂浓度为0.5～1％。
本发明制备的3-脱氧果糖快速定量检测装置可检测患者血液和尿液3-脱氧果糖含量，对临床糖尿病患者的体内血糖水平监测具有重要意义。
本发明由固相有纯化的3-脱氧果糖-载体蛋白(检测线T)和羊抗兔IgG抗体(质控线)的硝酸纤维素膜、吸附有免疫荧光微球标记3-脱氧果糖抗体的玻璃纤维、样品垫、吸水纸等其它辅料粘贴制成，具有特异、快速、灵敏的特点。
乙二醇与环氧氯丙烷用碱催化，其反应产物用稀盐酸中和、四氯化碳萃取减压蒸馏得到聚乙二醇丙三醇(PEGG)为淡黄色粘稠物。PEGG能与水以任意比例混溶，也能溶于一般的有机溶剂如乙醇、丙酮、四氢呋喃、氯仿，有一定的表面活性。聚乙二醇丙三醇的结构中含有多个羟基可供偶联,活化过程简单，方便NC膜表面固定蛋白。常规条件下，单位面积的NC膜上结合抗体的数量是有限的，采用聚乙二醇丙三醇处理之后，可以让单位面积的NC膜上结合抗体数量增加，进而可以实现更高的检测灵敏度。
在改善NC膜对蛋白吸附基础上，探讨蛋白对NC膜吸附效果也是提高本发明涉及产品灵敏度的另一途径。油酸或十二烷基硫酸钠修饰的ZnS不仅具有纳米级的粒径尺寸、且具有良好的水溶性与生物相容性，利用其外表面的功能性基团，在水介质中均匀分散，可与生物大分子相结合。油酸修饰的硫化锌纳米颗粒具有较好的稳定性、易于制备、生物相容性较好及较低的免疫原性等优势，在生物医学领域研究较为广泛。但在免疫荧光层析技术中尚未有报道应用。本研究探讨了油酸修饰的硫化锌纳米颗粒对NC膜包被抗体的影响，先将划膜用的抗体先与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合，封闭，离心纯化，去掉未结合的抗体，然后复溶到一定比例，然后划膜，这样一个油酸修饰的硫化锌纳米颗粒可以结合多个抗体，从而增加了包被抗体效率，灵敏度也会大大提高。
为了提高免疫荧光层析技术的灵敏度，我们通过对硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液进行了预处理，将包被NC的抗体与硫化锌纳米颗粒结合，达到了提高试纸灵敏度的目的。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的检测装置结构新颖，将3-脱氧果糖-载体蛋白吸附到油酸修饰的硫化锌纳米颗粒后包被于硝酸纤维膜膜上，特异性强，也没有增加生产操作的复杂度。
2、免疫荧光抗体制备步骤中，通过配合合适的缓冲液和样品垫处理液，可保证免疫荧光抗体释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫荧光微球的用量，节约成本。
3、本发明对包被蛋白的硝酸纤维素膜进行预处理，降低荧光淬灭，同时提高了检测试纸灵敏度、特异性。
4、本发明的检测装置操作简便，不需要专业人员操作，实用性强。
附图说明
图1是本发明的结构示意图；
图2是图1的A-A剖视图。
具体实施方式
实施例1：
样品垫1、免疫荧光抗体玻璃纤维膜2、免疫硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述免疫硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫荧光抗体玻璃纤维膜2搭接，所述免疫荧光抗体玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述免疫硝酸纤维素膜3上设置检测线T和质控线C，所述的检测线T上固相有3氧果糖-载体蛋白；或所述的第一检测线T线固相3脱氧果糖-载体蛋白，所述的质控线C上喷点羊抗兔IgG多克隆抗体；所述的检测线T上固相有3脱氧果糖-载体蛋白，该3-脱氧果糖-载体蛋白是指：卵清蛋白OVA、或牛血清白蛋白BSA、或血蓝蛋白KLH。
制备方法：
1、免疫荧光微球的制备，取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍,即1000ul，加入到EP管中，取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液(EDC)加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时。将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min。倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀；
2、活化的微球交联抗体，取1ml活化后的微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体。加入抗体后，大约反应1min后，再到超声波上超声30秒左右，然后再反应1小时，加BSA进行封闭1小时。将封闭好的微球进行离心，速度为10000r/min,15min。将保存液加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用。
3、采用优化的荧光抗体缓冲液稀释荧光抗体获得免疫荧光抗体溶液，用免疫荧光抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫荧光玻璃纤维膜；所述的荧光抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、BSA浓度为1％，pH为8.5；
4、固相硝酸纤维素膜
1)聚乙二醇丙三醇处理液预处理硝酸纤维素膜
配制聚乙二醇丙三醇处理液：聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
聚乙二醇丙三醇处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入聚乙二醇丙三醇处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)硫化锌纳米颗粒修饰3脱氧果糖-载体蛋白
油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备：取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中。水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间。待反应结束，降温至50℃，取出产物。用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
硫化锌纳米颗粒修饰3脱氧果糖-载体蛋白：
以油酸修饰的ZnS作为载体，取1mL3脱氧果糖-载体蛋白溶液，搅拌1小时后，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，去离子水各洗2遍。
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.4μl/cm，将硫化锌纳米颗粒3脱氧果糖-载体蛋白稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
4)样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
5、将预处理的样品垫、免疫荧光玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
6、定量检测：通过荧光定量检测仪检测，本检测装置检测3-脱氧果糖最低检测值：1ng/ml。
实施例2
配制聚乙二醇丙三醇处理液：由聚乙二醇丙三醇和多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.7％、酪蛋白浓度为0.15％、表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚浓度为0.7％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
其余同实施例1。
实施例3
配制聚乙二醇丙三醇处理液：由聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸(SIGMA,150KD)与PEG2000混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
样品垫预处理
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其种样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为1％、酪蛋白浓度为0.2％、表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚浓度为1％，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
其余同实施例1。
下边通过实验来进一步说明本发明的效果。
实验例1
1、聚乙二醇丙三醇处理液对硝酸纤维素膜抗淬灭能力的比较
1.1材料与方法
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司
1.2硝酸纤维素膜处理方法
1.2.1配制聚乙二醇丙三醇处理液
配制三种聚乙二醇丙三醇处理液：聚乙二醇丙三醇组，聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％组成；聚乙二醇丙三醇处理液多聚赖氨酸组，聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％；聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸和PEG20000组，，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，三组处理液均经0.22μm滤膜过滤，备用。
1.2.2硝酸纤维素膜处理方法
将硝酸纤维素膜放入聚乙二醇丙三醇处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
1.3实验方法
分别将未处理和已处理过的硝酸纤维素膜按照上述实施例工艺流程制备3-脱氧果糖荧光微球检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硝酸纤维素膜未处理和处理后荧光指标差异。
1.4结果:
1.4.1荧光强度比较
取处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察荧光显色情况判断处理后膜对荧光淬灭能力的影响，结果见表1。结果显示，处理后的硝酸纤维素膜在溶液浸润性方面要明显优于未处理膜，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明荧光淬灭能力降低，提高了反应灵敏度。
表1硝酸纤维素膜荧光淬灭能力比较
Figure BDA0002477295980000091
1.4.2硝酸纤维素膜稳定性比较
取聚乙二醇丙三醇处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察实验数据来判断处理后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表2。表2结果与表1结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表2硝酸纤维素膜加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0002477295980000101
实验例2：
2、硫化锌纳米颗粒修饰3-脱氧果糖-载体蛋白
2.1材料与方法
2.1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司
2.1.2硫化锌纳米颗粒修饰载体蛋白-3-脱氧果糖
2.1.2油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备
取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中。水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间。待反应结束，降温至50℃，取出产物。用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
2.2实验方法
分别将硫化锌纳米颗粒修饰的3-脱氧果糖-载体蛋白与未修饰的3-脱氧果糖-载体蛋白按照上述实施例工艺流程制备3-脱氧果糖检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硫化锌纳米颗粒处理和未处理对蛋白吸附力和稳定性指标差异。
2.3结果
2.3.1蛋白吸附力比较
取硫化锌纳米颗粒处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察显色情况判断处理后膜对蛋白吸附能力，结果见表3。结果显示，硫化锌纳米颗粒修饰组膜尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。
表3石墨纳米颗粒修饰对蛋白吸附能力比较
Figure BDA0002477295980000111
2.3.2稳定性比较
取硫化锌纳米颗粒处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断硫化锌修饰后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表4。表4结果与表3结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表4加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0002477295980000112
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种3-脱氧果糖快速定量荧光检测装置，其特征在于：样品垫(1)、免疫荧光抗体玻璃纤维膜(2)、免疫硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)分别粘贴在塑料板(5)，所述免疫硝酸纤维素膜(3)的两端分别与吸收垫(4)、免疫荧光抗体玻璃纤维膜(2)搭接，所述免疫荧光抗体玻璃纤维膜(2)的另一端与样品垫(1)搭接；所述免疫硝酸纤维素膜(3)上设置检测线(T)和质控线(C)，所述的检测线(T)上固相有3-脱氧果糖-载体蛋白；所述的质控线(C)上喷点羊抗兔IgG多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的3-脱氧果糖快速定量检测装置，其特征在于：所述的检测线(T)上固相有3-脱氧果糖-载体蛋白，该3-脱氧果糖-载体蛋白是指：卵清蛋白(OVA)、或牛血清白蛋白(BSA)、或血蓝蛋白(KLH)。
3.如权利要求1或2所述的3-脱氧果糖快速定量检测装置的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：
(a)免疫荧光微球的制备，取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍,即1000ul，加入到EP管中，取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液EDC加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时，将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min，倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀；
(b)活化的免疫荧光微球交联标记3-脱氧果糖抗体，取1ml活化后的免疫荧光微球悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，大约反应30s-120s后，再到超声波上超声20-40秒，然后再反应1小时，加牛血清白蛋白BSA进行封闭1小时，将封闭好的微球进行离心，速度为10000r/min,15min，将免疫荧光微球缓冲液加入到离心后的微球中，使微球分散均匀，待用；
(c)采用缓冲液稀释步骤(b)的免疫荧光微球交联标记抗体获得免疫荧光抗体溶液，用免疫荧光抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫荧光抗体玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理后，喷点与油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合的载体蛋白-3脱氧果糖作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫荧光抗体玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
4.根据权利要求3所述的3-脱氧果糖快速定量检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(b)所述的缓冲液由Tris-HCL液、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白BSA组成，pH值8.5，其中Tris-Hcl浓度为0.02mol/L，蔗糖浓度为5～20％，海藻糖浓度为1～5％，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％。
5.根据权利要求3所述的3-脱氧果糖快速定量检测装置的制备方法，其特征在在于：步骤(d)所述的将硝酸纤维素膜用聚乙二醇丙三醇处理液预处理是：用聚乙二醇丙三醇处理液浸泡硝酸纤维素膜1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
步骤(d)所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒结合载体蛋白-3脱氧果糖是：以油酸修饰的ZnS作为载体，取1mL3脱氧果糖-载体蛋白溶液，搅拌1小时后，分别以12000rpm，8500rpm和7000rpm离心10分钟收集，去离子水各洗2遍。
6.根据权利要求3或5所述的3-脱氧果糖快速定量检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇稀释到浓度为0.5％组成，经0.22μm滤膜过滤，备用。
7.根据权利要求3或5所述的3-脱氧果糖快速定量检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇和多聚赖氨酸SIGMA,150KD～300KD混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
8.根据权利要求3或5所述的3-脱氧果糖快速定量检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的聚乙二醇丙三醇处理液由聚乙二醇丙三醇、多聚赖氨酸SIGMA,150KD～300KD、PEG20000混合组成，其中聚乙二醇丙三醇浓度为0.5％，多聚赖氨酸浓度为0.5％，PEG20000浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
9.根据权利要求3或5所述的3-脱氧果糖快速定量检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(d)所述的油酸修饰的硫化锌纳米颗粒制备方法：取油酸无水乙醇溶液15ml加入到15ml浓度为0.3mol/L的醋酸锌水溶液中，40℃水浴搅拌，用氨水调节pH值，再加入15ml浓度为0.3mol/L的硫化钠水溶液，反应5min后，加入5ml SDS水溶液，待混合均匀后，将该反应液倒入90ml水热釜中，水热釜密闭后放入恒温干燥箱内，在一定温度下恒温反应一定时间，待反应结束，降温至50℃，取出产物，用丙酮，去离子水，乙醇洗涤，离心分离，在50℃下真空干燥2h得到粉体ZnS，存放待用。
10.根据权利要求3所述的3-脱氧果糖快速定量检测装置的制备方法，其特征在于：步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液由Tris-HCL液、牛血清白蛋白BSA、酪蛋白、表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚组成，其中Tris-HCL液浓度为0.1mol/L，牛血清白蛋白BSA浓度为0.5～1％，酪蛋白浓度为0.1～0.2％、表面活性剂浓度为0.5～1％。
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