CN111537492A - 一种均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针的制备方法及其制备的探针和应用 - Google Patents

一种均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针的制备方法及其制备的探针和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针的制备方法及其制备的探针和应用，该方法包括制备表面增强拉曼探针A，制备表面增强拉曼探针B，以及将两种探针表面的DNA互补配对形成DNA双链，使得金属纳米粒子的间距减小，形成信号均匀的高灵敏表面增强拉曼探针。本发明利用DNA链的互补配对缩短金属纳米粒子之间的间距，产生均匀而狭窄的纳米间隙，从而提高表面增强拉曼探针的表面增强拉曼散射信号强度，提高表面增强拉曼探针的检测灵敏度和均匀性，本发明制备的探针在复杂环境中的痕量检测具有重要价值，对于丰富生化分析中的检测手段也具有很大的意义。

Description

一种均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针的制备方法及其制 备的探针和应用
技术领域
本发明属于生物光子学和纳米光学，具体涉及一种均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针的制备方法及其制备的探针和应用。
背景技术
拉曼光谱包含丰富的分子振动、转动方面的信息，属于分子振动光谱，可以反映分子的特征结构，从而对物质进行特异性的识别，但由于物质分子本身的拉曼散射强度非常低，因此往往难以检测到有效的光谱信息。表面增强拉曼光谱是指在金、银、铜等金属的粗糙表面，分子的拉曼散射能够得到极大的增强。表面增强拉曼光谱的发现极大的扩展了拉曼光谱的应用范围，目前利用表面增强拉曼光谱的检测可以分为两类：其一是无标记的检测，通过直接检测目标分子本身的表面增强拉曼散射来进行检测，但受到目标分子表面增强拉曼散射强度的限制；其二是有标记的检测，通过检测具有强表面增强拉曼散射的分子的表面增强拉曼光谱来间接检测目标分子，不受目标分子本身表面增强拉曼散射强度的限制。但现有的有标检测方法所用的表面增强拉曼光谱探针的光谱强度取决于制备探针所用的纳米材料的增强效果，往往难以应对痕量待测物的检测。虽然一些研究针对纳米材料的形貌等进行了改进，所取得的效果依然受限于单个纳米材料本身提供的增强。利用DNA等实现纳米粒子间的电磁场耦合可以进一步提高增强效果，但传统方法是将特定基团如巯基、氨基等同时修饰在两条互补DNA链的5’端或者同时修饰在两条互补DNA链的3’端，DNA互补结合后，纳米粒子位于双链DNA的两端，粒子间距较大，通常在5纳米以上，电磁场耦合较弱，难以产生足够强的表面增强拉曼信号，如传统方法参考文献有：1、A SERS-active sensorbased on heterogeneous gold nanostar core–silver nanoparticle satelliteassemblies for ultrasensitive detection of aflatoxinB1,Nanoscale,2016,8,1873-1878；2、DNA-Directed Gold Nanodimers with Tailored Ensemble Surface-EnhancedRaman Scattering Properties,ACS Appl.Mater.Interfaces 2013,5,21,10423-10427)。因此，获得均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针，实现基于表面增强拉曼光谱的高灵敏检测对于表面增强拉曼光谱在复杂环境中的痕量检测具有重要价值，对于丰富生化分析中的检测手段也具有很大的意义。
发明内容：
本发明目的：为解决现有技术中的不足，本发明提供一种均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针的制备方法，该方法利用互补的两条DNA链分别修饰金属纳米粒子，再在金属纳米粒子表面标记拉曼分子，然后通过DNA链的互补配对来缩短金属纳米粒子间的距离，并最终和纳米粒子之间的静电斥力达到平衡，从而在纳米粒子间产生纳米或亚纳米级的均匀间隙，实现强电磁场耦合，从而产生更大的拉曼增强以解决现有的表面增强拉曼光谱检测灵敏度较低的问题。同时，由于DNA互补结合力和纳米粒子静电斥力是固定的，因此该方法形成的纳米探针具有很好的信号均一性，可以解决表面增强拉曼光谱在实际应用中的可靠性问题。在存在目标分子的情况下，DNA链优先和目标分子结合，从而减少DNA链的互补，导致拉曼分子表面增强拉曼光谱减弱，利用目标分子浓度和拉曼分子表面增强拉曼散射信号强度之间的关系可以实现对目标分子的检测。
本发明还提供了一种均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针及其应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备表面增强拉曼探针A：往金属纳米材料溶液中加入探针DNA单链和拉曼分子，并用封闭DNA链封闭纳米材料表面的剩余结合位点，获得表面增强拉曼探针A；
(2)制备表面增强拉曼探针B：在金属纳米材料表面依次修饰探针DNA的互补DNA单链、拉曼分子，并用封闭DNA链封闭纳米材料表面的剩余结合位点，获得表面增强拉曼探针B；
(3)将探针A和探针B混合，两种探针表面的DNA互补配对形成DNA双链，使的金属纳米材料中的金属纳米粒子的间距减小，形成信号均匀的高灵敏表面增强拉曼探针。
其中，步骤(1)和步骤(2)所述的金属纳米材料指能够实现表面增强拉曼散射的纳米材料，如金、银、铂、铜等。
其中，步骤(1)和步骤(2)所述的拉曼分子指能与金属纳米材料中的金属纳米粒子结合后能够产生表面增强拉曼散射光谱的分子，如5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、对巯基苯甲酸、二硝基苯甲酸、罗丹明6G、结晶紫、尼罗蓝等。
其中，步骤(1)和步骤(2)所述的封闭DNA链是指与探针本身及探针应用目标无特异性作用的DNA链，所述DNA如鲑鱼精DNA等，其中目标指待检测的目标分子包括小分子、蛋白质、DNA等物质如多巴胺、凝血酶等。
其中，步骤(1)所述的探针DNA单链指一端(5’端或3’端)修饰了能与金属纳米材料中的金属纳米粒子结合的化学基团且与目标分子能特异性结合的DNA单链，所述DNA如多巴胺适配体DNA、凝血酶适配体DNA等，所述化学基团如巯基、氨基等。
其中，步骤(2)所述的探针DNA的互补DNA单链是指在步骤(1)探针DNA单链修饰化学基团的相反一端修饰了能与金属纳米材料中的金属纳米粒子结合的化学基团且能够与步骤(1)所述探针DNA单链通过碱基的互补配对相互结合的DNA单链。所述化学基团可以与步骤(1)DNA单链化学基团相同或者不同，只要保证能连上纳米粒子即可。
作为优选，所述的化学基团分别修饰在两种DNA单链的5’端和3’端，即分别修饰在探针DNA单链和探针DNA的互补DNA单链的5’端和3’端，且不在同一端，在两种DNA单链互补后形成双链DNA后位于双链DNA的同一端。
本发明所述的制备方法所制备的均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针，其结构为拉链状的二聚体或多聚体结构，纳米粒子位于双链DNA的同一端。
本发明所述的制备方法所制备的均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针在检测多巴胺、凝血酶等小分子和蛋白质、DNA、RNA等大分子中的应用。本发明中检测可以是任意目标DNA分子。
其中，所述检测为向含有均匀的高灵敏表面增强拉曼探针溶液中加入检测的目标分子，并检测拉曼分子的表面增强拉曼光谱强度，根据拉曼分子的表面增强拉曼光谱强度和目标分子浓度之间的校准曲线获得目标分子的浓度，当检测的目标分子为DNA或者RNA时，探针A、探针B不预先混合，直接将探针A、探针B和检测的目标同时混合，并检测拉曼分子的表面增强拉曼光谱强度，根据拉曼分子的表面增强拉曼光谱强度和目标分子浓度之间的校准曲线获得目标分子的浓度。本发明的探针检测小分子或者蛋白质等目标物质的时候，AB先混合，形成探针，然后加入目标物，由于目标物和适配体的结合力很强，因此目标物会与探针A结合，使其与B探针分离，从而破坏探针结构；而检测DNA或者RNA时，由于目标DNA与探针A的结合力不够强，所以不能有效的破坏已经结合的探针AB，所以需要目标DNA和探针A和B同时混合，从而减少探针A和探针B之间的结合几率，减少形成的探针的数量，然后导致信号变化来进行检测。
进一步地，所述的拉曼分子的表面增强拉曼光谱强度和目标分子浓度之间的校准曲线，其依据在于目标分子和探针DNA的亲和力高于探针DNA和互补DNA之间的亲和力，目标分子浓度越高，形成的DNA双链越少，检测到的拉曼分子的表面增强拉曼光谱越弱，从而建立拉曼分子的表面增强拉曼光谱强度和目标分子浓度之间的校准曲线。
其中，所述检测拉曼分子的表面增强拉曼光谱强度，所用的仪器为拉曼光谱仪；目标分子是指使用本发明中的表面增强拉曼探针进行检测的待测物，如小分子、蛋白质、DNA、RNA等。
利用DNA等实现纳米粒子间的电磁场耦合可以进一步提高增强效果，但传统方法是同将特定基团如巯基等同时修饰在两条互补DNA链的5’端或者同时修饰在两条互补DNA链的3’端，DNA互补结合后，纳米粒子位于双链DNA的两端，粒子间距较大，电磁场耦合较弱，难以产生足够强的表面增强拉曼信号，同时改变本发明中步骤1中的DNA单链的DNA序列，即可应用于不同目标分子。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针的制备，其利用DNA链的互补配对缩短了金属纳米粒子间距，纳米粒子位于双链DNA的同一端，产生更大的电磁场增强和更高的表面增强拉曼光谱强度，从而能够实现更灵敏的检测，有效的解决了现有技术中纳米粒子位于双链DNA的两端，粒子间距较大，电磁场耦合较弱，难以产生足够强的表面增强拉曼信号等问题；
2、本发明中使用的DNA链的互补作用力与金属纳米粒子间的静电排斥力达到的平衡使金属纳米粒子间的间距更稳定，产生的表面增强拉曼光谱强度更均匀，检测的可靠性更高；
3、本发明的制备简单，操作简便，无需复杂和极端条件，改变修饰的化学基团即可应用于不同的纳米材料；
4、本发明的应用灵活、广泛，改变DNA序列即可应用于不同目标分子；
5、本发明极大的提高了对痕量物质的检测灵敏度，实现更精确的检测。
附图说明
图1为均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针的结构示意图；
图2为传统方法与本发明探针结构的透射电子显微镜成像和电磁场模拟图；
图3为传统方法检测不同浓度多巴胺的表面增强拉曼光谱结果图；
图4为实施例1中检测不同浓度多巴胺的表面增强拉曼光谱结果图；
图5为实施例1中多次检测同一浓度多巴胺的表面增强拉曼光谱均匀性结果图；
图6为实施例2中检测不同浓度DNA的表面增强拉曼光谱结果图；
图7为实施例2中多次检测同一浓度DNA的表面增强拉曼光谱均匀性结果图；
图8为实施例3中检测不同浓度多巴胺的表面增强拉曼光谱结果图；
图9为实施例4中检测不同浓度凝血酶的表面增强拉曼光谱结果图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
实施例1
1、制备银胶溶液：将11mg硝酸银溶解在61.25ml去离子水中，加热搅拌至沸腾后，加入1.25mL1％重量百分比的二水合柠檬酸三钠溶液，继续反应50分钟后停止加热，自然冷却后得到银胶溶液，待用；
2、制备银纳米表面增强拉曼探针A：往1mL银胶溶液中加入100uL浓度为10uM的一端修饰巯基的多巴胺核酸适配体(5’-SH-GTCTC TGTGTGC GCCA GAGAACACT GGGGCAGATATGGGCCAGCACAGAATGAGGCCC-3’)后室温磁力搅拌反应12h；再每隔4小时加入50uL的含有0.6M氯化钠的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，共加3次；随后加入5uL浓度为10mM的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液(拉曼分子)，室温反应半小时后加入50ul浓度为1mg/mL的鲑鱼精DNA溶液(购买自Sigma-Aldrich试剂公司)(直接购买的，是多种序列的混合物)，反应12h后将溶液以7000rpm速度的离心15min，然后去掉上清液，沉淀重新分散在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中。
3、制备银纳米表面增强拉曼探针B:往1mL银胶溶液中加入100ul浓度为10uM的一端修饰巯基的互补DNA链(5’-GGGCC TCATTC TGTGCTG GCCCAT ATCTGCCCCA GTGTTCTCTGGCGCACACAGAGAC-SH-3’)后磁力搅拌反应12h；再每隔4小时加入50uL的含有0.6M氯化钠的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，共加3次；随后加入5uL浓度为10mM的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液，室温磁力搅拌反应半小时后加入50ul浓度为1mg/ml的鲑鱼精DNA溶液，反应12h后将溶液以7000rpm速度的离心15min，然后去掉上清液，沉淀重新分散在磷酸盐缓冲液中。
4、将50uL浓度为10nM的银纳米表面增强拉曼探针A和50uL浓度为10nM的银纳米表面增强拉曼探针B混合，37℃反应8h后，形成高灵敏表面增强拉曼探针溶液，加入10uL不同浓度(0.01fM-10pM)的多巴胺溶液再反应1h，用拉曼光谱仪测量溶液中拉曼分子5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的表面增强拉曼光谱，建立多巴胺浓度和5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)表面增强拉曼光谱强度的对应关系，实现对多巴胺的检测。
而参考传统探针合成方法基本同本实施例的步骤2-3，区别在于步骤2和步骤3中DNA链为巯基同时修饰在5’端或者同时修饰在3’端，将两种传统探针混合即可得到传统二聚体结构。
如图1和图2所示，本发明的探针A和B在结合时，形成双链DNA后纳米粒子位于双链DNA的同一端，受到DNA互补结合产生的收缩力导致间距不断减小，随着间距减小，探针A和B之间的静电斥力增大，直到收缩力和斥力达到平衡，对于已确定的DNA和纳米粒子，收缩力和斥力是确定的，因此可以形成具有更小更均匀纳米间隙的二聚体结构，其间隙可达到亚纳米级别(正常指低于1nm的，本发明方法可实现0.5nm-1nm范围)，产生更大的电磁场增强。而传统方法探针A和B在结合时是将特定基团如巯基等同时修饰在两条互补DNA链的5’端或者同时修饰在两条互补DNA链的3’端，DNA互补结合后，纳米粒子位于双链DNA的两端，粒子间距较大，在5纳米以上，电磁场耦合较弱，难以产生足够强的表面增强拉曼信号。
如图3和图4所示，本实施例这种高灵敏表面增强拉曼探针对多巴胺的定量检测限可达到0.1fM，相比传统的表面增强拉曼探针提高了3个数量级以上；同时，如图5所示即使在测量1fM的超低浓度时，其不同区域的测量结果仍然具有很好的信号均匀性，相对标准偏差仅为4.6％，可以解决实际检测中，由于信号不均匀性所引起的浓度测量误差，提高检测结果的可靠性和稳定性。
实施例2
1、制备金胶溶液：将100uL质量分数10％的氯金酸溶液加入100ml去离子水中，加热搅拌至沸腾后，加入4ml 1％重量百分比的二水合柠檬酸三钠溶液，继续反应50分钟后停止加热，自然冷却后得到金胶溶液，待用；
2、制备金纳米表面增强拉曼探针A：往1mL金胶溶液中加入100uL浓度为10uM的一端修饰巯基的探针DNA(5’-SH-CGAATTCCGGAACGTTCCGGAATTCGCCGGAATTCCCGGG-3’)后室温搅拌反应12h，其序列为所要检测的任意目标DNA的互补序列；再每隔4小时加入50uL的含有0.6M氯化钠的磷酸盐缓冲液，共加3次；随后加入5uL浓度为10mM的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液，反应半小时后加入50ul浓度为1mg/ml的鲑鱼精DNA溶液，反应12h后将溶液以7000rpm速度的离心15min，然后去掉上清液，沉淀重新分散在磷酸盐缓冲液中。
3、制备金纳米表面增强拉曼探针B：往1mL金胶溶液中加入100uL浓度为10uM的一端修饰巯基的互补DNA链(3’-SH-GCTTAAGGCCTTGCAAGGCCTTAAGCGGCCTTAAGGGCCC-5’)后搅拌反应12h；再每隔4小时加入50ul的含有0.6M氯化钠的pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，共加3次；随后加入5uL浓度为10mM的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液，反应半小时后加入50uL浓度为1mg/ml的鲑鱼精DNA溶液，反应12h后将溶液以7000rpm速度的离心15min，然后去掉上清液，沉淀重新分散在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中。
4、将50ul金纳米表面增强拉曼探针A、50ul金纳米表面增强拉曼探针B和10uL不同浓度(1fM-100pM)的目标DNA(3’-GCTTAAGGCCTTG CAAGGCCTTAAGCGGCC TTAAGGGCCC-5’)溶液同时混合，37度反应8h后，用拉曼光谱仪测量溶液中拉曼分子5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的表面增强拉曼光谱，本实施例由于目标DNA和探针A上的DNA互补结合后会占据探针A上的结合位点，从而减少探针A和探针B之间的结合几率，导致信号减弱，目标DNA浓度越高，探针A和探针B的结合越少，因此可以建立目标DNA链浓度和5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)表面增强拉曼光谱强度的对应关系，实现对目标DNA的检测。
如图6所示，利用本实施例中的高灵敏表面增强拉曼探针对DNA进行检测，其定量检测灵敏度可达1fM，能够满足对生物样本中痕量DNA的定量检测。如图7所示，在对超低浓度DNA(1fM)的检测中，10次表面增强拉曼信号测量结果的相对标准偏差为3.37％，具有很好的均匀性。
实施例3
该实施例中涉及的食人鱼(piranha)溶液为质量分数98％的浓硫酸和质量分数30％的双氧水按体积比3：1比例混合而成。
1、合成探针A和探针B，合成方法同实施例1。
2、制备表面增强拉曼散射衬底：将50uL浓度为10nM的银纳米表面增强拉曼探针A和50uL浓度为10nM的银纳米表面增强拉曼探针B混合，37℃反应8h后，形成高灵敏表面增强拉曼探针溶液；将玻璃片用piranha溶液浸泡清洗半小时后用去离子水将玻璃片上残余的piranha溶液冲洗干净，放入烘箱100℃烘干两小时；将烘干后的玻璃片依次分别浸泡在1％质量分数的PDDA和高灵敏表面增强拉曼探针溶液中各2h；
3、样品检测：将上述处理后的玻璃片浸泡在不同浓度的多巴胺(10fM-10nM)溶液中，室温反应2h后，用拉曼光谱仪测量玻璃片上拉曼分子5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的表面增强拉曼光谱，建立多巴胺浓度和5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)表面增强拉曼光谱强度的对应关系，实现对多巴胺的检测。
如图8所示，本发明中的高灵敏表面增强拉曼探针也可适用于在玻璃片等表面对痕量样品进行测定，其灵敏度依然可以达到0.1pM，表明本发明中的高灵敏表面增强拉曼探针不仅可以在溶液中进行检测，也可以用于制备便携、易操作的检测芯片等；
实施例4
制备方法与实施例1相同，不同点在于目标分子为凝血酶(浓度范围1fM-1nM)，所用的步骤(1)的DNA链分别为凝血酶的核酸适配体5’-SH-GGTTGGTGTGGTTGG-3’，互补链为3’-SH-CCAACCACA CCAACC-5’。如图9所示，本发明的高灵敏探针对凝血酶的检测限可达到10fM。
实施例5
实施例5与实施例1制备方法相同，不同之处在于，金属纳米材料采用金纳米粒子，拉曼分子采用对巯基苯甲酸，探针DNA单链修饰了能与金属纳米材料中的金属纳米粒子结合的化学基团为氨基。
实施例6
实施例6与实施例1制备方法相同，不同之处在于，金属纳米材料采用铜纳米粒子，拉曼分子采用二硝基苯甲酸。
实施例7
实施例7与实施例1制备方法相同，不同之处在于，金属纳米材料采用铂纳米粒子，拉曼分子采用罗丹明6G。
实施例8
实施例8与实施例1制备方法相同，不同之处在于，拉曼分子采用结晶紫。
实施例9
实施例9与实施例1制备方法相同，不同之处在于，拉曼分子采用尼罗蓝。

Claims (10)

1.一种均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备表面增强拉曼探针A：往金属纳米材料溶液中加入探针DNA单链和拉曼分子，并用封闭DNA链封闭纳米材料表面的剩余结合位点，获得表面增强拉曼探针A；
(2)制备表面增强拉曼探针B：在金属纳米材料表面依次修饰探针DNA的互补DNA单链、拉曼分子，并用封闭DNA链封闭纳米材料表面的剩余结合位点，获得表面增强拉曼探针B；
(3)将探针A和探针B混合，两种探针表面的DNA互补配对形成DNA双链，使的金属纳米材料中的金属纳米粒子的间距减小，形成信号均匀的高灵敏表面增强拉曼探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述的金属纳米材料指能够实现表面增强拉曼散射的金属纳米材料。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述的拉曼分子指能与金属纳米材料中的金属纳米粒子结合后能够产生表面增强拉曼散射光谱的分子。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述的封闭DNA链是指与探针本身及探针应用目标无特异性作用的DNA链。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的探针DNA单链指一端修饰了能与金属纳米材料中的金属纳米粒子结合的化学基团，且与目标分子能特异性结合的DNA单链。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的探针DNA的互补DNA单链是指在步骤(1)探针DNA单链修饰化学基团的相反一端修饰了能与金属纳米材料中的金属纳米粒子结合的化学基团且能够与步骤(1)所述探针DNA单链通过碱基的互补配对相互结合的DNA单链。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述的化学基团分别修饰在两种DNA单链的5’端和3’端，在两种DNA单链互补后形成双链DNA后位于双链DNA的同一端。
8.一种权利要求1所述的制备方法所制备的均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针，其结构为二聚体或多聚体结构，纳米粒子位于双链DNA的同一端。
9.一种权利要求1所述的制备方法所制备的均匀的高灵敏表面增强拉曼光谱探针在检测小分子、蛋白质、DNA、RNA等物质中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述检测为向含有均匀的高灵敏表面增强拉曼探针溶液中加入检测的目标分子，并检测拉曼分子的表面增强拉曼光谱强度，根据拉曼分子的表面增强拉曼光谱强度和目标分子浓度之间的校准曲线获得目标分子的浓度；当检测的目标分子为DNA或者RNA时，探针A、探针B不预先混合，直接将探针A、探针B和检测的目标同时混合，并检测拉曼分子的表面增强拉曼光谱强度，根据拉曼分子的表面增强拉曼光谱强度和目标分子浓度之间的校准曲线获得目标分子的浓度。
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