CN111175277A - 用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂、试剂盒、制备方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂、试剂盒、制备方法和检测方法，涉及生物标志物检测技术领域。本发明公开的检测试剂，其包括第一检测试剂和第二检测试剂中的至少一种。采用本发明提供的检测试剂、试剂盒或方法检测阿尔兹海默病的生物标记物，能够简便、准确、高效地对生物标志物定量检测，能够满足对灵敏性和特异性等方面的要求，对于阿尔兹海默病的早期诊断具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物标志物检测技术领域，具体而言，涉及一种用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂、试剂盒、制备方法和检测方法。
背景技术
阿尔兹海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种严重的大脑神经退行性疾病，多发于老年人，疾病进展会导致严重的认知功能损害和记忆障碍。由于目前还没有治愈的方法，因此AD的早期诊断至关重要。有研究表明，血清中的Aβ蛋白和tau蛋白可以作为AD临床实验室诊断的可能标志物。目前临床主要依赖ELISA法检测AD患者脑脊液中两种蛋白水平，此方法通常受到交叉反应和高非特异性结合的影响，灵敏性低，检测限只可达0.312ng/mL和0.15ng/mL，并且脑脊液的采集对患者创伤大。因此，急需一种超灵敏的分析方法来选择性测量血液样本中的Aβ蛋白和tau蛋白水平。
拉曼光谱技术能够反映物质分子的结构信息，不同生物分子呈现出其特异的光谱峰位和强度特征，可用作生物分子的“指纹鉴定”。表面增强拉曼散射光谱技术(SERS)能利用贵金属纳米材料的表面等离子体共振效应，使吸附在金属粗糙表面的生物分子的拉曼信号强度增大103～106倍，具有较高的灵敏度和特异度，从而使其成为一种检测痕量生物分子的重要工具,并应用于肿瘤标志物的鉴定。
但是现有的使用表面增强拉曼散射光谱技术检测阿尔兹海默病生物标志物Aβ蛋白和tau蛋白的相关试剂盒等拉曼增强效果不理想，并且对目标分子的检测灵敏度低。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂、试剂盒、制备方法和检测方法。采用本发明提供的检测试剂、试剂盒或方法检测阿尔兹海默病的生物标记物，能够简便、准确、高效地对生物标志物定量检测，能够满足对灵敏性和特异性等方面的要求，对于阿尔兹海默病的早期诊断具有重要的意义。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂，其包括第一检测试剂和第二检测试剂中的至少一种；
所述第一检测试剂包括同时负载有第一抗体和拉曼信号分子的纳米金属颗粒；
所述第二检测试剂包括负载有第二抗体的SERS基底，所述SERS基底为磁性氧化石墨烯；
其中，所述第一抗体和所述第二抗体均能够特异性结合所述阿尔兹海默病的生物标记物。
本发明实施例提供的检测试剂包括第一检测试剂和第二检测试剂，其中第二检测试剂以磁性氧化石墨烯作为基底并负载能够特异性结合所述生物标记物的第二抗体，第一检测试剂包括负载有第一抗体和拉曼信号分子的纳米金属颗粒，本发明的发明人通过利用磁性氧化石墨烯作为基底和利用纳米金属颗粒增强拉曼散射的特性，以及利用双抗夹心法的检测原理设计出上述的用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂，并通过实验验证惊喜了发现，使用本发明的检测试剂检测时，提高了检测的灵敏度和拉曼散射的效果，克服了现有检测试剂灵敏低和拉曼散射效果不理想的问题。
本发明提供的检测试剂同时也为阿尔兹海默病的早期诊断提供了新的选择和思路。
本发明的第一检测试剂和第二检测试剂进行检测的原理或方法是：先使用待测样本与第二检测试剂混合，如果待测样本含有生物标记物，则被结合到SERS基底上，再将第一检测试剂与第二检测试剂混合，由于SERS基底上结合的生物标记物，负载有第一抗体和拉曼信号分子的纳米金属颗粒通过第一抗体与生物标记物的结合而被结合至基底上，这样通过拉曼光谱仪检测拉曼信号分子的强度，即可反应样本中的生物标记物的有无以及浓度。
在可选的实施方式中，所述检测试剂包括第一检测试剂和第二检测试剂。
在可选的实施方式中，所述纳米金属颗粒选自金、银、铂、钯或其组合。
在可选的实施方式中，所述纳米金属颗粒为银。
在可选的实施方式中，所述纳米金属颗粒的直径为8-11nm。
本发明对纳米金属颗粒的金属类别不作特别限定，只要是金、银、铂、钯或者是这些金属中任意两种以上的合金等也是可以的，无论选用何种纳米金属，其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述拉曼信号分子选自4-巯基苯甲酸(4-MBA)、对巯基苯甲酸、对巯基苯胺、对巯基苯硼酸、2-硝基-5-巯基苯甲酸、2-氨基-6-巯基嘌呤、4-巯基吡啶、对巯基苯胺和罗丹明6G中的任意一种。
本发明对拉曼信号分子的类别不作特别限定，只要是4-巯基苯甲酸(4-MBA)、对巯基苯甲酸、对巯基苯胺、对巯基苯硼酸、2-硝基-5-巯基苯甲酸、2-氨基-6-巯基嘌呤、4-巯基吡啶、对巯基苯胺或罗丹明6G等能够有产生拉曼信号的物质均可以应用至本发明，无论选择何种拉曼信号分子，其均是属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述生物标记物为Aβ蛋白或tau蛋白。
目前，Aβ蛋白或tau蛋白是阿尔兹海默病的主要标志物，但这不意味着本发明的生物标记物仅限于Aβ蛋白或tau蛋白，只要是可以作为诊断阿尔兹海默病的任何标志物，其均可以是本发明检测试剂的检测对象，因此，无论选择何种生物标志物作为检测对象，其均属于本发明的保护范围。
另外，本领域技术人员可以根据需要，选择合适的抗生物标记物的抗体负载至纳米金属颗粒和磁性氧化石墨烯上，这对本领域技术人员来说是不需要付出创造性劳动的，因此，无论选择何种抗体，其主要是能够特异性结合生物标志物，即属于本发明的保护范围。
第二方面，实施例提供一种检测阿尔兹海默病生物标记物的试剂盒，其包括前述实施方式所述的检测试剂。
第三方面，实施例提供如前述实施方式任一项所述的检测试剂的制备方法，其包括如下步骤(a)和/或(b)：
步骤(a)：在所述纳米金属颗粒表面负载所述第一抗体和所述拉曼信号分子；
步骤(b)：在所述SERS基底表面负载所述第二抗体，所述SERS基底为磁性氧化石墨烯。
本发明实施例提供的制备方法操作简单，所制备的检测试剂具有灵敏度高，拉曼散射效果理想的特点。
在可选的实施方式中，所述步骤(a)包括：
步骤(a1)：将所述拉曼信号分子负载于所述纳米金属颗粒表面；
步骤(a2)：将所述第一抗体负载于结合有所述拉曼信号分子的纳米金属颗粒表面。
在可选的实施方式中，所述步骤(a1)包括：将含有所述纳米金属颗粒的分散液A与含有所述拉曼信号分子的溶液混合，得到混合溶液。
在可选的实施方式中，所述步骤(a1)还包括：搅拌所述混合溶液进行搅拌，搅拌时间为6-8h。
在可选的实施方式中，在搅拌结束后，对所述混合溶液进行固液分离，获取固体分离物，将所述固体分离物分散于水中，得到含有负载有所述拉曼信号分子的纳米金属颗粒的分散液B。
在可选的实施方式中，采用离心方式对所述混合溶液进行固液分离。
在可选的实施方式中，离心的转速为13000-15000rpm，4-6min。
在可选的实施方式中，所述步骤(a2)包括：往所述分散液B中加入活化剂，搅拌，离心后取沉淀，用PBS进行分散，得到分散液C，将所述分散液C与含有所述第一抗体的抗体溶液A混合，并进行反应以使所述第一抗体负载至结合有所述拉曼信号分子的纳米金属颗粒表面。
在可选的实施方式中，活化剂选自EDC和NHS中的至少一种。
在可选的实施方式中，所述步骤(a2)中，搅拌的时间为28-30min；
在可选的实施方式中，所述步骤(a2)中，离心的转速为13000-15000rpm，4-6min。
在可选的实施方式中，所述步骤(b)包括：将磁性氧化石墨烯分散液与含有所述第二抗体的抗体溶液B混合。
在可选的实施方式中，所述磁性氧化石墨烯分散液的浓度为4-6mg/mL。
第四方面，实施例提供一种阿尔兹海默病生物标记物的检测方法，使用前述实施方式任一项所述的检测试剂进行检测。
在可选的实施方式中，所述检测方法包括：将所述第二检测试剂与待测样本混合，再与所述第一检测试剂混合。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1.用于检测阿尔茨海默氏病生物标志物的基于SERS的免疫测定的制备和应用的示意图。
图2.纳米银探针的表征结果，(a)TEM，(b)紫外光谱图。
图3.磁性氧化石墨烯的SEM图。
图4.不同浓度Aβ蛋白检测的拉曼光谱图。
图5.不同浓度Tau蛋白检测的拉曼光谱图。
图6.分别以1585cm-1和1076cm-1处的拉曼信号强度与Aβ蛋白浓度所绘制的标准曲线。
图7.分别以1585cm-1和1076cm-1处的拉曼信号强度与Tau蛋白浓度所绘制的标准曲线。
图8.Serum1样本中的Aβ蛋白及Tau蛋白测定结果。
图9.Serum2样本中的Aβ蛋白及Tau蛋白测定结果。
图10.Serum2样本稀释10-103倍后Aβ蛋白检测的拉曼谱图。
图11.Serum2稀释10-103倍后Tau蛋白检测的拉曼谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明实施例提供制备用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂的方法，其包括如下步骤：
(1)制备第一检测试剂：
(a)纳米银探针(纳米银颗粒)制备：量取100mL去离子水置于烧杯中，称取0.17g硝酸银溶解于水中，放置在磁性搅拌器上搅拌，加入0.05g丹宁酸，继续搅拌；滴加1.2mL双氧水，1.2mL水合肼，继续搅拌20min，得到纳米银探针溶液，纳米银浓度为0.01mol/L。
(b)4-巯基苯甲酸(4-MBA)标记探针：取4mL所步骤(a)制备的纳米银探针，14000rpm离心20min，去上清，沉淀分散于1mL去离子水中；加入200μL 4-MBA乙醇溶液(浓度为1mmol/L)，室温搅拌7h，14000rpm，5min，水洗两次，去除多余标记分子，将沉淀分散于1mLH2O中，得到分散液。
(c)向上述分散液中加入50μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，浓度100mmol/L)、80μL N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS，浓度100mmol/L)，室温搅拌30min；14000rpm，5min，0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤两次，沉淀分散于1mL PBS中；向分散液中加入200μL抗Aβ抗体(浓度100μg/mL)，4℃静置12h；次日加入100μL牛血清白蛋白溶液(BSA，质量分数为3％)封闭剩余活性位点，4℃静置6h；离心去上清，沉淀分散于1mLPBS中，得到负载有抗Aβ抗体和4-MBA的纳米银探针；即制得第一检测试剂。
(2)制备第二检测试剂：
(a)SERS基底：5mg/mL磁性氧化石墨烯分散液(购于江苏先丰纳米材料科技有限公司)。
(b)取100μL 5mg/mL磁性氧化石墨烯分散液，离心去上清，沉淀分散于1mLPBS中；加入200μL抗Aβ抗体(浓度为100μg/mL)，4℃静置12h；次日加入50μL牛血清白蛋白溶液(BSA，质量分数为3％)封闭剩余活性位点，4℃静置6h；磁性分离去上清，沉淀分散于1mLPBS中，得到负载抗Aβ抗体的磁性氧化石墨烯，即第二检测试剂。
本实施例制得的检测试剂可以检测阿尔兹海默病生物标记物Aβ蛋白。
实施例2
本发明实施例提供制备用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂的方法，其与实施例1的方法基本相同，不同的是：本实施例中，用抗tau抗体代替抗Aβ抗体。
本实施例制得的检测试剂可以检测阿尔兹海默病生物标记物tau蛋白。
实施例1和实施例1的制备方法的示意以及所得检测试剂检测生物标志物的原理图可以参考图1。
实施例3
本实施例提供了使用实施例1或实施例2检测阿尔兹海默病生物标记物的方法，其包括：
(1)取第二检测试剂150μL于2mLEP管中，加入40μL待测样品(例如稀释后的血清样本，也可以是标准品)，室温静置3h；PBS洗涤以去除未结合抗原；加入200μL第一检测试剂，室温静置2h；磁性分离去上清，PBS洗涤两次，沉淀物分散于100μL去离子水中；利用具有固态激光器的英国雷尼绍Invia拉曼光谱仪(激发波长为532nm，35mW)进行拉曼信号检测。
(2)结果分析：以tau或Aβ蛋白的标准品不同浓度的lg值与所检测出的拉曼信号强度作标准曲线，确定回归方程，通过检测出的样本中蛋白的拉曼信号强度结合回归方程计算出样本中的tau或Aβ蛋白的含量。
需要说明的是，当检测的是Aβ蛋白含量时，使用实施例1的检测试剂上述检测方法，当检测的是tau蛋白含量时，使用实施例2的检测试剂进行上述检测方法。
实验例1
材料表征
采用实施例1方法制得的纳米银探针的直径为10mn，纳米银周围存在有机物包裹(见图2中a)，这可增强探针的稳定性，紫外光谱图显示，探针的紫外吸收峰在400nm处，为银的特征峰(见图2中b)。
图3显示了未负载抗体的磁性氧化石墨烯的SEM图，可见灰色的片层状结构为氧化石墨烯，负载的黑色小颗粒为四氧化三铁粒子，便于磁性分离。
实验例2
灵敏度测试
使用实施例1的检测试剂，参照实施例3的方法，检测不同浓度的Aβ蛋白标准品，结果见图4。
如图4所示，在1585cm-1和1076cm-1处具有标记分子4-MBA的特征峰；同时可见随着蛋白浓度的降低，拉曼信号强度随之减弱，Aβ蛋白在10fg/mL浓度水平仍可检测到拉曼信号，tau蛋白的检测可达到1fg/mL浓度水平。
使用实施例2的检测试剂，参照实施例3的方法，检测不同浓度的tau标准品，结果见图5。
如图5所示，在1585cm-1和1076cm-1处具有标记分子4-MBA的特征峰；同时可见随着蛋白浓度的降低，拉曼信号强度随之减弱，tau蛋白的检测可达到1fg/mL浓度水平。
可以看出，使用两种实施例的检测试剂，拉曼信号效果理想，检测的灵敏低，可以将低至1fg/mL的tau蛋白检测出。
实验例3
1检测六例阿尔兹海默病患者血清样本(Serum1-Serum6)中的Aβ蛋白和tau蛋白水平
(1)以Aβ蛋白的标准品不同浓度的lg值与1585cm-1和1076cm-1处所检测出的拉曼信号强度作标准曲线，确定回归方程，见图6。
(2)以tau蛋白的标准品不同浓度的lg值与1585cm-1和1076cm-1处所检测出的拉曼信号强度作标准曲线，确定回归方程，见图7。
(3)参照实施例3的方法，结合上述的回归方程，计算六例阿尔兹海默病患者血清样本中的Aβ蛋白和tau蛋白水平，Serum1及Serum2结果见图8和图9，Serum3-Serum6检测原理与其相同。
图8显示为了样本Serum1中的Aβ蛋白和tau蛋白的拉曼谱图；
图9显示为了样本Serum2中的Aβ蛋白和tau蛋白的拉曼谱图。
根据样本在1585cm-1处所检测出的拉曼信号强度代入图6和图7所示的回归方程中，计算出血清样本中的Aβ蛋白和tau蛋白水平，见下表1(表中ELISA结果显示为“？”表示ELISA未能检测出此蛋白浓度)。
表1.SERS、ELISA检测结果比较
如表1所示，以实施例3的检测方法，能较好地检测出阿尔兹海默病患者血清样本中Aβ蛋白和tau蛋白水平，其结果与ELISA结果具有良好的相关性。同时实施例3的检测方法灵敏度显著高于ELISA，能够检测出ELISA未能检测出的血清蛋白浓度。
2进一步检测稀释条件下阿尔兹海默病患者血清样本(Serum2)中的Aβ蛋白和tau蛋白水平
(1)将Serum2血清用0.01mol/L PBS缓冲液稀释10-103倍。
(2)以实施例3的检测方法进行检测，Serum2稀释后两种蛋白检测结果见图10和图11。
图10显示为样本Serum2稀释10-103倍后的Aβ蛋白的拉曼谱图；
图11显示为样本Serum2稀释10-103倍后的tau蛋白的拉曼谱图。
从图10、图11可以看出，即使将血清样本稀释10-103倍，实施例3的检测方法仍能较好地检测出Aβ蛋白及tau蛋白，具有较高的灵敏度。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测阿尔兹海默病生物标记物的检测试剂，其特征在于，其包括第一检测试剂和第二检测试剂中的至少一种；
所述第一检测试剂包括同时负载有第一抗体和拉曼信号分子的纳米金属颗粒；
所述第二检测试剂包括负载有第二抗体的SERS基底，所述SERS基底为磁性氧化石墨烯；
其中，所述第一抗体和所述第二抗体均能够特异性结合所述阿尔兹海默病的生物标记物。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括第一检测试剂和第二检测试剂；
优选地，所述纳米金属颗粒选自金、银、铂、钯或其组合；
优选地，所述纳米金属颗粒为银；
优选地，所述纳米金属颗粒的直径为8-11nm。
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述拉曼信号分子选自4-巯基苯甲酸、对巯基苯甲酸、对巯基苯胺、对巯基苯硼酸、2-硝基-5-巯基苯甲酸、2-氨基-6-巯基嘌呤、4-巯基吡啶、对巯基苯胺和罗丹明6G中的任意一种；
优选地，所述拉曼信号分子为4-巯基苯甲酸。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测试剂，其特征在于，所述生物标记物为Aβ蛋白或tau蛋白。
5.一种检测阿尔兹海默病生物标记物的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的检测试剂。
6.如权利要求1-4任一项所述的检测试剂的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤(a)和/或(b)：
步骤(a)：在所述纳米金属颗粒表面负载所述第一抗体和所述拉曼信号分子；
步骤(b)：在所述SERS基底表面负载所述第二抗体，所述SERS基底为磁性氧化石墨烯。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)包括：
步骤(a1)：将所述拉曼信号分子负载于所述纳米金属颗粒表面；
步骤(a2)：将所述第一抗体负载于结合有所述拉曼信号分子的纳米金属颗粒表面；
优选地，所述步骤(a1)包括：将含有所述纳米金属颗粒的分散液A与含有所述拉曼信号分子的溶液混合，得到混合溶液；
优选地，所述步骤(a1)还包括：搅拌所述混合溶液进行搅拌，搅拌时间为6-8h，
优选地，在搅拌结束后，对所述混合溶液进行固液分离，获取固体分离物，将所述固体分离物分散于水中，得到含有负载有所述拉曼信号分子的纳米金属颗粒的分散液B；
优选地，采用离心方式对所述混合溶液进行固液分离；
优选地，离心的转速为13000-15000rpm，4-6min。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a2)包括：往所述分散液B中加入活化剂，搅拌，离心后取沉淀，用PBS进行分散，得到分散液C，将所述分散液C与含有所述第一抗体的抗体溶液A混合，并进行反应以使所述第一抗体负载至结合有所述拉曼信号分子的纳米金属颗粒表面；
优选地，活化剂选自EDC和NHS中的至少一种；
优选地，所述步骤(a2)中，搅拌的时间为28-30min；
优选地，所述步骤(a2)中，离心的转速为13000-15000rpm，4-6min。
9.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)包括：将磁性氧化石墨烯分散液与含有所述第二抗体的抗体溶液B混合；
优选地，所述磁性氧化石墨烯分散液的浓度为4-6mg/mL。
10.一种阿尔兹海默病生物标记物的检测方法，其特征在于，使用权利要求1-4任一项所述的检测试剂进行检测；
优选地，所述检测方法包括：将所述第二检测试剂与待测样本混合，再与所述第一检测试剂混合。
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