CN115015563B - MPO、cTnI或cTnT、IMA的联合检测装置及制备方法 - Google Patents

MPO、cTnI或cTnT、IMA的联合检测装置及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种MPO、cTnI或cTnT、IMA的联合检测装置及制备方法，属于医疗检测装置领域。样品垫、免疫胶体金抗体玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸收垫分别粘贴在塑料板，免疫硝酸纤维素膜上设置第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3和质控线C；检测线上分别固相有高特异性MPO、cTnI或cTn和IMA抗体。设计了氧化锌‑壳聚糖‑胶体金，提高了抗体标记效率，反应的灵敏度，稳定性和精准度；对包被硝酸纤维素膜的抗体进行了修饰，提高抗体的包被效率、增强硝酸纤维素膜吸附效果、蛋白分布更加均一，从而提高了免疫层析方法学的灵敏度、精准度和稳定性，本发明的检测装置操作简便，实用性强。

Description

MPO、cTnI或cTnT、IMA的联合检测装置及制备方法
技术领域
本发明涉及医疗检测装置领域，特别涉及一种心肌标志物的联合检测装置及其制备方法，利用胶体金免疫层析技术以及双抗体夹心法原理定量检测临床标本(全血、或血清、或血浆)中髓过氧化物酶(MPO)、心肌肌钙蛋白(cTnI或cTnT)和缺血修饰白蛋白(IMA)的检测装置及其制备方法，可实现心肌标志物的灵敏、特异和快速检测。
背景技术
急性心肌梗塞(AMI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，严重威胁人类健康。对心肌梗塞预警、快速诊断及有效治疗评价是降低病人死亡率的关键。对于无典型胸痛和心电图改变不明显的心肌梗死患者，仅依靠心电图、超声心动图和心脏核磁共振，难以准确诊断。因此，检测血清心肌标志物是诊断AMI的必要依据。
动脉粥样硬化的发病机制是一种多因素导致的慢性炎症反应过程。MPO的释放是中性粒细胞活化的标志，是由活化中性粒细胞所形成的重要的过氧化物酶类，在心血管疾病的发生和发展中，从早期内皮障碍到形成粥样硬化斑块，炎性反应贯穿整个过程，炎症时激活的中性粒细胞发生脱颗粒并释放髓过氧化物酶(MPO)，它能导致冠状动脉粥样硬化病灶不稳定甚至是破裂，使血管内皮下胶原组织暴露，随之发生血小板粘附聚集和血栓形成，造成冠状动脉阻塞，发生急性冠状动脉综合症，甚至是严重的心肌不可逆缺血损伤。近年来的临床研究资料提示髓过氧化酶等标志物变化与急性冠脉综合征患者的诊断和预后相关，是新一代早期预警心脏生物标示物。髓过氧化物酶(MPO)是冠状动脉粥样硬化病灶不稳定和中性白细胞应激的标志物，也是早期预警信号。大量临床研究资料表明，急性冠状动脉综合症的病人血清中髓过氧化物酶水平显著地升高，是预测冠心病患者发生不良心血管事件的一个新的预测因子。
心肌梗死是冠状动脉闭塞，血流中断，部分心肌因严重的持续性缺血而发生局部坏死。临床上典型的症状是剧烈而持久的胸骨后疼痛，伴有发热，心肌损伤性蛋白升高及进行性心电图变化。心梗常见的原因是由于供应心肌的冠状动脉内长有粥样化硬块等导致血管狭窄，以至闭塞，使之供血的部分心肌组织细胞缺血而坏死。由于心肌肌钙蛋白(cTnI或cTnT)的心脏特异性，及其在心脏受损后的快速及长时期升高，可作为一种诊断心肌损伤性疾病，特别是诊断心肌梗死的首选标志物。心肌肌钙蛋白(cTnI或cTnT)为心肌组织特有的一种调节蛋白，可抑制肌球蛋白与肌动蛋白结合，在心肌收缩过程中起重要作用。大量研究表明，在急性心肌梗死(AMI)早期cTnI或cTnT水平变化幅度较大，具有较高的敏感性，且cTnI或cTnT不在任何类型的骨骼肌中表达，具有较高的心肌细胞特异性。cTnI或cTnT诊断心肌梗塞的特异性为96％，敏感性为97％。因此，cTnI或cTnT是心肌细胞损伤最敏感和最特异性的血清标志物之一，加之cTnI或cTnT具有诊断阈值明确、窗口期宽以及检测快速等优点，已逐渐判断AMI患者心肌细胞损伤的主要生化指标。目前，心肌肌钙蛋白(cTnI或cTnT)主要用于心肌缺血损伤的临床诊断、危险性评估和预后判断。
缺血修饰白蛋白(IMA)是一种新的较为理想的缺血标志物，它是第一个被美国食品药品管理局批准销售的心肌缺血标志物。利用白蛋白-钴结合试验检测IMA含量，作为检测早期心肌缺血的指标。多方面研究证明，IMA可敏感地反映心肌缺血状况，在急性冠状动脉综合征的早期诊断、危险分层、指导治疗等方面有重要意义，是目前较为理想的检测心肌缺血的生化标志物。在缺血、再灌注发生时，由于自由基等破坏了血清白蛋白的氨基酸序列，而导致白蛋白与过渡金属的结合能力改变，这种因缺血而发生与过渡金属结合能力改变的白蛋白则称IMA。最近研究发现IMA在心肌坏死指标均阴性时，缺血修饰白蛋白表现出极高的敏感性，能在血液中被检测出。也就是说，IMA诊断心肌缺血的敏感性很高，能在心肌缺血早期可逆阶段被检出，因此IMA成为多国批准销售的心肌缺血标志物。IMA可及心电图正常的胸痛患者心肌缺血的排除诊断，但IMA不能鉴别心肌梗死和心肌缺血，因此现在主张对急性冠脉综合征患者同时检测IMA和心肌肌钙蛋白，因为两者联合使用可提高心肌梗死的灵敏度并使确诊时间提前。
目前检测MPO、cTnI或cTnT、IMA的方法主要有酶联免疫法、化学发光法、免疫比浊法等。胶体金免疫层析法需要标本量少，简便快速，适合于急性心肌梗死的快速检测，不受时间、地点的限制。纵观已有产品和文献报道，均为检测或预警心肌梗塞的某个阶段，而不能全面地、特异性地预警心肌梗塞的发生、发展全程，亟待改进。
胶体金免疫层析技术(gold immunochromatography assay，GICA)是一种将胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的固相膜免疫分析技术。胶体金免疫层析技术是一种常用的免疫层析检测方法，由于其操作简单、省时、制造成本较低、结果易判读等特点，非常适合于现场检测，广泛用于生物、医药、食品等领域。由于胶体金免疫层析技术是一步完成检测，因此检测过程的干扰因素较多，其灵敏度低是限制胶体金免疫层析应用范围的主要因素，传统的胶体金免疫层析技术的检测限高于ELISA等方法。
在胶体金免疫层析检测中，蛋白质固着于硝酸纤维素膜(NC膜)作为待测样本的捕获试剂。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在膜上均一、良好的吸附对胶体金检测结果非常重要。蛋白质固着于硝酸纤维素膜(NC膜)作为待测样本的捕获试剂。在实际应用过程中会硝酸纤维素膜出现“咖啡环效应”，即抗原的识别区域呈现边缘浓度远高于中间浓度的不均匀现象，导致所得印迹常常呈现环状，非常不利于进行后续的准确定量分析。一般而言，“咖啡环效应”的影响随着抗原浓度的降低而愈发明显。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在膜上均一、良好的吸附对胶体金检测结果非常重要。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释。在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，难以解释检测结果。
发明内容
本发明提供一种MPO、cTnI或cTnT、IMA的联合检测装置及制备方法，以解决现有技术存在的NC膜吸附蛋白量不足、结合力不强的问题。本发明制备的人髓过氧化物酶(MPO)、心肌肌钙蛋白(cTnI或cTnT)和N末端脑钠肽前体(IMA)三合一联合检测装置，可实现心肌标志物的灵敏、特异、快速检测，提高了对急性心肌梗塞患者进行心梗风险的合理综合判定，能够快速、准确进行心肌梗塞早期预警及病情风险判断。
本发明采取的技术方案是：MPO、cTnI或cTnT和IMA 联合检测装置，包括样品垫、免疫胶体金抗体玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸收垫分别粘贴在塑料板，所述免疫硝酸纤维素膜的两端分别与吸收垫、免疫胶体金抗体玻璃纤维膜搭接，所述免疫胶体金抗体玻璃纤维膜的另一端与样品垫搭接，所述免疫硝酸纤维素膜上设置第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3和质控线C；所述的第一检测线T1上固相有高特异性MPO抗体，所述的第二检测线T2上固相有高特异性cTnI或cTnT抗体，所述的第三检测线T3上固相有高特异性IMA抗体，所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述免疫硝酸纤维素膜3上设置的第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3和质控线C可以纵向排列在同一条线上，或设置的第一检测线T1、第二检测线T2和第三检测线T3分别设置在三条线上，并在每条线上分别设置质控线C。
本发明提供一种MPO、cTnI或cTnT、IMA的联合检测装置的制备方法，包括下列步骤：
(a)、氧化锌-壳聚糖-胶体金制备
1)N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至10-12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析(透析膜截取分子量为8000-12000g/mol)，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖；
2)纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊，继续滴加则浑浊完全消失，再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后,得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀；
4)胶体金的制备：
将装有99ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，同时注意加热时间，加热10分钟后，待烧瓶中的水即将沸腾之时开启转数控制开关，调至400rpm左右，纯化水液面形成漩涡为佳，并用注射器缓慢将1ml 1％氯化金溶液沿漩涡边缘加入，待溶液开始沸腾，没有形成大气泡之前，快速加入1％柠檬酸三钠溶液1.4ml，同时观察颜色变化，白色变黑再渐变为紫色，停止加热，保持磁力搅拌，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量；
5)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金洗涤，真空干燥24h；
(b)、氧化锌-壳聚糖-胶体金分别交联标记MPO、cTnI或cTnT、IMA抗体，分别取1ml氧化锌-壳聚糖-胶体金悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边分别滴加抗体，分别加入抗体后，反应1min后，再到超声波上超声30秒，然后再反应2小时，加BSA进行封闭2小时，封闭好后进行离心，速度为12000r/min，20min，分别保留离心后的沉淀，待用；
(c)、采用胶体金抗体缓冲液分别稀释步骤(b)离心后的沉淀氧化锌-壳聚糖-胶体金抗体，使其分散均匀，分别获得免疫胶体金抗体溶液，分别用免疫胶体金抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金抗体玻璃纤维膜2；
(d)、制备免疫硝酸纤维素膜3
1)聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜
聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)氧化锌-壳聚糖-胶体金修饰标记抗体
以氧化锌-壳聚糖-胶体金作为载体，分别取25μL 40μmol/L MPO、25μL40μmol/LcTnI或cTnT和25μL 40μmol/L IMA抗体溶液分别加入到200μL、1mg/mL氧化锌-壳聚糖-胶体金溶液中，再分别加入到超纯水中，使最终反应体系1mL，分别充分混匀后，设置摇床温度为25℃，转速为200r/m条件下，将上述各混合溶液在摇床内避光震荡培养2h，反应后的混合溶液用超速离心机在13000r/m转速条件下，使用超纯水彻底离心洗涤4次，去除上清液中过量的未反应的MPO、cTnI或cTnT和IMA抗体；所得沉淀物分别为氧化锌-壳聚糖-胶体金-MPO抗体复合物、氧化锌-壳聚糖-胶体金-cTnI/cTnT抗体复合物、氧化锌-壳聚糖-胶体金-IMA抗体复合物，用超纯水将其定容至1mL并在4℃条件储存；
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.5μl/cm，将MPO抗体复合物、cTnI或cTnT抗体复合物、IMA抗体复合物稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
(e)、预处理样品垫1
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，37℃烘干备用，经处理后样品垫1可提高反应灵敏度；
(f)、将预处理的样品垫1、免疫胶体金抗体玻璃纤维膜2、免疫硝酸纤维素膜3、吸收垫4依次粘贴在塑料板5上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
本发明所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，1)N-羧乙基壳聚糖的合成，在水溶液中透析时，采用的透析膜截取分子量为8000-12000g/mol。
本发明所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，2)纳米氧化锌颗粒制备，缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，该NaOH溶液为新配制的溶液。
所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备，所述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌的混合比例是，N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/5、100/8或100/10。
本发明所述步骤(c)中的胶体金抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、proclin浓度为0.5％，BSA浓度为0.5％，pH为8.0。
本发明所述步骤(d)所述的聚多巴胺处理液，聚多巴胺浓度为0.1-3％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明所述步骤(e)中样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂浓度为0.5％。
多巴胺(dopamine,DA)因其结合儿茶酚官能团和赖氨酸的氨基官能团，也被证明具有超强的黏附性能。DA在碱性溶液中可发生氧化自聚合，在材料表面形成具有超强黏性的聚多巴胺(PDA)层，从而实现在各种材料表面的超强黏附。PDA形成过程简单且不需要有机溶剂，仅需将材料浸入含DA的碱性Tris-Hcl缓冲液或其他碱性溶液中，即可在表面形成PDA层，因此，PDA被广泛应用于材料的表面改性。综上，聚多巴胺可以从电荷作用和疏水作用两方面来提高NC膜蛋白的包被效率和吸附效果。
甲壳素是地球上储量仅次于纤维素的可再生资源，壳聚糖是其脱乙酰基衍生物，由2-氨基2-脱氧-β-D-葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接形成的聚合物。由于壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、广谱抗菌性、防腐性、无抗原性，以及可止血和促进伤口愈合等特殊功能，使得壳聚糖成为组织工程支架材料中最有应用前景的生物大分子之一。纳米氧化锌(ZnO)，白色六方晶系结晶或球形粒子，粒径小于100nm，平均粒径50nm，比表面积大于4m2/g。具有极高的化学活性及优异的催化性和光催化活性。本研究探讨了氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒对NC膜包被抗体的影响，先将划膜用的抗体先与氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒结合，封闭，离心纯化，去掉未结合的抗体，然后复溶到一定比例，然后划膜，这样一个氧化锌-壳聚糖-胶体金粒子可以结合多个抗体，从而增加了包被抗体效率，借助其更大的表面积增加抗体的包被效率，提高胶体金免疫层析实验的灵敏度。
为了提高胶体金免疫层析技术的灵敏度和精准度，通过对硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液进行了预处理，增强了硝酸纤维素膜的吸附效应，使蛋白均一分布、吸附的更牢固；同时将包被于NC的抗体与事先处理好的氧化锌-壳聚糖-胶体金结合，使得结合度更好，抗体不会从胶体金表面脱落；综上处理后从而达到了提高试纸灵敏度和精准度等目的。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的检测装置结构新颖，将MPO、cTnI或cTnT、IMA抗体包被于硝酸纤维膜膜上，特异性强，既能同时检测标本中MPO、cTnI或cTnT、IMA，又没有增加生产操作的复杂度。
2、免疫胶体金的制备步骤中，设计了氧化锌-壳聚糖-胶体金，提高了抗体标记效率，通过配合合适的胶体金缓冲液和样品垫处理液，可保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效的提高了反应的灵敏度；同时这样的结合方式，会使标记物与抗体牢牢吸附在一起，从而抗体或抗原不会从标记物表面脱落，提高标记效率及免疫层析方法学的稳定性和精准度；同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。
3、本发明对硝酸纤维素膜进行聚多巴胺预处理，对包被硝酸纤维素膜的抗体进行了修饰，提高抗体的包被效率、增强硝酸纤维素膜吸附效果、蛋白分布更加均一，从而提高了免疫层析方法学的灵敏度、精准度和稳定性。
4、本发明的检测装置操作简便，不需要专业人员操作。实用性强。
附图说明
图1是本发明的结构示意图，图中检测线T1、T2、T3纵向排列在同一条线上；
图2是图1的A-A剖视图；
图3是本发明检测线T1、T2、T3分别横向排列在三条线上的结构示意图；
图4是图3的B-B剖视图；
图5是图3的C-C剖视图；
图6是图3的D-D剖视图；
图7是本发明实验例3的MPO的绝对偏倚图；
图8是本发明实验例3的cTnI的绝对偏倚图；
图9是本发明实验例3的IMA的绝对偏倚图。
具体实施方式
MPO、cTnI或cTnT和IMA联合检测装置，包括样品垫1、免疫胶体金抗体玻璃纤维膜2、免疫硝酸纤维素膜3、吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述免疫硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫胶体金抗体玻璃纤维膜2搭接，所述免疫胶体金抗体玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接，所述免疫硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3和质控线C；所述的第一检测线T1上固相有高特异性MPO抗体，所述的第二检测线T2上固相有高特异性cTnI或cTnT抗体，所述的第三检测线T3上固相有高特异性IMA抗体，所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体；如图1、2，所述免疫硝酸纤维素膜3上设置的第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3和质控线C可以纵向排列在同一条线上，如图3、4、5、6、或设置的第一检测线T1、第二检测线T2和第三检测线T3分别设置在三条线上，并在每条线上分别设置质控线C。
实施例1
(a)、氧化锌-壳聚糖-胶体金制备
1)N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至10，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，透析膜截取分子量为8000g/mol，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖3.6g，产率90％；
2)纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL新配制的5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊，继续滴加则浑浊完全消失，再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后,得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，使得N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/5，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀；
4)胶体金的制备：
将装有99ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，同时注意加热时间，加热10分钟后，待烧瓶中的水即将沸腾之时开启转数控制开关，调至400rpm左右，纯化水液面形成漩涡为佳，并用注射器缓慢将1ml 1％氯化金溶液沿漩涡边缘加入，待溶液开始沸腾，没有形成大气泡之前，快速加入1％柠檬酸三钠溶液1.4ml，同时观察颜色变化，白色变黑再渐变为紫色，停止加热，保持磁力搅拌，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量；
5)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金洗涤，真空干燥24h；
(b)、氧化锌-壳聚糖-胶体金分别交联标记MPO、cTnI或cTnT、IMA抗体，分别取1ml氧化锌-壳聚糖-胶体金悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边分别滴加抗体，分别加入抗体后，反应1min后，再到超声波上超声30秒，然后再反应2小时，加BSA进行封闭2小时，封闭好后进行离心，速度为12000r/min，20min，分别保留离心后的沉淀，待用；
(c)、采用胶体金抗体缓冲液分别稀释步骤(b)离心后的沉淀氧化锌-壳聚糖-胶体金抗体，使其分散均匀，分别获得免疫胶体金抗体溶液，分别用免疫胶体金抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金抗体玻璃纤维膜2；
所述的胶体金抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、proclin浓度为0.5％，BSA浓度为0.5％，pH为8.0；
(d)、制备免疫硝酸纤维素膜3
1)聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜
配制聚多巴胺处理液：聚多巴胺配成浓度为1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)氧化锌-壳聚糖-胶体金修饰标记抗体
以氧化锌-壳聚糖-胶体金作为载体，分别取25μL 40μmol/L MPO、25μL 40μmol/LcTnI或cTnT和25μL 40μmol/L IMA抗体溶液分别加入到200μL、1mg/mL氧化锌-壳聚糖-胶体金溶液中，再分别加入到超纯水中，使最终反应体系1mL，分别充分混匀后，设置摇床温度为25℃，转速为200r/m条件下，将上述各混合溶液在摇床内避光震荡培养2h，反应后的混合溶液用超速离心机在13000r/m转速条件下，使用超纯水彻底离心洗涤4次，去除上清液中过量的未反应的MPO、cTnI或cTnT和IMA抗体；所得沉淀物分别为氧化锌-壳聚糖-胶体金-MPO抗体复合物、氧化锌-壳聚糖-胶体金-cTnI或cTnT抗体复合物、氧化锌-壳聚糖-胶体金-IMA抗体复合物，用超纯水将其定容至1mL并在4℃条件储存；
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.5μl/cm，将MPO抗体复合物、cTnI或cTnT抗体复合物、IMA抗体复合物稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
(e)、预处理样品垫1
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其中样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫1可提高反应灵敏度；
(f)、将预处理的样品垫1、免疫胶体金抗体玻璃纤维膜2、免疫硝酸纤维素膜3、吸收垫4依次粘贴在塑料板5上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
实施例2
(a)、氧化锌-壳聚糖-胶体金制备
1)N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至11，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，透析膜截取分子量为10000g/mol，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖；
2)纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL新配制的5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊，继续滴加则浑浊完全消失，再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后,得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，使得N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/8，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀；
4)胶体金的制备：
将装有99ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，同时注意加热时间，加热10分钟后，待烧瓶中的水即将沸腾之时开启转数控制开关，调至400rpm左右，纯化水液面形成漩涡为佳，并用注射器缓慢将1ml 1％氯化金溶液沿漩涡边缘加入，待溶液开始沸腾，没有形成大气泡之前，快速加入1％柠檬酸三钠溶液1.4ml，同时观察颜色变化，白色变黑再渐变为紫色，停止加热，保持磁力搅拌，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量；
5)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金洗涤，真空干燥24h；
(b)、氧化锌-壳聚糖-胶体金分别交联标记MPO、cTnI或cTnT、IMA抗体，分别取1ml氧化锌-壳聚糖-胶体金悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边分别滴加抗体，分别加入抗体后，反应1min后，再到超声波上超声30秒，然后再反应2小时，加BSA进行封闭2小时，封闭好后进行离心，速度为12000r/min，20min，分别保留离心后的沉淀，待用；
(c)、采用胶体金抗体缓冲液分别稀释步骤(b)离心后的沉淀氧化锌-壳聚糖-胶体金抗体，使其分散均匀，分别获得免疫胶体金抗体溶液，分别用免疫胶体金抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金抗体玻璃纤维膜2；
所述的胶体金抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、proclin浓度为0.5％，BSA浓度为0.5％，pH为8.0；
(d)、制备免疫硝酸纤维素膜3
1)聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜
配制聚多巴胺处理液：聚多巴胺配成浓度为1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)氧化锌-壳聚糖-胶体金修饰标记抗体
以氧化锌-壳聚糖-胶体金作为载体，分别取25μL 40μmol/L MPO、25μL40μmol/LcTnI或cTnT和25μL 40μmol/L IMA抗体溶液分别加入到200μL、1mg/mL氧化锌-壳聚糖-胶体金溶液中，再分别加入到超纯水中，使最终反应体系1mL，分别充分混匀后，设置摇床温度为25℃，转速为200r/m条件下，将上述各混合溶液在摇床内避光震荡培养2h，反应后的混合溶液用超速离心机在13000r/m转速条件下，使用超纯水彻底离心洗涤4次，去除上清液中过量的未反应的MPO、cTnI或cTnT和IMA抗体；所得沉淀物分别为氧化锌-壳聚糖-胶体金-MPO抗体复合物、氧化锌-壳聚糖-胶体金-cTnI或cTnT抗体复合物、氧化锌-壳聚糖-胶体金-IMA抗体复合物，用超纯水将其定容至1mL并在4℃条件储存；
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.5μl/cm，将MPO抗体复合物、cTnI或cTnT抗体复合物、IMA抗体复合物稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
(e)、预处理样品垫1
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其中样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫1可提高反应灵敏度；
(f)、将预处理的样品垫1、免疫胶体金抗体玻璃纤维膜2、免疫硝酸纤维素膜3、吸收垫4依次粘贴在塑料板5上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
实施例3
(a)、氧化锌-壳聚糖-胶体金制备
1)N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，透析膜截取分子量为12000g/mol，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖；
2)纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL新配制的5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊，继续滴加则浑浊完全消失，再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后,得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，使得N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/10，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀；
4)胶体金的制备：
将装有99ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，同时注意加热时间，加热10分钟后，待烧瓶中的水即将沸腾之时开启转数控制开关，调至400rpm左右，纯化水液面形成漩涡为佳，并用注射器缓慢将1ml 1％氯化金溶液沿漩涡边缘加入，待溶液开始沸腾，没有形成大气泡之前，快速加入1％柠檬酸三钠溶液1.4ml，同时观察颜色变化，白色变黑再渐变为紫色，停止加热，保持磁力搅拌，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量；
5)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金洗涤，真空干燥24h；
(b)、氧化锌-壳聚糖-胶体金分别交联标记MPO、cTnI或cTnT、IMA抗体，分别取1ml氧化锌-壳聚糖-胶体金悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边分别滴加抗体，分别加入抗体后，反应1min后，再到超声波上超声30秒，然后再反应2小时，加BSA进行封闭2小时，封闭好后进行离心，速度为12000r/min，20min，分别保留离心后的沉淀，待用；
(c)、采用胶体金抗体缓冲液分别稀释步骤(b)离心后的沉淀氧化锌-壳聚糖-胶体金抗体，使其分散均匀，分别获得免疫胶体金抗体溶液，分别用免疫胶体金抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金抗体玻璃纤维膜2；
所述的胶体金抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、proclin浓度为0.5％，BSA浓度为0.5％，pH为8.0；
(d)、制备免疫硝酸纤维素膜3
1)聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜
配制聚多巴胺处理液：聚多巴胺配成浓度为1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)氧化锌-壳聚糖-胶体金修饰标记抗体
以氧化锌-壳聚糖-胶体金作为载体，分别取25μL 40μmol/L MPO、25μL40μmol/LcTnI或cTnT和25μL 40μmol/L IMA抗体溶液分别加入到200μL、1mg/mL氧化锌-壳聚糖-胶体金溶液中，再分别加入到超纯水中，使最终反应体系1mL，分别充分混匀后，设置摇床温度为25℃，转速为200r/m条件下，将上述各混合溶液在摇床内避光震荡培养2h，反应后的混合溶液用超速离心机在13000r/m转速条件下，使用超纯水彻底离心洗涤4次，去除上清液中过量的未反应的MPO、cTnI或cTnT和IMA抗体；所得沉淀物分别为氧化锌-壳聚糖-胶体金-MPO抗体复合物、氧化锌-壳聚糖-胶体金-cTnI或cTnT抗体复合物、氧化锌-壳聚糖-胶体金-IMA抗体复合物，用超纯水将其定容至1mL并在4℃条件储存；
3)硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.5μl/cm，将MPO抗体复合物、cTnI或cTnT抗体复合物、IMA抗体复合物稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
(e)、预处理样品垫1
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，其中样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5％、酪蛋白浓度为0.1％、表面活性剂浓度为0.5％，37℃烘干备用，经处理后样品垫1可提高反应灵敏度；
(f)、将预处理的样品垫1、免疫胶体金抗体玻璃纤维膜2、免疫硝酸纤维素膜3、吸收垫4依次粘贴在塑料板5上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
定量检测：通过胶体金定量检测仪检测，本检测装置检测MPO最低检测值：1ng、cTnI或cTnT最低检测值：0.2ng、IMA最低检测值：0.2ng。
下边通过具体实验例来进一步说明本发明。
实验例1：
1、聚多巴胺处理液对硝酸纤维素膜抗体吸附能力的比较
1.1材料与方法
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司，聚多巴胺购自Sigma公司
1.2硝酸纤维素膜处理方法
1.2.1配制聚多巴胺处理液
配制聚多巴胺处理液：聚多巴胺由蒸馏水配置成浓度为1％，，经0.22μm滤膜过滤，备用。
1.2.2硝酸纤维素膜处理方法
将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
1.3实验方法
分别将未处理和已处理过的硝酸纤维素膜按照上述实施例工艺流程制备MPO、cTnI或cTnT和IMA胶体金检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硝酸纤维素膜未处理和处理后胶体金指标差异。
1.4结果:
1.4.1抗体吸附强度比较
取处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过免疫层析定量分析仪读取胶体金显色情况判断处理后膜对抗体吸附的影响，结果见表1。结果显示，处理后的硝酸纤维素膜在溶液浸润性方面要明显优于未处理膜，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度。
表1硝酸纤维素膜抗体吸附能力比较
Figure BDA0003600075040000151
1.4.2硝酸纤维素膜稳定性比较
取聚多巴胺处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察实验数据来判断处理后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，通过免疫层析定量分析仪读取胶体金显色情况，结果见表2。表2结果与表1结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表2硝酸纤维素膜加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0003600075040000152
实验例2
2、氧化锌-壳聚糖-胶体金修饰MPO抗体
2.1材料与方法
2.1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司
2.1.2氧化锌-壳聚糖-胶体金修饰MPO抗体
以氧化锌-壳聚糖-胶体金作为载体，取200μL氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒(1mg/mL)溶液和25μMPO(40μmol/L)溶液加入到超纯水中，使最终反应体系1mL。充分混匀后，设置摇床温度为25℃，转速为200r/m条件下，将上述混合溶液在摇床内避光震荡培养2h；反应后的混合溶液用超速离心机在13000r/m转速条件下，使用超纯水彻底离心洗涤4次，去除上清液中过量的未反应的MPO抗体；所得沉淀物即为氧化锌-壳聚糖-胶体金-MPO抗体探针复合物，用超纯水将其定容至1mL并在4℃条件储存。
2.2实验方法
分别将氧化锌-壳聚糖-胶体金修饰的MPO抗体与未修饰的MPO抗体按照上述实施例工艺流程制备MPO抗体检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较氧化锌-壳聚糖-胶体金处理和未处理对灵敏度和稳定性指标差异。
2.3结果
2.3.1灵敏度比较
取氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过免疫层析定量分析仪读取显色情况判断处理后灵敏度，结果见表3。结果显示，氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒修饰组尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度。
表3氧化锌-壳聚糖-胶体金修饰的灵敏度比较
Figure BDA0003600075040000161
2.3.2稳定性比较
取氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验经免疫层析定量分析仪读取显色情况来判断氧化锌-壳聚糖-胶体金修饰后试纸的稳定性，结果见表4。表4结果与表3结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性非常好。
表4加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0003600075040000162
实验例3：联合检测装置实际应用于临床标本中检测能力分析
1研究对象一般资料及研究方法
此次临床试验中吉林省中医药科学院第一临床医院、吉林省人民医院共入选150例受试者，在试验过程中未出现检测结果明显不一致的样本。
与各检测指标的已上市应用产品进行比对，观察二者检测结果符合情况。
2研究结果
(1)MPO绝对偏倚分析
从图1可以看出：联合检测卡与对比产品MPO浓度检测结果的差值比较均匀地分布在中心线0的上下两侧，说明与对比产品相比，联合检测卡的数据符合要求，与对比产品检测结果具有一致性。
(2)cTnI绝对偏倚分析
从图2可以看出：联合检测卡与对比产品cTnI浓度检测结果的差值比较均匀地分布在中心线0的上下两侧，说明与对比产品相比，联合检测的数据符合要求，与对比产品检测结果具有一致性。
(3)IMA绝对偏倚分析
从图3可以看出：联合检测卡与对比产品IMA浓度检测结果的差值比较均匀地分布在中心线0的上下两侧，说明与对比产品相比，联合检测卡的数据符合要求，与对比产品检测结果具有一致性。
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种MPO、cTnI或cTnT、IMA的联合检测装置的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
（a）、氧化锌-壳聚糖-胶体金制备
1）N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL 水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的 NaOH溶液，调节溶液的pH值至10-12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，透析膜截取分子量为 8000-12000g/mol，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖；
2）纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊，继续滴加则浑浊完全消失，再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后,得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
3）N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀；
4）胶体金的制备：
将装有99ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，同时注意加热时间，加热10分钟后，待烧瓶中的水即将沸腾之时开启转数控制开关，调至400rpm，纯化水液面形成漩涡为佳，并用注射器缓慢将1ml 1%氯化金溶液沿漩涡边缘加入，待溶液开始沸腾，没有形成大气泡之前，快速加入1%柠檬酸三钠溶液1.4ml，同时观察颜色变化，白色变黑再渐变为紫色，停止加热，保持磁力搅拌，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量；
5）氧化锌-壳聚糖-胶体金制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金洗涤，真空干燥24h；
（b）、氧化锌-壳聚糖-胶体金分别交联标记 MPO、cTnI或cTnT、IMA 抗体，分别取 1ml氧化锌-壳聚糖-胶体金悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边分别滴加抗体，分别加入抗体后，反应1min后，再到超声波上超声 30 秒，然后再反应 2小时，加 BSA进行封闭2小时，封闭好后进行离心，速度为 12000r/min，20min，分别保留离心后的沉淀，待用；
（c）、采用胶体金抗体缓冲液分别稀释步骤（b）离心后的沉淀氧化锌-壳聚糖-胶体金抗体，使其分散均匀，分别获得免疫胶体金抗体溶液，分别用免疫胶体金抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金抗体玻璃纤维膜；
（d）、制备免疫硝酸纤维素膜
1) 聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜
聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2）氧化锌-壳聚糖-胶体金修饰标记抗体
以氧化锌-壳聚糖-胶体金作为载体，分别取25μL 40μmol/L MPO、25μL 40μmol/LcTnI或cTnT和25μL 40μmol/L IMA抗体溶液分别加入到200μL、1mg/mL氧化锌-壳聚糖-胶体金溶液中，再分别加入到超纯水中，使最终反应体系1 mL，分别充分混匀后，设置摇床温度为25℃，转速为200 r/m条件下，将上述各混合溶液在摇床内避光震荡培养2 h，反应后的混合溶液用超速离心机在13000 r/m转速条件下，使用超纯水彻底离心洗涤4次，去除上清液中过量的未反应的MPO、cTnI或cTnT和IMA抗体；所得沉淀物分别为氧化锌-壳聚糖-胶体金-MPO抗体复合物、氧化锌-壳聚糖-胶体金- cTnI/cTnT抗体复合物、氧化锌-壳聚糖-胶体金-IMA抗体复合物，用超纯水将其定容至1mL 并在4℃条件储存；
3）硝酸纤维素膜检测线与质控线抗体的包被
当喷膜量为1.5µl/cm，将MPO抗体复合物、cTnI或cTnT 抗体复合物、IMA抗体复合物稀释至1.5mg/ml，质控线羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，分别包被硝酸纤维素膜的检测线与质控线，室温干燥过夜，储存备用；
（e）、预处理样品垫
将玻璃纤维用样品垫处理液浸泡10min，37℃烘干备用，经处理后样品垫可提高反应灵敏度；
（f）、将预处理的样品垫、免疫胶体金抗体玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘贴在塑料板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
2.根据权利要求1所述的MPO、cTnI或cTnT、IMA的联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，1）N-羧乙基壳聚糖的合成，在水溶液中透析时，采用的透析膜截取分子量为 8000-12000g/mol。
3.根据权利要求1所述的MPO、cTnI或cTnT、IMA的联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤（a）氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，2）纳米氧化锌颗粒制备，缓慢滴加9mL5mol/L的NaOH溶液，该NaOH溶液为新配制的溶液。
4.根据权利要求1所述的MPO、cTnI或cTnT、IMA的联合检测装置的制备方法，其特征在于：步骤（a）氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，3）N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备，所述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌的混合比例是，N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为 100/5、100/8或100/10。
5.根据权利要求1所述的MPO、cTnI或cTnT、IMA的联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤（c）中的胶体金抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5%、海藻糖浓度为1%、proclin浓度为0.5%，BSA浓度为0.5%，pH为8.0。
6.根据权利要求1所述的MPO、cTnI或cTnT、IMA的联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤（d）所述的聚多巴胺处理液，聚多巴胺浓度为0.1-3%，经0.22μm滤膜过滤，备用。
7.根据权利要求1所述的MPO、cTnI或cTnT、IMA的联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤（e）中样品垫处理液包括：Tris-HCL液浓度为0.1M、牛血清白蛋白BSA浓度为0.5%、酪蛋白浓度为0.1%、表面活性剂浓度为0.5%。
8.采用如权利要求1~7任一项方法制备的一种MPO、cTnI或cTnT、IMA的联合检测装置，其特征在于：包括样品垫、免疫胶体金抗体玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜、吸收垫分别粘贴在塑料板，所述免疫硝酸纤维素膜的两端分别与吸收垫、免疫胶体金抗体玻璃纤维膜搭接，所述免疫胶体金抗体玻璃纤维膜的另一端与样品垫搭接，所述免疫硝酸纤维素膜上设置第一检测线 T1、第二检测线T2、第三检测线T3和质控线C；所述的第一检测线T1上固相有高特异性MPO抗体，所述的第二检测线T2上固相有高特异性cTnI或cTnT抗体，所述的第三检测线T3上固相有高特异性IMA抗体，所述的质控线C上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体；所述免疫硝酸纤维素膜上设置的第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3和质控线C可以纵向排列在同一条线上，或设置的第一检测线T1、第二检测线T2和第三检测线T3分别设置在三条线上，并在每条线上分别设置质控线C。
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