CN106257271B - 一种基于表面增强拉曼散射技术的复合材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于表面增强拉曼散射技术的复合材料及其制备方法。具体地，本发明公开了一种复合材料，所述复合材料包括表面修饰有第一靶分子的微球与表面修饰有拉曼信号分子和经第二靶分子修饰的高分子的第二组分；并且，在含待测物溶液中，所述待测物与所述微球和所述第二组分通过所述第一靶分子和所述第二靶分子结合形成易于离心沉淀的复合物。本发明还公开了所述复合材料的制法和用途，使用所述复合材料对人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)或疾病标志物(如肿瘤标志物、心血管疾病标志物、老年痴呆症标志物、支原体、衣原体等)等进行检测，可有效降低假阳性和假阴性效应，具有高灵敏、简单、快速、低成本等优点。

Description

一种基于表面增强拉曼散射技术的复合材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地涉及一种基于表面增强拉曼散射技术的复合材料及其制备方法

背景技术

特异性的分子识别，例如抗原-抗体、生物素-亲和素、DNA-DNA或RNA，是很重要的生物分析。其中抗原-抗体的特异性相互作用在人类疾病检测中的应用最广泛。人类免疫系统可以在非正常细胞表面产生不同种抗原，利用抗原的检测可以达到诊断疾病的效果。而目前临床检测抗原的方法，包括血清检测、酶联免疫吸附测试等，上述方法均存在操作复杂、耗时长、在低浓度抗原检测时灵敏度低的不足。另外，人类疾病的早期诊断对医药治疗和减小治疗的副作用起着至关重要的作用。因此，发展一种高通量、高灵敏、低成本的准确检测早期疾病的诊断方法是一个亟待解决的问题。

拉曼光谱术是一种基于拉曼散射效应而发展起来的分子光谱技术，采用拉曼光谱技术可以从分子水平上探测组织细胞内的蛋白、核酸、脂类以及糖类等生物分子的精细结构和信息。与常规检测技术相比，拉曼光谱技术具有样本预处理简单、无损和快速等优点，然而，由于分子的拉曼散射截面小，使得拉曼光谱检测液体样品的信号非常微弱(约为荧光的万分之一)，一些与抗原多肽相关的指纹信号易被荧光等背景噪声所掩盖。因此，如能对拉曼信号进行增强，同时抑制荧光等背景信号，将显著提高癌症检测的灵敏度。1974年，Fleishman等发现，当吡啶分子吸附在粗糙银表面上，其拉曼散射信号比溶液中吡啶分子的拉曼散射信号增强约6个数量级，这种增强效应被称为表面增强拉曼散射(SERS)效应。目前SERS增强效应最高可达到10¹⁴～10¹⁵数量级，实现了某种意义上可称为灵敏度最高的单分子检测。SERS技术保留了拉曼光谱技术简单、无损和快速等原有优点，同时具备了高灵敏度的独特优势。因此，将SERS技术应用于生物蛋白的检测已成为检测抗原多肽的最佳手段之一。

但是，现有技术中多为直接在SERS纳米粒子表面修饰Raman信号分子和抗体，这不可避免地会使得金属纳米粒子裸露的表面与抗原上的-SH发生反应，产生假阳性的结果。

综上所述，本领域急需开发一种新型的可有效降低假阳性和假阴性效应，且可高灵敏、简单、快速、低成本检测人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)或疾病标志物的复合材料及其制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的可有效降低假阳性和假阴性效应，且可高灵敏、简单、快速、低成本检测人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)或疾病标志物的复合材料及其制备方法。

本发明的第一方面，提供了一种复合材料，所述复合材料包括：

(a)第一组分，所述第一组分包括：

(a-i)作为内核的微球，所述微球易于离心沉淀；和

(a-ii)位于外层的第一靶分子，所述第一靶分子修饰于所述微球表面，且与待测物具有特异性相互作用；和

(b)第二组分，所述第二组分包括：

(b-i)作为内核的贵金属粒子；

(b-ii)拉曼信号分子，所述拉曼信号分子固定和/或吸附于所述贵金属粒子表面；

(b-iii)作为中间层的高分子，所述高分子具有多个与所述贵金属粒子进行结合的结合官能团(binding functional group)，且所述高分子通过多个所述结合官能团结合于所述贵金属粒子的外周；和

(b-iv)位于外层的第二靶分子，所述第二靶分子偶联于所述高分子，且与待测物具有特异性相互作用；

并且，在含待测物溶液中，所述待测物与所述第一组分和所述第二组分通过所述第一靶分子和所述第二靶分子结合形成易于离心沉淀的复合物。

在另一优选例中，所述待测物选自下组：人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)、疾病标志物(如肿瘤标志物、心血管疾病标志物、老年痴呆症标志物、支原体、衣原体等)、或其组合。

在另一优选例中，所述复合材料还包括溶剂。

在另一优选例中，所述溶剂选自下组：水、四氢呋喃、PBS、或其组合。

在另一优选例中，所述复合材料在所述溶剂中的重量百分含量为0.01－10％，较佳地0.05－5％，更佳地0.1－0.5％。

在另一优选例中，所述微球表面具有选自下组的基团：羧基、氨基、羟基、或其组合；和/或

所述微球的粒径为100nm-1000μm。

在另一优选例中，所述微球的粒径为200nm-500μm，较佳地为300nm-300μm，更佳地为400nm-200μm，最佳地为500nm-100μm。

在另一优选例中，所述微球的形状选自下组：球形、类球形、棒形、星形、三角片、立方体、三角锥。

在另一优选例中，所述微球选自下组：聚苯乙烯-丙烯酸微球、聚苯乙烯-甲基丙烯酸微球、聚苯乙烯微球、聚乳酸微球、聚乳酸-羟基乙酸微球、或其组合。

在另一优选例中，所述“易于离心沉淀”是指：在离心处理过程中，2.0mL 2.0mg/mL的所述微球在500×g离心力下在20min内的沉淀率为30－100％，较佳地为70－100％，更佳地为90－100％。

在另一优选例中，在所述复合材料中，所述微球的浓度为0.01-50mg/mL，较佳地为0.5-3.0mg/mL，更佳地为1.0-2.0mg/mL。

在另一优选例中，在所述复合材料中(溶剂除外，包括微球、第一靶分子、贵金属粒子、拉曼信号分子、高分子和第二靶分子)，所述微球的重量百分含量为10－95wt％，较佳地为30－90wt％，更佳地为50－90wt％。

在另一优选例中，在所述复合材料中，所述微球的体积百分含量为40－99体积％，较佳地为50－98体积％，更佳地为60－95体积％。

在另一优选例中，所述第一靶分子经选自下组的基团与所述微球连接：羧基、氨基、羟基、巯基或其组合。

在另一优选例中，所述贵金属粒子选自下组：金、银、铂、或其组合；和/或

所述贵金属粒子的粒径为5-500nm。

在另一优选例中，所述贵金属粒子的粒径为10-400nm，较佳地为20-300nm，更佳地为30-200nm，最佳地为40-100nm。

在另一优选例中，所述贵金属粒子的形状选自下组：球形、类球形、棒形、星形、三角片、立方体、三角锥、或其组合。

在另一优选例中，所述贵金属粒子选自下组：金纳米球、金纳米立方体、金纳米星、金纳米棒、银纳米球、银纳米三角片、铂纳米球、铂纳米片、金包银球、金包银星、银包金球、或其组合。

在另一优选例中，在所述复合材料中，所述贵金属粒子的浓度为0.1-5.0mg/mL，较佳地为0.2-3.0mg/mL，更佳地为0.4-2.0mg/mL。

在另一优选例中，在所述复合材料中(溶剂除外，包括微球、第一靶分子、贵金属粒子、拉曼信号分子、高分子和第二靶分子)，所述贵金属粒子的重量百分含量为5-90wt％，较佳地为10-70wt％，更佳地为10-50wt％。

在另一优选例中，在所述复合材料中，所述微球和所述贵金属粒子的质量比为1：30-10000，较佳地1：50-1000，更佳地1：50-500，最佳地1：50-120。

在另一优选例中，在所述复合材料中，所述贵金属粒子的体积百分含量为1-60体积％，较佳地为2-50体积％，更佳地为5-40体积％。

在另一优选例中，所述拉曼信号分子为在拉曼光谱中具有明显共轭振动的有机分子。

在另一优选例中，所述“固定”和/或所述“吸附”为化学键合和/或物理吸附。

在另一优选例中，所述有机分子选自下组：4-巯基苯甲酸、巯基吡啶、4-巯基苯胺、巯基萘、对氟硫酚、罗丹明、结晶紫、耐尔蓝、或其组合。

在另一优选例中，所述拉曼信号分子与所述贵金属粒子的质量比为0.001－0.3，较佳地为0.01－0.25，更佳地为0.1－0.2。

在另一优选例中，在所述复合材料中，所述拉曼信号分子的浓度为5-500μM，较佳地为50-200μM，更佳地为100-150μM。

在另一优选例中，所述结合官能团选自下组：巯基、氨基、或其组合；和/或

所述高分子为线性高分子，且所述高分子的各分子链通过多个“金属－S键”和/或“金属-N键”与所述贵金属粒子化学键合。

在另一优选例中，所述高分子为具有巯基和/或氨基的聚合物(包括直链和支链聚合物)。

在另一优选例中，所述高分子“平躺式”地与所述贵金属粒子结合，即所述高分子的各分子链基本平铺于所述贵金属粒子表面，和/或所述高分子的各分子链基本平行于所述贵金属粒子的表面。

在另一优选例中，所述“平躺式”指所述高分子中的每个分子均通过多个结合官能团与所述贵金属粒子在n个位置发生连接，其中n为≥3的正整数，较佳地n≥10个，更佳地≥50个。

在另一优选例中，所述高分子的分子量≥1000道尔顿，较佳地≥5000道尔顿，更佳地≥10000道尔顿。

在另一优选例中，所述高分子的分子量通常≤1000000道尔顿，较佳地≤100000道尔顿。

在另一优选例中，所述高分子选自下组：寡肽、多肽、蛋白质、多糖、聚醚类改性化合物、聚酯类改性化合物、或其组合。

在另一优选例中，所述多肽含有多个巯基。

在另一优选例中，所述多肽的长度≥20个氨基酸，较佳地50-2000个氨基酸，更佳地100-1000个氨基酸。

在另一优选例中，所述多肽包括：聚谷氨酸、聚天门冬氨酸、含谷氨酸化合物、含天门冬氨酸化合物、聚赖氨酸、聚精氨酸、含赖氨酸化合物、含精氨酸化合物、或其组合。

在另一优选例中，所述蛋白质为还原型蛋白质，如还原型牛血清白蛋白(rBSA)。

在另一优选例中，所述多糖选自下组：壳聚糖、葡聚糖、甲壳素、纤维素、淀粉、琼脂、或其组合。

在另一优选例中，所述改性化合物具有选自下组的基团：氨基、羧基、羟基、或其组合。

在另一优选例中，所述高分子末端带有选自下组的基团：氨基。

在另一优选例中，所述高分子在所述贵金属粒子表面的覆盖率为≥30％，较佳地≥70％，更佳地≥80％，最佳地≥90％或100％。

在另一优选例中，在所述复合材料中，所述高分子的浓度为0.1－20μg/mL，较佳地为0.5－10μg/mL，更佳地为3－5μg/mL。

在另一优选例中，所述第一靶分子和所述第二靶分子可相同或不同，各自独立地选自下组：单克隆抗体、叶酸、半乳糖胺、表皮生长因子EGF、多肽类物质、核酸适配体、或其组合。

在另一优选例中，所述第一靶分子和所述第二靶分子相同，且选自下组：单克隆抗体、叶酸、半乳糖胺、表皮生长因子EGF、多肽类物质、核酸适配体、或其组合。

在另一优选例中，所述单克隆抗体选自下组：人前列腺特异性抗体、人血红蛋白(Hb)特异性抗体、肿瘤标志物特异性抗体、心血管疾病标志物特异性抗体、老年痴呆症标志物特异性抗体、EPCAM抗体、CD44抗体、或其组合。

在另一优选例中，所述多肽类物质选自下组：RGD肽、转铁蛋白、或其组合。

在另一优选例中，所述第一靶分子在所述微球表面均匀分布。

在另一优选例中，所述第一靶分子在所述微球表面的覆盖率为≥10％，较佳地≥30％，更佳地≥50％。

在另一优选例中，所述“均匀分布”指在所述微球的任一单位表面积内所述第一靶分子的覆盖率与在所述微球的整个表面积内所述第一靶分子的覆盖率的比值为0.8-1.2，较佳地为0.9-1.1。

在另一优选例中，所述第二靶分子在所述第二组分表面均匀分布。

在另一优选例中，所述第二靶分子在所述第二组分表面的覆盖率为≥10％，较佳地≥30％，更佳地≥50％。

在另一优选例中，所述“均匀分布”指在所述第二组分的任一单位表面积内所述第二靶分子的覆盖率与在所述第二组分的整个表面积内所述第二靶分子的覆盖率的比值为0.8-1.2，较佳地为0.9-1.1。

在另一优选例中，在所述复合材料中(溶剂除外，包括微球、第一靶分子、贵金属粒子、拉曼信号分子、高分子和第二靶分子)，所述第一靶分子的重量百分含量为0.1－5wt％，较佳地为1－4wt％，更佳地为2－3wt％。

在另一优选例中，在所述复合材料中(溶剂除外，包括微球、第一靶分子、贵金属粒子、拉曼信号分子、高分子和第二靶分子)，所述第二靶分子的重量百分含量为0.1－5wt％，较佳地为1－4wt％，更佳地为2－3wt％。

在另一优选例中，所述第二靶分子通过酰胺键与所述高分子共价键合。

在另一优选例中，所述复合材料是使用本发明第三方面的方法制备的。

本发明的第二方面，提供了一种检测人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)或疾病标志物的方法，所述方法包括如下步骤：

a)将本发明第一方面所述的复合材料与待测样品均匀混合，得到第一混合液；

b)离心沉淀第一混合液，使用拉曼光谱仪检测所得沉淀的拉曼信号，确定待测样品中PSA、Hb、PCT或疾病标志物的存在与否和/或数量。

在另一优选例中，在步骤a)之后还任选地包括如下步骤：培养第一混合液。

在另一优选例中，在步骤b)中使用拉曼光谱仪检测所得沉淀之前还任选地包括步骤：使用纯水分散所述沉淀。

在另一优选例中，所述待测样品选自下组：精斑、血迹、血液、唾液、尿液。

在另一优选例中，所述待测样品中待测物的浓度为0.0001－1000μg/L，较佳地为0.001－100μg/L，更佳地为0.01－10μg/L。

在另一优选例中，所述疾病标志物选自下组：肿瘤标志物、心血管疾病标志物、老年痴呆症标志物、支原体、衣原体、或其组合。

在另一优选例中，所述培养的培养时间为10－80min，较佳地20-60min。

在另一优选例中，步骤b)所述离心的离心力为300－1000×g，离心时间为2－60min，较佳地3-40min。

在另一优选例中，所述经纯水分散的沉淀液中所述沉淀的浓度为1.0－100mg/mL，较佳地为5.0－50mg/mL，更佳地为10－20mg/mL。

在另一优选例中，所述方法是非诊断性的、非治疗性的。

在另一优选例中，所述方法具有选自下组的一个或多个特征：

i)当待测物为PSA时，其检测灵敏度下限为0.1ng/L；

在另一优选例中，当待测物为PSA时，其检测灵敏度下限为0.1ng/L，较佳地为0.5ng/L，更佳地为5ng/L，最佳地为30ng/L。

ii)当待测物为Hb时，其检测灵敏度下限为1.0ng/L；

在另一优选例中，当待测物为Hb时，其检测灵敏度下限为1.0ng/L，较佳地为5.0ng/L，更佳地为10ng/L，最佳地为50ng/L。

iii)当待测物为胰腺癌标志物MUC4(黏蛋白)时，其检测灵敏度下限为0.1μg/L；

在另一优选例中，当待测物为胰腺癌标志物MUC4(黏蛋白)时，其检测灵敏度下限为0.1μg/L，较佳地为1μg/L，更佳地为5μg/L，最佳地为10μg/L。

ⅳ)当待测物为老年痴呆症标志物β-淀粉样肽时，其检测灵敏度下限为0.01μg/L；

v)当待测物为心血管疾病标志物肌钙蛋白I时，其检测灵敏度下限为5ng/L。

在另一优选例中，当待测物为心血管疾病标志物肌钙蛋白I时，其检测灵敏度下限为5ng/L，较佳地为10ng/L，更佳地为50ng/L，最佳地为100ng/L。

在另一优选例中，当待测物为老年痴呆症标志物β-淀粉样肽时，其检测灵敏度下限为0.01μg/L，较佳地为0.1μg/L，更佳地为0.5μg/L，最佳地为1.0μg/L。

本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的复合材料的制备方法，所述方法包括如下步骤：

1)提供本发明第一方面所述的第一组分和第二组分，其中，

所述第一组分是如下制备的：

a-1)提供微球和第一靶分子；

a-2)在催化剂作用下，使微球和第一靶分子反应得到所述第一组分；

所述第二组分是如下制备的：

b-1)提供第一混合液、第二混合液、第三混合液和第四混合液，其中，

所述第一混合液含有第一溶剂和所述贵金属粒子；

所述第二混合液含有第二溶剂和所述拉曼信号分子；

所述第三混合液含有第三溶剂和所述高分子；

所述第四混合液含有第四溶剂和所述第二靶分子；

b-2)将所述第二混合液加入所述第一混合液中进行反应；

b-3)将所述第三混合液加入步骤b-2)所得产物中进行反应；

b-4)在催化剂作用下，将所述第四混合液加入步骤b-3)所得产物中进行反应，得到所述第二组分；

2)混合步骤1)所得第一组分和第二组分，得到本发明第一方面所述的复合材料。

在另一优选例中，所述微球、所述第一靶分子、所述贵金属粒子、所述拉曼信号分子、所述高分子和所述第二靶分子如本发明第一方面所述。

在另一优选例中，所述第一靶分子和/或第二靶分子经活化剂活化。

在另一优选例中，所述催化剂选自下组：EDC、NHS、或其组合。

在另一优选例中，所述第一溶剂、第二溶剂、第三溶剂和第四溶剂可相同或不同，各独立地选自下组：水、四氢呋喃、PBS、或其组合。

在另一优选例中，所述活化剂选自下组：EDC、NHS、或其组合。

在另一优选例中，在所述第一混合液中所述贵金属粒子的浓度为0.1－4.0mg/mL。

在另一优选例中，在所述第二混合液中所述拉曼信号分子的浓度为10－500μM。

在另一优选例中，在所述第三混合液中所述高分子的浓度为0.2－40mg/mL。

在另一优选例中，在所述第四混合液中所述第二靶分子的浓度为10－100μg/mL。

在另一优选例中，所述第一混合液、第二混合液、第三混合液和第四混合液的添加体积比为：5－10：0.001－0.005：0.01－0.1：0.5－2。

本发明的第四方面，提供了一种本发明第一方面所述的复合材料的用途，用于制备检测人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)或疾病标志物的试剂或药剂。

在另一优选例中，PSA的检测是用来确定强奸犯案件中精斑存在与否。

在另一优选例中，Hb的检测是用来确定凶杀案件中的血迹为人血还是动物血。

在另一优选例中，PCT的检测是用来确定是否细菌感染。

在另一优选例中，所述疾病标志物选自下组：肿瘤标志物、心血管疾病标志物、老年痴呆症标志物、支原体、衣原体、或其组合。

本发明的第五方面，提供了一种产品，所述产品含有本发明第一方面所述的复合材料或由本发明第一方面所述的复合材料组成。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1是本发明复合物的结构示意图，其中(灰色)代表微球、(紫红色)代表贵金属粒子、代表拉曼信号分子、代表高分子、代表与待测物具有特异性相互作用的抗体、◆代表待测物。

图2是本发明实施例1所得复合材料1检测人前列腺特异性抗原(PSA)的选择性和灵敏度的初步验证结果，(a)为所述复合材料1对前列腺特异性抗原选择性检测结果，(b)为所述复合材料1对前列腺特异性抗原灵敏度检测结果。

图3是本发明实施例6所述复合材料6检测人血红蛋白(Hb)的选择性和灵敏度的初步验证结果，(a)为所述复合材料6对人血红蛋白选择性检测结果，(b)为所述复合材料6对人血红蛋白灵敏度检测结果。。

图4是本发明实施例7所述复合材料7检测人胰腺癌标志物MUC4的选择性和灵敏度的初步验证结果，(a)为所述复合材料7对人胰腺癌标志物MUC4选择性检测结果，(b)为所述复合材料7对人胰腺癌标志物MUC4灵敏度检测结果。

图5是本发明实施例8所述复合材料8检测老年痴呆症标志物β-淀粉样肽的选择性和灵敏度的初步验证结果，(a)为所述复合材料8对老年痴呆症标志物β-淀粉样肽选择性检测结果，(b)为所述复合材料8对老年痴呆症标志物β-淀粉样肽灵敏度检测结果。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，意外地制得一种具有特定新型结构的复合材料，将该复合材料应用于人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)或疾病标志物的检测可有效降低假阳性和假阴性效应，且可高灵敏、简单、快速、低成本检测PSA、Hb、PCT或疾病标志物。具体地，本发明人通过将易于离心的表面修饰有第一靶分子的微球与表面修饰有拉曼信号分子和经第二靶分子修饰的高分子的第二组分组合得到一种新型的复合材料，将该复合材料应用于PSA、Hb、PCT或疾病标志物检测时，PSA、Hb、PCT或疾病标志物与所述微球和所述第二组分通过所述第一靶分子与所述第二靶分子特异性结合，在所述微球的存在下，在离心步骤可极大地提高待测样品的沉淀率，进而显著提高PSA、Hb、PCT或疾病标志物检测的灵敏度。在此基础上，发明人完成了本发明。

复合材料

本发明提供了一种复合材料，所述复合材料包括：

(a)第一组分，所述第一组分包括：

(a-i)作为内核的微球，所述微球易于离心沉淀；和

(a-ii)位于外层的第一靶分子，所述第一靶分子修饰于所述微球表面，且与待测物具有特异性相互作用；和

(b)第二组分，所述第二组分包括：

(b-i)作为内核的贵金属粒子；

(b-ii)拉曼信号分子，所述拉曼信号分子固定和/或吸附于所述贵金属粒子表面；

(b-iii)作为中间层的高分子，所述高分子具有多个与所述贵金属粒子进行结合的结合官能团(binding functional group)，且所述高分子通过多个所述结合官能团结合于所述贵金属粒子的外周；和

(b-iv)位于外层的第二靶分子，所述第二靶分子偶联于所述高分子，且与待测物具有特异性相互作用；

并且，在含待测物溶液中，所述待测物与所述第一组分和所述第二组分通过所述第一靶分子和所述第二靶分子结合形成易于离心沉淀的复合物。

在本发明中，所述第一靶分子、第二靶分子、拉曼信号分子、高分子、贵金属粒子和微球的种类、形貌和粒径没有特别限制，可根据实际需要在很大范围内进行变化。

代表性地，所述待测物包括(但并不限于)：人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)、疾病标志物(如肿瘤标志物、心血管疾病标志物、老年痴呆症标志物、支原体、衣原体等)、或其组合。

在本发明中，所述复合材料通常还包括溶剂，所述溶剂的种类和用量没有特别限制，可根据实际需要在很大范围内进行调整。

代表性地，所述溶剂包括(但并不限于)：水、四氢呋喃、PBS、或其组合。

典型的，所述复合材料在所述溶剂中的重量百分含量为0.01－10％，较佳地0.05－5％，更佳地0.1－0.5％。

在本发明中，所述微球表面具有包括(但并不限于)的基团：羧基、氨基、羟基、或其组合；和/或

所述微球的粒径为100nm-1000μm。

在另一优选例中，所述微球的粒径为200nm-500μm，较佳地为300nm-300μm，更佳地为400nm-200μm，最佳地为500nm-100μm。

代表性地，所述微球的形状包括(但并不限于)：球形、类球形、棒形、星形、三角片、立方体、三角锥。

代表性地，所述微球包括(但并不限于)：聚苯乙烯-丙烯酸微球、聚苯乙烯-甲基丙烯酸微球、聚苯乙烯微球、聚乳酸微球、聚乳酸-羟基乙酸微球、或其组合。

在本发明中，所述“易于离心沉淀”是指：在离心处理过程中，2.0mL 2.0mg/mL的所述微球在500×g离心力下在20min内的沉淀率为30－100％，较佳地为70－100％，更佳地为90－100％。

在本发明中，在所述复合材料中，所述微球的浓度为0.01-50mg/mL，较佳地为0.5-3.0mg/mL，更佳地为1.0-2.0mg/mL。

在另一优选例中，在所述复合材料中(溶剂除外，包括微球、第一靶分子、贵金属粒子、拉曼信号分子、高分子和第二靶分子)，所述微球的重量百分含量为10－95wt％，较佳地为30－90wt％，更佳地为50－90wt％。

在另一优选例中，在所述复合材料中，所述微球的体积百分含量为40－99体积％，较佳地为50－98体积％，更佳地为60－95体积％。

在另一优选例中，所述第一靶分子经包括(但并不限于)下组的基团与所述微球连接：羧基、氨基、羟基、巯基或其组合。

代表性地，所述贵金属粒子包括(但并不限于)：金、银、铂、或其组合；和/或

所述贵金属粒子的粒径为5-500nm。

在另一优选例中，所述贵金属粒子的粒径为10-400nm，较佳地为20-300nm，更佳地为30-200nm，最佳地为40-100nm。

代表性地，所述贵金属粒子的形状包括(但并不限于)：球形、类球形、棒形、星形、三角片、立方体、三角锥、或其组合。

代表性地，所述贵金属粒子包括(但并不限于)：金纳米球、金纳米立方体、金纳米星、金纳米棒、银纳米球、银纳米三角片、铂纳米球、铂纳米片、金包银球、金包银星、银包金球、或其组合。

典型的，在所述复合材料中，所述贵金属粒子的浓度为0.1-5.0mg/mL，较佳地为0.2-3.0mg/mL，更佳地为0.4-2.0mg/mL。

在本发明中，在所述复合材料中(溶剂除外，包括微球、第一靶分子、贵金属粒子、拉曼信号分子、高分子和第二靶分子)，所述贵金属粒子的重量百分含量为5-90wt％，较佳地为10-70wt％，更佳地为10-50wt％。

在本发明中，在所述复合材料中，所述微球和所述贵金属粒子的质量比没有特别限制，可根据实际需要在很大范围内变化。

在另一优选例中，在所述复合材料中，所述微球和所述贵金属粒子的质量比为1：30-10000，较佳地1：50-1000，更佳地1：50-500，最佳地1：50-120。

在另一优选例中，在所述复合材料中，所述贵金属粒子的体积百分含量为1-60体积％，较佳地为2-50体积％，更佳地为5-40体积％。

在另一优选例中，所述拉曼信号分子为在拉曼光谱中具有明显共轭振动的有机分子。

在另一优选例中，所述“固定”和/或所述“吸附”为化学键合和/或物理吸附。

在本发明中，所述有机分子的种类没有特别限制，可根据实际需要在很大范围内进行调整。

代表性地，所述有机分子包括(但并不限于)：4-巯基苯甲酸、巯基吡啶、4-巯基苯胺、巯基萘、对氟硫酚、罗丹明、结晶紫、耐尔蓝、或其组合。

典型地，所述拉曼信号分子与所述贵金属粒子的质量比为0.001－0.3，较佳地为0.01－0.25，更佳地为0.1－0.2。

在另一优选例中，在所述复合材料中，所述拉曼信号分子的浓度为5-500μM，较佳地为50-200μM，更佳地为100-150μM。

在本发明中，所述结合官能团包括(但并不限于)：巯基、氨基、或其组合；和/或

所述高分子为线性高分子，且所述高分子的各分子链通过多个“金属－S键”和/或“金属-N键”与所述贵金属粒子化学键合。

在另一优选例中，所述高分子为具有巯基和/或氨基的聚合物(包括直链和支链聚合物)。

应理解，在本发明中，所述高分子“平躺式”地与所述贵金属粒子结合，即所述高分子的各分子链基本平铺于所述贵金属粒子表面，和/或所述高分子的各分子链基本平行于所述贵金属粒子的表面。

在本发明中，所述“平躺式”指所述高分子中的每个分子均通过多个结合官能团与所述贵金属粒子在n个位置发生连接，其中n为≥3的正整数，较佳地n≥10个，更佳地≥50个。

典型地，所述高分子的分子量≥1000道尔顿，较佳地≥5000道尔顿，更佳地≥10000道尔顿。

典型地，所述高分子的分子量通常≤1000000道尔顿，较佳地≤100000道尔顿。

代表性地，所述高分子包括(但并不限于)：寡肽、多肽、蛋白质、多糖、聚醚类改性化合物、聚酯类改性化合物、或其组合。

典型地，所述多肽含有多个巯基。

通常，所述多肽的长度≥20个氨基酸，较佳地50-2000个氨基酸，更佳地100-1000个氨基酸。

代表性地，所述多肽包括(但并不限于)：聚谷氨酸、聚天门冬氨酸、含谷氨酸化合物、含天门冬氨酸化合物、聚赖氨酸、聚精氨酸、含赖氨酸化合物、含精氨酸化合物、或其组合。

优选地，所述蛋白质为还原型蛋白质，如还原型牛血清白蛋白(rBSA)。

代表性地，所述多糖包括(但并不限于)：壳聚糖、葡聚糖、甲壳素、纤维素、淀粉、琼脂、或其组合。

代表性地，所述改性化合物具有包括(但并不限于)下组的基团：氨基、羧基、羟基、或其组合。

代表性地，所述高分子末端带有包括(但并不限于)下组的基团：氨基。

典型地，所述高分子在所述贵金属粒子表面的覆盖率为≥30％，较佳地≥70％，更佳地≥80％，最佳地≥90％或100％。

通常，在所述复合材料中，所述高分子的浓度为0.1－20μg/mL，较佳地为0.5－10μg/mL，更佳地为3－5μg/mL。

在本发明中，所述第一靶分子和所述第二靶分子可相同或不同，各自独立地包括(但并不限于)：单克隆抗体、叶酸、半乳糖胺、表皮生长因子EGF、多肽类物质、核酸适配体、或其组合。

在另一优选例中，所述第一靶分子和所述第二靶分子相同，且包括(但并不限于)：单克隆抗体、叶酸、半乳糖胺、表皮生长因子EGF、多肽类物质、核酸适配体、或其组合。

代表性地，所述单克隆抗体包括(但并不限于)：人前列腺特异性抗原(PSA)的特异性抗体、人血红蛋白(Hb)特异性抗体、降钙素原(PCT)特异性抗体、肿瘤标志物特异性抗体、心血管疾病标志物特异性抗体、老年痴呆症标志物特异性抗体、EPCAM抗体、CD44抗体、或其组合。

代表性地，所述多肽类物质包括(但并不限于)：RGD肽、转铁蛋白、或其组合。

在另一优选例中，所述第一靶分子在所述微球表面均匀分布。

典型地，所述第一靶分子在所述微球表面的覆盖率为≥10％，较佳地≥30％，更佳地≥50％。

在另一优选例中，所述“均匀分布”指在所述微球的任一单位表面积内所述第一靶分子的覆盖率与在所述微球的整个表面积内所述第一靶分子的覆盖率的比值为0.8-1.2，较佳地为0.9-1.1。

在另一优选例中，所述第二靶分子在所述第二组分表面均匀分布。

在另一优选例中，所述第二靶分子在所述第二组分表面的覆盖率为≥10％，较佳地≥30％，更佳地≥50％。

在另一优选例中，所述“均匀分布”指在所述第二组分的任一单位表面积内所述第二靶分子的覆盖率与在所述第二组分的整个表面积内所述第二靶分子的覆盖率的比值为0.8-1.2，较佳地为0.9-1.1。

在另一优选例中，在所述复合材料中(溶剂除外，包括微球、第一靶分子、贵金属粒子、拉曼信号分子、高分子和第二靶分子)，所述第一靶分子的重量百分含量为0.1－5wt％，较佳地为1－4wt％，更佳地为2－3wt％。

在另一优选例中，在所述复合材料中(溶剂除外，包括微球、第一靶分子、贵金属粒子、拉曼信号分子、高分子和第二靶分子)，所述第二靶分子的重量百分含量为0.1－5wt％，较佳地为1－4wt％，更佳地为2－3wt％。

在另一优选例中，所述第二靶分子通过酰胺键与所述高分子共价键合。

在另一优选例中，所述复合材料是使用本发明第三方面的方法制备的。

在本发明中，一方面，发明人通过采用线性高分子与贵金属粒子“平躺式”结合的连接方式，极大地增加了与高分子连接的第二靶分子的数量同时显著减薄了位于所述贵金属粒子表面的高分子层的厚度；另一方面，发明人将易于离心沉淀的微球通过第一靶分子经人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)或疾病标志物与第二组分结合，可显著提高离心沉淀率，从而可以有效地提高所述复合材料对PSA、Hb、PCT或疾病标志物的检测灵敏度。

检测方法

本发明还提供了一种检测人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)或疾病标志物的方法，所述方法包括如下步骤：

a)将所述的复合材料与待测样品均匀混合，得到第一混合液；

b)离心沉淀第一混合液，使用拉曼光谱仪检测所得沉淀的拉曼信号，确定待测样品中PSA、Hb、PCT或疾病标志物的存在与否和/或数量。

在另一优选例中，在步骤a)之后还任选地包括如下步骤：培养第一混合液。

在另一优选例中，在步骤b)中使用拉曼光谱仪检测所得沉淀之前还任选地包括步骤：使用纯水分散所述沉淀。

在本发明中，所述待检样品及其中待测物的浓度没有特别限制，可在实际应用中根据需要在很大范围内调整。

代表性地，所述待测样品包括(但并不限于)：精斑、血迹、血液、唾液、尿液。

代表性地，所述待测样品中待测物的浓度为0.0001－1000μg/L，较佳地为0.001－100μg/L，更佳地为0.001－10μg/L。

代表性地，所述疾病标志物包括(但并不限于)：肿瘤标志物、心血管疾病标志物、老年痴呆症标志物、支原体、衣原体、或其组合。

在另一优选例中，所述培养的培养时间为10－80min，较佳地20-60min。

在另一优选例中，步骤b)所述离心的离心力为300－1000×g，离心时间为2－60min，较佳地3-40min。

在另一优选例中，所述经纯水分散的沉淀液中所述沉淀的浓度为1.0－100mg/mL，较佳地为5.0－50mg/mL，更佳地为10－20mg/mL。

在另一优选例中，所述方法是非诊断性的、非治疗性的。

在本发明中，所述方法具有包括(但并不限于)的一个或多个特征：

i)当待测物为PSA时，其检测灵敏度下限为0.1ng/L；

在另一优选例中，当待测物为PSA时，其检测灵敏度下限为0.1ng/L，较佳地为0.5ng/L，更佳地为5ng/L，最佳地为30ng/L。

ii)当待测物为Hb时，其检测灵敏度下限为1.0ng/L；

在另一优选例中，当待测物为Hb时，其检测灵敏度下限为1.0ng/L，较佳地为5.0ng/L，更佳地为10ng/L，最佳地为50ng/L。

iii)当待测物为胰腺癌标志物MUC4(黏蛋白)时，其检测灵敏度下限为0.1μg/L；

在另一优选例中，当待测物为胰腺癌标志物MUC4(黏蛋白)时，其检测灵敏度下限为0.1μg/L，较佳地为1μg/L，更佳地为5μg/L，最佳地为10μg/L。

ⅳ)当待测物为老年痴呆症标志物β-淀粉样肽时，其检测灵敏度下限为0.01μg/L。

在另一优选例中，当待测物为老年痴呆症标志物β-淀粉样肽时，其检测灵敏度下限为0.01μg/L，较佳地为0.1μg/L，更佳地为0.5μg/L，最佳地为1.0μg/L。

在本发明中，通过进一步优化所述复合材料中各组分的结构和比例，可使得对待测物的检测灵敏度下限进一步降低。

制备方法

本发明还提供了一种所述的复合材料的制备方法，所述方法包括如下步骤：

1)提供所述的第一组分和第二组分，其中，

所述第一组分是如下制备的：

a-1)提供微球和第一靶分子；

a-2)在催化剂作用下，使微球和第一靶分子反应得到所述第一组分；

所述第二组分是如下制备的：

b-1)提供第一混合液、第二混合液、第三混合液和第四混合液，其中，

所述第一混合液含有第一溶剂和所述贵金属粒子；

所述第二混合液含有第二溶剂和所述拉曼信号分子；

所述第三混合液含有第三溶剂和所述高分子；

所述第四混合液含有第四溶剂和所述第二靶分子；

b-2)将所述第二混合液加入所述第一混合液中进行反应；

b-3)将所述第三混合液加入步骤b-2)所得产物中进行反应；

b-4)在催化剂作用下，将所述第四混合液加入步骤b-3)所得产物中进行反应，得到所述第二组分；

2)混合步骤1)所得第一组分和第二组分，得到所述的复合材料。

应理解，所述微球、所述第一靶分子、所述贵金属粒子、所述拉曼信号分子、所述高分子和所述第二靶分子如本发明第一方面所述。

在另一优选例中，所述第一靶分子和/或第二靶分子经活化剂活化。

典型地，所述催化剂包括(但并不限于)：EDC、NHS、或其组合。

典型地，所述第一溶剂、第二溶剂、第三溶剂和第四溶剂可相同或不同，各独立地包括(但并不限于)：水、四氢呋喃、PBS、或其组合。

典型地，所述活化剂包括(但并不限于)：EDC、NHS、或其组合。

在本发明中，所述第一混合液、第二混合液、第三混合液和第四混合液中各组分的浓度没有特别限制，可根据实际需要在很大范围内进行调整。

通常，在所述第一混合液中所述贵金属粒子的浓度为0.1－4.0mg/mL。

通常，在所述第二混合液中所述拉曼信号分子的浓度为10－500μM。

通常，在所述第三混合液中所述高分子的浓度为0.2－40mg/mL。

通常，在所述第四混合液中所述第二靶分子的浓度为10－100μg/mL。

典型地，所述第一混合液、第二混合液、第三混合液和第四混合液的添加体积比为：5－10：0.001－0.005：0.01－0.1：0.5－2。

在本发明中，一种典型的制备所述贵金属粒子的方法包括如下步骤：

c-1)提供贵金属化合物的水溶液和溶有还原剂的溶液；

c-2)将所述溶有还原剂的溶液加入到所述贵金属化合物的水溶液中，进行反应，得到所述的贵金属粒子。

在另一优选例中，所述贵金属化合物的水溶液还含有保护剂。

在另一优选例中，在步骤c-2)之后还包括如下步骤：

c-3)提供生长液，所述生长液含有保护剂、贵金属化合物和还原剂；

c-4)将步骤c-2)所得产物加入步骤c-3)所述生长液中，制得所述贵金属纳米粒子。

在另一优选例中，所述反应在避光条件下进行。

在本发明中，所述贵金属化合物没有特别限制，可根据实际需要在很大范围内进行调整。

代表性地，所述贵金属化合物包括(但并不限于)：氯金酸、氯化金、氯化亚金、氯金酸钾、氯金酸钠、硝酸银、醋酸银、三氟乙酸银、三氟甲烷磺酸银、六氟锑酸银、四氟硼酸银、或其组合。

在另一优选例中，步骤c-1)所述贵金属化合物和步骤c-3)所述贵金属化合物可相同或不同。

典型地，所述还原剂包括(但并不限于)：柠檬酸三钠、硼氢化钠、柠檬酸、草酸钠、没食子酸、抗坏血酸、水合肼、葡萄糖酸钠、葡聚糖、过氧化氢、或其组合。

典型地，所述保护剂包括(但并不限于)：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、柠檬酸、柠檬酸三钠、吐温、十二烷基硫酸钠(SDS)、或其组合。

用途

本发明还提供了一种所述的复合材料的用途，用于制备检测人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)或疾病标志物的试剂或药剂。

通常，PSA的检测是用来确定强奸犯案件中精斑存在与否。

通常，Hb的检测是用来确定凶杀案件中的血迹为人血还是动物血。

通常，PCT的检测是用来确定是否细菌感染。

代表性地，所述疾病标志物包括(但并不限于)：肿瘤标志物、心血管疾病标志物、老年痴呆症标志物、支原体、衣原体、或其组合。

应用

本发明还提供了一种产品，所述产品含有所述的复合材料或由所述的复合材料组成。

与现有技术相比，本发明具有以下主要优点：

(1)通过在所述贵金属粒子表面包覆所述线性高分子，可避免贵金属粒子与待测物的反应，进而有效降低假阳性和假阴性效应；

(2)通过采用所述线性高分子与所述贵金属粒子“平躺式”结合的连接方式，可显著降低贵金属粒子表面的高分子层厚度，从而提高对待测物的检测灵敏度；

(3)通过引入易于离心沉淀的微球，并将其与所述第二组分和待测物经第一靶分子和第二靶分子结合，可明显提高所得复合物的离心沉淀率，提高对待测物的检测灵敏度；

(4)使用所述复合材料，可在极低的检测浓度下实现对人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)或疾病标志物的高灵敏检测，从而便于实现对疾病的早发现、早治疗；

(5)使用所述复合材料，可实现对PSA、Hb、PCT或疾病标志物的高靶向性、高选择性的检测；

(6)所述复合材料制备方法简单、成本低；

(7)所述检测方法操作简单、便于产业化推广。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

制备复合材料1

(1)具有SERS功能的金纳米球(AuNPs)的制备

把10mL5mM氯金酸加入到30mL超纯水中，加热至沸，再加入10mL1％柠檬酸三钠，待反应溶液的颜色变为紫色，停止反应，自然冷却至室温，溶液变为酒红色，便制得AuNPs，4℃保存。

(2)连接有拉曼信号分子的金纳米球(AuNP-MBA)的制备

把4-巯基苯甲酸(4-MBA)溶在四氢呋喃溶剂中，配制浓度为50mM的4-巯基苯甲酸的四氢呋喃溶液。

取3mL(1)所述的金纳米球，加入到9mL超纯水中，混合均匀，再加入30.0μL4-巯基苯甲酸溶液，待反应一定时间后，便制得AuNP-MBA材料，4℃保存。

(3)含有二硫键的高分子牛血清白蛋白(BSA)的还原及包裹有高分子的金纳米球(AuNP-MBA-BSA)的制备

配制1mg/mL的BSA水溶液，取10mL1mg/mLBSA，向其中加入65μL0.1M硼氢化钠水溶液，室温反应1h，在70℃水浴至无气泡产生，将制备的还原牛血清白蛋白(rBSA)稀释至0.5mg/mL，4℃保存。

取120μL0.5mg/mLrBSA加入到12mLAuNP-MBA溶液中，待反应一定时间后，制得AuNP-MBA-rBSA材料，4℃保存。

(4)还原BSA表面抗体的偶联

在EDAC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)的催化下，利用人前列腺特异性抗体FA的羧基与还原BSA表面的氨基之间的化学反应，在还原BSA表面偶联能够特异性靶向作用于人前列腺特异性抗原的人前列腺特异性抗体。

优选地，所述人前列腺特异性抗体在使用前需进行活化处理，具体处理方法简述如下：取人前列腺特异性抗体、EDC和NHS，溶于磷酸缓冲液(PBS)中，避光反应8h。

取经活化的人前列腺特异性抗体加入到12mLAuNP-MBA-rBSA中，反应16h，再使用超滤离心管(MWCO3.0kDa)浓缩离心，将AuNP-MBA-rBSA-FA浓缩至2mL，即可获得表面偶联有人前列腺特异性抗体的AuNP-MBA-rBSA-FA复合纳米材料。

(5)微球的制备及表面抗体的偶联

利用微乳液法制备聚苯乙烯微球，且在EDAC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)的催化下，利用人前列腺特异性抗体的氨基与微球表面的羧基之间的化学反应，在微球表面偶联能够特异性靶向作用于的人前列腺特异性抗原的人前列腺特异性抗体。

取经活化的人前列腺特异性抗体加入到微球中，反应16h，再使用超滤离心管(MWCO3.0kDa)浓缩离心，将微球浓缩，即可获得表面偶联有人前列腺特异性抗体的复合微球材料。表面偶联有人前列腺特异性抗体的AuNP-MBA-rBSA-FA复合纳米材料和表面偶联有人前列腺特异性抗体的复合微球材料共同构成基于SERS技术的复合材料1。

人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)或疾病标志物检测

复合材料的选择性实验：取200μL 1mg/mL AuNP-MBA-rBSA-FA和400μL2mg/mL接枝有叶酸的复合微球加入到4mL 0μg/L和10μg/L人前列腺特异性抗原中，在35℃恒温培养箱中孵育30min，500×g离心5min，弃去上清液，在使用PBS在相同转速时间下离心清洗3次，弃去上清液并将沉淀物定容到200μL，利用拉曼光谱仪测0μg/L和10μg/L人前列腺抗原样品的拉曼光谱。

复合材料的灵敏度实验：取100μL 1mg/mL AuNP-MBA-rBSA-FA和200μL2mg/mL接枝有叶酸的复合微球加入到4mL 50-1000ng/L人前列腺特异性抗原中(即50、100、500、1000ng/L浓度的人前列腺特异性抗原)，在35℃恒温培养箱中孵育30min，500×g离心5min，弃去上清液，在使用PBS在相同转速时间下离心清洗3次，弃去上清液并将沉淀物定容到200μL，利用拉曼光谱仪测50、100、500、1000ng/L的人前列腺特异性抗原样品的拉曼光谱。

结果

对实施例1所得产物进行粒径分析、形貌分析、成分分析和人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)或疾病标志物等检测。

经测算，所得金纳米球的平均粒径为60nm，形貌为球形。

所得聚苯乙烯微球的平均粒径为1000nm，形貌为球形。

所得复合材料1中金纳米球和聚苯乙烯微球的质量比为1：50-80。

在人前列腺特异性抗原(PSA)、人血红蛋白(Hb)、降钙素原(PCT)或疾病标志物检测过程中，在所述离心条件下，金纳米球的沉淀率为0-1％，聚苯乙烯微球的沉淀率为90-100％，故复合材料1的沉淀率可达到90-100％。

图2是实施例1所得复合材料1检测人前列腺特异性抗原(PSA)的选择性和灵敏度的初步验证结果，(a)为所述复合材料1对前列腺特异性抗原选择性检测结果，(b)为所述复合材料1对前列腺特异性抗原灵敏度检测结果。从图2可知，复合材料1对前列腺特异性抗原具有高检测灵敏度，且在50-1000ng/L人前列腺抗原浓度范围内，有清晰的信号峰，可实现对人前列腺抗原的低浓度检测。

上述实验结果表明，所述复合材料1对人前列腺抗原的检测灵敏度下限可低至50ng/L。

实施例2

制备复合材料2

(1)具有SERS功能的金纳米棒(AuNRPs)的制备

第一步，金种的制备，7.5mLCTAB和0.5mL5mM氯金酸混合均匀，再快速加入0.6mL0.01M硼氢化钠，待溶液变为棕色，即可制得金种，4℃保存。

第二步，生长液制备，100mL0.1MCTAB和0.1mL20mM硝酸银混合，加入12mL5mM氯金酸搅拌均匀，再加入0.48mL抗坏血酸水溶液，待溶液变为无色后，加入0.2mL金种，避光反应，待颜色变为深蓝色，便可制得具有SERS功能的金纳米棒(AuNRPs)。

(2)在纳米粒子表面连接拉曼信号分子、生物分子的二硫键的还原、在纳米粒子表面包裹还原生物高分子、还原生物高分子表面人前列腺特异性抗体的偶联、微球的制备及表面人前列腺特异性抗体的偶联与实施例1相同，即可制备一种基于SERS技术可用于检测人前列腺特异性抗原的复合材料2。

结果

经测试，得知复合材料2也可实现对人前列腺抗原的低浓度检测。

具体实验结果表明，所述复合材料2对人前列腺抗原的检测灵敏度下限可低至约30ng/L。

实施例3

制备复合材料3

(1)具有SERS功能的金纳米星(AuNS)的制备

第一步，金种的制备，把3mL5mM氯金酸加入到45mL超纯水中，加热至沸，再快速加入2.5mL1％柠檬酸三钠，待颜色变为紫色时停止反应，自然冷却至室温，液体颜色变为酒红色，4℃保存。第二步，生长液制备，1.0mL0.1MCTAB、2.75mL5mM氯金酸加入到45mL超纯水中，再加入50μL50mM硝酸银溶液，而后加入0.565mL10mg/mL抗坏血酸，待液体颜色变为无色时，加入50μL金种，待颜色变为深蓝色，便可制得具有SERS功能的金纳米星(AuNS)。

(2)在纳米粒子表面连接拉曼信号分子、生物分子的二硫键的还原、在纳米粒子表面包裹还原生物高分子、还原生物高分子表面人前列腺特异性抗体的偶联、微球的制备及表面人前列腺特异性抗体的偶联与实施例1相同，即可制备一种基于SERS技术可用于检测人前列腺特异性抗原的复合材料3。

结果

经测试，得知复合材料3也可实现对人前列腺抗原的低浓度检测。

具体实验结果表明，所述复合材料3对人前列腺抗原的检测灵敏度下限可低至约40ng/L。

实施例4

制备复合材料4

(1)具有SERS功能的银纳米球(AgNPs)的制备

把1mL20mM硝酸银加入到97mL超纯水中，再加入1mL保护剂(30mM柠檬酸三钠)，再加入1mL0.1M硼氢化钠，待反应一定时间后，便可制得颜色为黄色的银纳米球(AgNPs)。

(2)在纳米粒子表面连接拉曼信号分子、生物分子的二硫键的还原、在纳米粒子表面包裹还原生物高分子、还原生物高分子表面人前列腺特异性抗体的偶联、微球的制备及表面人前列腺特异性抗体的偶联与实施例1相同，即可制备一种基于SERS技术可用于检测人前列腺特异性抗原的复合材料4。

结果

经测试，得知复合材料4也可实现对人前列腺抗原的低浓度检测。

具体实验结果表明，所述复合材料4对人前列腺抗原的检测灵敏度下限可低至约45ng/L。

实施例5

制备复合材料5

(1)具有SERS功能的银纳米三角片(AgNRPs)的制备

把6mL30mM柠檬酸三钠、6mL0.7mM聚乙烯吡咯烷酮加入到99.5mL超纯水中，搅拌混合，向其中加入0.5mL20mM硝酸银和0.24mL30％过氧化氢，搅拌均匀。快速加入1mL0.1M硼氢化钠，避光反应一定时间后，待颜色变为蓝色后，便可制得具有SERS功能的银纳米三角片(AgNRPs)。

(2)在纳米粒子表面连接拉曼信号分子、生物高分子的二硫键的还原、在纳米粒子表面包裹还原生物高分子、还原生物高分子表面人前列腺特异性抗体的偶联、微球的制备及表面人前列腺特异性抗体的偶联与实施例1相同，即可制备一种基于SERS技术可用于检测人前列腺特异性抗原的复合材料5。

结果

经测试，得知复合材料5也可实现对人前列腺抗原的低浓度检测。

具体实验结果表明，所述复合材料5对人前列腺抗原的检测灵敏度下限可低至约35ng/L。

实施例6

制备复合材料6

将实施例1步骤(4)中还原BSA表面偶联的抗体和步骤(5)中聚苯乙烯微球偶联的抗体改为人血红蛋白特异性抗体。具体地，在EDAC的催化下，利用人血红蛋白特异性抗体的氨基与还原BSA和聚苯乙烯微球表面的羧基之间的化学反应，在还原BSA和微球表面偶联能够特异性靶向作用于人血红蛋白的特异性抗体。具体制备方法简述如下：用PBS作溶剂配制的人血红蛋白特异性抗体溶液，将EDAC溶于人血红蛋白特异性抗体溶液(冰浴)，然后取2mL活化人血红蛋白特异性抗体溶液加入到12mL AuNP-MBA-rBSA中，反应4-24h，即可获得表面偶联有人血红蛋白特异性抗体的AuNP-MBA-rBSA复合纳米材料；取活化人血红蛋白特异性抗体溶液加入到聚苯乙烯微球溶液中，反应4-24h，即可获得表面偶联有人血红蛋白特异性抗体的复合微球材料。其他步骤与实施例1相同，即可制得一种基于SERS技术特异性检测人血红蛋白的复合材料6。

结果

图3是实施例6所述复合材料6检测人血红蛋白(Hb)的选择性和灵敏度的初步验证结果，(a)为所述复合材料6对人血红蛋白选择性检测结果，(b)为所述复合材料6对人血红蛋白灵敏度检测结果。从图3可以看出，复合材料6对人血红蛋白(Hb)具有高检测灵敏度，且在100-1000ng/L人血红蛋白(Hb)浓度范围内，有清晰的信号峰，可实现对人血红蛋白(Hb)的低浓度检测。

所述复合材料6对人血红蛋白(Hb)的检测灵敏度下限可低至100ng/L。

实施例7

制备复合材料7

将实施例1步骤(4)中还原BSA表面偶联的抗体和步骤(5)中聚苯乙烯微球偶联的抗体改为胰腺癌标志物MUC4的特异性抗体，在EDAC的催化下，利用胰腺癌标志物MUC4的特异性抗体的氨基与还原BSA和聚苯乙烯微球表面的羧基之间的化学反应，在还原BSA和聚苯乙烯微球表面偶联能够特异性靶向作用于胰腺癌标志物MUC4的特异性抗体。具体制备方法简述如下：用PBS作溶剂配制胰腺癌标志物MUC4的特异性抗体溶液，将EDAC溶于胰腺癌标志物MUC4的特异性抗体溶液(冰浴)，然后取2mL活化胰腺癌标志物MUC4的特异性抗体溶液加入到12mL AuNP-MBA-rBSA中，反应4-24h，即可获得表面偶联有胰腺癌标志物MUC4的特异性抗体的AuNP-MBA-rBSA复合纳米材料；取活化胰腺癌标志物MUC4的特异性抗体溶液加入到聚苯乙烯微球溶液中，反应4-24h，即可获得表面偶联有胰腺癌标志物MUC4的特异性抗体的复合微球材料。其他步骤与实施例1相同，即可制得一种基于SERS技术特异性检测胰腺癌标志物MUC4的复合材料7。

结果

图4是实施例7所述复合材料7检测人胰腺癌标志物MUC4的选择性和灵敏度的初步验证结果，(a)为所述复合材料7对人胰腺癌标志物MUC4选择性检测结果，(b)为所述复合材料7对人胰腺癌标志物MUC4灵敏度检测结果。从图4可以看出，复合材料7对人胰腺癌标志物MUC4具有高检测灵敏度，且在0.01-10μg/L人胰腺癌标志物MUC4浓度范围内，有清晰的信号峰，可实现对人胰腺癌标志物MUC4的低浓度检测。

所述复合材料7对人胰腺癌标志物MUC4的检测灵敏度下限可低至0.01μg/L。

实施例8

制备复合材料8

将实施例1步骤(4)中还原BSA表面偶联的抗体和步骤(5)中聚苯乙烯微球偶联的抗体改为老年痴呆症标志物β-淀粉样肽的特异性抗体，在EDAC的催化下，利用老年痴呆症标志物β-淀粉样肽的特异性抗体的氨基与还原BSA和聚苯乙烯微球表面的羧基之间的化学反应，在还原BSA和聚苯乙烯微球表面偶联能够特异性靶向作用于老年痴呆症标志物β-淀粉样肽的特异性抗体。具体制备方法简述如下：用PBS作溶剂配制老年痴呆症标志物β-淀粉样肽的特异性抗体溶液，将EDAC溶于老年痴呆症标志物β-淀粉样肽的特异性抗体溶液(冰浴)，然后取2mL活化老年痴呆症标志物β-淀粉样肽的特异性抗体溶液加入到12mL AuNP-MBA-rBSA中，反应4-24h，即可获得表面偶联有老年痴呆症标志物β-淀粉样肽的特异性抗体的AuNP-MBA-rBSA复合纳米材料；取2mL活化老年痴呆症标志物β-淀粉样肽的特异性抗体溶液加入到10mL聚苯乙烯微球溶液中，反应4-24h，即可获得表面偶联有老年痴呆症标志物β-淀粉样肽的特异性抗体的复合微球材料。其他步骤与实施例1相同，即可制得一种基于SERS技术特异性检测老年痴呆症标志物β-淀粉样肽的复合材料8。

结果

图5是实施例8所述复合材料8检测老年痴呆症标志物β-淀粉样肽的选择性和灵敏度的初步验证结果，(a)为所述复合材料8对老年痴呆症标志物β-淀粉样肽选择性检测结果，(b)为所述复合材料8对老年痴呆症标志物β-淀粉样肽灵敏度检测结果。从图5可以看出，复合材料8对老年痴呆症标志物β-淀粉样肽具有高检测灵敏度，且在1-50μg/L老年痴呆症标志物β-淀粉样肽浓度范围内，有清晰的信号峰，可实现对老年痴呆症标志物β-淀粉样肽的低浓度检测。

所述复合材料8对老年痴呆症标志物β-淀粉样肽的检测灵敏度下限可低至1μg/L。

实施例9

制备复合材料9

将实施例1步骤(5)中的聚苯乙烯微球改为聚苯乙烯-丙烯酸微球，并在其表面偶联人前列腺特异性抗体，在EDAC的催化下，利用人前列腺特异性抗体的氨基与聚苯乙烯-丙烯酸微球表面的羧基之间的化学反应，在聚苯乙烯-丙烯酸微球表面偶联能够特异性靶向作用于人前列腺的特异性抗体。

在纳米粒子表面连接拉曼信号分子、生物高分子的二硫键的还原、在纳米粒子表面包裹还原生物高分子、还原生物高分子表面人前列腺特异性抗体的偶联、聚苯乙烯-丙烯酸微球的制备方法及表面人前列腺特异性抗体的偶联与实施例1相同，即可制备一种基于SERS技术可用于检测人前列腺特异性抗原的复合材料9。

结果

经测试，得知复合材料9也可实现对人前列腺抗原的低浓度检测。

具体实验结果表明，所述复合材料9对人前列腺抗原的检测灵敏度下限可低至约40ng/L。

实施例10

制备复合材料10

将实施例1步骤(5)中的聚苯乙烯微球改为聚苯乙烯-甲基丙烯酸微球，并在其表面偶联人前列腺特异性抗体，在EDAC的催化下，利用人前列腺特异性抗体的氨基与聚苯乙烯-甲基丙烯酸微球表面的羧基之间的化学反应，在聚苯乙烯-甲基丙烯酸微球表面偶联能够特异性靶向作用于人前列腺特异性抗原的特异性抗体。

在纳米粒子表面连接拉曼信号分子、生物高分子的二硫键的还原、在纳米粒子表面包裹还原生物高分子、还原生物高分子表面人前列腺特异性抗体的偶联、聚苯乙烯-甲基丙烯酸微球的制备方法及表面人前列腺特异性抗体的偶联与实施例1相同，即可制备一种基于SERS技术可用于检测人前列腺特异性抗原的复合材料10。

结果

经测试，得知复合材料10也可实现对人前列腺抗原的低浓度检测。

具体实验结果表明，所述复合材料10对人前列腺抗原的检测灵敏度下限可低至约40ng/L。

实施例11

制备复合材料11

将实施例1步骤(5)中的聚苯乙烯微球改为聚乳酸微球，并在其表面偶联人前列腺特异性抗体，在EDAC的催化下，利用人前列腺特异性抗体的氨基与聚乳酸微球表面的羧基之间的化学反应，在聚乳酸微球表面偶联能够特异性靶向作用于人前列腺特异性抗原的特异性抗体。

在纳米粒子表面连接拉曼信号分子、生物高分子的二硫键的还原、在纳米粒子表面包裹还原生物高分子、还原生物高分子表面人前列腺特异性抗体的偶联、聚乳酸微球的制备方法及表面人前列腺特异性抗体的偶联与实施例1相同，即可制备一种基于SERS技术可用于检测人前列腺特异性抗原的复合材料11。

结果

经测试，得知复合材料11也可实现对人前列腺抗原的低浓度检测。

具体实验结果表明，所述复合材料11对人前列腺抗原的检测灵敏度下限可低至约40ng/L。

实施例12

制备复合材料12

将实施例1步骤(5)中的聚苯乙烯微球改为聚乳酸-羟基乙酸微球，并在其表面偶联人前列腺特异性抗体，在EDAC的催化下，利用人前列腺特异性抗体的氨基与聚乳酸-羟基乙酸微球表面的羧基之间的化学反应，在聚乳酸-羟基乙酸微球表面偶联能够特异性靶向作用于人前列腺特异性抗原的特异性抗体。

在纳米粒子表面连接拉曼信号分子、生物高分子的二硫键的还原、在纳米粒子表面包裹还原生物高分子、还原生物高分子表面人前列腺特异性抗体的偶联、聚乳酸-羟基乙酸微球的制备方法及表面人前列腺特异性抗体的偶联与实施例1相同，即可制备一种基于SERS技术可用于检测人前列腺特异性抗原的复合材料12。

结果

经测试，得知复合材料13也可实现对人前列腺抗原的低浓度检测。

具体实验结果表明，所述复合材料13对人前列腺抗原的检测灵敏度下限可低至约30ng/L。

对比例1复合材料C1

同实施例1，区别在于：所述复合材料C1中不含聚苯乙烯微球

结果表明，当复合材料C1中不含聚苯乙烯微球时，500×g离心5min，复合材料C1与金纳米球相互作用的人前列腺抗原不能沉淀下来，或其沉淀率极小，导致复合材料C1对人前列腺抗原无选择性，或检测灵敏度下限要求非常高。

对比例2复合材料C2

同实施例1，区别在于：所述复合材料C2中高分子为非平躺式

当复合材料C2中高分子为非平躺式结合时，一方面，该高分子与靶分子叶酸相互作用的官能团很少，导致复合材料C2中接枝的叶酸量显著减少，使得沉淀率急剧下降，在拉曼检测中拉曼信号变得非常差，这进一步表明当使用该复合材料C2检测人前列腺抗原时要求更高的灵敏度下限；另一方面，在保证足够量的叶酸含量的情况下，就要求保护金纳米球的高分子数量增加，使得保护层变厚，阻碍SERS增强效果，导致拉曼信号变差，这会严重影响对人前列腺抗原的检测灵敏度。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种复合材料，其特征在于，所述复合材料包括：

(a)第一组分，所述第一组分包括：

(a-i)作为内核的微球，所述微球易于离心沉淀；和

(a-ii)位于外层的第一靶分子，所述第一靶分子修饰于所述微球表面，且与待测物具有特异性相互作用；和

(b)第二组分，所述第二组分包括：

(b-i)作为内核的贵金属粒子；

(b-ii)拉曼信号分子，所述拉曼信号分子固定和/或吸附于所述贵金属粒子表面；

(b-iii)作为中间层的高分子，所述高分子具有多个与所述贵金属粒子进行结合的结合官能团(binding functional group)，且所述高分子通过多个所述结合官能团结合于所述贵金属粒子的外周；和

(b-iv)位于外层的第二靶分子，所述第二靶分子偶联于所述高分子，且与待测物具有特异性相互作用；

并且，在含待测物溶液中，所述待测物与所述第一组分和所述第二组分通过所述第一靶分子和所述第二靶分子结合形成易于离心沉淀的复合物；

所述的高分子包括还原型牛血清白蛋白(rBSA)；

所述高分子“平躺式”地与所述贵金属粒子结合。

2.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述微球表面具有选自下组的基团：羧基、氨基、羟基、或其组合；和/或

所述微球的粒径为100nm-1000μm。

3.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述贵金属粒子选自下组：金、银、铂、或其组合；和/或

所述贵金属粒子的粒径为5-500nm。

4.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述结合官能团选自下组：巯基、氨基、或其组合。

5.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述高分子为线性高分子，且所述高分子的各分子链通过多个“金属－S键”和/或“金属-N键”与所述贵金属粒子化学键合。

6.如权利要求1所述的复合材料，其特征在于，所述第一靶分子和所述第二靶分子可相同或不同，各自独立地选自下组：单克隆抗体、叶酸、半乳糖胺、表皮生长因子EGF、多肽类物质、核酸适配体、或其组合。

7.一种权利要求1所述的复合材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)提供权利要求1所述的第一组分和第二组分，其中，

所述第一组分是如下制备的：

a-1)提供微球和第一靶分子；

a-2)在催化剂作用下，使微球和第一靶分子反应得到所述第一组分；

所述第二组分是如下制备的：

b-1)提供第一混合液、第二混合液、第三混合液和第四混合液，其中，

所述第一混合液含有第一溶剂和所述贵金属粒子；

所述第二混合液含有第二溶剂和所述拉曼信号分子；

所述第三混合液含有第三溶剂和所述高分子；

所述第四混合液含有第四溶剂和所述第二靶分子；

b-2)将所述第二混合液加入所述第一混合液中进行反应；

b-3)将所述第三混合液加入步骤b-2)所得产物中进行反应；

b-4)在催化剂作用下，将所述第四混合液加入步骤b-3)所得产物中进行反应，得到所述第二组分；

2)混合步骤1)所得第一组分和第二组分，得到权利要求1所述的复合材料。

8.一种权利要求1所述的复合材料的用途，其特征在于，用于制备鉴定和/或检测PSA、Hb、PCT或疾病标志物的试剂或药剂。

9.一种用于鉴定和/或检测PSA、Hb、PCT或疾病标志物的产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1所述的复合材料。