KR101886064B1 - 표면 증강 라만 산란용 금속 입자 및 분자 센싱 - Google Patents

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Abstract

증강 라만 산란용 금속 나노입자에 있어서 특히 그 증강 전기장 강도를 입자간 거리의 조절에 의해 제어하여, 매우 강한 라만 산란 특성을 부여함에 따라, 고감도의 라만 산란 센싱을 제공한다. [해결수단] 금속 나노입자를 유기 분자를 통해 연결시킴으로써, 3 내지 10개의 금속 나노입자가 각각 옆의 금속 나노입자와의 사이에서 소정 거리로 결합된 금속 나노입자 집합체를 구비하고, 이 집합체는 그것에 가해지는 전기장 내에 라만 활성 분자를 포함하여 이루어지는, 증강 전기장에서 라만 활성 분자로부터의 증강된 라만 산란광을 발하는 분자 센싱용 금속 나노입자 재료 그리고 이 분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법 및 이 분자 센싱용 금속 나노입자 재료를 이용한 분자 센싱.

Description

표면 증강 라만 산란용 금속 입자 및 분자 센싱{METAL PARTICLES FOR SURFACE-ENHANCED RAMAN SCATTERING AND MOLECULAR SENSING}
본 발명은 표면 플라스몬(plasmon) 현상을 응용한 표면 증강 라만 산란법에 사용되는, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
상세하게는, 가시광 영역에서 표면 플라스몬 흡수를 갖는 금속 나노입자들을 DNA 등의 유기 분자에 의해 소정 거리를 두고 연결한 금속 나노입자 집합체로 이루어지는 분자 센싱용 금속 나노입자 재료이다.
금속 표면에 흡착된 유기 분자에 대하여 특이적으로 발견되는 특성으로서, 표면 증강 라만 산란(Surface Enhanced Raman Scattering: SERS)이 있다.
SERS란, 구체적으로는, 금속 입자끼리 근접하여 존재함에 따라, 이 입자 표면 상에서 공명 효과에 의해, 국소 표면 플라스몬을 유도하고, 또한 국소 표면 플라스몬이 증강 전기장을 유도하고, 이 증강 전기장 중에 금속 입자에 흡착되어 존재함으로써 이루어지는 라만 활성 분자(로다민 6G 등의 색소 유기 분자)로부터의 라만 산란이 증강된 현상을 말한다.
이 SERS가 주목을 받는 이유 중 하나는, 단일분자나 단일입자로부터 진동 스펙트럼을 얻을 수 있다는 점에 있다. 이에 따라 생체분자인식 등 미량 화학물질의 검출이 가능해지기 때문에, 다양한 연구가 현재 활발히 검토되고 있다. (비특허문헌 1, 2, 3)
대체로 라만 산란은, 그 특성상, 이러한 미량 검출에는 전혀 적합하지 않은 물리적 현상이다. 그 이유는 다음과 같이 생각할 수 있다.
라만 산란은 측정 분자와 레이저광으로부터 방출되는 광자(photon; 포톤)의 충돌에 기인하고 있다. 예를 들어, 1초 동안 파장 488nm 아르곤 레이저로부터 방출되는 포톤 수는 1W 출력으로 대략 2.5×1018개로 어림잡을 수 있다. 이 중 분자와 충돌할 수 있는 포톤은 1013~1015개 정도로, 대다수의 포톤은 그냥 지나간다. 이 충돌하는 약간의 포톤의 충돌 모드에는, 탄성 충돌과 비탄성 충돌의 2종류가 있다. 전자는 충돌하는 동안 분자와 포톤 간에 에너지의 주고받음이 없는 것으로, 이 충돌 모드에서 일어나는 산란을 「레일리(rayleigh) 산란」이라고 칭하고 있다. 레일리 산란에서는 포톤과 분자 간의 에너지 주고받음이 없으므로 산란광의 진동 수는 끝내 입사광의 파장과 동일하게 된다. 상기와 같이 발생하는 약간의 분자와 포톤의 충돌 대부분이 이 탄성 산란으로, 따라서 산란광의 대부분이 레일리 산란이다.
한편, 비탄성 산란은 탄성 산란과는 반대로 포톤은 분자와 충돌하여, 그 에너지를 분자로 이동시킨다. 따라서 산란광의 진동 수는, 레일리 산란과는 대조적으로 입사광의 진동수와는 상이해진다. 이러한 산란을 라만 산란이라 칭하고 있다. 특히 라만 산란광이 입사광의 진동 수보다 큰 경우(포톤이 분자로부터 에너지를 얻는 경우)를 반 스토크스(anti-stokes) 라만 산란, 반대로 포톤이 분자에 에너지를 부여하는 경우를 스토크스 라만 산란이라 칭한다. 이같은 비탄성 충돌을 일으키는 포톤은 충돌 포톤 전체 중 대략 1/107 정도이다. 이처럼 입사 포톤 수에 대하여 비탄성 충돌을 일으켜 라만 산란을 일으키는 포톤 수는 매우 적다. 때문에 검출 감도가 낮아, 현재까지 분석 수단으로서 이용되는 경우가 적었다.
그러나, 1970년대에 들어, W. Holzer 등(비특허문헌 4)에 의한 기체 할로겐 분자의 공명 라만 산란 스펙트럼의 측정 등 다수의 공명 라만에 관한 연구가 보고되기 시작하였다. 이 공명 라만 산란에 의한 산란 강도의 증대(통상 공명 라만 효과에 의한 강도 증강은 103~105배 정도)에 따라 라만 산란이 각광을 받게 되었다. 공명 라만이란, 어떤 분자의 흡수대에 중첩되는 파장의 여기광을 이용하여 라만 산란을 측정했을 때에, 흡수대의 원인이 되는 발색단 부분의 진동에 유래하는 라만 밴드의 강도가 현저하게 증대되는 효과를 말하며, 수 μM 정도 농도의 색소의 라만 스펙트럼 측정을 가능케 하였다.
그 후, 1977년에 또 한번 P.P. Van Duyne 등(비특허문헌 5)과 J.A. Creighton 등(비특허문헌 6)의 그룹이 독립적으로 표면 증강 라만 산란을 발견하였다. 실제로는, 이로부터 3년 전에 Fleischmann 등의 그룹이 이 현상을 관측하고 있었지만, 그들은 산란 단면적이 공명 라만 효과와 마찬가지로 증대하고 있다는 것을 깨닫지 못했던 것으로 보인다.
SERS는 일반적으로는 금속전극, 졸, 결정, 증착막, 반도체의 표면상에 흡착된 어떠한 종류의 분자의 라만 산란 강도가, 그 분자가 용액 중에 있을 때보다도 현저하게 증강되는 현상을 말하는데, 현재로써도 그 현상의 메커니즘에 관해서는 불명확한 점이 많다. 금, 은, 구리, 백금, 니켈 등에서 SERS가 확인되고 있지만, 현재 알고 있는 SERS의 특징은, 특히, 은이나 금에서 증강 효과가 크다는 점이다. 그 대표적 물성은 다음과 같은 의존성을 나타낸다.
1) 금속 표면의 거칠기가 SERS 발현에 어떠한 관여를 하고 있다.
2) SERS 스펙트럼은 일반적으로 명확한 파장 의존성을 나타낸다.
3) SERS 강도는 금속 표면에 흡착된 분자의 배향에 의존한다. 또한, 금속 표면으로부터의 거리에 의존한다.
SERS 발현의 메커니즘은 현재 2가지의 사고방식이 제안되고 있다. 하나는 표면 플라스몬 모델이다. 이 모델은 반사 스펙트럼을 여기광이 금속 표면에 닿음에 따라 발생하는 표면 플라스몬의 흡수라고 간주하여, 흡착 분자의 분자 진동과 이 표면 플라스몬 여기의 커플링에 의해 발현되는 것이라고 생각하는 것이다. 다른 하나의 모델은, 전하 이동 모델이라 불리는 것으로, 반사 스펙트럼을 금속 표면과 분자가 형성하는 착체의 흡수라고 생각하고, 이 흡수에 기인한 공명 라만 효과에 의해 SERS가 발현된다고 생각하는 것이다. 어느 쪽이든, 현재 그 메커니즘이 아직 해명되어 있지 않다 하더라도, 앞서 설명한 공명 라만 조건과 SERS의 조건이 중복된 표면 증강 라만 산란에서는 산란 강도가 1011~1014배 정도나 증대하는 것이 명백해져, 단일분자 분광의 가능성이 크게 확장된 것이다. 이 감도의 높이로 인해 미량 정성 분석에는 이미 응용되기 시작했다.
지금까지 제안된 SERS를 응용한 나노입자로는, 예를 들면 저분자 방향환 화합물을 직접 정전 상호 작용에 의해 나노입자 표면에 흡착시키는 방법이나, 티올 말단을 갖는 로다민, 나프탈렌, 퀴놀린 등 리포터 분자를 나노입자 표면에 흡착시키는 것 등이(비특허문헌 7), 분자인식 센서나 pH 센서로서 응용되고 있다(비특허문헌 8).
SERS 입자의 합성법으로는 나노 플레이크 형상 금속 복합체 재료 합성법(특허문헌 1 참조)이나, 나노 다공질체 표면에 로다민 6G 등 색소(라만 활성 분자)를 흡착시키는 방법(특허문헌 2 참조), 또한 금 나노입자를 응용한 예에서는 기판 상에 금 나노로드를 고정하고, 그 표면 분자의 증강 라만 산란을 분석에 이용하는 것(특허문헌 3 참조) 등이 알려져 있다.
또한, 복수의 결합 입자의 표면, 및 복수의 금속 입자가 최초로 접촉한 복수의 접합부에 흡착된, 복수의 라만 활성 유기 화합물을 포함하는 금속 클러스터를 형성하는, 몇 개의 융합 또는 회합한 복수의 금속 입자를 포함하는 복수의 합성 유기무기 나노 클러스터(특허문헌 4 참조)가 개시되어 있다.
일본특허공개 2009-061580호 공보 일본특허공개 2008-184671호 공보 일본특허공개 2005-233637호 공보 일본특허공표 2007-514169호 공보
ACS Nano 2(4) 612-616, (2008) Anal Chem, 79, 6927-6932, (2007) Anal Chem, 77, 6134-6139, (2005) J. Chem. Phys. 52,399 (1970) J. Electroanal Chem., 84, 1 (1977) J. Am. Chem. Soc., 99, 5215 (1977) Langmuir 23, 10539-10545 (2007) Nano Lett. Vol 7, No9 2819-2823 (2007) J. Am. Chem. Soc. Vol 131, 7518-7519 (2009)
최근 SERS는 다양한 응용이 검토되고 있지만, 사용 가능한 기판이나 표면 거칠기에 제한이 있을 뿐만 아니라, 그 라만 강도가 라만 활성 분자의 배향성에 크게 의존하는 점에서, 대부분의 경우 측정 개소에 따라 불균일이 크게 발생하게 되어, 정량성을 요구한 분석이 매우 힘들다는 등의 결점이 있다.
또한, 종래 제안되어 있는 색소 등의 저분자계 라만 활성 분자를 이용한 경우, 이 라만 활성 분자의 나노입자에 대한 흡착 프로세스(정전기적 흡착 과정)에서, 나노입자의 표면 전하가 변해, 입자 간의 표면 전하 반발이 약해지기 때문에 일어나는 것으로 보이는 나노입자의 응집이 발생하는 점이 문제가 된다. 나노입자의 응집은, 라만 활성 분자의 탈리(脫離)를 발생시킬 뿐만 아니라, 분자인식 전에 라만 활성 분자가 흡착된 나노입자의 응집이 일어나면, 분자인식 이전임에도 불구하고 SERS 신호가 나와 버리기 때문에 오(誤) 인식으로 이어진다. 특히, 생체 환경 하에서 이들 입자를 이용하는 경우, 고 염농도 하에서의 분산안정성 확보가 필수여서, 응집 문제에 대한 대책이 필요하게 되었다.
본 발명자들은, 상기 목적을 달성하기 위하여 예의 검토를 거듭한 결과, 금속 나노입자끼리 유기 분자를 이용하여 미리 일정 간격이 되도록 연결시킨 금속 나노입자 집합체를 형성함으로써, 금속 나노입자의 응집이나, 금속 나노입자의 농도 분포의 편향을 억제할 수 있어, 금속 나노입자끼리의 근접 계면에 생성되는 증강 전기장으로부터 얻어지는 표면 증강 라만 산란광을 안정적으로 검출할 수 있다는 것을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은, 금속 나노입자 사이를 연결하는 유기 분자로서 특히 DNA를 이용함으로써, 금속 나노입자 간의 거리를 쉽게 원하는 거리로 할 수 있을 뿐만 아니라, 금속 나노입자의 집합체를 용이하게 제조할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은, 제1의 관점으로서 금속 나노입자를 유기 분자를 통해 연결시킴으로써, 3 내지 10개의 금속 나노입자가 각각 측면의 금속 나노입자 간에 소정 거리로 결합된 금속 나노입자 집합체를 구비하고, 이 집합체는 그것에 가해지는 전기장 내에 라만 활성 분자를 포함하여 이루어지는, 증강 전기장에서 라만 활성 분자로부터의 증강된 라만 산란광을 발하는 것인 분자 센싱용 금속 나노입자 재료에 관한 것이다.
제2의 관점으로서, 제1의 관점에 있어서, 표면 플라스몬 공명을 일으키는 공명파장을 자외선 영역 내지 적외선 영역에 갖는 금속원소로 이루어지는, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료에 관한 것이다.
제3의 관점으로서, 제1의 관점 또는 제2의 관점에 있어서, 상기 금속 나노입자가 1nm 내지 100nm의 평균 입자경을 갖는 입자인, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료에 관한 것이다.
제4의 관점으로서, 제1의 관점 내지 제3의 관점 중 어느 한 관점에 있어서, 상기 금속 나노입자 집합체에 있어서, 연결된 금속 나노입자가 그 양 옆의 금속 나노입자와의 사이에서 일직선상으로 결합되어 있지 않은, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료에 관한 것이다.
제5의 관점으로서, 제1의 관점 내지 제4의 관점 중 어느 한 관점에 있어서, 상기 유기 분자가 말단에 티올기 또는 아미노기를 가지면서, 핵산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 탄화수소를 포함하는, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료에 관한 것이다.
제6의 관점으로서, 제5의 관점에 있어서, 상기 유기 분자가 3 내지 40의 염기 수를 가지면서, 티올기 또는 아미노기를 말단에 갖는 핵산인, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료에 관한 것이다.
제7의 관점으로서, 제6의 관점에 있어서, 상기 핵산이 DNA인, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료에 관한 것이다.
제8의 관점으로서, 제1의 관점 내지 제7의 관점 중 어느 한 관점에 있어서, 상기 라만 활성 분자는 상기 유기 분자에 결합되어 이루어지는, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료에 관한 것이다.
제9의 관점으로서, 제1의 관점 내지 제8의 관점 중 어느 한 관점에 있어서, 상기 금속 나노입자가 적어도 1개 이상의 분자인식 프로브 분자를 그 금속 나노입자 표면에 결합되어 이루어지는, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료에 관한 것이다.
제10의 관점으로서, 제1의 관점 내지 제9의 관점 중 어느 한 관점에 있어서, 상기 분자인식 프로브 분자가 말단에 티올기 또는 아미노기를 가지면서, 핵산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 탄화수소를 통해 분자인식 프로브가 결합된 분자인, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료에 관한 것이다.
제11의 관점으로서, a) 기체(基體)가 되는 단일가닥(single strand)의 핵산가닥(1)에, 그 핵산가닥(1) 중의 부분 염기 구조에 상보성을 가지면서 한쪽 말단에 티올기를 갖는 단일가닥의 핵산가닥(2)을 적어도 2개 결합시켜 2중 나선을 형성시킨 변성 핵산가닥을 얻는 공정,
b) 상기 변성 핵산가닥의 티올기와 금속 나노입자를 반응시키고, 이 금속 나노입자의 표면에 변성 핵산가닥을 결합시킨 후, 60~100℃로 가열하여 변성 핵산가닥의 2중 나선 구조를 분리시킴으로써 단일가닥의 핵산가닥(1)을 제거하여, 티올기를 통해 단일가닥의 핵산가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)를 얻는 공정,
c) 상기 핵산가닥(2)과 상보성을 가지며, 한쪽 말단에 티올기를 갖는 염기가닥 길이가 동일한 단일가닥의 핵산가닥(3)과, 금속 나노입자를 반응시켜, 티올기를 통해 단일가닥의 핵산가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 얻는 공정,
d) 단일가닥의 핵산가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)와 단일가닥의 핵산가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 혼합함으로써, 단일가닥의 핵산가닥(2)과 단일가닥의 핵산가닥(3)을 결합시켜 2중 나선을 형성시켜서 금속 나노입자 집합체를 제조하는 공정,
및
상기 a) 공정에서 사용된 단일가닥의 핵산가닥(2) 혹은 상기 c) 공정에서 사용된 단일가닥의 핵산가닥(3), 또는, 이들 양쪽에 라만 활성 분자를 결합하는 공정을 포함하는,
제1의 관점 내지 제10의 관점 중 어느 한 하나에 기재된 분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법에 관한 것이다.
제12의 관점으로서, a) 기체가 되는 단일가닥의 DNA 가닥(1)에, 그 DNA 가닥(1) 중의 부분 염기 구조에 상보성을 가지면서 한쪽 말단에 티올기를 갖는 단일가닥의 DNA 가닥(2)을 적어도 2개 결합시켜 2중 나선을 형성시킨 변성 DNA 가닥을 얻는 공정,
b) 상기 변성 DNA 가닥의 티올기와 금속 나노입자를 반응시키고, 이 금속 나노입자의 표면에 변성 DNA 가닥을 결합시킨 후, 60~100℃로 가열하여 변성 DNA 가닥의 2중 나선 구조를 분리시킴으로써 단일가닥의 DNA 가닥(1)을 제거하여, 티올기를 통해 단일가닥의 DNA 가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)를 얻는 공정,
c) 상기 DNA 가닥(2)과 상보성을 가지며, 한쪽 말단에 티올기를 갖는 염기가닥 길이가 동일한 단일가닥의 DNA 가닥(3)과, 금속 나노입자를 반응시켜, 티올기를 통해 단일가닥의 DNA 가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 얻는 공정,
d) 단일가닥의 DNA 가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)와 단일가닥의 DNA 가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 혼합함으로써, 단일가닥의 DNA 가닥(2)과 단일가닥의 DNA 가닥(3)을 결합시켜 2중 나선을 형성시켜서 금속 나노입자 집합체를 제조하는 공정,
및
상기 a) 공정에서 사용한 단일가닥의 DNA 가닥(2) 혹은 상기 c) 공정에서 사용한 단일가닥의 DNA 가닥(3), 또는, 이들 양쪽에 라만 활성 분자를 결합하는 공정을 포함하는,
제1의 관점 내지 제10의 관점 중 어느 한 하나에 기재된 분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법에 관한 것이다.
제13의 관점으로서, 제12의 관점에 있어서, 상기 d) 공정에서 이 단일가닥의 DNA 가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)의 1당량에 대하여, 이 단일가닥의 DNA 가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 2당량 이용하여 금속 나노입자 집합체를 제조하는, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법에 관한 것이다.
제14의 관점으로서, 제12의 관점 또는 제13의 관점에 있어서, 상기 단일가닥 DNA 가닥(2)은 서로 상보성을 갖는 부위를 갖지 않는 것인, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법에 관한 것이다.
제15의 관점으로서, 제12의 관점 내지 제14의 관점 중 어느 한 관점에 있어서, a) 내지 d) 중 어느 한 공정에서,
e) 핵산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 탄화수소를 포함하는 분자가닥의 일측 말단에 분자인식 프로브를 가지고, 다른측 말단에 티올기 또는 아미노기를 갖는 분자인식 프로브 분자와, 금속 나노입자를 반응시켜, 금속 나노입자 표면에, 티올기 또는 아미노기를 통해 말단에 분자인식 프로브 분자를 결합시키는 공정
을 더 포함하는,
분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법에 관한 것이다.
제16의 관점으로서, 제1의 관점 내지 제10의 관점 중 어느 한 하나에 기재된 분자 센싱용 금속 나노입자 재료를, 검체(檢體)와 접촉시킨 후, 검체의 라만 산란 측정을 행하는 것을 특징으로 하는, 분자 센싱 방법에 관한 것이다.
제17의 관점으로서, 제16의 관점에 있어서, 상기 분자 센싱용 금속 나노입자 재료가 기판상에 고정되어 이루어지는, 분자 센싱 방법에 관한 것이다.
본 발명의 분자 센싱용 금속 나노입자 재료는, 금속 나노입자가 소정 간격으로 연결된 금속 나노입자 집합체로 이루어지기 때문에, 금속 나노입자의 계면에 형성되는 증강 전기장 강도를 일정하게 할 수 있어, 종래 기술에서 문제시되었던 SERS 입자의 응집이나 농도부 분포의 편차에 따른 오인 검출을 방지할 수 있고, 또한, 표면 상태에 따른 SERS 신호의 변동을 피할 수 있으므로, 표면 증강 라만 산란광의 안정적인 검출로 이어진다.
또한, 본 발명의 분자 센싱용 금속 나노입자 재료는, 이 금속 나노입자 집합체의 금속 나노입자의 표면에 비오틴(biotin) 등의 분자인식 프로브를 연결시킴으로써, 표적 검체를 인식할 수 있다.
그리고, 본 발명의 분자 센싱용 금속 나노입자 재료를 이용함으로써, 통상의 라만 산란 강도의 10의 11승배나 달하는 표면 증강 라만 산란의 강도를 안정적으로 유지할 수 있게 되므로, 농도가 매우 옅은 검체에 대해서도 유효한 검출이 가능해진다.
나아가, 본 발명의 분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법에 따르면, 표면 증강 라만 산란 활성 입자인 금, 은, 구리, 백금 또는 니켈 등의 금속 나노입자를, 말단에 티올기 또는 아미노기를 갖는 단일가닥의 DNA 가닥으로 한정한 것과, 이 DNA 가닥과 상보가닥의 관계에 있는 말단에 티올기를 갖는 다른 단일가닥 DNA로 사슬 한정한 것을 섞기만 해도, 용이하게 금속 나노입자 간에 결합이 형성되어, 금속 나노입자 집합체를 제조할 수 있다.
또한, 금속 나노입자 간의 거리는, DNA의 염기 수를 조정함으로서 자유롭게 조절할 수 있으므로, 가장 강한 증강 전기장을 발생시키는 거리로 금속 나노입자 사이를 연결시킨 금속 나노입자 집합체를 제조할 수 있다.
그리고 이 금속 나노입자 집합체 중에 금속 나노입자 표면에, 표적 검체에 대하여 강한 상호 작용을 갖는 분자(분자인식 프로브 분자)를 연결시킴으로써, 표적으로 하는 검체의 인식이 가능한 SERS 활성 분자인식 입자를 합성할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방식을 나타내는 도면이다.
도 2는, 5’-HS-C6-GCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3’ 표면 수식 금 나노입자의 투과형 전자현미경 이미지를 나타내는 도면이다.
도 3은, 5’-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3’ 표면 수식 금 나노입자의 투과형 전자현미경 이미지를 나타내는 도면이다.
도 4는, 5’-HS-C6-GCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3’ 표면 수식 금 나노입자와 5’-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3’ 표면 수식 금 나노입자의 혼합 후의 입자상태의 투과형 전자현미경 이미지를 나타내는 도면이다.
도 5는, 5’-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3’를 고정한 금 나노입자의 원자간력 현미경 이미지를 나타내는 도면이다.
도 6은, 5’-HS-C6-GCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3’ 표면 수식 금 나노입자와 5’-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3’ 표면 수식 금 나노입자의 혼합 후의 입자의 원자간력 현미경 이미지를 나타내는 도면이다.
도 7은, 5’-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3’를 고정한 금 나노입자의 근접장 현미경에 의한 형상 및 전기장 측정을 나타내는 도면이다.
도 8은, 5’-HS-C6-GCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3’ 표면 수식 금 나노입자와 5’-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3’ 표면 수식 금 나노입자의 혼합 후의 입자의 근접장 현미경에 의한 형상 및 전기장 측정을 나타내는 도면이다.
도 9는, 5’-HS-C6-GCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3’ 표면 수식 금 나노입자와 5’-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3’ 표면 수식 금 나노입자의 혼합 후의 입자의 공명 라만 산란 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은, 5’-HS-C6-GCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3’ 표면 수식 금 나노입자와 5’-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3’ 표면 수식 금 나노입자의 혼합 후의 입자의 온도 변화에 따른 라만 산란 강도 변화의 설명도를 나타내는 도면이다.
도 11은, 비오틴을 센싱 프로브로서 표면에 도입한 5’-HS-C6-GCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3’ 표면 수식 금 나노입자와, 5’-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3’ 표면 수식 금 나노입자에 의한 스트렙타비딘(streptavidin)의 분자인식을 나타내는 도면이다.
도 12는, 실시예 1에서 얻은 특정간 거리로 연결한 금 나노입자의 투과형 전자현미경 이미지를 나타내는 도면이다.
도 13은, 특정간 거리로 연결한 금 나노입자를 이용한 스트렙타비딘의 분자인식 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는, 실시예 2에서 얻은 특정간 거리로 연결한 금 나노입자의 투과형 전자현미경 이미지를 나타내는 도면이다.
도 15는, 예 8에서 얻은 티올 말단 DNA 11을 흡착시킨 금 나노입자 분산액의 자외·가시 흡수 스펙트럼 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 16은, 예 8에서 얻은 티올 말단 DNA 11 또는 티올 말단 DNA 12를 추가로 흡착시킨 금 나노입자 분산액의 자외·가시 흡수 스펙트럼 측정 결과(DNA 11: 부호 17, DNA 12: 부호 18)를 나타내는 도면이다.
도 17은, 예 9에서 얻은 sample[1] 용액의 투과형 전자현미경 이미지를 나타내는 도면이다.
도 18은, 예 9에서 얻은 sample[2] 용액의 투과형 전자현미경 이미지를 나타내는 도면이다.
도 19는, 예 9에서 얻은 금 나노입자 집합체의 투과형 전자현미경 이미지를 나타내는 도면이다.
도 20은, 예 10에서 얻은 티올 말단 DNA 13, 티올 말단 14 또는 티올 말단 15를 흡착시킨 금 나노입자 분산액의 자외·가시 흡수 스펙트럼 측정 결과(DNA 13: 부호 19, DNA 14: 부호 20, DNA 15: 부호 21)를 나타내는 도면이다.
도 21은, 예 10에서 얻은 sample[3] 용액(DNA 13), sample[4](DNA 14) 용액 또는 sample[5] 용액(DNA 15)의 자외·가시 흡수 스펙트럼 측정 결과(DNA 13: 부호 19, DNA 14: 부호 20, DNA 15: 부호 21)를 나타내는 도면이다.
도 22는, 예 10에서 얻어진 sample[6]과 sample[7]의 외관(사진)을 나타내는 도면이다.
도 23은, AS1411 흡착-금 나노입자 집합체의 공명 라만 산란 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 24는, a549 암세포의 공명 라만 산란 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 25는, AS1411 흡착-금 나노입자 집합체를 흡착시킨 a549 암세포의 공명 라만 산란 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 26은, 암세포 유래 DNA의 인산 유래의 매핑과, 금 입자 흡착 부위의 매핑과, 암세포의 현미경 사진을 나타내는 도면이다.
본 발명의 분자 센싱용 금속 나노입자 재료는, 유기 분자를 통해 금속 나노입자 사이를 연결시킴으로써, 3 내지 10개의 금속 나노입자가 각각 옆의 금속 나노입자와의 사이에서 소정 거리로 결합된 구조를 갖는 금속 나노입자 집합체를 구비하고, 상기 집합체는 그것에 가해지는 전기장 내에 라만 활성 분자를 포함하여 이루어지는 것이다.
본 발명에서 이용하는 금속 나노입자로는 특별히 한정되지 않으나, 표면 플라스몬 공명을 일으키는 공명파장을 자외선 영역 내지 적외선 영역에 갖는 금속원소로 이루어지는데, 예를 들면, 금, 은, 구리, 백금, 니켈, 알루미늄 등으로부터 선택되는 금속원소로 이루어진 입자를 들 수 있다. 이 중에서도, 금 나노입자를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 금속 나노입자는, 1nm 내지 500nm의, 바람직하게는 1nm 내지 100nm의, 보다 바람직하게는 5nm 내지 100nm의, 특히 바람직하게는 5nm 내지 20nm의 평균 입자경을 갖는 것이 바람직하다.
금속 나노입자끼리의 연결에 이용하는 유기 분자로서, 핵산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 탄화수소 등의 유기 화합물로 이루어진 분자가닥을 이용할 수 있으며, 이들 유기 분자는 금속 나노입자(표면)에 결합하기 위한 기로서, 티올기 또는 아미노기를 말단에 갖고 이루어진다.
이 중에서도 핵산(특히 DNA)은, 염기 수를 조정함으로써 원하는 분자가닥 길이를 갖는 유기 분자로 할 수 있으며, 즉, 금속 나노입자 간의 거리를 원하는 길이로 조정하는 것이 용이하므로 특히 바람직하다. 이 경우, 핵산의 염기 수의 수치 범위는 3염기 내지 40염기인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3 내지 20염기, 예를 들면 12염기 길이의 DNA를 이용하는 것이 바람직하다.
또 상기 유기 분자에는, 금속 나노입자 간의 거리를 소정 간격으로 조정하기 위해 이용되는 화합물(DNA 등)에 더하여, 상기 라만 활성 분자(라만 프로브라고도 칭함)를 결합하여 이루어지는 것이 바람직하다. 라만 활성 분자는, 예를 들어 로다민 6G(R6G), 크리스탈 바이올렛(CRV), 쿠마린 등 색소 유기 분자에 더하여, 방향환이 몇 개 정도 연결된 축합환 화합물 등을 들 수 있다. 이들 라만 활성 분자는 유기 분자의 어느 한 말단에 도입된다.
상기 유기 분자에 의해 연결되는 금속 나노입자의 개수는, 상술한 바와 같이, 3 내지 10개인 것이 바람직하다. 이는, 근접한 2개의 금속 입자 사이에 유기된 증강 전기장은, 2입자의 운동에 의해 방향이 변한다는 점에서, 가장 최적의 증강 자기장을 발생시키는 방향으로 향하고 있다고는 할 수 없으며, 입자가 운동하더라도 최적의 증강 전기장을 발생시키려면, 2 입자 사이에 형성된 유기 분자에 의한 결합 방향에 대하여, 180° 이하의 각도를 갖는 결합 방향을 갖는 유기 분자 또는 입자를 결합시킨 3입자 이상의 집합체 형태를 이루는 것이 바람직하기 때문이다. 단, 이들 3입자 집합체에 더 많은 유기 분자와 금속 입자로 이루어진 집합체를 결합시키더라도, 검출 장소에서 라벨화 부분의 농도차가 발생하므로 바람직하지 않고, 금속 입자 집합체는 최대 10입자 정도의 금속 입자가 유기 분자로 결합된 것이 바람직하다.
그리고, 금속 나노입자 집합체에 있어서, 연결된 금속 나노입자는 그 양 옆의 금속 나노입자와의 사이에서 일직선으로 결합되어 있지 않은 것, 즉, 3개의 금속 나노입자 사이의 2개의 유기 분자는, 180° 이하, 예를 들면 10 내지 160°의 각도를 갖고 한가운데의 금속 나노입자의 결합되어 있는 것이 바람직하다.
한편, 상기 금속 나노입자 집합체에 있어서의 금속 나노입자(표면)는, 표적 검체를 인식할 수 있는 분자인식 프로브 분자를 추가로 갖고 있어도 된다. 이에 따라, 검체를 인식시킨 후에 라만 산란 측정을 함으로써, 목적으로 하는 검체의 검출이 가능해진다.
분자인식 프로브 분자는, 예를 들면 상술한 유기 분자로서 이용한 핵산(DNA)과는 다른 염기 배열을 갖는 핵산(DNA), 폴리에틸렌 글리콜, 혹은 탄화수소를 포함하는 분자가닥의 한쪽 말단에 분자인식 프로브(비오틴 등; 검출 부위라고도 함)를 도입하고, 다른측 말단에 금속 나노입자 표면에 대한 결합능을 갖는 티올기, 아미노기 등을 도입한 분자이다. 그리고 이 티올기 등을 통해, 분자인식 프로브 분자를 금속 나노입자(표면)에 결합시킨다.
본 발명의 분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법은 이하의 a) 내지 d) 공정을 포함하여 이루어진다.
a) 기체가 되는 단일가닥의 핵산가닥(1)에, 그 핵산가닥(1) 중의 부분 염기 구조에 상보성을 가지면서 한쪽 말단에 티올기를 갖는 단일가닥의 핵산가닥(2)을 적어도 2개 결합시켜 2중 나선을 형성시킨 변성 핵산가닥을 얻는 공정,
b) 상기 변성 핵산가닥의 티올기와 금속 나노입자를 반응시키고, 이 금속 나노입자의 표면에 변성 핵산가닥을 결합시킨 후, 60~100℃로 가열하여 변성 핵산가닥의 2중 나선 구조를 분리시킴으로써 단일가닥의 핵산가닥(1)을 제거하여, 티올기를 통해 단일가닥의 핵산가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)를 얻는 공정,
c) 상기 핵산가닥(2)과 상보성을 가지며, 한쪽 말단에 티올기를 갖는 염기가닥 길이가 동일한 단일가닥의 핵산가닥(3)과, 금속 나노입자를 반응시켜, 티올기를 통해 단일가닥의 핵산가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 얻는 공정,
d) 단일가닥의 핵산가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)와 단일가닥의 핵산가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 혼합함으로써, 단일가닥의 핵산가닥(2)과 단일가닥의 핵산가닥(3)을 결합시켜 2중 나선을 형성시켜서 금속 나노입자 집합체를 제조하는 공정.
본 발명의 분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법에 있어서, 상기 핵산은 DNA인 것이 바람직하며, 즉, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법은 이하의 a) 내지 d) 공정을 포함하여 이루어진다.
a) 기체가 되는 단일가닥의 DNA 가닥(1)에, 그 DNA 가닥(1) 중의 부분 염기 구조에 상보성을 가지면서 한쪽 말단에 티올기를 갖는 단일가닥 DNA 가닥(2)을 적어도 2개 결합시켜 2중 나선을 형성시킨 변성 DNA 가닥을 얻는 공정,
b) 상기 변성 DNA 가닥의 티올기와 금속 나노입자를 반응시키고, 이 금속 나노입자의 표면에 변성 DNA 가닥을 결합시킨 후, 60~100℃로 가열하여 변성 DNA 가닥의 2중 나선 구조를 분리시킴으로써 단일가닥의 DNA 가닥(1)을 제거하여, 티올기를 통해 단일가닥의 DNA 가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)를 얻는 공정,
c) 상기 DNA 가닥(2)과 상보성을 가지며, 한쪽 말단에 티올기를 갖는 염기가닥 길이가 동일한 단일가닥 DNA 가닥(3)과, 금속 나노입자를 반응시켜, 티올기를 통해 단일가닥 DNA 가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 얻는 공정,
d) 단일가닥의 DNA 가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)와 단일가닥의 DNA 가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 혼합함으로써, 단일가닥의 DNA 가닥(2)과 단일가닥의 DNA 가닥(3)을 회합시켜 2중 나선을 형성시켜서 금속 나노입자 집합체를 제조하는 공정.
그리고 추가로, 본 발명의 분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법에 있어서, 상기 a) 내지 d) 공정에 더하여, 상기 a)공정에서 이용하는 단일가닥의 DNA 가닥(2) 혹은 상기 c)공정에서 이용하는 단일가닥의 DNA 가닥(3) 중 어느 하나, 혹은, 이들 양쪽에 라만 활성 분자를 결합하는 공정을 포함한다.
상기 공정에서 이용하는 단일가닥의 DNA 가닥(2)은, DNA 가닥(2)끼리 서로 상보성을 갖는 것도 가능하지만, 바람직하게는 DNA 가닥(2)끼리 서로 상보성을 갖지 않는 것이 바람직하다. 이는 금속 나노입자와 반응시켜 단일가닥 DNA 가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)를 형성할 때, DNA 가닥(2)이 서로 상보성을 갖는 것일 경우, 입자(1)끼리의 결합체가 형성될 우려가 있어, 응집의 발생을 막기 때문이다.
또한, 단일가닥의 DNA 가닥(2)과 단일가닥의 DNA 가닥(3)의 분자가닥 길이(즉, 염기가닥 길이)는 상이해도 되지만, 동일한 길이인 것이 바람직하다.
한편, 상기 공정에서 이용하는 금속 나노입자(1)와 금속 나노입자(2)에 이용하는 금속은 동일한 금속종이어도 되고 상이한 금속종이어도 되지만, 바람직하게는 동일한 금속종을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 a) 공정에 있어서, 기체가 되는 단일가닥의 DNA 가닥(1)과 결합시킨 2개의 DNA 가닥(2)의 2개의 티올기 사이의 거리는, b) 공정에서 얻어지는 금속 나노입자(1) 상에 형성되는 DNA 가닥(2)의 결합 위치에 대응된다.
여기서, 금속 나노입자를 사이에 두고 서로 반대측 위치에 2개의 DNA 가닥(2)이 결합되면, 3개의 금속 나노입자, 즉, 금속 나노입자(1)와, 그 후의 d) 공정에서 이 DNA 가닥(2)에 DNA 가닥(3)이 회합하여 결합된 2개의 금속 나노입자(2)의 3개의 입자가 직선상으로 나열되게 된다. 즉, 이들 3개의 금속 나노입자 사이에 형성되는 2개의 증강 전기장이 이루는 각도가 180°가 되므로, 상술한 바와 같이 바람직하지 않다.
따라서, DNA 가닥의 가닥길이나, 금속 나노입자의 크기(평균 입자경)를 조정하고, 3개의 금속 나노입자의 배열(각도)을 바람직한 각도로 조정하는 것이 중요하다.
상기 d)공정, 즉, 금속 나노입자(1)와 금속 나노입자(2)의 혼합에 의한 금속 나노입자 집합체를 제조하는 공정은, 금속 나노입자(1)에 대하여 과잉량의 금속 나노입자(2)를 첨가함으로써 행해진다. 예를 들면, 금속 나노입자(1)와 금속 나노입자(2)를 1:2~10 정도의 당량비로 혼합함으로써, DNA 가닥(2)과 DNA 가닥(3)을 회합시켜 2중 나선을 형성시켜서, 2개의 금속 나노입자 간에 유기 분자(DNA 등)에 의한 결합을 형성한다.
예를 들면, 2당량의 단일가닥의 DNA 가닥(2)을 갖는 1개의 금속 나노입자(1)와, 1당량의 단일가닥의 DNA 가닥(3)을 갖는 2개의 금속 나노입자(2)를 혼합함으로써 얻어지는 3개의 금속 나노입자로 구성되는 금속 나노입자 집합체가 바람직하다.
이렇게 하여 얻어진, 금속 나노입자들이 그 사이가 등간격으로 연결된 금속 나노입자 집합체는 표면 증강 라만 산란을 발할 수 있는 분자 센싱금속 나노입자 재료로서 작용한다.
이하에, 본 발명의 분자 센싱용 금속 나노입자 재료에 이용하는 금속 나노입자 집합체의 제조 방법에 대하여, 도 1의 구체예를 이용하여 설명한다. 본 방법은 비특허문헌 9에 개시되는 방법에 따라 실시할 수 있다.
도 1에서 번호 1, 2, 3에 나타내는 3종의 DNA(이하, 각각 DNA 1, DNA 2, DNA 3이라 칭함)를 준비한다. DNA 1과 DNA 2는 각각 상보가닥의 관계에 있는 DNA이고, DNA 3은 중앙부에서 2중가닥을 이루지만, 그 양 단은 DNA 1 및 DNA 2와 상보가닥의 관계에 있는 염기가닥이다. 또한 DNA 1 및 DNA 2는 그 말단에 티올기를 갖는다.
이들 DNA 1, DNA 2 및 DNA 3을 혼합하여, 도 1에서 번호 4에 나타내는 바와 같은 변성 DNA를 합성한다. 합성된 변성 DNA 4는 금 나노입자 5 콜로이드 용액과 혼합하고, 금 나노입자 표면에 티올기를 통해 결합시켜 도 1에서 번호 6으로 나타낸 DNA가 결합된 금 나노입자가 된다. 다음에, 용액을 가온(염기 수에 의해 적당히 온도를 설정)하여 2중 가닥을 해리시켜, 도 1에서 번호 7로 나타낸 DNA 1과 DNA 2가 결합된 금 나노입자를 합성한다.
이에 반해, 미리 금 나노입자 표면에 티올기를 통해, 라만 활성 분자를 포함하는 DNA 1 및 DNA 2를 결합시킨 금 나노입자 8 및 9를, 도 1에서 번호 7로 나타낸 금 나노입자에 가함으로써, DNA끼리 2중가닥을 이루도록 하여, 도 1에서 번호 10으로 나타낸 금 입자 접합이 완성된다. 이 경우, 금 입자끼리는 완전히 제어된 위치로 고정하는 것이 가능하다.
상술한 본 발명의 분자 센싱용 금속 나노입자 재료는, 검체와 접촉시킨 후, 검체의 라만 산란 측정을 행하는 것에 따라, 분자 센싱으로서 유용한 방법이 된다.
이때, 상기 분자 센싱용 금속 나노입자 재료는, 기판상에 고정되어 있어도 된다.
본 발명의 분자 센싱용 금속 나노입자 재료는, 상술한 바와 같이, 금속 나노입자를 소정 간격으로 결합시킨 금속 나노입자 집합체를 이용함으로써, 금속 나노입자의 계면에 형성되는 증강 전기장을 조절할 수 있고, 즉, 안정된 증강 전기장을 금속 나노입자 표면에 형성시킴으로써 일정한 라만 산란 강도를 안정화시킬 수 있다. 따라서, 종래와 같은 라만 산란의 불안정함을 개선하는데 매우 유용한 기술이다.
(실시예)
이하, 본 발명에 관하여, 더욱 구체적이고 상세하게 실시예를 이용하여 설명하지만, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니다.
이후의 염기 배열에 있어서의 간략 기호는, 아데닌(A), 구아닌(G), 타이민(T), 사이토신(C), 티올기(HS 또는 SH)이다.
[예 1 금 나노입자에 대한 티올 말단 DNA의 고정]
먼저, 상보가닥의 관계에 있는 단일 가닥 DNA (a) 및 (b)를 각각 준비하였다.
(a) 5’-HS-C6-GCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3’
염기 배열이 GCCACCAGCTCC인 12염기에 있어서, 금 표면에 고정하는 부위로서 티올기를 탄소 원자수 6의 알킬사슬(C6)을 통해 5’ 말단에 결합시키고, 또한, 라만 활성 분자(라만 프로브)로서 색소인 로다민(TAMRA)을 탄소 원자수 6의 알킬사슬(C6)을 통해 3’ 말단에 결합시켰다.
(b) 5’-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3’
염기 배열이 GGAGCTGGTGGC인 12염기에 있어서, 금 표면에 고정하는 부위로서 티올기를 탄소 원자수 6의 알킬사슬(C6)을 통해 5’ 말단에 결합시켰다.
이들 단일가닥 DNA (a) 및 (b)는, 각각 독립적으로 금 나노입자 용액(금 콜로이드 용액)에 첨가함으로써, 금 나노입자 표면에 결합되지만, 이들 DNA의 말단 티올기는 불안정하고, 주위의 티올기 끼리 결합되어 용이하게 S-S 결합을 형성하므로, DNA를 금 표면에 고정화하기 전에, 형성한 S-S 결합을 환원제에 의해 티올로 되돌려 둘 필요가 있다. 이 환원 방법에 대해서는 특별히 한정하는 것은 아니지만, 일예로서, 이번에는 다음 순서에 따라 이용하여 S-S 결합을 환원시켰다.
즉, 100pmol/μL의 5’-티올화 DNA의 DTT(디티오트레이톨) 용액으로부터 50μL를 1.5mL의 마이크로 튜브에 담아, 2.5M NaCl를 20μL, -20℃로 식힌 에탄올을 950μL 첨가하고, -80℃에서 20분간 방치하였다. 그 후 12,000회전, 4℃에서 10분간 원심분리하고, 상등액을 버리고, 50μL의 TE 용액(트리스-EDTA Buffer: 10mM 트리스하이드록시메틸아미노메탄, 1mM EDTA, pH~8)으로 재용해시켜, 정제된 티올화 DNA를 얻었다.
금 나노입자에 대한 DNA의 고정(결합)화 조작으로는 특별히 한정되지 않으나, 이번에는 다음 방법을 이용하여 행하였다.
즉, 금 나노입자 용액 1mL에 상술한 방법을 통해 S-S 결합을 환원한 정제 티올화 DNA 5nmol을 첨가하였다. 이때 티올화 DNA의 최종 농도는 5μL였다.
첨가 후, 용기를 볼텍스·믹서(vortex mixer)를 이용하여 5분간 교반하고, 그 후, 50℃의 항온조에 4시간 내지 24시간 방치하여, 금 나노입자 표면에 대한 DNA의 고정화를 촉진시켰다. 이때 금 나노입자 표면에서는 티올기의 결합뿐만 아니라, DNA 염기의 흡착도 발생하므로, 치밀한 흡착 상태로 되어 있지는 않다. 따라서, 금 나노입자와 티올화 DNA 용액에, 2.5M NaCl를 40μL, 500mM 인산완충액을 20μL 첨가하여, NaCl 및 인산완충액(pH7)을 최종 농도 0.1M 및 10mM가 되도록 하고, 다시 50℃에서 40시간 방치하였다.
[예 2 금 나노입자 집합체의 제작]
상기 방법에 의해 상보가닥끼리의 DNA를 각각 고정한 2종의 금 나노입자 용액을, 0.5mL씩 매크로 튜브에 측량하여 담아, 14,000rpm으로 25분간 원심분리하여, 그 후, 상등액을 제거하고, 10mM 인산완충액(0.1M NaCl 함유, pH7)으로 재분산시켰다. 이때, 의사(擬似)적으로 응집되는 경우가 있으나, 그 경우에는 50℃에서 잠시 따뜻하게 한 다음, 재분산시켰다. 이 조작을 한번 더 반복하여, 상등액을 제거한 후, 0.01% tween-20 1μL, 0.1M NaCl(10mM 인산완충액, pH7) 0.25mL에 재분산시켰다.
이렇게 하여 얻어진, 표면에 DNA가 결합된, 2종의 금 나노입자 분산 용액을 혼합하고, DNA의 상보가닥을 회합시킴으로써, 금 나노입자 간의 결합을 형성시켜, 금속 나노입자 집합체를 제조하였다.
즉, 먼저 PCR 튜브에 1% tween-20 1μL, DNA 수식 금 나노입자 5μL(상보 관계에 있는 수식 입자를 각각 5μL), 5M NaCl 4μL를 첨가하여 실온에서 10분간 방치하는 한편, 금 나노입자 집합체의 형성(응집체처럼 보이는)이 관찰되지 않는 경우에는 빙랭(氷冷)하여 20분 이상 방치한 후, 탁상 원심기로 가볍게 원심하여, 얻어진 집합체를 침전시켰다.
한편, 금 나노입자 집합체는, 먼저 PCR 튜브에 1% tween-2 1μL, DNA 수식 금 나노입자 5μL, 상기 수식에 이용한 DNA와 상보가닥의 관계에 있는 1μM DNA 10μL, 5M NaCl 4μL를 첨가하여, 실온에서 10분간 방치하고(금 나노입자 집합체의 형성(응집체처럼 보이는)이 관찰되지 않는 경우에는 빙랭하여 20분 이상 방치한 후), 탁상 원심기로 가볍게 원심하여, 얻어진 집합체를 침전시키는 것에 의해서도 얻어졌다.
[예 3 금 나노입자 집합체의 해석(1): 집합체 형성의 해석]
얻어진 금속 나노입자 집합체에 대하여, 투과형 전자현미경 및 원자간력 현미경에 의해 해석하였다.
우선, 상기 단일가닥 DNA(a)[5’-HS-C6-GCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3’]가 결합된 금 나노입자의 투과형 전자현미경 이미지를 도 2에, 단일가닥 DNA(b)[5’-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3’]가 결합된 금 나노입자의 투과형 전자현미경 이미지를 도 3에, 그리고 이들 금 나노입자를 혼합하고, 얻어진 금 나노입자 집합체의 투과형 전자현미경 이미지를 도 4에, 각각 나타낸다.
또한, 상기 단일가닥 DNA(b)[5’-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3’]가 결합된 금 나노입자의 원자간력 현미경 이미지를 도 5에, 상기 단일가닥 DNA(b)가 결합된 금 나노입자와 단일가닥 DNA(a)[5’-HS-C6-GCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3’]가 결합된 금 나노입자를 혼합하고, 얻어진 금 나노입자 집합체의 원자간력 현미경 이미지를 도 6에, 각각 나타낸다.
도 4 및 도 6에 나타내는 바와 같이, 단분산 상태에 있는 2종의 금 나노입자를 혼합함으로써, 집합체가 형성되었다는 것을, 투과형 전자현미경 이미지 그리고 원자간력 현미경 이미지로부터 확인할 수 있었다.
[예 4 금 나노입자 집합체의 해석(2): 증강 전기장의 측정]
다음에, 인접한 금 나노입자의 계면에서 형성되는 증강 전기장의 계측과 형상 측정을 근접장 마이크로 현미경을 이용하여 동시에 행하였다.
상기 단일가닥 DNA(b)[5’-HS-C6-GGAGCTGGTGGC-3’]가 결합된 금 나노입자의 근접장 현미경에 의한 이미지(위치 정보, 도 7에서 부호 11)와 그 표면 근방에 형성되는 전기장(도 7에서 부호 12)을 도 7에, 상기 단일가닥 DNA(b)가 결합된 금 나노입자와 단일가닥 DNA(a)[5’-HS-C6-GCCACCAGCTCC-C6-TAMRA-3’]가 결합된 금 나노입자를 혼합하고, 얻어진 금 나노입자 집합체의 근접장 현미경에 의한 이미지(위치 정보, 도 8에서 부호 13)와 그 표면 근방에 형성되는 전기장(도 8에서 부호 14)을 도 8에, 각각 나타낸다.
도 7 및 도 8에 나타내는 바와 같이, 금 나노입자 집합체가 형성되어 있는 입자로부터는 매우 강한 증강 전기장이 얻어지고 있음을 확인할 수 있으며, 이 증강 전기장 중에 포함되는 라만 활성 분자로부터는 매우 강한 라만 산란이 얻어지는 것을 기대할 수 있는 결과가 되었다.
[예 5 금 나노입자 집합체의 해석(3): 라만 스펙트럼 측정]
계속해서, 얻어진 금 나노입자 집합체(용액)를 석영으로 제조된 모세관(capillary tube)에 봉지하고, 이 모세관 내의 용액의 라만 스펙트럼을 측정하였다. 한편, 본 시험에서 이용한 12염기 DNA는 90℃ 이상의 온도에서 DNA의 회합이 해리되어, 단일가닥 DNA로 되돌아가므로, 90℃의 온도 하에서의 라만 스펙트럼의 측정도 함께 행하였다. 생체 온도에 상당하는 온도(약 34~38℃)에서 측정한 라만 스펙트럼 결과(금 나노입자 집합체)를 도 9의 부호 15에, 90℃의 온도 하에서의 라만 스펙트럼 결과(단일가닥 DNA가 결합된 금 나노입자)를 도 9의 부호 16에 나타낸다.
도 9로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이, 집합체가 형성된 금 나노입자로부터는, 강한 라만 산란이 관찰되었다. 이는 도 10에 나타내는 바와 같은 금 나노입자끼리의 집합(결합)·해리 상태가 온도 변화에 따라 가역적으로 변하기 때문에 일어난 것이라 할 수 있다.
[예 6 분자인식 프로브 함유 금 나노입자 집합체의 제작 및 분자인식]
이렇게 하여 얻어진 금 나노입자 집합체의 금속 나노입자 표면을, 추가로 특정 분자인식 가능한 분자인식 프로브로 수식하였다. 이 방법은 특별히 한정하는 것은 아니지만, 앞서 기재된 DNA를 금 나노입자 표면에 고정할 때에 미리 혼합해 두는 것이 일반적이다.
즉, 먼저 PCR 튜브에 1% tween-20 1μL, DNA 수식 금 나노입자 5μL, 상기 DNA 수식 금 나노입자의 수식에 이용한 DNA와 상보가닥의 관계에 있는 1μM DNA 10μL 내에 10질량%의 비율로 한쪽 말단에 알킬아민을 다른측 말단에 비오틴을 갖는 헤테로 2관능 PEG(분자량 5,000)를 혼합한 용액, 5M NaCl 4μL를 첨가하여 실온에서 10분간 방치하고(금 나노입자 집합체의 형성(응집체처럼 보이는)이 관찰되지 않는 경우에는 빙랭하여 20분 이상 방치한 후), 탁상 원심기로 가볍게 원심분리하여 집합체를 침전시켰다.
이렇게 하여 얻어진 분자인식 프로브 함유 라만 센싱용 금 나노입자 집합체를 스트렙타비딘·플레이트에 첨가하여, 실온에서 몇 분간 방치한 후에, 멸균수로 수회 세정하고, 미고정된 분자인식 프로브 함유 라만 센싱용 금 나노입자 집합체를, 정제수로 금의 플라스몬 흡수가 없어질 때까지 충분히 세정하였다. 이렇게 처리한 스트렙타비딘·플레이트를 레이저 라만 현미경으로 관찰한 결과, 도 11에 나타내는 바와 같은 라만 산란 스펙트럼이 얻어져, 분자인식 프로브 함유 라만 센싱용 금 나노입자 집합체에 의한 분자인식이 이루어졌다는 것을 보여주었다.
[실험예 1 금 나노입자 집합체의 제조 및 분자인식]
<DNA의 조제>
2종의 단일가닥 DNA를 준비하였다.
먼저, 염기 배열이 TTTCTATTCCTA CCAATGTAGCGACTACCTCAG인 33염기의 5’ 말단에 대하여 금 표면에 고정하는 부위로서 티올기를 탄소수 6의 알킬사슬을 통해 결합시킨 DNA를 합성하였다.
한편, 이와는 별도로 염기 배열이 TTTCGATCTAATACAGTTAGTTAGTATACG TGC인 33염기의 5’ 말단에 대하여 금 표면에 고정하는 부위로서 티올기를 탄소수 6의 알킬사슬을 통해 결합시킨 DNA를 합성하였다.
다음에, 상기 단일가닥 DNA의 2개를 금속 나노입자에 고정시키기 위한 템플레이트가 되는 단일가닥 DNA로서, 상기 단일가닥 DNA에 대하여 상보적인 관계에 있는 부위를 갖는 염기군과 상기 2개의 단일가닥 DNA의 간격을 조절하는 염기군으로 이루어진 단일가닥 DNA를 준비하였다.
즉, 앞서 기재된 DNA와 결합시키는 상보적 DNA로서, 5’ 말단으로부터 CTGAGGTAG TCGCTACATTGGTAGGAATAGGATTGCATGGGATACTATACACTGCACAGGCTTAC의 65염기 DNA를 합성하였다.
또한 뒤에 기재된 DNA와 결합시키는 상보적 DNA로서, 5’ 말단으로부터 GCACGTATACTAACTAAC TGTATTAGATCGGTAAGCCTGTGCAGTGTATAGTATCCCATGCAATC의 65염기 DNA를 합성하였다.
이상, 합성한 티올 말단 33염기 DNA와 65염기 DNA의 구조는 이하와 같다.
1: 5’-HS-C6-TTTCTATTCCTACCAATGTAGCGACTACCTCAG-C6-TAMRA-3’
2: 5’-HS-C6-TTTCGATCTAATACAGTTAGTTAGTATACGTGC-3’
3: 5’-CTGAGGTAGTCGCTACATTGGTAGGAATAGGATTGCATGGGA TACTATACACTGCACAGGCTTAC-3’
4: 5’-GCACGTATACTAACTAACTGTATTAGATCGGTAAGCCTGTG CAGTGTATAGTATCCCATGCAATC-3’
<2중가닥 DNA의 제조>
이들 4종의 DNA를 각각 상보가닥의 관계에서 2중가닥 구조로 하여 결합시켰다. 이 방법은 특별히 한정하지 않지만, 이번에는 다음 방법을 이용하여 행하였다.
즉, 상기 1 내지 4의 DNA를 각각 따로따로 농도 10μM가 되도록 순수에 용해하고, 용해 후, DNA 1:DNA 3=9:10 및 DNA 2:DNA 4=9:10의 부피비율로 각각 마이크로 튜브에 넣어 혼합하였다. 여기에 300mM의 NaCl를 함유하는 30mM 트리스하이드록시메틸아미노메탄-염산(pH8) 버퍼를 첨가하여, 최종 농도 100mM NaCl가 되도록 조정을 행하였다. 시료 튜브를 90℃ 10분간 가열 방치한 후, 30℃까지 냉각 속도 -1℃/min로 냉각하여, 회합한 이들 DNA를 전기영동법에 의해 분리 정제하였다.
<금 입자에 대한 DNA의 흡착(1): DNA를 1개 흡착시킨 금 나노입자>
금 나노입자 분산액(British BioCell International, Ltd.제: 입자경: 15nm) 120μL에, 미리 조정한 무수 비스(p-설포네이트페닐)페닐포스핀2칼륨염 용액(10mg/mL 수용액, BSPP라고 칭함) 12μL를 마이크로 튜브 내에서 혼합하고, BSPP에 의해 표면을 코팅된 금 나노입자를 형성하였다. 이 혼합 용액을 4℃, 1시간 21,600G에서 원심분리하고, 상등액을 버려, 최종적으로 10μL로 하였다.
이 농축한 금 나노입자 분산액을 2μL의 트리스-보레이트-EDTA(TBE라고 칭함) 버퍼(0.5×TBE, 1.4M NaCl 함유)와 혼합하였다.
이 용액 4μL에 대하여 2μL의 티올 말단 DNA(2μM)(앞서 기재한 DNA 1 혹은 DNA 2)를 첨가하여 혼합하였다. 혼합 후, 0.5×TBE(100mMNaCl 함유)로 최종 부피를 8μL로 조정하고, 이 혼합 용액을 실온(22℃)에서 24시간 방치하였다. 방치 후, BSPP(0.25mg/mL 용액) 250μL를 혼합하고, 4℃, 1시간, 21,600G에서 원심 침강시키고, 상등액을 버려, 미반응 DNA를 제거하였다.
<금 입자에 대한 DNA의 흡착(2): DNA를 2개 흡착시킨 금 나노입자>
상기 (1)과 동일한 방법을 이용하여 BSPP 코트 15nm금 나노입자를 조제하였다. 앞서 제시한 <2중가닥 DNA의 제조>에서 합성한 2중가닥 구조의 정제 DNA를, 몰비(금 나노입자 용액):(DNA 용액)=5:1로, 0.5×TBE 버퍼(BSPP: 1mg/mL, NaCl 166mM) 중에서 혼합하였다. 혼합 후 실온에서 24시간 방치하고, 금 입자 표면에 DNA를 고정하였다. 그 후, BSPP 용액(0.25mg/mL 용액)의 희석 용액 내에서 40℃로 유지함으로써, 2중가닥을 절단(解裂)시키고, 원심 정제(4℃, 1시간, 21,600G)에 의해 정제하였다.
<금 나노입자 집합체의 조제>
금 나노입자에 대한 DNA의 흡착(1) 및 (2)에서 조제한 DNA 흡착 금 나노입자 분산액(a: DNA 1 흡착 금 나노입자, b: DNA 2 흡착 금 나노입자, c: DNA 1 및 DNA 2 흡착 금 나노입자)을 a:b:c=1:1:10의 부피비로 혼합하고, 실온 24시간 방치하였다. 방치 후 원심 정제(-4℃, 10분, 10,000G)하고, 미고정 금 나노입자를 제거하였다. 얻어진 금 나노입자 집합체의 투과형 전자현미경 이미지를 도 12에 나타낸다.
이 도면에 따르면, 금 나노입자가 3개 결합되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 즉, c입자를 과잉 첨가하여, a입자-c입자-b입자가 비직선상으로 3개 결합된 집합체가 얻어졌다. 이때 얻어진 금 나노입자의 입자 계면에 형성된 전기장은 앞선 예 4의 시험에서 얻어진 결과와 동등한 강도를 가지고 있었다.
<분자인식 프로브 함유 금 나노입자 집합체의 제조 및 분자인식>
상술한 얻어진 금 나노입자 집합체 용액에 대하여 10질량%의 비율로, 한쪽 말단에 알킬아민을 다른측 말단에 비오틴을 갖는 헤테로 2관능 PEG(분자량 5,000, 100mM)를 분자인식 프로브 분자와 혼합하고, 실온에서 2시간 방치하였다. 그 후, 원심분리 정제에 의해 미흡착의 센싱 프로브를 제거하였다.
이렇게 얻어진 분자인식 프로브 함유 금 나노입자 집합체를 스트렙타비딘·플레이트에 첨가하여, 실온에서 몇 분간 방치한 후에, 멸균수로 수회 세정하고, 미고정된 분자인식 프로브 함유 금 나노입자를 세정하고, 세정수로부터 금의 플라스몬 흡수가 없어질 때까지 충분히 세정을 행하였다. 이러한 방법으로 처리한 스트렙타비딘·플레이트를 레이저 라만 현미경으로 관찰한 결과, 도 13에 나타내는 바와 같은 라만 산란 스펙트럼이 얻어졌으며, 분자인식 프로브 함유 금 나노입자에 의한 분자인식이 이루어진 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 2]
이하에 나타내는 3종의 DNA(DNA 5, 6, 7, 8, 9, 10)를 준비하였다.
DNA 5; 5’-HS-TTTCTATTCCTACCAATGTAGCGACTACCTCAGTTTTTT-3’
DNA 6; 5’-HS-TTTCGATCTAATACAGTTAGTTAGTATACGTGCTTTTTT-3’
DNA 7; 5’-CTGAGGTAGTCGCTACATTGGTAGGAATAGGATTGCATGGGATAC-3’
DNA 8; 5’-GCACGTATACTAACTAACTGTATTAGATCGGTATCCCATGCAATC-3’
DNA 9; 5’-HS-TCTGAGGTAGTCGCTACATTGGTAGG-C6-TAMRA-3’
DNA 10; 5’-HS-TGCACGTATACTAACTAACTGTATTA-C6-TAMRA-3’
이를 상기 [실시예 1]에 개시한 것과 동일한 방법을 이용하여 DNA 7과 DNA 8을 회합시켜 중앙 부분이 2중가닥이 된 DNA 가닥(도 1에서, 중앙 부분이 2중가닥이 된 DNA 3에 상당한다)로 하고, 다시 이 DNA 가닥의 양 말단의 단일가닥 부분에 DNA 5 및 DNA 6을 작용시켜 2중가닥을 만들었다(도 1에서, 변성 DNA 4 에 상당한다). 2중가닥을 만드는 조건은 모두 실시예 1에 따라 행하였다.
이 2중가닥 DNA 가닥의 5nmol을 금 나노입자 용액 1mL에 첨가하였다. 첨가 후, 용기를 볼텍스·믹서를 이용하여 5분간 교반하고, 그 후, 50℃의 항온조에 4시간 내지 24시간 방치하고, 금 나노입자 표면에 대한 티올기를 사이에 둔 2중가닥 DNA 가닥의 고정화를 촉진시켜, DNA가 결합된 금 나노입자(도 1에서, 금 나노입자 6에 상당한다)를 형성하였다. 다음에, 이 금 나노입자 함유 용액을 90℃에서 5시간 가열하여, 2중가닥을 해리시켰다(도 1에서, 금 나노입자 7에 해당함).
한편, 미리 상기 기재된 방법으로 각각 독립적으로 준비해 둔 DNA 9 및 10가 흡착된 금 나노입자(도 1에서, 금 나노입자 8 및 금 나노입자 9에 상당한다)를 상기 금 나노입자 함유 용액에 첨가하고, 금 나노입자 집합체(도 1에서, 금 나노입자 집합체 10에 상당한다)를 얻었다.
얻어진 금 나노입자 집합체의 투과형 전자현미경 이미지를 도 14에 나타낸다. 도 14에 나타내는 바와 같이, 비직선상으로 입자가 3개 결합된 집합체가 얻어졌다.
[예 7 핵산(DNA)의 조제]
Figure 112013001438420-pct00001
<DNA의 조제 및 정제>
우선, 상보가닥의 관계에 있는 단일가닥 DNA 11 및 DNA 12를 준비하였다(표 1 참조).
계속해서, 이들 DNA 11 및 DNA 12에서, 금 표면에 고정하는 부위로서 티올기를 탄소 원자수 6의 직쇄 알킬기(C6)를 통해 5’ 말단에 결합시켰다.
계속해서, 합성한 티올 말단의 DNA 11(또는 DNA 12)에, DTT(디티오트레이톨)를 DNA에 대하여 200배량이 되도록 첨가한 다음, TE 용액(트리스-EDTA Buffer: 10mM 트리스하이드록시메틸아미노메탄, 1mM EDTA, pH~8)으로 용해시켰다. 피펫팅(pipetting), 볼텍스로 용액을 교반한 후, 상온에서 2시간 반응시켰다. 이 조작에 의해, SH화 DNA의 일부가 S-S 결합된 부분을 절단하였다.
그 후, DTT 처리한 상기 DNA 용액에, 3M 아세트산나트륨 수용액을 DTT 처리한 DNA 용액에 대하여 1/10배량이 되도록 첨가하였다. 여기에 미리 4℃로 식혀 둔 냉 에탄올을, DNA 용액에 대하여 2.5배량이 되도록 첨가하였다. 그 후, -20℃ 냉동실에 6시간 이상 정치하여, DNA를 침전시켰다. 침전한 DNA를 원심분리(4℃, 12,000rpm; 7,740G, 30분간)에 의해 회수하였다. 이들 에탄올 침전-원심분리에 의한 정제, 즉 3M 아세트산나트륨 수용액을 첨가하는 것부터 침전 정제시키는 것까지의 사이클을 다시 2회 행하였다.
[예 8 금 나노입자에 대한 티올 말단 DNA의 고정]
금 나노입자 분산액(BBInternational 제조: 입자경: 10nm) 1mL에, 예 7에서 S-S 결합을 환원(절단), 정제한 티올 말단 DNA(DNA 11 혹은 DNA 12)를 5nM 첨가하고, 피펫팅, 볼텍스로 1분간 교반한 후, 50℃에서 12시간 정치하여, 금 나노입자 표면에 대한 DNA의 고정화를 촉진시켰다.
12시간 정치 후, UV 측정을 통해 금 나노입자의 분산, 응집 상태를 확인하였다. 도 15에 티올 말단 DNA 11을 흡착시킨 금 나노입자 분산액의 자외·가시 흡수 스펙트럼 측정 결과를 나타낸다.
각 금 나노입자 분산액에 2.5M NaCl를 40μL, 500mM 인산완충액(pH7)을 20μL 첨가한 다음, 50℃에서 40시간 정치하였다. 이 조작에 의해, 금 표면의 마이너스(-) 전하를 NaCl이 빼앗아, 용액 중에 금 나노입자 표면에 미흡착의 상태로 잔존해 있는 티올 말단 DNA를 다시 금 나노입자 표면에 흡착시켰다.
40시간 정치 후, UV 측정을 통해 금 나노입자의 분산, 응집 상태를 확인하였다. 도 16에 티올 말단 DNA 11(도 16에서 부호 17) 및 티올 말단 DNA 12(도 16에서, 부호 18)를 흡착시킨 금 나노입자 분산액의 자외·가시 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
[예 9 금 나노입자 집합체의 제작]
상기 방법에 의해 상보가닥 간의 DNA(DNA 11, DNA 12)를 각각 고정한 2종의 금 나노입자 용액을, 13,000rpm으로 30분간 원심분리하고, 금 나노입자를 침전시켜, 상등액을 제거하였다. 여기에 10mM 인산완충액(0.1M NaCl 함유, pH7) 0.5mL를 첨가하여 침전물을 재분산시켰다. 재차 13,000rpm으로 30분간 원심분리하여, 상등액을 제거한 후, 0.01% tween-20 1μL, 10mM 인산완충액(0.1M NaCl 함유, pH 7) 0.25mL에 재분산시켰다.
DNA 11을 이용하여 조제한 금 나노입자 분산액을 sample [1] 용액, DNA 12를 이용하여 조제한 금 나노입자 분산액을 sample [2] 용액이라 칭한다. 각각의 sample 용액을 투과형 전자현미경으로 관찰한 결과를 각각 도 17 및 도 18에 나타낸다.
이렇게 하여 얻어진, 표면에 DNA가 결합된, 2종의 금 나노입자 분산 용액을 혼합하고, DNA의 상보가닥을 회합시킴으로써, 금 나노입자 간의 결합을 형성시켜, 금 나노입자 집합체를 제조하였다.
즉, 먼저 1.5mL의 마이크로 튜브에, 1% tween-20 1μL, sample [1] 용액 10μL, sample [2] 용액 10μL, 5M NaCl 4μL를 첨가하여, 75℃의 고온조 내에 1시간 방치한 후, 실온에서 10분간 정치시켰다.
10분간 정치 후, 용액의 색이 적색에서 보라색으로 변한 것을 확인하고, 다시 20분간 정치한 후, 가볍게 원심분리를 행하여, 얻어진 집합체를 침전시켰다.
얻어진 금 나노입자 집합체의 투과형 전자현미경(TEM) 이미지를 도 19에 나타낸다.
[예 10 염기 수가 상이한 DNA에 의한 금 입자 표면의 수식]
<DNA의 조제>
하기 표 2로 나타내는 3종의 DNA(DNA 13~DNA 15) 각각에 대하여, 다음의 처리를 행하였다.
티올 말단 DNA(DNA 13~DNA 15)에 DTT(디티오트레이톨)를 DNA에 대하여 200배량이 되도록 첨가한 다음, TE 용액(트리스-EDTA Buffer: 10mM 트리스하이드록시메틸아미노메탄, 1mM EDTA, pH~8)으로 용해시켰다. 피펫팅, 볼텍스로 용액을 교반한 후, 상온에서 2시간 반응시켰다.
그 후, DTT 처리한 상기 DNA 용액에, 3M 아세트산나트륨 수용액을 DTT 처리한 DNA 용액에 대하여 1/10배량이 되도록 첨가하였다. 여기에 미리 4℃로 식혀 둔 냉 에탄올을, 이 DNA 용액에 대하여 2.5배량이 되도록 첨가하였다. 그 후, -20℃ 냉동실에 6시간 이상 정치하여, DNA를 침전시켰다. 침전한 DNA를 원심분리(4℃, 12,000rpm; 7,740G, 30분간)에 의해 회수하였다. 이들 에탄올 침전-원심분리에 의한 정제, 즉 3M 아세트산나트륨 수용액을 첨가하는 것부터 침전 정제시키는 것까지의 사이클을 다시 2회 행하였다.
Figure 112013001438420-pct00002
<금 나노입자에 대한 티올 말단 DNA의 고정>
금 나노입자 분산액(BBInternational 제조: 입자경: 10nm) 1mL에 상기 공정으로 정제한 티올 말단 DNA(DNA 13 내지 DNA 15)를 5nM 첨가하고, 피펫팅, 볼텍스로 1분간 교반한 후, 50℃에서 24시간 정치하여, 금 나노입자 표면에 대한 DNA의 고정화를 촉진시켰다.
12시간 정치 후, 각 금 나노 분산액에 2.5M NaCl를 40μL, 200mM 인산완충액(pH7)을 50μL 첨가한 다음, 50℃에서 45시간 정치하였다. 정치 후의 각 티올 말단 DNA를 흡착시킨 금 나노입자 분산액(도면에서, DNA 13: 부호 19, DNA 14: 부호 20, DNA 15: 부호 21)의 자외·가시 흡수 스펙트럼 측정 결과를 도 20에 나타낸다.
상기 3종의 DNA(DNA 13~DNA 15)를 각각 고정한 3종의 금 나노입자 용액을, 그 후, 14,000rpm(18,700G)로 30분간 원심분리하고, 금 나노입자를 침전시켜, 상등액을 제거하였다. 여기에 10mM 인산완충액(0.1M NaCl 함유, pH7) 0.5mL를 첨가하여 침전물을 재분산시켰다. 재차 14,000rpm으로 30분간 원심분리하여, 상등액을 제거한 후, 0.01% tween-20 1μL, 10mM 인산완충액(0.1M NaCl 함유, pH7) 0.25mL에 재분산시켰다.
DNA 13을 이용하여 조제한 금 나노입자를 sample [3] 용액, DNA 14를 이용하여 조제한 금 나노입자를 sample [4] 용액, DNA 15로 조제한 금 나노입자를 sample [5] 용액이라 칭한다. 각각의 시료 용액의 자외·가시 흡수 스펙트럼 측정 결과를 도 21(도면에서, DNA 13: 부호 19, DNA 14: 부호 20, DNA 15: 부호 21)에 나타낸다.
<금 나노입자 집합체의 제작(1): sample [3] 용액과 sample [5] 용액>
1.5mL의 마이크로 튜브에, 1% tween-20 1μL, sample [3] 용액(DNA 가닥 길이: 42mer) 10μL, sample [5] 용액(DNA 가닥 길이: 15mer) 10μL, 5M NaCl 4μL를 첨가하고, 75℃의 고온조 내에 1시간 방치한 후, 실온에서 10분간 정치시켰다.
10분간 정치 후, 용액의 색이 적색에서 보라색으로 변한 것을 확인하고, 다시 20분 정치한 후, 가볍게 원심분리를 행하여, DNA 염기의 상보가닥을 회합시킴으로써 금 나노입자 간의 결합을 형성시켜 얻어진 금 나노입자 집합체를 얻었다. 얻어진 집합체를 sample [6]이라 칭한다.
<금 나노입자 집합체의 제작(2): sample [4] 용액과 sample [5] 용액>
1.5mL의 마이크로 튜브에, 1% tween-20 1μL, sample [4] 용액(DNA 가닥 길이: 27mer) 10μL, sample [5] 용액(DNA 가닥 길이: 15mer) 10μL, 5M NaCl 4μL를 첨가하고, 75℃의 고온조 내에 1시간 방치한 후, 실온에서 10분간 정치시켰다.
10분간 정치 후, 용액의 색이 적색에서 보라색으로 변한 것을 확인하고, 다시 20분 정치한 후, 가볍게 원심분리를 행하여, DNA 염기의 상보가닥을 회합시킴으로써 금 나노입자 간의 결합을 형성시켜 얻어진 금 나노입자 집합체를 얻었다. 얻어진 집합체를 sample [7]이라 칭한다.
얻어진 sample [6]과 sample [7]의 외관(사진)을 도 22에 나타낸다.
[실시예 3 핵산에 의한 분자인식]
폐암에 대한 핵산제제중 하나인 aptamer AS1411의 말단을 티올기로 수식한 분자(Tsukuba Oligo Service Co., Ltd.로부터 입수)를, 예 9에서 제조한 금 나노입자 집합체 표면에 흡착시키고, 이것을 폐암 세포(a549)에 작용시켜, 작용 전후의 라만 산란 스펙트럼을 비교하였다.
상세하게는, 예 9에 따라 제조한 금 나노입자 집합체 분산액(10mM 인산완충액(pH7.0)에 분산)에 5nM의 aptamer AS1411용액을 첨가하고, 40℃에서 24시간 교반하였다. 그 후 14,000rpm(18,700G)으로 30분간 원심분리하고, 입자를 침전시켜, 상등액을 제거하였다. 여기에 10mM 인산완충액(0.1M NaCl 함유, pH7) 0.5mL를 첨가하여 침전물을 재분산시켰다. 재차 14,000rpm으로 30분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 0.01% tween-20 1μL, 10mM 인산완충액(0.1M NaCl 함유, pH7) 0.25mL에 재분산시켰다.
이렇게 얻어진 AS1411 흡착-금 나노입자 집합체를 미리 배양 플래이트에서 배양한 폐암 세포에 20uL 첨가하고, 48시간 방치하여 암세포에 흡착시켰다. 그 후, 라만 분광 장치에 의해 암세포 표면을 측정하고, 흡착시키기 전의 암세포 표면과 흡착 후의 암세포 표면의 라만 산란 스펙트럼을 비교하였다. AS1411 흡착-금 나노입자 집합체의 라만 산란 스펙트럼을 도 23에, a549 암세포의 라만 산란 스펙트럼을 도 24에, 그리고 AS1411 흡착-금 나노입자 집합체를 흡착시킨 a549 암세포의 라만 산란 스펙트럼을 도 25에, 각각 나타낸다.
도 24~도 25에 나타내는 바와 같이, AS1411 흡착-금 나노입자 집합체를 암세포에 작용시킴으로써 라만 산란 스펙트럼이 크게 변했고, 예 9에서 제조한 금 나노입자 집합체를 이용한 분자인식이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 4 핵산에 의한 분자인식]
폐암에 대한 핵산제제중 하나인 aptamer AS1411의 말단을 티올기로 수식한 분자(Tsukuba Oligo Service Co., Ltd.로부터 입수)를, 실시예 3에 나타내는 방법으로 제조한 금 나노입자 집합체 표면에 흡착시키고, 이것을 폐암 세포(a549)에 작용시켜, 흡착 사이트의 매핑을 시험하였다.
얻어진 AS1411 흡착-금 나노입자 집합체를 미리 배양 샬레에서 배양한 폐암 세포에 20uL 첨가하고, 48시간 방치하여 암세포에 흡착시켰다. 그 후, 라만 분광 장치에 의해 암세포 표면을 측정하고, 흡착에 관한 라만 스펙트럼에 대하여 측정을 행해 암세포 유래 DNA의 인산 유래의 매핑과 금 입자 흡착 부위의 매핑, 그리고 현미경 사진을 중복하여 비교한 결과, 암세포가 인식되고 있는 것을 확인할 수 있었다.
(산업상 이용가능성)
본 발명의 분자 센싱용 금속 나노입자 재료는, 고감도 분자인식 센서로서 유용하며, 미량 분자인식, 즉, 생체 관련 물질의 센싱에 매우 적합한 재료로서 사용할 수 있다.
1. 티올 말단 단일가닥 DNA 1
2. DNA 1과 상보가닥의 관계에 있는 단일가닥 DNA 2
3. 중앙부가 2중가닥 DNA이고, 그 양 단에 1 및 2로 표시한 단일가닥 DNA를 배치한 DNA 3
4. DNA 3의 양 말단에 DNA 1 및 DNA 2가 회합한 DNA 4
5. 금 나노입자
6. 표면에 DNA 4 를 티올기를 통해 결합시킨 금 나노입자
7. 가온에 의해 2중가닥을 해리시켜 분리한 후의 금 나노입자
8. 단일가닥 DNA 1이 흡착된 금 나노입자
9. 상보가닥 DNA 2가 흡착된 금 나노입자
10. 금 나노입자 집합체
11. 단일가닥 DNA(b)가 결합된 금 나노입자의 위치 정보
12. 단일가닥 DNA(b)가 결합된 금 나노입자로부터 나오는 전기장 정보
13. 금 나노입자 집합체에서의 금 나노입자의 위치 정보
14. 금 나노입자 집합체에서의 금 나노입자로부터 나오는 전기장 정보
15. 금 나노입자 집합체에서의 근접 상태에 있는 금 나노입자에 의한 증강 라만 산란
16. 가온에 의한 금 나노 집합체가 해소된 금 나노입자에 의한 증강 라만 산란
17. 티올 말단 DNA 11을 흡착시킨 금 나노입자 분산액의 자외·가시 흡수 스펙트럼
18. 티올 말단 DNA 12를 흡착시킨 금 나노입자 분산액의 자외·가시 흡수 스펙트럼
19. 티올 말단 DNA 13을 흡착시킨 금 나노입자 분산액의 자외·가시 흡수 스펙트럼
20. 티올 말단 DNA 14를 흡착시킨 금 나노입자 분산액의 자외·가시 흡수 스펙트럼
21. 티올 말단 DNA 15를 흡착시킨 금 나노입자 분산액의 자외·가시 흡수 스펙트럼

Claims (17)

  1. 3 내지 10개의 금속 나노입자가 각각 옆의 금속 나노입자와의 사이에서 소정 거리로 결합된 금속 나노입자 집합체로 이루어지고, 또한 라만 활성 분자를 핵산가닥에 결합하여 이루어지는, 증강 전기장에서 상기 라만 활성 분자로부터의 증강된 라만 산란광을 발하는 분자 센싱용 금속 나노입자 재료를 제조하는 방법으로서,
    a) 중앙부에서 2중가닥을 이루는 기체(基體)가 되는 핵산가닥(1)에, 그 핵산가닥(1) 중의 부분 염기 구조에 상보성을 가지면서 한쪽 말단에 티올기를 갖는 단일가닥의 핵산가닥(2)을 적어도 2개 회합시켜 2중 나선을 형성시킨 변성 핵산가닥을 얻는 공정,
    b) 상기 변성 핵산가닥의 티올기와 금속 나노입자를 반응시키고, 이 금속 나노입자의 표면에 변성 핵산가닥을 결합시킨 후, 60~100℃로 가열하여 변성 핵산가닥의 2중 나선 구조를 해리시킴으로써 핵산가닥(1)을 제거하여, 티올기를 통해 단일가닥의 핵산가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)를 얻는 공정,
    c) 상기 핵산가닥(2)과 상보성을 가지며, 한쪽 말단에 티올기를 갖는 염기가닥 길이가 동일한 단일가닥의 핵산가닥(3)과, 금속 나노입자를 반응시켜, 티올기를 통해 단일가닥의 핵산가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 얻는 공정,
    d) 단일가닥의 핵산가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)와 단일가닥의 핵산가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 혼합함으로써, 단일가닥의 핵산가닥(2)과 단일가닥의 핵산가닥(3)을 회합시켜 2중 나선을 형성시켜서 금속 나노입자 집합체를 제조하는 공정,
    및
    상기 a) 공정에서 사용된 단일가닥의 핵산가닥(2) 혹은 상기 c) 공정에서 사용된 단일가닥의 핵산가닥(3), 또는, 이들 양쪽에 라만 활성 분자를 결합하는 공정을 포함하는,
    분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법.
  2. 3 내지 10개의 금속 나노입자가 각각 옆의 금속 나노입자와의 사이에서 소정 거리로 결합된 금속 나노입자 집합체로 이루어지고, 또한 라만 활성 분자를 DNA 가닥에 결합하여 이루어지는, 증강 전기장에서 상기 라만 활성 분자로부터의 증강된 라만 산란광을 발하는 분자 센싱용 금속 나노입자 재료를 제조하는 방법으로서,
    a) 중앙부에서 2중가닥을 이루는 기체(基體)가 되는 DNA 가닥(1)에, 그 DNA 가닥(1) 중의 부분 염기 구조에 상보성을 가지면서 한쪽 말단에 티올기를 갖는 단일가닥의 DNA 가닥(2)을 적어도 2개 회합시켜 2중 나선을 형성시킨 변성 DNA 가닥을 얻는 공정,
    b) 상기 변성 DNA 가닥의 티올기와 금속 나노입자를 반응시키고, 이 금속 나노입자의 표면에 변성 DNA 가닥을 결합시킨 후, 60~100℃로 가열하여 변성 DNA 가닥의 2중 나선 구조를 해리시킴으로써 DNA 가닥(1)을 제거하여, 티올기를 통해 단일가닥의 DNA 가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)를 얻는 공정,
    c) 상기 DNA 가닥(2)과 상보성을 가지며, 한쪽 말단에 티올기를 갖는 염기가닥 길이가 동일한 단일가닥의 DNA 가닥(3)과, 금속 나노입자를 반응시켜, 티올기를 통해 단일가닥의 DNA 가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 얻는 공정,
    d) 단일가닥의 DNA 가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)와 단일가닥의 DNA 가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 혼합함으로써, 단일가닥의 DNA 가닥(2)과 단일가닥의 DNA 가닥(3)을 회합시켜 2중 나선을 형성시켜서 금속 나노입자 집합체를 제조하는 공정,
    및
    상기 a) 공정에서 사용된 단일가닥의 DNA 가닥(2) 혹은 상기 c) 공정에서 사용된 단일가닥의 DNA 가닥(3), 또는, 이들 양쪽에 라만 활성 분자를 결합하는 공정을 포함하는,
    분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 d)공정에 있어서, 이 단일가닥의 DNA 가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1)의 1당량에 대하여, 이 단일가닥의 DNA 가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 2당량 이용하여 금속 나노입자 집합체를 제조하는, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 단일가닥의 DNA 가닥(2)은, 서로 상보성을 갖는 부위를 갖지 않는 것인, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    a) 내지 d) 중 어느 한 공정에서,
    e) 핵산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 탄화수소를 포함하는 분자가닥의 일측 말단에 분자인식 프로브를 가지고, 다른측 말단에 티올기 또는 아미노기를 갖는 분자인식 프로브 분자와, 금속 나노입자를 반응시켜, 금속 나노입자 표면에, 티올기 또는 아미노기를 통해 말단에 분자인식 프로브 분자를 결합시키는 공정
    을 더 포함하는, 분자 센싱용 금속 나노입자 재료의 제조 방법.
  6. 한쪽 말단에 티올기를 갖는 단일가닥 핵산가닥(2)과, 금속 나노입자를 반응시켜, 티올기를 통해 단일가닥의 핵산가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1')를 얻는 공정,
    상기 핵산가닥(2)과 상보성을 가지며, 한쪽 말단에 티올기를 갖는 단일가닥의 핵산가닥(3)과, 금속 나노입자를 반응시켜, 티올기를 통해 단일가닥의 핵산가닥(2)과 염기가닥 길이가 동일한 단일가닥의 핵산가닥(3)이 결합된 금속 나노입자(2)를 얻는 공정,
    단일가닥의 핵산가닥(2)이 결합된 금속 나노입자(1')와 단일가닥의 핵산가닥(3)가 결합된 금속 나노입자(2)를 혼합함으로써, 단일가닥의 핵산가닥(2)과 단일가닥의 핵산가닥(3)을 회합시켜 2중 나선을 형성시켜서 금속 나노입자 집합체를 제조하는 공정
    을 포함하는 제조 방법에 의해 얻어지는, 금속 나노입자가 옆의 금속 나노입자 사이에서 소정 거리로 결합된 금속 나노입자 집합체로 이루어진 금속 나노입자 재료를, 검체와 접촉시킨 후, 증강 전기장에서 검체의 라만 산란 측정을 행하는 것을 특징으로 하는, 분자 센싱 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 금속 나노입자 집합체가, 상기 어느 하나의 공정에서
    핵산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 탄화수소를 포함하는 분자가닥의 한쪽 말단에 분자인식 프로브를 가지고, 다른 쪽 말단에 티올기 또는 아미노기를 갖는 분자인식 프로브 분자와, 금속 나노입자를 반응시켜, 금속 나노입자 표면에, 티올기 또는 아미노기를 통해 말단에 분자인식 프로브 분자를 결합 또는 흡착시키는 공정
    을 더 포함하는 방법으로 제조된 것인, 분자 센싱 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 분자 센싱용 금속 나노입자 재료가 기판상에 고정되어 있는, 분자 센싱 방법.
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